专利名称：：母系遗传耳聋线粒体基因1494位c-t和1555位a-g突变的检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程
技术领域：
，具体讲是涉及母系遗传耳聋线粒体基因1494位C_T突变和1555位A—G突变的检测方法。本发明还涉及制备根据该方法的体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1494位C一T突变和1555位A—G突变的试剂盒，以及该试剂盒在检测所述的1494位C—T突变和1555位A—G突变中的应用。
背景技术：
：氨基糖甙类抗生素(链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素及小诺霉素等)因其广谱高效的抗菌作用以及低廉的价格在临床上被广泛用于控制革兰氏阴性和阳性菌感染，但此类抗生素具有严重的耳毒性作用，可使患者发生不可逆转的听力损失。近十年来研究发现，部分氨基糖甙类抗生素致聋患者有母系遗传家族史，并与线粒体DNA12SrRNA基因1494C一T和1555A—G均质性点突变有关。单次剂量的氨基糖甙类药物应用即可导致携带1494C一T或1555A—G突变个体的重度听力损失。根据目前已有的研究结果可知，几乎携带1494C一T或1555A—G突变的个体在应用不同剂量的氨基糖甙类抗生素后均可发生严重或者较严重的听力损失，是后天性获得性耳聋发生的重要原因。鉴于这一耳聋的有明确的基因变化和诱发因素，使得这种耳聋成为一种可以预防的疾病。1555位A—G突变和1494位C一T突变会在12SrRNA的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1494U-A1555碱基对。这些改变使得12SrRNA在二级结构上与细菌的16SrRNA的相应区域的二级结构更加相似，因此，由于1494C一T和1555A—G突变在12SrRNA形成U-A和G-C配对使线粒体与氨基糖甙类抗生素的结合更加容易，所以带有这些突变的人在接触了氨基糖甙类抗生素时会出现或加重耳聋。G-CC—(3，孕ctericWa16SriRNAuc』—W9Sin扭rnalloop*a气Al柳-"c"g.—l柳a—ulowerstemC—Gc—GAAA,AAanA"Ac--gAAACC■mitodhondrial12SrRNAi柳-ca—说smw—c-g^-j欲i槲+y-咩—i鄉WiMtypeMatent线粒体DNA1555位A—G突变较为为常见，发生率约为1~3%(Mkaouar-RebaiE等，BiochemBiophysResCommun2006，340:1251-1258;OStergaardE等，ClinGenet2002，62:303-305;UsamiS等，JMedGenet2000，37:38-40)，而线粒体DNA1494位C—T突变在中国耳聋人群中的发生频率为0.45%(李琦等，中国听力言语康复科学杂志，2008),考虑到尚有很多同类家系尚未被发现报道，以及1494C一T和1555A—G突变在散发性耳聋的致病机制中占有一定的比例，对这种耳聋的预防变得更为重要，其预防的关键环节在于通过筛查，检测发现携带线粒体1494C—T和1555A—G突变的个体，绝对禁止此类个体接触氨基糖甙类抗生素，从而避免严重的耳毒性反应发生。自1993年以来，对此突变的检测除了直接测序外，最常用的筛选方法为BsmA1(Alw261)酶切法(Fischel-Ghodsi等，AmJOtolaryngol,1993,14:399-403;Fischel-Ghodsian等,AmJOtolaryngol,1997b,18:173-178;袁慧军等，中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33:67-70)。在国内外，普遍应用限制性酶BsmAI(Alw261)酶切配合序列分析鉴定有无线粒体DNA1555A—G突变，酶切鉴定方便快捷，cuccf^^60B6结果可靠，但不足的是BsmAI(Alw261)价格较贵，与常用的限制性酶相比，价格差异达50-100倍。专利号为ZL03156762.2的专利公开了一种线粒体1555位A—G突变的检测方法及试剂盒，此专利通过在线粒体DNA的1555位邻近引入一个包括1555位在内的新的限制性酶位点，然后用相应的限制性酶消化，从而检测该突变的存在。此方法简单快捷而且成本低，但不能达到快速、准确、成本低并且同时检测1494C一T和1555A—G两个突变的要求。
