专利名称：：一种核苷酸突变位点的检测方法
技术领域：
：本发明属于基因组学和分子生物学中有机生物分子领域，尤其涉及核苷酸突变位点的4企测方法。
背景技术：
：自然界大多数生物体的遗传信息均包含在脱氧核糖核酸(DNA)中，人类全基因组中30亿个碱基，约4万个基因，分布在24对染色体上。每个基因通过转录、翻译，编码特异的蛋白质，调控生物体内特定的生化反应，发挥特异的生物学功能。DNA序列的改变，即基因突变，会导致蛋白质结构、功能的改变或缺失，进而引起相关的遗传疾病。基因突变包括DNA分子中发生碱基对的插入、缺失和改变(点突变)。研究表明许多疾病的发生，如血友病、地中海贫血、杜氏型肌营养不良、亨廷顿舞蹈症、老年痴呆症、糖尿病、肥胖症、心血管疾病以及自身免疫等3000多个疾病与基因突变密切相关。另外，近年来人们逐渐认识到癌症的发生发展也是基因累积突变的结果。在人类基因组中，约卯％的差异是以单个核苷酸的差异体现出来的，主要由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，这样的差异位点称作单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。在人群中，这种变异的发生频率至少要大于1%,否则被认为是点突变。SNP位点大多数为双态，即在一个位点上仅有两种表现形式，并且在人类基因组中广泛存在，平均每500~1000个石威基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。这些差异极有可能是造成个体差异的遗传因素，因此发现这些位点可广泛地应用于遗传标记的研究、评估个体遗传关系、评估物种进化等研究领域。目前检测SNP和基因突变的方法有许多种，如直接PCR测序、RFLP、基因芯片和焚光定量PCR等。其中，直接PCR测序最不敏感，只有耐药突变株达到20%以上才能#皮检测到；也不适用于大规模筛选；RFLP分析只能检测出在病毒总体中大于5%的突变抹，但是对于每个感兴趣的突变，必须特别设计单独的核酸内切酶。针对某些突变的特异性内切酶可能并不存在，RFLP分析并不适用于所有的突变。基因芯片技术利用寡核苷酸微点阵，可以检测新发现的突变，但这种方法代价昂贵，没有得到广泛应用。总之，上述这些方法不是费时费力，灵敏度低，准确度低，就是成本高，不适合大规模筛查。
发明内容本发明实施例的目的在于提供一种核苷酸突变位点的检测方法，旨在解决现有核苷酸突变位点的检测方法灵敏度低、准确性低的问题。本发明实施例是这样实现的，一种核苷酸突变位点的一企测方法，包括如下步骤一种核香酸突变位点的^^测方法，包括如下步骤(1)针对待检核苷酸序列可能存在的突变位点，并确定突变位点在待检序列中的位置；(2)根据突变位点的位置，设计3条引物，其中，一对为扩增引物，每条引物长度至少30bp,其5'端各含10bp的tag;另一条为延伸引物，长度为17-28bp，正好位于突变位点的5'端；(3)通过PCR扩增，获得含有所述突变位点的靶序列扩增产物；(4)通过SAP酶处理，除去所述扩增产物中含有的dNTPs;(5)通过延伸反应，在延伸引物的3，端连接一个碱基，且该碱基正好与突变位点上的石成基互补，延伸反应所使用的原料是是以扩大分子量差异为目的进行过质量修饰的四种ddNTP分子(6)釆用树脂纯化延伸反应产物；(7)将纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发进行质谱检测，确定突变的基因型。与现有技术相比，上述技术方案，通过SAP酶(坏磁Z畴酸酶)处理，除去所述扩增产物中含有的dNTPs,可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基；延伸反应所使用的原料是经过质量修饰的ddNTP，以增大四种ddNTP分子量差异，提高分辨率。将纯化产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发，由于基质分子经辐射吸收能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子，产生的离子多为单电荷离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能，进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离，在真空小管中飞行到达^r测器。