专利名称：：黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测方法
技术领域：
：本发明专利属于生物技术工程领域，特别是涉及一种植物病毒黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cwcw附6ermoW/e附(wa/cv/nw，CGMMV)的'决速检领!l方法。
背景技术：
：黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cwcww6ermoW/emo抑/cv/n/s，CGMMV)是一种正单链RNA病毒，属烟草花叶病毒属(7b6a/nov/n^),主要分布在罗马尼亚、波兰、丹麦、英国、芬兰、德国、前苏联、希腊克里特岛、中国台湾、日本、韩国、印度、伊朗、沙特阿拉伯、以色列、巴西等地。在自然界该病毒主要侵染葫芦科作物，引起叶片斑驳、灼泡状和畸形，并伴随植株生长矮化，是葫芦科作物上最具威胁的植物病毒病害。CGMMV侵染黄瓜引起叶片斑驳、水泡及变形，植株矮化、结果延时甚至导致不孕，果实大部分黄化或变白并产生黑绿色水疱状的坏死斑，产量损失达15%以上；在前苏联的Georgia地区，黄瓜发病率达80100%。CGMMV早期侵染的西瓜(Citrullusvulgaris)植株生长缓慢，出现花叶，果实中严重变色或果实内部造成腐烂，果肉纤维化，果实产量下将30%。在中国，2002年首次从日本引进的种苗中截获CGMMV，2004年厦门动植物检疫局又从日本进口的南瓜种子上检测到CGMMV。2005年辽宁省盖州市感染CGMMV的西瓜面积达333hm2，绝收的13hm2。2006年12月21日农业部发布788号公告，将黄瓜绿斑驳花叶病毒确定为全国农业植物检疫性有害生物，属国家三类检疫性病害。CGMMV可经多种途径传播，以种子传播和接触性传染为主要传播途径。随着种子运输，病毒可长距离传播到新的地区或国家，给当地农业生产带来很大的威胁，如日本从印度进口带毒的葫戶种子，导致该病毒在日本定殖扩散，给日本的葫芦科作物的生产带来毁灭性的打击。因此，加强种子带毒检测，建立CGMMV的快速、准确、可靠的检测方法，对于防止该病毒进一步扩散，保护农业生产，具有十分重要的意义。目前传统的生物学、血清学、电子显微镜技术和反转录PCR等检测方法都各有优缺点。反转录PCR作为一种比血清学更加灵敏的技术，可以对CGMMV进行准确的检测。实时荧光定量PCR技术是近年新发展起来的一项检测技术，是反转录PCR技术的延伸，它通过监测每个扩增循环中所收集的荧光信号，可以实时的、定量的检测目的基因，该方法在病毒的定量评估研究中显示了巨大的潜力，在植物病毒检测领域已得到了广泛的应用。因此，本发明利用实时荧光定量PCR技术，建立一套快速、简便、准确、灵敏的CGMMV定量检测方法，并应用此方法对西瓜种子携带的CGMMV进行了检测。
发明内容基于上述研究领域中的空白，本发明提供了西瓜种子携带的黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测技术，为植物病毒检测提供了一种新方法。黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测方法，采用一步实时定量RT-PCR反应，其特征在于耙基因为CGMMV分离物CP基因。所述RT-PCR反应体系中的引物对和探针为引物对CGMMV-F:CCAGACTCAAGCGGGAAGAG，CGMMV-R:TCTACGACAGACGAGGGTAACG，探针CGMMV-T:5、FAMTTCTTTCCGCGAGTCCCTGTBHQ-13、。所述RT-PCR反应体系为2倍反应缓冲液1ExTaq聚合酶(5U4U)0牟预制反转录反应液0牟上游引物(l(HiM)0.2^1下游引物(10pM)0，探针(10nM)0.2pl总RNA2(xl水6牟总体积20^1所述RT-PCR反应条件为42'C反转录5min;95'C变性5s;95°C10s，60°Clmin，45个循环。