发明内容本发明要解决的技术问题是针对现有技术中检测线粒体DNA的1494位C一T突变和1555A—G突变的方法所存在的缺陷，提供一种简单、快速、成本低并且同时检测两个突变位点的方法。本发明要解决的另一个的技术问题是提供一种根据上述方法的体外检测母系遗传耳聋缚粒体基因1494位C—T突变和1555位A—G突变的试剂盒。本发明要解决的再一个技术问题是该试剂盒在检测所述的1494位C—T突变和1555位A—G突变中的应用。为了解决本发明的上述技术问题，本发明采用如下技术方案本发明设计了两组特异性引物，各4条。利用所设计的4条引物，根据碱基配对原则，经PCR扩增和凝胶电泳，突变基因与正常基因扩增出不同的基因片段，从而检测1494C一T和1555A—G突变。其中，在第一组引物中引物1是线粒体的DNA核苷酸1026—1045，其序列为序列表中的SEQIDNO:l;引物2是线粒体的DNA核苷酸1513—1494，其序列为序列表中的SEQIDNO:2，其中1494位的G置换为A，1497位的G置换为C;引物3是线粒体的DNA核苷酸1536—1555，其序列为序列表中的SEQIDNO:3，其中1552位的G置换为C，1555位的A置换为G;引物4是线粒体的DNA核苷酸1761—1742，其序列为序列表中的SEQIDNO:4。将四条引物等比例加入同一体系对于1494位为C和1555位为A的线粒体DNA，引物1与引物4配对，扩增出一条736bp片段；对于1494位为T的线粒体DNA，弓|物1分别与引物2和引物4配对，扩增出三条片段488bp、736bp和一条错误引发片段；对于1555位为G的线粒体DNA，引物4分别与引物1和引物3配对，扩增出226bp和736bp两条片段，示意图见附图1。从而通过扩增出基因片段的不同检测出1494C一T和1555A—G突变。电泳图谱见附图2。在第二组引物中弓l物1是线粒体的DNA核苷酸1026—1045，其序列为序列表中的SEQIDN0:1;引物2是线粒体的DNA核苷酸1513—1494，其中其1497位的G置换为C，其序列为序列表中的SEQIDNO:5;引物3是线粒体的DNA核苷酸1536—1555，其中1552位的G置换为C其序列为序列表中的SEQIDNO:6;弓l物4是线粒体的DNA核苷酸1761—1742，其序列为序列表中的SEQIDNO:4。将四条引物等比例加入同一体系对于1494位为C和1555位为A的线粒体DNA，引物1与引物2配对，引物3与引物4配对，引物1与引物4配对，扩增出226bp、488bp和736bp三条片段；对于1494位为T的线粒体DNA，引物4分别与引物3和引物1配对，扩增出226bp和736bp两条片段；对于1555位为G的线粒体DNA，引物1分别与引物2和引物4配对，扩增出488bp和736bp两条片段。示意图见附图3。从而通过扩增出基因片段的不同检测出1494C一T和1555A—G突变。电泳图谱见附图4。PCR扩增，优选为Topch-downPCR扩增，因为Topch-downPCR每隔一个循环降低rc的反应退火温度，可以避免确定最佳退火温度的实验步骤，从而简化实验过程。凝胶电泳，优选为琼脂糖凝胶电泳。本发明采用的Touch-downPCR的扩增体系为10Xbuffer(含有15mMMg2+)2.Opl;IXdNTP0.5~4.0^il;引物1(lOpM)0.2~2.0|il;引物2'(10pM)0.2~2.0pl;引物3(lOpM)0.2~2.0pl;引物4(lOpM)0.2~2.(Hil;Taq酶(5U/|il)0.1~1.0pl;DNA模板20~400ng;加三蒸水至20W。本发明采用的Touch-downPCR的扩增体系优选为10Xbuffer(含有15mMMg2+)2.O^il;IXdNTP2.0pi;引物1(10pM)1.0引物2(lOpM)1.0jal;引物3(lOpM)1.0pi;引物4(lOpM)1.0pi;Taq酶(5，)0.5pi;DNA模板200ng;加三蒸水至20)al。本发明采用的Touch-downPCR的扩增条件为:95。C变性4~6分钟；94。