这样，采用质语仪检测待检测突变位点不仅方便，而且灵敏度高、准确性高。上述耙序列扩增产物长度为80-120bp。作为本发明的一个具体的实施方式，四种ddNTP的分子量分别是ddATP271.2Da，ddTTP327.1Da，ddCTP247.2Da,ddGTP287.2Da,其中分子量差异最小的是16Da,大大提高了分辨率。作为本发明的一个较佳的实施方式，上述步骤(2)还可以包括按照引物间，引物与扩增产物间不形成二聚体、发夹结构，以及不发生错配的原则，将多个检测位点的扩增引物与扩增引物混合，延伸引物与延伸引物混合。这样可以同时检测多个非连续的SNP位点，提高了效率，节省了成本。作为本发明的另一个较佳的实施方式，还可以将连续多个突变位点标记在同一条核苷酸序列上，共用一对扩增引物。扩增产物的长度可在100-350bp间。两端的突变位点采取向左右两侧设计，左侧突变位点的延伸引物采取正向设计，右侧突变位点的延伸？1物采取反向设计；位于中间的突变位点的延伸引物有多条，且包含其上游的突变位点可能存在的所有核苷酸情况。这样，可以同时检测连续突变的多个位点，节省了成本，缩短了周期，-提高了效率。具体来讲，可以采用如下方法设计连续多个突变位点的引物若左侧突变位点为Snpl，中间的突变位点为S叩2，右侧突变位点为S叩3,S叩l/SnpWSnp3所在序列为S叩1[C/T]，右侧SNP位点，正向设计，延伸引物为......TCAGCGATATSnp3[T/G]，左侧SNP位点，反向设计，延伸引物为......TACGAATTSnp2[G/A],中间SNP位点，兼并引物，延伸引物为......AGCGATATCC和......AGCGATATTC。上述具体实施方式中，质谱仪选择基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。该飞行时间质i普基因分型系统的反应体系为非杂交依赖性，不存在潜在的杂交错配干扰，也不需要引入各种标记物，因而准确性高。图1A为本发明实施例1中，所得到的阴性对照Al的质谱图；图1B为本发明实施例1中，所得到的待测样本B1的质谱图；图1C是本发明实施例1中，所得到的待测样本C1的质谱图2A为本发明实施例2中，所得到的阴性对照A2的质谱图；图2B为本发明实施例2中，所得到的待测样本B2的质谱图；图2C是本发明实施例2中，所得到的待测样本C2的质谱图；图2D为本发明实施例2中，所得到的待测样本D2的质谱图；图2E是本发明实施例2中，所得到的待测样本E2的质谱图3A-1为本发明实施例3中，所得到的阴性对照A3-l的质谱图；图3A-2为本发明实施例3中，所得到的阴性对照A3-2的质谱图；图3B为本发明实施例3中，所得到的待测样本B3的质谱图；图3C是本发明实施例3中，所得到的待测样本C3的质谱图；、图4A为本发明实施例4中，所得到的待测样本A4的质谱图；图4B-E分别为图4A的局部放大图，其中，图4B为本发明实施例4中，检测180位点的质谱图；图4C为本发明实施例4中，检测204位点的质谱图；图4D为本发明实施例4中，检测250位点的质谱图；图4E为本发明实施例4中，检测184位点的质谱图。具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1:(1)设计扩增乙肝病毒逆转录酶区180位密码子的引物乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染是严重的世界性卫生问题，每年约有近百万人死于乙肝病毒感染引起的各类疾病。目前治疗乙肝的药物主要是核酸类似物，包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦等，这类药物在病毒DNA复制过程中替代正常dNTP，从而导致DNA合成终止。然而，长期服用某种药物会导致耐药性的产生，不仅达不到治疗的目的，反而导致反弹。如果对乙肝患者体内的耐药变异进行研究，即可揭示人群中不同个体对相同药物的敏感性差异的根本原因，也有助于研究者筛选更合适的药物。其中，乙肝病毒基因组逆转录酶区180位密码子C/TTG变成ATG，使得氨基酸由亮氨酸变为曱硫氨酸(L180M)，从而产生对抗病毒药物拉米夫定的耐药性。