专利名称：：用于沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌复合增菌的培养基及制备方法
技术领域：
：本发明属于致病菌的前增菌培养基，特别是涉及一种同时对沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌复合增菌的培养基及其制备方法。
背景技术：
：我国是世界上畜牧业生产大国，肉产量居世界第一，国内人均肉类占有量达到58千克，高于世界40千克的平均水平。随着经济增长，食物消费发生了变化，畜产品消费量的快速增加，这种变化对肉类食品的质量安全要求有了更高、更迫切的要求。在已知的致病菌中，沙门氏菌(5W/wo恥Wa)、金黄色葡萄球菌(Sto;A少/ococcusciwew)、单核细胞增生李斯特菌(丄加er^wo"oo^取脱"经常出现在各类肉制品中，有较高的致病率和致死率，是国家常规检测项目。根据国家食源性疾病监测网的统计资料显示，近10年来，在我国由微生物引起的食源性疾病事件中，沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别占117.9%和8.9%，是最常见和最主要的病因物质。据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占世界第二位，仅次于大肠杆菌。在美国国内由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%。就单增李斯特菌而言，外国的调查表明各类产品中，新鲜肉类、肉类日制品和熟食肉类制品含有单增李斯特菌的比例最高，而国内发现肉类制品污染单增李斯特菌的比例最高。因此，通过控制和阻止沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌来改善食品供应的安全受到高度重视。在食品分配销售之前，快速准确的检测这三种菌是必要的、有时甚至是强制的。尽管诸如基于抗体，核酸，生物传感器的现代检测方法已经大大提高了致病菌的检测速度，但能够满足的检测灵敏度仍然要求一个前增菌步骤。现今的研究侧重于强调在一个检测平台上检测多个致病菌，例如多重PCR技术、蛋白或抗体微阵列感受器、免疫吸收及DNA微阵列等技术。多重致病菌的检测方法经济实效，因为它可以减少处理大量样品仪器所占用的空间、供应物、试剂、员工，从而减少总的成本。为了加快多种致病菌在同一检测平台上的共检，一种合适的复合增菌培养基是急需的。营养肉汤等前增菌肉汤是经济的，但是缺乏抑制剂去选择目标菌，不合适于高背景微生物的原材料及未经处理的样品。
发明内容本发明旨在提供可以同时支持沙门氏菌，金黄色葡萄球菌及单核细胞增生李斯特菌三种食源性疾病的同时生长的培养基，将常规检测方法中的前增菌步骤和选择性增菌步骤合二为一，用于在一个检测平台上检测多个致病菌。本发明通过选择合适的组分，并进行合理混配，经加热、溶解、混合、高温灭菌等步骤而获得一种使沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌及金黄色葡萄球菌复合增菌的培养基。本发明选择的配方如下胰蛋白胨17份、蛋白胨3份、磷酸二氢钠2.5份、葡萄糖2.5份、七叶苷1.0份、蒸馏水1000份、丙酮酸钠2.5份、甘露醇5.0份、氯化钠20.0份、氯化锂2.0份、亚碲酸钾0.00015份、萘啶酮酸0.01份，pH值7.2-7.3。本培养基含有抑制剂氯化锂、亚碲酸钾及萘啶酮酸。其中萘啶酮酸抑制革兰氏阴性菌的生长，但是对沙门氏菌的抑制作用不明显，氯化锂对三种目标菌没有明显的没有抑制作用，但对绿脓杆菌、志贺氏菌、小肠耶尔森氏菌等有抑制作用。亚碲酸钾对大肠杆菌及蜡样芽孢杆菌有抑制作用。三种抑制剂的添加可以起到抑制背景微生物的生长，使目标菌有较好的生长。三种菌对氯化钠的耐受性能好，提高其用量，抑制其他微生物的生长。磷酸二氢钾用于调节pH。胰蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖、丙酮酸钠是培养基中基本的营养和支持成分。七叶苷、甘露醇分别用于促进单增李斯特菌及金黄色葡萄球菌的生长。标本接种后，在37C培养，增菌24小时后，划线到三种目标菌各自的选择性培养基上，分离鉴别。本发明的制备方法是l)将胰蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、甘露醇、丙酮酸钠、氯化钠、七叶苷、氯化锂、按配比加入到990份蒸镏水中，加热溶解，冷却至室温后，矫正pH值为7.2-7.3。(2)混匀，121。C灭菌15min;(3)称取0.01份萘啶酮酸加入到5份浓度为0.05mol/L的氢氧化钠溶液中，得到萘啶酮酸溶液。称取0.00015份亚碲酸钾加入到5份以灭菌的蒸馏水中，得到亚碲酸钾溶液。(4)在无菌条件下，加入步骤3中配制的萘啶酮酸溶液5份及亚碲酸钾溶液5份；分装存于4'C下备用。相对于现有技术，本发明具有以下优点本培养基可融合致病菌的前增菌及选择性增菌两个步骤，縮短增菌时间至24小时；使得三种常见的致病菌同时增菌而其他的致病微生物生长受到一定的抑制；本发明的培养物可以直接做目标菌的分离培养及生物鉴定实验，也可以直接用于多重PCR检测，作出诊断报告。图1是沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒检测结果图。