一种利用⁶⁰Coγ射线辐照获得丁醇高产株的方法

专利名称：一种利用⁶⁰Coγ射线辐照获得丁醇高产株的方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种利用Co60Y射线辐照获得丁醇生产高 产株的方法。
背景技术：
丁醇作为一种重要的有机溶剂和化工原料，已广泛应用于化工、医药、食品、农用 化学品等领域，而近年的研究表明，丁醇与乙醇相似，可以和汽油混合用于清洁能源， 并具有能量密度高、腐蚀性小、对水的宽容度大等许多优于乙醇之处，因此丁醇的市场 前景广阔(柴国梁.国内丁醇市场分析(上).上海化工，2006, 31(2): 49-52， National Agricultural Bio- technology Council 19th Annual Meeting[EB/OL]. http:〃nabc19. sdstate.org/speaker.cfm lname=Ramey,2007-05)。
当前，丁醇工业的生产以石油资源为原料，采取化学法合成，此法受世界石油短缺 和价格飙升所限，显然不具有扩展优势，于是曾经一度兴盛而后遭受石油工业冲击并衰 退的丁醇发酵工业再度复苏，重新成为各国研究的焦点，原料已从单纯的粮食转变为农
产品生产、加工的废弃物，发酵方面也充分融合了现代生物工程技术的研究成果，总溶 剂和丁醇产率大大提高(Benoit Faucon.BP, ABF and DuPont to Build Biofuel Plant.Wall Street Journal (Eastern edition). New York, 2007-06-28(A9)
Thaddeus Chukwuemeka Ezeji,Nasib Qureshi，Hans Peter Blaschek. Bioproduction of butanol from biomass: from genes to bioreactors. Current Opinion in Biotechnology 2007， 18:1—8)。
2006年6月，美国杜邦公司和英国BP公司联合宣布建立合作伙伴关系，共同开发、生产 并向市场推出新一代生物燃料一生物丁醇，以满足全球日益增长的燃料需求，该生物丁 醇厂将于2009年投入运营(钱明.BP和杜邦加快生产生物丁醇.中国石化报，2007 —3 —14 ， (5) Benoit Faucon.BP, ABF and DuPont to Build Biofuel Plant.Wall Street Journal (Eastern edition) . New York, Jun 28,2007,A.)。
由于传统的丁醇发酵总溶剂浓度《2%，水分可达98%以上，而且丁醇在总溶剂中的 比例低， 一般只占60%，其余30%为丙酮，10%为乙醇，加大了后期丁醇回收、分离的 成本，这也是丁醇高成本的关键所在(靳孝庆，王桂兰，何冰芳.丙酮丁醇发酵的研究进 展及其高产策略.化工进展，2007， 26 (12) : 1727—1732)。因此，改良现有菌株，利 用现代的菌种选育技术，解除代谢过程中可能存在的产物或者中间产物的抑制，提高菌 种对丁醇的耐受性，强化丁醇生产中的关键酶，切断丙酮、乙醇的生成代谢，提高丁醇 在溶剂中的比例也成为广大学者研究的热点之一。
由于菌体本身受溶剂的影响很大，特别是丁醇的浓度，在发酵液中一般达到1.5% 时，即为致命的水平(丙酮的毒性较低， 一般菌能耐2.9%的浓度)，而溶剂产量的高低往
往与菌株对丁醇的耐力有关。因此，为减少生物丁醇生产中存在的低效价、低产量及低 产率等因素的制约，提高生物丁醇的市场竞争力，有必要改良菌种提高其生产效率。
目前采用的方法有传统诱变和筛选、重组DNA技术等，它们可以改变菌株的目标代谢 途径。诱导丙酮丁醇菌株突变的诱变剂有氢过氧化物、萘啶酮酸、2—甲基一5 —硝基一1 一咪唑基乙醇、甲基磺酸乙酯、N—甲基一N—硝基一N—亚硝基胍、紫外线辐射等，其中 以N—甲基一N —硝基一N —亚硝基胍的诱变效果最好(Thaddeus Chukwuemeka Ezeji，Nasib Qureshi,Hans Peter Blaschek. Bioproduction of butanol from biomass: from genes to bioreactors. Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-8)。在国外广为使用的以稳定性、超级淀粉水解能力及产丁醇特性著称的突变株 C. Z ej'乂en'/7ch7 5A W，就是在1991年由C 6eCarr'/ ch7 AOM9卵忍经N—甲基一N — 硝基一N—亚硝基胍诱变处理和葡萄糖类似物2—脱氧葡萄糖富集培养筛选而得。我国张 益荣等从土样中分离了多株能产生溶剂的梭菌，经多次单细胞分离、纯化，再经亚硝基 胍和甲基磺酸乙酯诱变和抗性筛选，获得一株高丁醇的丙酮丁醇梭菌 C7. aceto6"yh'c咖，丁醇产量为总溶剂的70% ，对温度可耐受到39 —40°C ，菌株性状稳 定(张益荣，陈军，杨蕴刘，焦瑞身.高丁醇比丙酮丁醇梭菌的选育与应用.工业微生物， 1996， 26 (4) : l—6)。北京化工大学采用自然分离、诱变、选育得到高丁醇比例菌种， 丁醇生产率达70 % ，淀粉转化率为25 % ，总溶剂生产达20 g/L ，指数均高于传统工业菌 种，且菌种的遗传性状稳定，可进行工业规模化连续发酵生产(赵引德，段学维.乙醇燃料企 业向生物精细化工延伸玉米发酵生产丁醇竞争优势明显.中国化工报,2007-6-5， (2))。
采用基因工程进行丁醇发酵菌种的改造也有了很多报道。2003年，Tummala等用反义 RNA技术试图增加C. flceto6w^/c謂824发酵产丁醇/丙酮的比例，发现用反义RNA下调丙 酮形成路径中的酶乙酰乙酸脱羧酶(AADC)和CoA转移酶(CoAT)，虽然CoAT基因下调 显著，丙酮产量有了实质性的下降，但碳流并没有改道合成丁醇，相反，合成的突变株 产丁醇水平大大下降。Tu咖ala等(Tu腿ala SB， Junne SG， P邻outsakis ET: Antisense RNA downregulation of coenzyme A transferase combined with alcohol-aldehyde deghydrogenase overexpression leads to predorminantly alchologenic C7o""W"/z scetoZwtj^'c咖fermentation. J Bacteriol 2003, 185:3644-3653.)用 反义RNA抑制ctfB (位于多顺反子aad-ctfA-ctffi上的CoAT的第二个基因)下调CoAT,试图通 过醇一醛脱氢酶(aad)基因的过表达提高发酵过程中丁醇/丙酮的比例，然而，合成的 突变株丁醇水平仍然显著下降，乙醇浓度却高于对照23倍。虽然对于丙酮丁醇梭菌在分 子生物学特性方面的研究取得了一些成就，但由于对丁醇产生缺乏整体规律性认识以及 溶剂生产菌特有生理学特性的了解，尚有很多难点未能突破，如外源DNA难于进入丙酮 丁醇菌内，没有合适的用于转导的克隆载体等。因此，应用重组DNA技术还远没有构造出 一株超高产丁醇的工业菌株。
原生质体诱变技术也是一种行之有效的育种方法，它是以原生质体为材料，采用物 理或化学诱变剂处理，经过再生培养，从而选育获得突变株的一门技术。(丁晓兵，李 宗伟，刘晓波等.原生质体诱变在工业微生物育种中的应用进展.食品工业科技，2008， 7: 260_262。施巧琴，吴松刚主编.工业微生物育种学.北京科学出版社，2003)而 60Co Y射线作为物理诱变剂中电离射线的一种，可引发生物基因突变和染色体畸变,是一 种得到高产目标菌株的有效手段。
目前还没有用60Co Y射线进行丁醇发酵菌株诱变育种的报道。

发明内容
本发明的主要目的是提供一种利用60C0Y射线辐照获得丁醇生产高产株的方法，采用 60C0Y射线辐照对丁醇生产菌细胞或其原生质体进行辐照，获得丁醇高产株。其工艺步骤 包括
1、 细胞悬液的制备
将斜面培养基上培养好的丁醇产生菌用无菌水洗下，显微镜计数调节细胞浓度为5 —
7 xl0 6个/mL。
所述丁醇产生菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、糖一醋丁基梭菌 (Clostridium saccharro-acetoburylicum)、费地浸麻梭状芽抱杆菌(Clfelsineum) 、 丁基 梭状芽孢杆菌(Cl.butylicum)。
2、 原生质体的制备
