专利名称：单一菌种对木质纤维素水解产物的原位脱毒乙醇发酵方法
技术领域：
本发明涉及一种乙醇发酵方法，具体地说是一种釆用单一菌种对木 质纤维素水解产物的原位脱毒乙醇发酵方法，本发明还涉及用于乙醇发
酵的微生物新菌株，具体地说是一种树干毕赤酵母(尸/c/n'a S^7/to )新 菌株。
背景技术：
在以木质纤维素为原料生产乙醇的研究开发领域中，木质纤维素稀 酸水解被认为是最容易实现商业化的生产工艺[1]，国内外在该领域进行 了大量和深入的研究。但到目前为止，国内外在稀酸水解木质纤维素生 产燃料乙醇方面还存在着瓶颈问题，解决该技术瓶颈是要得到高效发酵 水解糖液中的木糖产乙醇并要高效代谢水解产物中的发酵抑制剂的菌 种。
能够进行木糖乙醇发酵的菌种较少，目前研究较为深入的尸/c/n力 s印他能发酵木糖且具有很高的乙醇产率P] ， Lohmder-Vogel等人研究 发现，P W^/fe对木质纤维素稀酸水解产物中的糠醛、羟甲基糠醛和乙 酸等抑制因子比较敏感[3]。只有少数酵母菌能耐受木质纤维素稀酸水解 产物中较高浓度的抑制因子，如&cc/zaram;;ces cemWw'ae TMB 3400 ， XcerevWae TMB 3006, Co"/oc/z從to //gm.aha NRRL30616等，但是它们 却不能代谢木糖产乙醇[4，5]。水解产物中的抑制因子会影响微生物的生长 和发酵能力，其中糠醛和5-羟甲基糠醛(5-HMF)是最为主要的抑制因 子[6]。发酵前通常要对水解液进行脱毒处理，这就需要添加处理设备， 并要使脱毒设备与发酵工艺很好整合，因而提高了整个乙醇发酵工艺的 复杂性并提高了生产的成本[7]。
为了对木质纤维素稀酸水解产物进行原位脱毒(即该发酵菌种在进 行乙醇发酵的同时能高效代谢发酵液中的毒性物质，不需进行任何额外 的脱毒处理，乙醇发酵就能高效进行的发酵过程)及葡萄糖和木糖的乙 醇发酵，本发明人通过大量篩选工作得到一种高效代谢葡萄糖和木糖产 乙醇并高效代谢抑制剂的菌株尸/c/z^劝)7/to Y7，发明人尝试使用该菌株 对木质纤维素稀酸水解产物进行原位脱毒乙醇发酵，以了解该菌对木质 纤维素稀酸水解产物进行葡萄糖和木糖原位脱毒的高效乙醇发酵，为进 一步应用提供基础数据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种树干毕赤酵母新菌株(尸/c/7/a Y7保藏号为CGMCC No.2661。
本发明的另一个目的在于提供该菌株在木质纤维素稀酸水解液的 原位脱毒乙醇发酵中的应用。
本发明中菌株是在长期的木质纤维素水解液实验过程中发现的，该 菌代谢旺盛，能够高效利用水解液中的葡萄糖和木糖，能够耐受高浓度 的抑制剂，是发酵技术流程的核心。该菌株已于2008年9月4曰在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京巿朝阳区大 屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101 )保藏，分类命名为树干 毕赤酵母(尸/c/2/a 'to )，保藏号为CGMCC No.2661 。
在实施例中，将本发明菌株在含有葡萄糖的YPD培养基中培养， 结果表明，乙醇的产率可达0.486 g/g糖，达到理论值的95.3%;在含 有木糖的YPD培养基中培养，结果表明，乙醇的产率可达0.42g/g糖， 达到理论值的83.2%。
在实施例中，将本发明菌株在含有糠醛抑制剂的YPD培养基中培 养，结果表明，4g/L的浓度对本发明菌株没有起到明显的抑制作用；在
在含有5-羟甲基糠醛的培养基中培养时，结果表明，该4g/L的浓度对
Y7的生长没有任何影响。进一步，将这两种抑制剂同时添加到YPD培 养基中，来考察其对本发明菌株的抑制作用，结果表明，YPD培养基中 加入3g/L糠醛和3g/L羟甲基糠醋时，Y7仅出现了 一个24h的生长延迟期。
在上述研究的基础上，将Y7种子液10ml接种于100ml未经任何脱 毒处理的稀酸水解液中，30 。C、 150rpm培养，测定乙醇、糖的浓度。木 质纤维素稀酸水解液中的葡萄糖36h利用完，木糖72h利用完，乙醇产 量为32.53g/L,乙醇产率为0.47g/g糖，达到理论值的92.4%。