图2是沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒检测结果图。图3是沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒检测结果图。具体实施例方式为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。实施例1:称取胰蛋白胨17g、蛋白胨3g、磷酸二氢钠2.5g、葡萄糖2.5g、七叶苷lg、丙酮酸钠2.5g、甘露醇5g、氯化钠20g、氯化锂2g、蒸馏水加至990ml，加热溶解，冷却到室温后矫正pH值至7.2-7.3;混匀，121'C灭菌15min;称取lOmg萘啶酮酸加入到5ml浓度为0.05mol/L的氢氧化钠溶液中，得到萘啶酮酸溶液。称取0.15mg亚碲酸钾加入到5ml以灭菌的蒸馏水中，配成亚碲酸钾溶液。在无菌条件下，加入萘啶酮酸溶液5ml及亚碲酸钾溶液5mh分装存于4°C下备用，制得用于沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌复合增菌的培养基。将制备的用于沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌复合增菌的培养基分别接入稀释到104的沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌三种目标菌及杂菌(表1中)的菌液0.2ml,37'C培养24h。用可见分光光度计测定540nm下的OD值。以营养肉汤为空白对照。结果见表l。表l目标菌及杂菌单独在培养基中的生长情况<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表中，x表示菌体不生长，O号为空白对照，l-3号为三个重复。由表1可知，将沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌三种目标菌及杂菌单独接入到复合增菌液中，经24小时增菌复合增菌液对目标菌的增菌效果与无选择性的营养肉汤相当，而杂菌在复合增菌液中的不生长或生长受抑制。实施例2:称取胰蛋白胨17g、蛋白胨3g、磷酸二氢钠2.5g、葡萄糖2.5g、七叶苷lg、丙酮酸钠2.0g、甘露醇10g、氯化钠25g、氯化锂2.5g、蒸馏水加至990ml，加热溶解，冷却到室温后矫正pH值至7.2-7.3;混匀，121。C灭菌15min;称取15mg萘啶酮酸加入到5ml浓度为0.05md/L的氢氧化钠溶液中，得到萘啶酮酸溶液。称取0.2mg亚碲酸钾加入到5ml以灭菌的蒸馏水中，配成亚碲酸钾溶液。在无菌条件下，加入萘啶酮酸溶液5ml及亚碲酸钾溶液5ml;分装存于4'C下备用，制得用于沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌复合增菌的培养基。将制备的用于沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌复合增菌的培养基分别接入稀释到104的三种目标菌及杂菌(见表2)的菌液0.2ml，37'C培养24h。用可见分光光度计测定540nm下的OD值。同时将菌体接入营养肉汤中做空白对照。表2目标菌及杂菌单独在培养基中的生长情况0123沙门氏菌1.218U341.0891.021金黄色葡萄球菌1.2130，0.9871.012单增李斯特菌1.0390.978l屈0扁大肠杆菌1.4230.5340.4560.601蜡样芽孢杆菌1.342XXX小肠耶尔森氏菌1.123XXX变形杆菌1.4820.6230.4300.402产气肠杆菌1.221XXX净虽氏志贺菌1.342XXX鲍氏志贺菌1.345XxX绿脓杆菌1.231XX表中，x表示菌体不生长，O号为空白对照，l-3号管为三个重复。由表2可知，将沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌三种菌单独接入到增菌液中，经24小时增菌与无选择性的营养肉汤有相当的增菌效果。杂菌生长受抑制或受部分抑制，可减少背景微生物对目标菌生长的影响。实施例3:称取胰蛋白胨17g、蛋白胨3g、磷酸二氢钠2.5g、葡萄糖2.5g、七叶苷lg、丙酮酸钠lg、甘露醇3g、氯化钠10g、氯化锂2.5g、蒸馏水加至990ml，加热溶解，冷却到室温后矫正pH值至7.2-7.3;混匀，12rC灭菌15min;称取5mg萘啶酮酸加入到5ml浓度为0.05mol/L的氢氧化钠溶液中，得到萘啶酮酸溶液。称取0.05mg亚碲酸钾加入到5ml以灭菌的蒸馏水中，配成亚碲酸钾溶液。在无菌条件下，加入萘啶酮酸溶液5ml及亚碲酸钾溶液5ml;分装存于4'C下备用，制得用于沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌复合增菌的培养基。将制备的用于沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌复合增菌的培养基分别接入稀释到10—4的沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌三种目标菌及杂菌(见表3)的菌液0.2ml，37'C培养24h。