对于该突变位点的质谱检测，我们设计如下实验首先根据乙肝病毒基因组的序列(NCBI登录号NC—003977)，设计一对PCR引物和一条延伸引物，PCR引物为上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3';下游5，-acgttggatgAGCCCTACGAACCACTGAAC-3，；延伸引物为5，画GCCTCAGTCCGTTTCTC-3，。其中，小写字母部分表示10bp的tag。(2)扩增含有乙肝病毒逆转录酶区180位密码子的片段PCR反应片段长度大小为101bp，反应体系为5ul，其中含有4mMMg2+,lx緩冲液，100nM引物，500uMdNTP,0.5UHotstarTaq;反应条件95。C15min;45个循环(94°C20s，56°C30s,72。Clmin);72°C3min。PCR反应后，乙肝病毒基因组DNA中带有突变位点的那段核苷酸序列的拷贝数得到了放大。反应完成后的纯化产物可在4。C保存数天，也可在-20。C保存数周，也可直接用于后续的SAP处理。(3)SAP处理PCR反应产物经过SAP处理，去除多余的dNTPs。具体的SAP反应体系lxSAP緩冲液和0.5USAP酶，反应总体积为7ul(2ulSAP+5ulPCR产物)。反应条件为37°C40min，85°C5min。SAP为虾碱磷酸酶，可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。反应完成后的纯化产物可在4。C保存数天，也可在-20。C保存数周，也可直接用于后续的延伸反应。(4)延伸反应延伸反应后得到一个片段大小为18bp的产物，它与延伸引物(17bp)的区别仅在于3'端多了一个碱基。延伸反应所使用的原料是经过质量修饰的ddNTP,它既保证了延伸反应只连接一个碱基，又进一步整个系统的分辨率提高。延伸反应体系为9ul，緩沖液、ddNTPs(质量经过修饰)、延伸引物、iPLEX酶等各种试剂的反应浓度因反应丛数的不同而不同，反应总体积为9ul(2ul延伸mix+7ulSAP处理产物)。反应条件94°C30s;40个循环(94。C5s,5个小循环(52。C5s,80°C5s)};72°C3min。反应完成后的延伸产物可在4。C保存数天，也可在-20。C保存数周，也可直接用于后续的树脂纯化。(5)树脂纯化在延伸反应的产物中加入6mg树脂，上下颠倒30min。经过本步反应，树脂将充分与反应体系中的阳离子结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4。C保存lt天，也可在-20。C保存数周，也可4000rpm离心5min后取上清直接用于质i条险测。(6)质谱检测纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发，即可进行MALDI-TOF-MS分析。判定标准如下如果没有发生耐药突变，延伸产物的质谱结果为5'-GCCTCAGTCCGTTTCTCC-3，或5，-GCCTCAGTCCGTTTCTCT-3，，分子量分别为5335.5Da和5415.4Da;如果发生耐药突变，延伸产物的质谱结果为5，-GCCTCAGTCCGTTTCTCA-3，，分子量为5359.5Da。检测结果如下其中样本A1为阴性对照样本，样本B1和C1为待测样本。对于阴性对照样本Al,由于其没有发生耐药突变，因此延伸产物的分子量为5415.4Da(见图1A);对于样本B2，质谱4企测到的分子量为5359.5Da，可以确定样本B2发生了耐药突变(见图1B);对于样本Cl，质谱图上出规,了两个峰，分别在5359.5Da和5415.4Da，可以推断该样本中存在野生林和突变林(见图1C)。实施例2(1)设计扩增乙肝病毒逆转录酶区181位密码子的引物乙肝病毒基因组逆转录酶区181位密码子GCT变成GTT或ACT，使得氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸或苏氨酸(A181V/T),从而产生对抗病毒药物阿德福韦酯的耐药性。对于该突变位点的质谱检测，根据乙肝病毒基因组的序列(NCBI登录号NC—003977),设计1对PCR引物和5条延伸引物，PCR引物为上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3';下游5'画acgttggatgAGCCCTACGAACCACTGAAC-3,。