Y7用于木质纤维素稀酸水解液的原位脱毒乙醇发酵的发酵条件是 25~35°C、 (0 300)rpm，发酵24~96小时；发酵培养基为木质纤维素 稀酸水解液，酵母膏适量(其他生长因子也可代替)，蛋白胨适量(其 他可利用氮源也可代替)，Ca (OH) 2调节pH为4.5~6.0。取10mLY7 种子液加入装有100mL水解液(加入酵母膏10g/L,蛋白胨10g/L， Ca (0H)2调节pH5.0)的三角瓶中，最佳发酵条件是150rpm， 3(TC培养， pH5.0-5.5。接种发酵时，种子液的活菌数宜在105-101()个/1111,接种量宜
在1~20% ( W/W )。
木质纤维素稀酸水解被认为是最容易实现商业化的生产工艺，但是
该水解工艺在产生可发酵糖的同时，还产生大量的对乙醇发酵微生物有 强抑制作用的抑制剂，所以水解液中的糖转化为乙醇的原位脱毒方法成 为该乙醇生产工艺的瓶颈。本发明用尸/c/w'a Y7对木质纤维素稀
酸水解液进行原位脱毒乙醇发酵，取得了很好的结果，解决了以木质纤 维素为原料生产乙醇的瓶颈问题。
本发明菌株能将木质纤维素稀酸水解液中的葡萄糖和木糖高效转 化为乙醇，达到乙醇最高理论值的92.4%,该结果在国内外还未见报道。
低乙醇生产成本。对木质纤维素乙醇生产的商业化具有重要的理论和实 际意义。
图1显示的是Y7对葡萄糖的乙醇发酵；
图2显示的是Y7对木糖的乙醇发酵；
图3显示的是Y7对葡萄糖和木糖混合糖的乙醇发酵；
图4显示的是Y7对耐糠醛的耐受；
图5显示的是Y7对5-羟甲基糠醛的耐受；
图6显示的是Y7对糠醛和5-羟甲基糠醛的耐受；
图7显示的是Y7对木质纤维素稀酸水解液的乙醇发酵。
具体实施例方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限 制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件 所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知 的常规手段。
实施例l Y7的分离鉴定
1筛选过程
由本实验室从酒精厂下水污泥中分离获得，在加有糠醛和羟甲基糠 醛的YPD液体培养基中进行富集培养，然后在含有木糖的固体平板上 涂布分离出单菌落，经大量筛选后发现，其中一株代谢旺盛，能够高效 利用水解液中的葡萄糖和木糖，能够耐受高浓度的抑制剂，将其命名为 Y7，最后进行斜面保藏。 2形态特征
菌落光滑，菌体圆球形，较小，以二分裂方式繁殖，不产生假丝。3培养特征
在液体培养基中培养一段时间后，菌液浑浊，无絮凝现象。 4代谢特征
能够快速利用木糖和葡萄糖产乙醇，同时能够耐受高浓度抑制剂。
实施例2 Y7对木质纤维素稀酸水解液的原位脱毒乙醇发酵的鉴定 1材料和方法
U菌种
菌种尸/c/z/a S争to Y7
1.2培养基(g/L)
YPD培养基葡萄糖20,酵母膏10,蛋白胨20, pH5.0~5.5。 发酵培养基酵母膏10,蛋白胨20。另外，根据不同的需要分别添
加葡萄糖,木糖(浓度以实际测定为准)pH5.0~5.5。
1.3木质纤维素稀酸水解液(g/L)
本研究所用木质纤维素稀酸水解液由华东理工大学提供，其中葡萄 糖为44.678,木糖24.35，糠醛1.37, 5-HMF0.47,乙酸IO， Ca(OH)2调节 水解液pH到5.0。 1.4菌种的培养
将菌种Y7接种于100mlYPD培养基中，30°C、 150rpm培养12h。 1.5乙醇发酵
Y7种子液(活菌数8x 1()8个/ml 9x 1。8个/ml) 10ml接种于100ml 发酵培养基以及100ml未经任何脱毒处理的稀酸水解液中，30 °C、 150rpm培养，测定乙醇、糖的浓度。 1.6耐抑制剂实验
YPD培养基中分别加入不同梯度的糠醛，羟甲基糠醛以及糠醛和羟 甲基糠醛的混合物(比例为1: 1),定时取样，样品经稀释测定菌液OD 值。
1.7分析方法
1.7.1糖浓度测定
高效液相色谱仪(Waters 2690 )测定糖浓度，色谱条件氨柱 (200x4.6mm)，柱温40。C， waters410示差检测器，流动相V(乙腈) V(水"80: 20,流速lmL/min,进样量20pL。 1.7.2乙醇含量测定
气相色谱仪(SP-3420)测定乙醇及糠醛和5-HMF的含量。乙醇测 定条件柱温8(TC，注射室温度15(TC,检测器温度50。C，进样量0.5pL。
2结果和讨论
2. 1葡萄糖、木糖、混合糖的发酵 2.1.1 Y7葡萄糖发酵特性