所述黄瓜绿斑驳花叶病毒为西瓜种子携带的黄瓜绿斑驳花叶病毒。本发明选用CGMMV分离物CP基因作为靶基因，利用反转录PCR扩增方法，在同一反应体系中加入引物对CGMMV-F、CGMMV-R和探针CGMMV-T进行实时荧光定量检测。本发明方法快速，准确，可靠，对于防止种子病毒的进一步扩散，有很重要的意义。图1CGMMVCP扩增电泳图，其中泳道l:DL2000;泳道2，3:CGMMVCP基因的扩增产物图2引物和探针浓度的优化，横坐标PCR循环数；纵坐标PCR反应荧光信号相对强度，其中令引物和探针浓度均为0.2nmol/L;T:引物浓度0.2pmol/L,探针浓度0.4pmol/L，■:引物浓度0.1nmol/L，探针浓度0.1nmol/L。图3CGMMVCP标准曲线扩增图横坐标PCR循环数；纵坐标PCR反应荧光信号相对强度曲线自左至右模板中CGMMVCP拷贝数依次为500000，50000，5000，500,50。图4CGMMVCP标准曲线横坐标拷贝数LOG对应数值；纵坐标Ct值。图5CGMMV标准曲线扩增图，横坐标PCR循环数；纵坐标PCR反应荧光信号相对强度。图6CGMMV标准曲线横坐标拷贝数LOG对应数值；纵坐标Ct值。图7CGMMV分离物CP基因比对序列具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。下述实施例中所用方法如无特殊说明均为常规方法。1.实验选用的材料1.1供试样品CGMMV种子标样为本组保存的各地区植保站送检的西瓜种子，健康对照为健康植株的种子。1.2主要试剂RNAisoPlus购自TaKaRa公司。限制性内切酶S>na/，￡co//，5am/f/购自NewEnglandBiolabs公司。IPTG、X-Gal、氨苄青霉素、B型小量质粒快速提取试剂盒、B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒及A型质粒大量快速提取试剂盒均为博大泰恒公司产品。AxyPrepPCR清洁试剂盒购自Axygen公司。ExTaqDNA聚合酶、dNTP、RNase、RNAisoReagent(总RNA提取试剂)、TranscriptRNACleanUpKit、DL2000DNAMarker、RNAMarkerRLIOOOO、RNAMarkerRLIOOO、EASYDilution,OneStepPrimeScriptRT-PCRKit为TaKaRa公司产品。M-MLVReverseTranscriptase、pGEM-TEasyVectorSystemI，RiboMAXLargeScaleRNAProductionSystem-T7购自Progenia公司。硝基苯磷酸钠购自Sigma公司。电泳用琼脂糖为西班牙进口产品。其他常用化学试剂购自北京试剂公司。2.本发明设计和引用的引物与探针在荧光定量检测中，靶基因的选择很重要。本发明在本实验室近两年对全国不同地区CGMMV分离物CP基因序列分析的基础上，选定了序列比较保守的CP基因作为荧光定量检测的靶基因。并通过对NCBI上登陆的所有CGMMV分离物CP基因序列进行比对(见图7,同源性达97.7%),找到序列保守区域。然后利用Primerexpress2.0进行引物和探针的设计。将候选的几组组合分别于所有CGMMV分离物CP基因序列进行比对，筛选出最合适的一组。设计的探针5'端用FAM(6-carboxyfluorescein)荧光素标记作为报告基因，3，端用BHQ-1(BlackHoleQuencher1)作为淬灭基团。引物探针均由北京英俊基因技术有限公司负责合成标记，设计的引物序列见表l。