将培养好的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、糖一醋丁基梭菌 (Clostridium saccharro-acetoburylicum)、费地浸麻梭状芽抱杆菌(Clfelsineum) 、 丁基 梭状芽孢杆菌(Cl.butylicum)等丁醇产生菌在斜面培养基上进行活化，然后接种于完全 培养基，30 — 37。C静置培养18—24h，添加0. 1—0.3%甘氨酸和20-30u/ml青霉素处理 2 — 3h后3000 — 5000r/min离心5—10min，缓冲液洗涤菌体。收集处理后的菌体悬浮于 原生质体稳定液中，加入2-4mg/mL溶菌酶，37。C保温6-8h后终止酶解，3000_ 5000r/min，离心5-10min，收集原生质体。 所述的完全培养基是指
完全培养基(g/L);酵母浸粉3.0， 牛肉膏10.0，胰蛋白胨10.0，可溶性淀粉1.0， 葡萄糖5.0， L-半胱氨酸0.50， NaCI5.0， NaAc3.0，琼脂粉15, pH8.5。
3、60CoY射线辐照诱变
将制备的细胞悬液或原生质体悬浮于高渗缓冲液中，60CoY射线辐照，辐照剂量 100_1000 Gy，剂量率3—5Gy/min，诱变后稀释1(T3 1()-6涂布于完全培养基上，于30 一35'C黑暗条件下避光培养2—3d。
本发明所述高渗缓冲液的成份为0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液，0.8mol/L甘露醇。
4、 高产株的筛选
选取致死率在90%以上的辐照剂量辐照的菌株30—37。C有氧培养48—72h后测 定丁醇产量，筛选高产菌株。 本发明的有益效果
采用"C0Y射线辐照诱变操作简单，辐照原生质体正变率高，可显著提高菌株的丁
醇生产能力，降低丁醇生产成本。
具体实施例方式
本发明的目的是提供一种利用6°C0 Y射线辐照获得丁醇生产高产株的方法，采用 6。C0Y射线辐照对丁醇生产菌细胞或其原生质体进行辐照，获得丁醇高产株。采用6"C0Y 射线辐照诱变操作简单，辐照原生质体正变率高，可显著提高菌株的丁醇生产能力，降 低丁醇生产成本。
下面再举具体实施例对本发明予以进一步说明。
实例l:
1. 菌种
拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)
2. 培养基
完全培养基(g/L):酵母浸粉3.0，牛肉膏10.0，胰蛋白胨10.0，可溶性淀粉l.O，葡萄 糖5.0， L-半胱氨酸0.50， NaCI5.0， NaAc 3.0，琼脂粉15， pH8.5。 P2培养基(g/L):葡萄糖30.0，酵母粉l.O
P2营养液(g/L) : KH2P04 50.0, K2HP04 50.0， NH4C00H 220,对一氨基苯甲酸O. 10，硫 胺素O. 10， 0.001， MgS04. 7H20 20. 0， MnS04. H20 1.0， FeS04. 7H20 1.0， NaCI 1.0。过 滤灭菌。接种前将P2营养液以1X的比例加入P2合成培养基中。
玉米培养基(g/L):质量分数7%玉米醪培养基。称取过40目筛的玉米粉70g，加1L 自来水，煮沸50min后，补足挥发水分。
3. 细胞悬液的制备
将完全培养基斜面菌种用无菌水洗下制成菌悬液备用。
4. 诱变
菌悬液在钴源下分别接受100， 200， 400， 600， 800Gy剂量照射，剂量率 5Gy/min，辐照后稀释涂布于完全培养基平板，37'C培养48h。
5. 突变株的筛选
初筛挑取辐照剂量600Gy (致死率在90%以上)的菌落于完全培养基斜面，待菌 体繁殖后接种于玉米培养基，37。C培养72h后测定丁醇、丙酮、乙醇产量。
复筛初筛后的菌株在P2合成培养基中进行复筛，37'C培养72h后测定丁醇、丙 酮、乙醇产量。
6. 辐照结果
选育出的丁醇高产株总溶剂产量较出发菌株提高58. 84%, 丁醇产量提高56. 88%。 总溶剂产量和丁醇产量分别达到14. 82g/L和9. 57g/L。 实例2:
1. 菌种
拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)
2. 培养基和缓冲液
完全培养基、P2合成培养基、P2营养液、玉米培养基同实例一。
高渗再生培养基(g/L):葡萄糖40.0，胰蛋白胨6.0，酵母膏2.0，牛肉膏2.0，醋酸铵 3.0,蔗糖171.15， KH2PO40.5，中性红0.2, MgS04.7H20 0.2， FeS04.7H20 0.01，琼脂 20， pH6.2。