C变性30~50秒，53。C退火3050秒，72。C延伸30~50秒，每个循环條低rC，共5个循环；接着94'C变性30~50秒，48'C退火30~50秒，72t:延伸3050秒，共25个循环；最后72。C延伸6~8分钟。本发明采用的Touch-downPCR的扩增条件优选为95t:变性5分钟；94。C变性40秒，53。C退火40秒，72'C延伸40秒，每个循环降低rc'，共5个循环；接着94。C变性40秒，48。C退火40秒，72。C延伸40秒，共25个循环；最后72'C延伸7分钟。本发明还根据本发明中设计的引物序列，通过人工合成(通过给定序列由自动化核酸合成仪合成)获得引物，并与提取血样DNA的试剂，包括dNTP、10XPCR缓冲液、Mg2+、三蒸水、Taq酶的PCR扩增反应试剂，两个阳性标本对照，一个阴性标本对照，一个空白对照以及使用说明书组合起来，提供了用于体外检测母系遗传耳聋线粒体基因1494位C一T突变和1555位A—G突变的试剂盒，其主要功能在于将所有试剂集成在一个小盒内，使得DNA提取、核酸片段扩增可以在试剂盒提供的试剂基础上顺序完成。优选的本发明的试剂盒内还含有两个阳性对照和阴性标本对照，两个阳性对照分别为1494C—T和1555A—G突变基因的人工合成产物，阴性标本对照为正常基因的人工合成产物。其中1494C一T阳性对照的序列为SEQIDNO:7，1555A—G阳性对照的序列为SEQIDNO:8，阴性对照的序列为SEQIDNO:9。本发明的试剂盒适用于大规模筛查或预防性检查线粒体基因1494C—T突变和1555A—G突变，禁止阳性结果者使用氨基糖甙类抗生素，从而避免严重的耳毒性反应发生。利用本发明的方法检测母系遗传耳聋线粒体基因1494C一T和1555A—G突变具有以下技术优势1.本发明具有方法简单，易于操作的特点。本发明通过对引物的设计，仅通过PCR扩增和凝胶电泳两个实验步骤，使正常基因和突变基因经过扩增产生不同的基因片段，从而检测突变位点。2.本发明可以同时检测到1494C一T和1555A—G两个突变位点，并且成本低，适用于在全国范围内对线粒体DNA的突变进行检测，从而避免氨基糖甙类药物性耳聋的发生。3.本发明的方法特异性强、灵敏度高。PCR过程中引物与模板DNA的结合及延伸都遵循碱基配对原则，而且我们选择的靶基因区具有很高的特异性和保守性，因此本发明的方法具有很强特异性。PCR产物的生成量以指数方式增加的，灵敏度很高，并且不需要纯度很高的标本。4.本发明的方法具有简单快速的优势。Touch-downPCR可避开确定最佳退火温度，使实验过程简化，从而快速准确的扩增到目的基因。图1:第一组引物设计示意图图2:第一组引物的电泳结果M为2000bpMarker，其中1、2、3、4为正常个体，其电泳条带为一条736bp的条带；5、6、7、8为线粒体DNA的1555A—G突变个体，其电泳条带为2条226bp和736bp;9、10、11、12为线粒体DNA的1494C一T突变个体，其电泳条带为三条488bp、736bp和一条错误引发条带。图3:第二组引物的设计示意图图4:第二组引物的电泳结果M为2000bpMarker，其中1为空白对照，2、3、4为正常个体，其电泳条带为226bp、488bp和736bp三条条带；5、6、7为线粒体DNA的1555A~G突变个体，其电泳条带为488bp和736bp两条条带；8、9、10为线粒体DNA的1494C—T突变个体，其电泳条带为226bp和736bp两条条带。图5:实施例1的家系1的系谱图图6:实施例1家系2的系谱图具体实施例方式下面的实施例用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。实施例1母系遗传耳聋家系线粒体基因1494C一T突变和1555A—G突变的检一.检测样本选择以母系遗传为传递特征的耳聋家系9个，总人数137人，受检者30人。使用上海华舜生物工程有限公司生产的柱离心式血液基因组DNA抽提试剂盒，从被检个体提取外周全血DNA作为检测样本，9个家系综合情况见表1，其中家系1和家系2的系谱图见图5和图6。其余家系的疾病传递方式均类似。二.