如图l所示，在含有24.86 g/L的葡萄糖培养基中，葡萄糖12h利用 完，最大乙醇产量为12.08g/L,乙醇产率为0.486 g/g糖，达到理论值的 95.3%。
2丄2 Y7木糖发酵特性
如图2 ,在含有23.81g/L木糖培养基中，木糖72h利用完，最大乙 醇产量为10.10g/L,乙醇产率为0.424 g/g糖，达到理论值的83.2%。
图1和图2可以看出，该菌能高效的代谢葡萄糖和木糖产乙醇，12 小时的葡萄糖乙醇发酵和72小时的木糖乙醇发酵达到了世界先进水平。 2丄3 Y7混合糖发酵特性
如图3,在含有16.29g/L葡萄糖8.15g/L木糖的混合糖培养基中,葡 萄糖12h利用完，木糖36h利用完，最大乙醇产量为11.36g/L,乙醇产 率为0.465 g/g糖，达到理论值的91.2%。
由图3可以看出，当葡萄糖和木糖同时存在时，葡萄糖促进了木糖
的转化，仅需48小时即可将木糖转化为乙醇。48小时完全转化木糖成
乙醇，在国内外还未及见报道。
2.2 Y7对抑制剂糠醛和5-羟甲基糠醛的耐受
在了解了该菌利用葡萄糖、木糖、混合糖产乙醇特性的基础上，进 一步阐明该菌乃抑制剂的能力，主要调查了该菌对糠醛和5-甲基糠醛的 降解能力。如图4所示，Y7在YPD培养基中，能够耐受的糠醛量达到 4g/L,但出现了 24h的延迟期，在3g/L时,延迟期仅为12h。
图5显示了在培养基中加入4g/L的5-羟甲基糠醛时，该抑制剂的 浓度对Y7的生长没有任何影响。
如图6所示,在YPD培养基中,同时加入4g/L糠醛和4g/L5-羟甲基糠 醛时，菌体生长受到了完全抑制，但在YPD培养基中加入3g/L糠醛和 3g/L羟甲基糠醛时，Y7仅出现了一个24h的生长延迟期。
2.3 Y7对木质纤维素稀酸水解液的原位脱毒乙醇发酵 在了解了该菌既能快速代谢葡萄糖和木糖产乙醇，又能高效代谢发
酵抑制剂的基础上，接着，以木质纤维素稀酸水解液为乙醇发酵底物， 阐明该菌代谢木质纤维素稀酸水解液中的葡萄糖和木糖及代谢其中的 发酵抑制剂的实际应用的特性。如图7所示，木质纤维素稀酸水解液中 的葡萄糖36h利用完，木糖72h利用完，乙醇产量为32.53g/L,乙醇产 率为0.471 g/g糖，达到理论值的92.4%。
实施例3 Y7对木质纤维素稀酸水解液的原位脱毒乙醇发酵
1种子液制备
在250mL三角瓶中加入100mL YPD液体培养基(葡萄糖20g/L,蛋白 胨20g/L,酵母膏10g/L),放入115t:灭菌锅中灭菌25分钟。挑取一 环单菌落接入三角瓶，150rpm，摇床30。C培养12小时。 2水解液的处理在水解液中加入蛋白胨(20g/L)，酵母膏(10g/L), Ca(OH)2调 节pH为5.0，放入115。C灭菌锅中灭菌25分钟。 3木质纤维素稀酸水解液发酵
取10mL Y7种子液(活菌数8 x 108个/ml ~9 x 108个/ml)加入装有 水解液的三角瓶中，150rpm，摇床30。C培养。 4分析方法 4. 1糖浓度测定
高效液相色谱仪(Waters 2690 )测定糖浓度，色谱条件氨柱 (200x4.6mm)，柱温4(TC， waters410示差检测器，流动相V(乙腈) V(水)-80: 20,流速lmL/min,进样量20pL。 4. 2乙醇含量测定
气相色谱仪(SP-3420)测定乙醇及糠醛和5-HMF的含量。乙醇测 定条件柱温80°C，注射室温度15(TC,检测器温度50 °C，进样量0.5pL。 5发酵结果
如图7所示，木质纤维素稀酸水解液中的葡萄糖36h利用完，木糖 72h利用完，乙醇产量为32.53g/L,乙醇产率为0.471 g/g糖，达到理论 值的92.4%。
参考文献 Tania I. Georgieva， Birgitte K. Ahring. Evaluation of continuous ethanol fermentation
of dilute-acid corn stover hydrolysate using thermophilic anaerobic bacterium
Thermoanaerobacter BG1L1 ， [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 77: 61—68. [2] du Preez JC, Prior BA. A quantitative screening of some xylose fermenting yeast