表1CGMMV的引物和探针编号用途位置序列及荧光标记基团CGMMV-CP-FCGMMV克隆片段的检测引上游ATGGCTTACAATCCGATCACACC物CGMMV-CP-RCGMMV克隆片段的检测引下游CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCC物CGMMV-SCGMMV克隆片段的检测引下游CCCGGGCTAAGCTTTCGAGGTG物CGMMV-FCGMMV实时定量PCR检测上游CCAGACTCAAGCGGGAAGAG引物CGMMV-RCGMMV实时定量PCR检测下游TCTACGACAGACGAGGGTAACG引物CGMMV-TCGMMV实时定量PCR检测探针5'(FAM)探针TTCTTTCCGCGAGTCCCTGT(BHQ-1)3、3西瓜种子总RNA的提取种子样品总RNA的提取是定量检测中关键的一步，其纯度、质量直接影响定量检测结果，而西瓜种子含有大量多糖，提取纯度较高的总RNA难度很大。本发明在植物叶组织RNA提取的基础，建立了一套用于西瓜种子总RNA提取的方法。通过该方法可以抽提得到适合定量检测的西瓜种子总RNA。在种子RNA抽提过程中，适当的加入高盐溶液处理多糖多酚，在RNA溶解后，再次低温离心，进一步剔除多糖。RNA纯化的具体步骤如下取单粒西瓜种子，加液氮研磨，加入1ml的RNAisoplus(TaKaRaBiotechnology)进一步研磨并移至离心管中。12000rpm，4'C离心5min，将上清转移至新的离心管；在上清中加入O.lml5MNaCl和0.3ml氯仿，振荡混匀，12000rpm，4'C离心15min;将上清再转移至新管，加入1/2体积的异丙醇和1/2体积的高盐溶液，室温静置10min;12000rpm，4'C离心10min，75%乙醇洗涤沉淀物；12000rpm，4"离心5min，弃上清，将沉淀物干燥并溶于50pl的DEPC处理的TE中，1%普通凝胶电泳检测RNA质量。4.CGMMVCP基因的扩增、克隆和测序以上述西瓜种子总RNA为模板，CGMMV-CP-F/CGMMV-CP-R为引物，进行RT-PCR扩增，得到约500bp的PCR产物，经过PCR产物的纯化、与pGEM-TEasy载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞(JM10)、以及阳性克隆的筛选、鉴定，得到了阳性克隆。序列分析结果表明PCR产物长度为486bp。与GenBank中搜索到的CGMMV韩国甜瓜分离物(登陆号AF417243)、CGMMV韩国西瓜分离物(登陆号AF417242)、CGMMVSH分离物(登陆号D12505)和W分离物(登陆号AB015146)，以及本实验室测定的CGMMV中国辽宁分离物(登陆号EU352259)序列比较分析结果表明本发明测定的分离物和上述分离物CP基因核苷酸序列一致性在96.1%左右，说明我们得到了正确的CGMMVCP基因序列。5.CGMMVCP基因的体外转录和RNA的纯化5.1带酶切位点的CGMMVCP基因的扩增、克隆片段正向插入的重组质粒的构建以上述含有正确序列的重组质粒为模板，以CGMMV-CP-F/CGMMV-S为引物对，PCR扩增3'末端带有SmaI酶切位点的CGMMVCP基因。回收纯化486bp的PCR产物，与pGEM-TEasy载体连接，转化感受态细胞JMllO、以及阳性克隆的筛选、鉴定、序列分析，得到了CP基因片段正向插入克隆载体的重组质粒，命名为pT-CP500，该重组质粒经过线性化处理后可用于后期体外转录反应的模板。5.2重组质粒的大量制备将上述含有目的片段正向插入的重组质粒pT-CP500重新转化大肠杆菌JMllO、涂平板培养、挑取单菌落，进行质粒的大量扩繁，利用博大泰恒公司的A型质粒大量快速提取试剂盒纯化质粒，操作参照试剂盒说明，并通过凝胶电泳检测质粒质量。5.3重组质粒的线性化、脱盐纯化及定量重组质粒线性化处理:重组质粒pT-CP500在25°C条件下，Smal酶切16小时，待完全酶切线性化后65'C温育10min中止反应。酶切体系如下反应缓冲液5|ilSmal内切酶lpl载体DNA2吗加水至50nl线性化的质粒作为体外转录的模板之前是必须进行脱盐浓縮处理的，以保证体外转录反应能够顺利充分的进行。酶切反应产物采用Axygen公司的AxyPrepPCR清洁试剂盒进行脱盐浓縮，具体步骤参照试剂盒进行。