用可见分光光度计测定540nm下的OD值。同时将菌体接入营养肉汤中做空白对照。表3目标菌及杂菌单独在培养基中的生长情况<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表中，x表示菌体不生长，O号为空白对照，1-3号管为沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌三个重复。由本表可知，将三种菌单独接入到增菌液中，经24小时增菌与无选择性的营养肉汤有相当的增菌效果。而杂菌在复合增菌液中的不生长或生长受抑制。实施例4:按实施例l配制培养基，按沙门氏菌单增李斯特菌金黄色葡萄球菌的比例为1:1:I接入培养基中，37'C培养24小时候，将菌液稀释到10—6，分别涂布到BS琼脂平板，MMA琼脂平板及B-P平板上，进行分离培养。沙门氏菌在BS琼脂上为墨绿色圆形菌落，金葡菌和单增李斯特菌不生长。在B-P平板上金葡菌为黑色菌落，沙门菌剂李斯特菌不生长。用白炽灯45度照射MMA平板，李斯特菌为灰蓝或蓝色小的圆形菌落，沙门菌和金葡菌不生长。生长结果见表4。表4复合增菌培养基增菌效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由本表可知，经过24小时增菌，菌体可增多至105至106，可以满足后期检测的菌浓度要求。实施例5:按实施例l配制培养基。在无菌条件下，将鸡脯肉、牛肉、猪肉(经荧光PCR鉴定不含三种目标菌)分别制备成25g粉碎。将大约3Xl(^CFU/g的培养物被接种于样品中，室温下处理15min，使细菌被吸收，然后将其放入含有225ml的自制培养基的无菌袋中，混合2min。均匀好的样品接种后37'C培养24小时。用酚/氯仿法提取细菌的DNA，用沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌荧光PCR检测试剂盒进行检测，检测结果如图1至图3，可见三种目标菌均出现明显的DNA扩增曲线，说明复合增菌培养基使得样品中的沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌三种目标菌同时增长，并达到PCR检测的菌浓度要求，证明经复合增菌培养基增菌培养后，可用于PCR检验，满足其检测限的要求。权利要求1、用于沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌复合增菌的培养基，其特征在于，以质量分数计，其配方组成为胰蛋白胨15-19份、蛋白胨2-4份、磷酸二氢钠2-3份、葡萄糖2-3份、七叶苷0.5-1.5份、蒸馏水1000份、丙酮酸钠1-2.5份、甘露醇3-10.0份、氯化钠1.0-25.0份、氯化锂1-2.5份、亚碲酸钾0.0001-0.0002份、萘啶酮酸0.005-0.015份，pH值为7.1-7.5。2、根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述培养基的的配方为胰蛋白胨17份、蛋白胨3份、磷酸二氢钠2.5份、葡萄糖2.5份、七叶苷1.0份、蒸馏水1000份、丙酮酸钠2.5份、甘露醇5.0份、氯化钠20.0份、氯化锂2.0份、亚碲酸钾0.00015份、萘啶酮酸0.010份，pH值7.2-7.3。3、权利要求1所述用于沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌及金黄色葡萄球菌复合增菌的培养基的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)按照权利要求1所述的配方，将胰蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖、磷酸二氢钾、甘露醇、丙酮酸钠、氯化钠、七叶苷、氯化锂加入到990份蒸馏水中，加热至溶解，冷却至室温后，矫正pH值至7.2-7.3;(2)混匀，121-125'C灭菌15-18min;(3)按权利要求1称取萘啶酮酸加入到5份浓度为0.05mol/L的氢氧化钠溶液中，得到萘淀酮酸溶液；按权利要求1称取亚碲酸钾加入到5份以灭菌的蒸馏水中，得到亚碲酸钾溶液；(4)在无菌条件下，加入步骤(3)中配制的萘啶酮酸溶液及亚碲酸钾溶液；分装存于4-6。C下备用。全文摘要本发明公开了用于沙门氏菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌复合增菌的培养基及制备方法，该培养基包括胰蛋白胨15-19份、蛋白胨2-4份、磷酸二氢钠2-3份、葡萄糖2-3份、七叶苷0.5-1.5份、蒸馏水1000份、丙酮酸钠1-2.5份、甘露醇3-10.0份、氯化钠1.0-25.0份、氯化锂1-2.5份、亚碲酸钾0.0001-0.0002份、萘啶酮酸0.005-0.015份，pH值为7.1-7.5。本培养基在使得三种目标致病菌同时增菌的同时，抑制其它的致病微生物生长，可直接做目标菌的分离培养及生物鉴定实验，也可以直接用于多重PCR等基于一个检测平台的多个致病菌的检测技术中，作出诊断报告。文档编号C12Q1/68GK101412978SQ20081021941公开日2009年4月22日申请日期2008年11月25日优先权日2008年11月25日发明者余以刚,刘园园,晖吴,李苏龙,肖性龙申请人:华南理工大学