其中，小写字母部分表示lObp的tag。由于181位点的上游180位点也容易发生突变，即C/TTG也会变成ATG，而下游184位点也会发生突变，由ACT变成GGT,所以针对l81密码子的第一个碱基设计了3条兼并延伸引物，分別为181歸1:5，-TCAGTCCGTTTCTCTTG-3，，181歸2:5，-TCAGTCCGTTTCTCCTG-3，，181#1#3:5，画TCAGTCCGTTTCTCATG-3，。其第二个密码子设计了2条兼并延伸引物，分别为18翻1:5，-ATGGCACTAGTAAACTGA-3,,181#2#2:5，-TGGCACTACCAAACTGA-3，。(2)扩增含有乙肝病毒逆转录酶区181位密码子的片段PCR反应片段长度大小为98bp，反应体系为5ul，其中含有4mMMg2+，1x緩冲液，100nM引物，500uMdNTP，0.5UHotstarTaq;反应条件95。C15min;45个循环(94°C20s,56°C30s，72°Clmin);72°C3min。PCR反应后，乙肝病毒基因组DNA中带有突变位点的那段核苷酸序列的拷贝数得到了放大。反应完成后的纯化产物可在4。C保存数天，也可在-20。C保存数周，也可直接用于后续的SAP处理。(3)SAP酶处理PCR反应产物经过SAP处理，去除多余的dNTPs。具体的SAP反应体系1xSAP緩冲液和0.5USAP酶，反应总体积为7ul(2ulSAP+5ulPCR产物)。反应条件为37°C40min，85°C5min。SAP为虾i成磷酸酶，可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。反应完成后的纯化产物可在4"保存数天，也可在-20。C保存数周，也可直接用于后续的延伸反应。(4)延伸反应延伸反应后得到一个片段大小为18bp的产物，它与延伸引物的区别仅在于3，端多了一个碱基。延伸反应所使用的原料是经过质量修饰的ddNTP，它既保证了延伸反应只连接一个碱基，又进一步整个系统的分辨率提高。延伸反应体系为9ul，緩沖液、ddNTPs(质量经过修饰)、延伸引物、iPLEX酶等各种试剂的反应浓度因反应丛数的不同而不同，反应总体积为9ul(2ul延伸mix+7ulSAP处理产物)。反应条件94°C30s;40个循环(94。C5s,5个小循环(52°C5s,80°C5s)};72°C3min。反应完成后的延伸产物可在4。C保存数天，也可在-2(TC保存数周，也可直接用于后续的树脂纯化。(5)树脂纯化在延伸反应的产物中加入6mg树脂，上下颠倒30min。经过本步反应，树脂将充分与反应体系中的阳离子结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4。C保存数天，也可在-20。C保存数周，也可4000rpm离心5min后取上清直接用于质语检测。(6)质镨检测纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质语仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发，即可进行MALDI-TOF-MS分析。分型结果依据分子量来判定，标准如下181#1#1，野生型为5405.5Da，突变型为5389.5Da;181#1#2,野生型为5390.5Da，突变型为5374.5Da;181#1#3,野生型为5414.6Da,突变型为5398.5Da;181#2#1，野生型为5818.8Da，突变型为5802.8Da;181#2#2，野生型为5450.6Da，突变型为5434.6Da。;险测结果如下样本A2、B2、C2、D2和E2为临床待测样本。样本A2，由181#1#1检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5405.5Da和5389.5Da(见图2A);样本B2，由181#1#2检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5390.5Da和5374.5Da(见图2B);样本C2，由181#1#3检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5414.6Da和5398.5Da(见图2C);样本D2，由181#2#1检测到野生型和突变型，因此延伸产物的分子量分别为5818.8Da和5802.8Da(见图2D);样本E2，由181#2#2冲企测到突变型，因此延伸产物的分子量为5434.6Da(见图2E)。