经纯化的酶切产物，用H20或TE适当稀释后，用NanoDropND-1000核酸蛋白测定仪(NanoDropTechnologies,USA)测定260nm与280nm处的光吸收值，A260/A280值应在1.82.0之间。根据A260值，以A26(M时，双链DNA浓度为50ug/mL标准，计算DNA样品的浓度。后述体外转录反应要求线性化质粒脱盐浓縮后，质粒浓度应大于0.5mg/ml。5.4体外转录体外转录反应要求模板的A260/A280必须在1.8-2.0之间，质粒序列的3'端用合适的平末端限制性内切酶切断质粒，否则T7RNA聚合酶转录RNA的效率非常低。本发明中以纯化的线性质粒作为模板，在T7RNA聚合酶作用下，采用Promega公司的RiboMAXLargeScaleRNAProducitonSystems-T7试剂盒进行体外转录体外转录生成RNA。标准的体外转录反应为100ul，室温下顺序加样制备下列反应体系，混匀后，37'C恒温反应24h。随后，采用TaKaRa公司的TranscriptRNACleanUpKit对体外转录的RNA产物进行纯化，具体操作步骤参照试剂盒说明，并电泳检测体外转录物的质量。体外转录的反应体系T7体外转录反应缓冲液20^1rNTPs(25mMATP,CTP，GTP，UTP)30nl线形化DNA(510ug)40nlT7体外转录酶10^1总体积lOOpl6.CGMMV—步实时定量RT-PCR标准曲线的制作6.1CGMMV—步实时RT-PCR反应体系的优化为了尽量避免试剂配制中污染和误差，CGMMV实时PCR反应采用TaKaRa公司的OneStepPrimeScriptRT-PCRKit。一步法RT-PCR比较两步法RT-PCR更能保证定量检测样品间的稳定性，而采用预混试剂可以简化实验操作并减少污染。本发明对OneStepRealTimeRT-PCR反应进行了优化，引物和探针浓度的组合如下ABC2倍反应缓冲液军，1ExTaq聚合酶(5U/pl)O牟0.4nl预制反转录反应液0.4^10.4^10.4nl上游引物(lOpM)O.化lO.化l0.2nl下游引物(10nM)O牟0.4^10.2pl探针(10nM)0.8^10.4pl0.2^1总RNA2^12pl2pl水5.6^16pl总体积20^120^120[il反应参数42。C反转录5min;95'C变性5s;95°C10s，60°Clmin，45个循环。扩增结果表明引物和探针的浓度均为0.2pmol/L时扩增信号最强，当探针浓度提高至0.4timol/L时信号反而降低，而引物和探针的浓度分别为0.1nmol/L;0.1nmol/L时扩增信号最弱。(图2)6.2CGMMV—步实时定量RT-PCR标准曲线的制作本发明配制的标准曲线是从500000~50拷贝的ssRNA片段序列，其目的片段550bp，RNA的浓度是1.5ng/nl，PCR反应中所用的RNA体积是用2pl/管。以ssRNA为模板，进行一步法实时RT-PCR扩增，每个梯度设置3个重复，以EASYDilution作为模板定义为空白对照制备标准曲线(图3)，标准曲线见图5。结果显示，模板中ssRNA拷贝数从50到500000，均得到了成功的扩增，而且具有良好的重复性(表2)，达到了制作标准曲线的要求。这说明本发明采用的检测体系，只要在2ul的模板中有50拷贝的靶基因时就能检测到，并可根据标准曲线进行CGMMVCPRNA的定量。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>以Ct值为纵坐标，基因拷贝数的对数值为横坐标做标准曲线，二者的回归方程为Y=-3.232X+41.030，R=1.000,PCR扩增效率为103.9%，Ct值从22.52到35.76个循环(图4)。一般情况下斜率只要在-3.0-3.6即可满足RealTimePCR对扩增效率的要求，-3.3时最理想。本发明制备的标准曲线的斜率为-3.232，完全符合实验要求，表明该反应体系是可行的。本发明建立的针对CGMMVCPRNA的一步法实时定量RT-PCR标准曲线定量范围是从50拷贝到500000拷贝。