引物设计使用GenetoolLite和primerpremier5.0程序协助设计引物，根据已公开的线粒体基因剑桥序列(CambridgeSequence),引物设计方案如下(1)序列SEQIDNO:2和序列SEQIDN0:3的3，端分别位于1494和1555位点；序列SEQIDNO:l是线粒体核苷酸1026—1045，序列SEQIDN0:4是线粒体核苷酸1761—1742;(2)序列SEQIDN0:2的1494位的G置换为A，序列SEQIDNO:3的1555位的A置换为G，目的是为了与突变的线粒体DNA在扩增时形成配对碱基。另外序列SEQIDNO:2的1497位的G置换为C，序列SEQIDNO:3的1552位的G置换为C，错配的碱基降低PCR反应时的退火温度，使得线粒体基因检测的目的得以实现。三.Touch-downPCR扩增反应根据上述设计的弓I物序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4，通过人工合成(通过给定序列由自动化序列合成仪合成)得到四条引物序列，并以提取的被测样本外周血DNA为模板，进行PCR扩增反应:10Xbuffer(含有15mMMg2+)2.0^1;1XdNTP2.0)Lll;引物IDNO:l(10nM)1,0^1;引物IDN0:2(10pM)1.0引物IDNO:3(10pM)1.0引物IDNO:4(10pM)1.0Taq酶(5U/jal)0.5DNA模板200ng;加三蒸水至20^1。反应条件95。C变性5分钟；94。C变性40秒，53。C退火40秒，72。C延伸40秒，每个循环降低rC，共5个循环；接着94。C变性40秒，48。C退火40秒，72'C延伸40秒，共25个循环；最后72"延伸7分钟。四.电泳用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物1.制胶称取0.8g琼脂糖粉，加入40ml1XTAE电泳缓冲液中配制成2%的琼脂糖，振荡混匀后，微波加热50秒，冷却至60。C左右加入2^il不含溴化乙锭的EB替代染料，混匀后倒入装配好的25孔制胶床内，室温下30min待琼脂糖完全凝固后小心拔出加样梳取胶备用。2.加样lpl6XLoadingBuffer与5plPCR产物混合，微量移液器吹打均匀后小心加入加样孔中，5(alDL2000作为DNA标准分子量(Marker)同时加样。每次加样均同时加入阳性对照和阴性对照标本以判断PCR扩增效果。3.电泳将上好样的凝胶小心放入DYY-6C型电泳仪中，以110V电压、100mA电流进行电泳，电泳时间均为25min。4.扫描电泳结束后，将凝胶置于电泳成像分析仪中进行图像扫描。五.检测结果如表1所示，在总共9个家系中，6个家系14个耳聋患者的PCR扩增产物出现226bp和736bp两条条带，表明其存在mtDNA1555A—G突变。2个家系的14个耳聋患者的PCR扩增产物出现488bp、736bp和一条错误引发条带，表明其存在mtDNA1494A—G突变。还有1个家系的4个成员的PCR扩增产物仅出现一条736bp的条带，表明其不存在mtDNA1494C"T和1555A—G突变。六.可靠性检验所有被检测个体的1494位点和1555位点均经过直接测序检测，结果与上述方法检测结果完全一致，说明使用本发明方法检测1494C—T和1555A—G突变的可靠性和稳定性。_表1母系遗传家系情况及线粒体1494位点和1555位点检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>实施例二应用体外检测试剂盒检测母系遗传耳聋线粒体基因1494C一T突变和1555A—G突变一.试剂盒组成1.提取血样DNA的试剂；2.PCR试剂10mMdNTP0.5ml;IOXPCR缓冲液(含有15mMMg2+)lml;5U/|ilTaq酶2500ju四种10pM引物各1ml3.四种引物的核苷酸序列为-引物IDNO:1AAGTGGCTTTAACATATCTG引物IDNO:2TTGAAGTATACTTGAGCAGA弓I物IDNO:3ACGCATTTATATAGAGCAGG弓I物IDNO:4TCAATTTCTATCGCCTATAC4.阳性对照标本10(^1，阴性对照标本lOOpl其中两个阳性对照分别为线粒体DNA的1494C一T和1555A—G突变基因的PCR扩增产物，阴性标本对照为正常基因的PCR扩增产物。5.使用说明书二.检测对象选择家系1(系谱图见图5)和家系2(系谱图见图6)，本实施例各选取两家系中四名患者为受检对象。