实施例3(1)KRAS基因第12，13位密码子突变4全测引物设计KRAS基因又称鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因，其功能与GTP酶活性密切相关。检测KRAS基因是否突变能预测结肠癌患者对西妥昔单抗(Erbitux，爱必妥，百时美施贵宝)的疗效，已被NCCN列为推荐检测的基因项目之一；KRAS最为重要的突变为第一外显子12、13位密码子，野生型12、13位密码子为GGTGGC,其存在多种突变；12、13位密码子第一二位石威基的突变可引起编码氨基酸的改变，进而影响KRAS基因表达产物的功能。对于该突变位点的质谱检测，根据KRAS基因的序列(NCBI登录号EU332849)，设计1对PCR引物和10条延伸引物。由于KRAS基因第12，13位密码子的第1,2个碱基均可能发生突变，所以采取两侧设计和兼并引物设计的方法。KRAS引物序列表见表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>KRAS13c2GAAGGCACTCTTGCCTACGCKRAS13c2ATCAAGGCACTCTTGCCTACGTKRAS13c2CCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGG(2)扩增含有KRAS12、13位密码子的136bp的片段PCR反应片段长度大小为136bp，反应体系为5ul，其中含有4mMMg2+,lx緩沖液，100nM引物，500uMdNTP,0.5UHotstarTaq;反应条件95。C15min;45个循环(94°C20s,56°C30s,72°Clmin);72°C3min。PCR反应后，KRAS中带有易突变12、13为密码子位点的那段核苷酸序列的拷贝数得到了放大。反应完成后的纯化产物可在4。C保存数天，也可在-20。C保存数周，也可直接用于后续的SAP处理。(3)SAP处理PCR反应产物经过SAP处理，去除多余的dNTPs。具体的SAP反应体系1xSAP緩沖液和0.5USAP酶，反应总体积为7ul(2ulSAP+5ulPCR产物)。反应条件为37°C40min，85°C5min。SAP为虾减z瞵酸酶，可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。反应完成后的纯化产物可在4。C保存数天，也可在-20。C保存数周，也可直接用于后续的延伸反应。(4)延伸反应延伸反应后得到一个片段大小范围在19-29bp范围内的产物，它与延伸引物的区别仅在于3，端多了一个碱基。延伸反应所使用的原料是经过质量修饰的ddNTP，它既保证了延伸反应只连接一个碱基，又进一步整个系统的分辨率提高。延伸反应体系为9ul，緩冲液、ddNTPs(质量经过修饰)、延伸引物、iPLEX酶等各种试剂的反应浓度因反应丛数的不同而不同，反应总体积为9ul(2ul延伸mix+7ulSAP处理产物)。反应条件94°C30s;40个循环{94匸5s,5个小循环(52。C5s,80°C5s)};72°C3min。反应完成后的延伸产物可在4。C保存数天，也可在-20。C保存数周，也可直接用于后续的树脂纯化。(5)树脂纯化在延伸反应的产物中加入6mg树脂，上下颠倒30min。经过本步反应，树脂将充分与反应体系中的阳离子结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4'C保存数天，也可在-20。C保存数周，也可4000rpm离心5min后取上清直接用于质谱检测。(6)质谱检测纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发，即可进行MALDI-TOF-MS分析。分型结果依据分子量来判定，标准如下如KRAS12cl，野生型为5574.6Da,突变型会有三种质谱质量，分别为5534.6Da,5558.6Da，5614.5Da;KRAS12clG,野生型为6819.5Da,突变型会有三种质谱质量分别为6779.4Da，6803.5Da，6859.3Da。