曲线斜率均在-3.0-3.6之间，这表明所建立的标准曲线是可靠的。在实际检测定量过程中，可以根据未知样品的大体浓度范围，适当调整标准曲线的定量范围。7.—步实时定量RT-PC方法检测种子携带CGMMV以单粒西瓜种子总RNA为模板，应用本发明建立的一步实时定量RT-PC方法对未知浓度样品(本实验室保存的CGMMV侵染的西瓜种子标样)中CGMMVCPRNA进行了定量分析，扩增图和标准曲线见图5，图6。本次制备的标准曲线的样品拷贝数分别为200，500，5000，50000，500000，成功的进行了扩增，标准曲线的回归方程为y=-3.265x+38.464，r=0.991，建立的标准曲线符合实验要求，另外，经稀释的未知浓度的样品也全部落在了标准曲线范围内(见图6)，因此可直接通过标准曲线确定未知样品中CGMMVCPRNA的数量。本发明对10个种子标样进行了检测，根据Ct值(表3)可以看出IO个种子样品全部检测到CGMMVCPRNA，且含量较高，检出率为100%。但常规的RT-PCR仅检测到6个阳性样品，检出率为60%。这说明本发明建立的检测技术叫常规的RT-PCR灵敏。表3种子中CGMMVCPRNA的定量Ct值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>附录引物对CGMMV墨F:5，-CCAGACTCAAGCGGGAAGAG-3，CGMMV-R:5，-TCTACGACAGACGAGGGTAACG-3'探针CGMMV-T:5，-(FAM)TTCTTTCCGCGAGTCCCTGT(BHQ－l)-3,权利要求1.黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)的快速检测方法，采用一步实时定量RT-PCR反应，其特征在于靶基因为CGMMV分离物CP基因。2、根据权利要求1所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测方法，RT-PCR反应体系中的引物对和探针为引物对CGMMV-F:5，-CCAGACTCAAGCGGGAAGAG-3，CGMMV-R:5，-TCTACGACAGACGAGGGTAACG-3'探针CGMMV-T:5，-(FAM)TTCTTTCCGCGAGTCCCTGT(BHQ-1)-3，。3、根据权利要求2所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测方法，所述RT-PCR反应体系为:2倍反应缓冲液ExTaq聚合酶(5U4d)o牟预制反转录反应液0.4^1上游引物(lOpM)0.2^1下游引物(l(HiM)0.2^1探针(10^iM)0.2pl总RNA2(xl水6.6^1总体积20^14、根据权利要求3所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测方法，所述RT-PCR反应条件为42。C反转录5min;95。C变性5s;95。C10s，60°Clmin，45个循环。5、根据权利要求1所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测方法，所述黄瓜绿斑驳花叶病毒为西瓜种子携带的黄瓜绿斑驳花叶病毒。全文摘要本发明涉及“黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测方法”，属于生物技术工程领域。黄瓜绿斑驳花叶病毒的快速检测方法，采用一步实时定量RT-PCR反应，其特征在于靶基因为CGMMV分离物CP基因。同时本发明对RT-PCR的反应体系和条件作了优化。本发明方法快速，准确，可靠，对于防止种子病毒的进一步扩散，有很重要的意义。文档编号C12Q1/70GK101368217SQ20081022239公开日2009年2月18日申请日期2008年9月18日优先权日2008年9月18日发明者艳刘,周广和,珣张,莉李,王锡锋申请人:中国农业科学院植物保护研究所