isolates[J]. Biotechnol Lett, 1985, 7: 241—248, [3] Lohmeier-Vogel,E.M， Sopher， et al. Intracellular acidification as mechanism for the
inhibition by Acid hydrolysis-derived inhibitors of xylose fermentation by yeasts.
Journal of Industrial Microbiology Biotechnology, 1998, 20: 75-80. [4] B她el Hahn-Hagerdal, Kaisa Karhumaa, C6sar Fonseca, etal. Industrial
pentose-fermenting yeast strains[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74:937-953. [5] Nancy N. Nichols, Bruce S. Dienr, Gema M. Guisaoo， etal. Bioabatement to Remove
Inhibitors from Biomass-Derived Sugar Hydrolysates[J]. Applied Biochemistry and
Biotechnology, 2005, 121-124: 379-390. [6] Michiel丄Boonstra, B"oke Tjeerdsma. Chemical analysis of heat treated softwoods.
Holz als Roh- und Werkstoff, 2006,64: 204-211. [7] Frank K Agbogbo， Kevin S. Wenger. Production of ethanol from corn stover
hemicellulose hydrolyzate using尸z'c/w" s印她[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2007,
34:723-727.
权利要求
1、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)Y7CGMCC No.2661。
2、 权利要求1所述的菌株在木质纤维素稀酸水解液的原位脱毒乙醇 发酵中的应用。
3、 一种木质纤维素稀酸水解液的原位脱毒乙醇发酵方法，其特征在 于使用权利要求1所述的菌株进行发酵。
4、 如权利要求3所述的方法，其特征在于将权利要求1所述的菌株 制成种子液，接种含木质纤维素稀酸水解液的发酵培养基，进行发酵， 发酵条件是25~35°C、 0 300rpm,发酵24~96小时；发酵培养基为 木质纤维素稀酸水解液，酵母膏适量，蛋白胨适量。
5、如权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵条件是3(TC、150rpm, 发酵72小时；发酵培养基为木质纤维素稀酸水解液，酵母膏10g/L,蛋 白胨20g/L。
6、如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，种子液的活菌数 为105-101()个/1111,接种量为1%~20%。
全文摘要
本发明提供了一种采用单一菌种对木质纤维素水解产物的原位脱毒乙醇发酵方法。为此，本发明首先提供了一种树干毕赤酵母(Pichia.Stipitis)新菌株Y7，保藏号为CGMCC No.2661，实验表明，该菌株能够对木质纤维素稀酸水解产物进行原位脱毒，其能将木质纤维素稀酸水解液中的葡萄糖和木糖高效转化为乙醇，达到乙醇最高理论值的92.4％。利用该菌株可以简化以木质纤维素为原料生产乙醇的工艺、降低乙醇生产成本，对木质纤维素乙醇生产的商业化具有重要的理论和实际意义。
文档编号C12N1/16GK101353629SQ20081022330
公开日2009年1月28日 申请日期2008年9月24日 优先权日2008年9月24日
发明者杨秀山 申请人:首都师范大学