检测结果如下其中样本A3为阴性对照样本，样本B3和C3为待测样本。对于阴性对照样本A3，由于密码子没有发生突变，因此KRAS12cl和KRAS12clG延伸产物分子量为5574.6Da(图3A-1)和6819.5Da(图3A-2);对于样本B3，质谱检测KRAS12cl产物的分子量为5614.5Da和5574.6Da,可以确定样本B3发生了KRAS12位密码子第一碱基的突变(图3B);对于样本3C，质谱检测KRAS12clG产物的分子量为，分别在6819.5Da和6803.5Da，可以推断该样本中存在KRAS12位密码子第二碱基的突变(见图3C)。实施例4(1)设计扩增乙肝病毒逆转录酶区180、204、250和184位密码子的引物乙肝病毒基因组逆转录酶区180位密码子TTG或CTG变成ATG,204位密码子ATG变成ATT，250位密码子ATG变成GTG,以及184位密码子ACT变成GCT,/人而产生抗病毒药物耐药性。对于这些突变位点的质谱检测，根据乙肝病毒基因组的序列(NCBI登录号NC—003977)，设计1对PCR引物和4条延伸引物，PCR引物为上游5，-acgttggatgAAGATTCCTATGGGAGTGGG-3，；下游5，画acgttggatgACCCCAACTTCCAATTACAT-3'。其中，小写字母部分表示10bp的tag。4条延伸引物分别对应4个斗企测位点，信息如下180:5，-GCCTCAGTCCGTTTCTC-3'204:5，-CCCCCAATACCACATCATC-3'250:5，-GGGCTACTCCCTTAACTTC-3'184:5，-ACTGAACAAATGGCACTAC-3(2)扩增含有乙肝病毒逆转录酶区181位密码子的片段PCR反应片段长度大小为293bp，反应体系为5ul，其中含有4mMMg2+,lx緩冲液，100nM引物，500uMdNTP，0,5UHotstarTaq;反应条件95°C15min;45个循环(94°C20s,56°C30s,72°Clmin);72°C3min。PCR反应后，乙肝病毒基因组DNA中带有突变位点的那段核苷酸序列的拷贝数得到了放大。反应完成后的纯化产物可在4。C保存数天，也可在-20。C保存数周，也可直接用于后续的SAP处理。(3)SAP酶处理PCR反应产物经过SAP处理，去除多余的dNTPs。具体的SAP反应体系1xSAP緩冲液和0.5USAP酶，反应总体积为7ul(2ulSAP+5ulPCR产物)。反应条件为37°C40min，85°C5min。SAP为奸石威磷酸酶，可以将未反应的dNTP去磷酸化，阻止其参与到后续反应中，以确保延伸反应时只延伸一个碱基。反应完成后的纯化产物可在4。C保存数天，也可在-20。C保存数周，也可直接用于后续的延伸反应。(4)延伸反应延伸反应后得到4个片段大小为18-29bp的产物，它与延伸引物的区别仅在于3，端多了一个石咸基。延伸反应所使用的原料是经过质量修饰的ddNTP,它既保证了延伸反应只连接一个碱基，又进一步整个系统的分辨率提高。延伸反应体系为9ul，緩沖液、ddNTPs(质量经过修饰)、延伸引物、iPLEX酶等各种试剂的反应浓度因反应丛数的不同而不同，反应总体积为9ul(2ul延伸mix+7ulSAP处理产物)。反应条件94°C30s;40个循环(94。C5s，5个小循环(52°C5s,80°C5s)};72°C3min。反应完成后的延伸产物可在4。C保存数天，也可在-2(TC保存数周，也可直接用于后续的树脂纯化。(5)树脂纯化在延伸反应的产物中加入6mg树脂，上下颠倒30min。经过本步反应，树脂将充分与反应体系中的阳离子结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4。C保存数天，也可在-20。C保存数周，也可4000rpm离心5min后取上清直接用于质谱;险测。(6)质谱4全测纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发，即可进行MALDI-TOF-MS分析。分型结果依据分子量来判定，标准如下180，野生型为5335.5Da,突变型为5359.5Da;2(M，野生型为5868.9Da,突变型为5892.9Da;250，野生型为5985.9Da，突变型为6001.9Da;184，野生型为6037.0Da，突变型为6116.9Da。;险测结果如下样本A4为临床待测样本。