高渗缓冲液0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液中加入0.8mol/L甘露醇。原生质体稳定液 (SMM) (g/L):蔗糖0.5mo1， MgCl2.6H20 20 mmol/L,顺丁烯二酸0.02 mol， pH6.5。 原生质体稳定液(SMM) (g/L):蔗糖0.5mo1， MgCl2.6H20 20 mmol/L,顺丁烯二酸 0.02 mol， pH6.5。
3. 原生质体制备
菌种活化后接种于完全培养基，37'C静置培养一段时间，添加青霉素、甘氨酸处理 2h后4000r/min离心10min，缓冲液洗涤菌体。收集处理后的菌体悬浮于SMM中，加入 适量溶菌酶，37。C保温8h后终止酶解，3000r/min，离心lOmin，收集原生质体。
4. 原生质体的^CoY射线辐照诱变 原生质体高渗液在钴源下分别接受10， 50， 100， 200， 500Gy剂量照射，剂量率
5Gy/min，辐照后稀释涂布于再生平板，37'C培养72h。
5. 突变株的筛选
初筛挑取辐照剂量500 Gy (致死率在90%以上)的再生菌落于完全培养基中，待 菌体繁殖后接种于玉米培养基，37'C培养72h后测定丁醇、丙酮、乙醇产量。
复筛初筛后的菌株在P2合成培养基中进行复筛，37。C培养72h后测定丁醇、丙 酮、乙醇产量。
6. 辐照结果
选育出的丁醇高产株总溶剂产量较出发菌株提高81.46%， 丁醇产量提高85.41%。 总溶剂产量和丁醇产量分别达到16. 94g/L和11. 31g/L。
权利要求
1.一种利用60Co γ射线辐照获得丁醇生产高产株的方法，其特征在于，工艺步骤包括(1)细胞悬液的制备将斜面培养基上培养好的丁醇产生菌用无菌水洗下，显微镜计数调节细胞浓度为5-7×106个/mL；(2)原生质体的制备将斜面培养基上培养好的丁醇产生菌接种于完全培养基，30-37℃静置培养18-24h，添加0.1-0.3％甘氨酸和20-30u/ml青霉素处理2-3h后3000-5000r/min离心5-10min，缓冲液洗涤菌体；收集处理后的菌体悬浮于原生质体稳定液中，加入2-4mg/mL溶菌酶，30-37℃保温6-8h后终止酶解，3000-5000r/min，离心5-10min，收集原生质体；(3)60Co γ射线辐照诱变将制备的细胞悬液或原生质体悬浮于高渗缓冲液中，用60Co γ射线辐照，辐照剂量100-1000Gy，剂量率3-5Gy/min，诱变后稀释10-3～10-6涂布于完全培养基上，于30-35℃黑暗条件下避光培养2-3d；(4)高产株的筛选选取致死率在90％以上的辐照剂量辐照的菌株30-37℃有氧培养48-72h后测定丁醇产量，筛选高产菌株。
2、 按照权利要求l所述的方法，其特征在于所述丁醇产生菌为丙酮丁醇梭 菌C/oWnV//ww "c^o6w/>>//cmw、糖—醋丁基梭菌C7oWn'd/ww s"cc/ aro aceto6^7//0^、费地浸麻梭状芽孢杆菌C7./eto力eww或丁基梭状芽孢杆菌
3、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述完全培养基为 完全培养基g/L:酵母浸粉3.0,牛肉膏10.0，胰蛋白胨10.0，可溶性淀粉1.0，葡萄糖5.0, L-半胱氨酸0.50, NaCI5.0， NaAc 3.0，琼脂粉15, pH8.5。
4、 按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述高渗缓冲液的成份为0.1mol/LpH6.0磷酸缓冲液，0.8mol/L甘露醇。
全文摘要
一种利用⁶⁰Coγ射线辐照获得丁醇生产高产株的方法，属于生物化工技术领域。采用⁶⁰Coγ射线对丁醇生产菌细胞或其原生质体进行辐照，获得丁醇高产株。其优点在于，操作简单，辐照原生质体正变率高，可显著提高菌株的丁醇生产能力，降低丁醇生产成本。
文档编号C12P7/16GK101358187SQ200810223080
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月26日 优先权日2008年9月26日
发明者娅 刘, 刘宏娟, 周玉杰, 张建安, 程可可 申请人:清华大学