从图中可以看出，通过这一次反应，实现了4个位点同时4全测(图4A)。其中检测到180位点为野生型，分子量为5335.5Da(图4B);204位点为野生型，分子量为5868.9Da(图4C);250位点为野生型，分子量为5985.9Da(图4D);184位点为突变型，分子量为6116.9Da(图4E)。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。权利要求1、一种核苷酸突变位点的检测方法，包括如下步骤(1)针对待检核苷酸序列可能存在的突变位点，并确定突变位点在待检序列中的位置；(2)根据突变位点的位置，设计3条引物，其中，一对为扩增引物，每条引物长度至少30bp，其5’端各含10bp的tag；另一条为延伸引物，长度为17-28bp，正好位于突变位点的5’端；(3)通过PCR扩增，获得含有所述突变位点的靶序列扩增产物；(4)通过SAP酶处理，除去所述扩增产物中含有的dNTPs；(5)通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，且该碱基正好与突变位点上的碱基互补，延伸反应所使用的原料是以扩大分子量差异为目的进行过质量修饰的四种ddNTP分子；(6)采用树脂纯化延伸反应产物；(7)将纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发进行质谱检测，确定突变的基因型。2、如权利要求1所述的核苷酸突变位点的检测方法，其特征在于，所述靶序列扩增产物长度为80-120bp。3、如权利要求1所述的核苷酸突变位点的检测方法，其特征在于，所述经过质量修饰的四种ddNTP的分子量分别是ddATP271.2Da,ddTTP327.1Da,ddCTP247.2Da，ddGTP287.2Da。4、如权利要求1所述的核苷酸突变位点的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)还包括按照引物间，引物与扩增产物间不形成二聚体、发夹结构，以及不发生错配的原则，将多个检测位点的扩增引物与扩增引物混合，延伸引物与延伸引物混合。5、如权利要求1所述的核苷酸突变位点的检测方法，其特征在于，待检测核苷酸突变位点为连续多个，该连续多个突变位点标记在同一条核苷酸序列上，且共用一对扩增引物，两端的突变位点采取向左右两侧设计，左侧突变位点的延伸引物采取正向设计，右侧突变位点的延伸引物釆取反向设计；位于中间的突变位点的延伸引物有多条，且包含其上游的突变位点可能存在的所有核苷酸情况。6、如权利要求5所述的核苷酸突变位点的检测方法，其特征在于，扩增产物的长度为100-350bp。7、如权利要求5所述的核苷酸突变位点的检测方法，其特征在于，若所述左侧突变位点Snpl,中间的突变位点为Snp2,右侧突变位点为S叩3，Snpl/S叩2/Snp3所在序列为S叩1[C/T]，右侧SNP位点，正向设计，延伸引物为......TCAGCGATATS叩3[T/G]，左侧SNP位点，反向设计，延伸引物为......TACGAATTSnp2[G/A],中间SNP位点，兼并引物，延伸引物为……AGCGATATCC和......AGCGATATTC。'8、如权利要求17任一项所述的核苷酸突变位点的检测方法，其特征在于，所述质谱仪为基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪。全文摘要本发明提供了一种核苷酸突变位点的检测方法，包括如下步骤(1)确定突变位点在待检序列中的位置；(2)根据突变位点的位置，设计引物；(3)PCR扩增；(4)SAP酶处理，除去所述扩增产物中含有的dNTPs；(5)延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基；(6)采用树脂纯化延伸反应产物；(7)将纯化后的产物与芯片基质共结晶，将该晶体放入质谱仪的真空管，然后用瞬时纳秒强激光激发进行质谱检测，确定突变的基因型。本发明解决了现有核苷酸突变位点的检测方法灵敏度低、准确性低的问题。文档编号C12Q1/68GK101440407SQ20081021834公开日2009年5月27日申请日期2008年12月12日优先权日2008年12月12日发明者平吴,爽喻,李晶晶,玲杨,威王,清韦,扬高申请人:深圳华大基因科技有限公司