三.检测方法和结果按照本试剂盒的使用说明书1.反应体系为1Oxbuffer(含有15mMMg2+)2.Opl;lxdNTP2.0jil;引物IDNO:l(lOpM)1.0|nl;引物IDNO:2(10pM)LOjil;引物IDNO:3(lOpM)1.0pi;引物IDNO:4(10pM)1.0pi;Taq酶(5U1)0.5jil;15DNA模板200ng;加三蒸水至20y。2.TouchdownPCR反应条件95。C变性5分钟；94。C变性40秒，53'C退火40秒，72。C延伸40秒，每个循环降低rc，共5个循环；接着94。C变性40秒，48。C退火40秒，72。C延伸40秒，共25个循环；最后72'C延伸7分钟。按同样的PCR反应条件，用试剂盒内提供的1494C一T和1555A—G阳性模板和阴性模板同时作阳性和阴性对照PCR反应，并设立无模板PCR空白对照管。3.反应结果反应后用2%琼脂糖凝胶电泳检査扩增产物，1494C一T阳性对照扩增出488bp、736bp和一条错误引发条带，1555A—G阳性对照扩增出226bp和736bp条带，阴性对照扩增出736bp条带，空白对照没有扩增条带，受检标本结果与测序结果完全一致。应用体外检测试剂盒检测母系遗传耳聋线粒体基因1494C一T突变和1555A—G突变一.试剂盒组成1.提取血样DNA的试剂；2.PCR试剂10mMdNTP0.5ml;10XPCR缓冲液(含有15mMMg2+)lml;5U/plTaq酶2500ju四种10|LiM引物各lml6.四种引物的核苷酸序列为引物IDNO:1AAGTGGCTTTAACATATCTG引物IDNO:5TTGAAGTATACTTGAGCAGG引物IDNO:6ACGCATTTATATAGAGCAGA引物IDNO:4TCAATTTCTATCGCCTATAC7.阳性对照标本100W，阴性对照标本100H1其中两个阳性对照分别为线粒体DNA的1494C—T和1555A—G突变基因的人工合成产物，阴性标本对照为正常基因的人工合成产物。8.使用说明书二.检测对象选择家系1(系谱图见图5)和家系2(系谱图见图6)，本实施例各选取两家系中三名患者为受检对象。三.检测方法和结果按照本试剂盒的使用说明书3.反应体系为10Xbuffer(含有15mMMg2+)2.0pl;IXdNTP2.0pi;引物IDN0:1(lOpM)l.Opl;引物IDNO:5(lOpM)l.Ojul;引物IDNO:6(10|iM)1,0jil;引物IDNO:4(lOpiM)1.0pi;Taq酶(5U/V1)0.5DNA模板200ng;加三蒸水至20pl。4.TouchdownPCR反应条件95。C变性5分钟；94。C变性40秒，53。C退火40秒，72。C延伸40秒，每个循环降低rc，共5个循环；接着94。C变性40秒，48t:退火40秒，72。C延伸40秒，共25个循环；最后72'C延伸7分钟。按同样的PCR反应条件，用试剂盒内提供的1494C一T和1555A—G阳性模板和阴性模板同时作阳性和阴性对照PCR反应，并设立无模板PCR空白对照管。3.反应结果反应后用2%琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物，1494C一T阳性对照扩增出226bp和736bp条带，1555A—G阳性对照扩增出488bp和736bp条带，阴性对照扩增出226bp、488bp和736bp条带，空白对照没有扩增条带，受检标本结果与测序结果完全一致。<no>董大光<120>母系遗传耳聋线粒体基因1494位C一T和1555位A—G突变的检测方法及其试剂盒<160>:力<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1AAGTGGCTTTAACATATCTG<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2TTGAAGTATACTTGAGCAGA<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ACGCATTTATATAGAGCAGG<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4TCAATTTCTATCGCCTATAC<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5TTGAAGTATACTTGAGCAGG<210>6<21]>20<212>DNA<213>人工序列<400>6ACGCATTTATATAGAGCAGA<210>7<211>736<212>DNA<213>人工序列<400>7aagtggctttaacatatctgaacacacaatagctaagacccaaactggga50ttagataccccactatgcttagccctaaacctcaacagttaaatcaacaa100aactgctcgccagaacactacgagccacagcttaaaactcaaaggacctg150gcggtgcttcatatccctctagaggagcctgttctgtaatcgataaaccc200cgatcaacctcaccacctcttgctcagcctatataccgccatcttcagca250aaccctgatgaaggctacaaagtaagcgcaagtacccacgtaaagacgtt300aggtcaaggtgtagcccatgaggtggcaagaaatgggctacattttctac350cccagaaaactacgatagcccttatgaaacttaagggtcgaaggtggatt400tagcagtaaactaagagtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgc450gtacacaccgcccgtcactctcctcaagtatacttcaaaggacatttaac500taaaacccctacgcatttatatagaggagacaagtcgtaacatggtaagt550gtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagca600cccaacttacacttaggagatttcaacttaacttgaccgctctgagctaa650acctagccccaaacccactccaccttactaccagacaaccttagccaaac700catttacccaaataaagtataggcgatagaaattga736<210>8<211>736<212>DNA<213>人工序列<400>8aagtggctttaacatatctgaacacacaatagctaagacccaaactggga50ttagataccccactatgcttagccctaaacctcaacagttaaatcaacaa訓aactgctcgccagaacactacgagccacagcttaaaactcaaaggacctg150gcggtgcttcatatccctctagaggagcctgttctgtaatcgataaaccc200cgatcaacctcaccacctcttgctcagcctatataccgccatcttcagca250aaccctgatgaaggctacaaagtaagcgcaagtacccacgtaaagacgtt300aggtcaaggtgtagcccatgaggtggcaagaaatgggctacattttctac350cccagaaaactacgatagcccttatgaaacttaagggtcgaaggtggatt400tagcagtaaactaagagtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgc450gtacacaccgcccgtcaccctcctcaagtatacttcaaaggacatttaac500taaaacccctacgcatttatatagaggaggcaagtcgtaacatggtaagt550gtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagca600cccaacttacacttaggagatttcaacttaacttgaccgctctgagctaa650acctagccccaaacccactcC3ccttoctaccagacaaccttagccaaac了OOcatttacccaaataaagtataggcgatagaaattga736<210>9<211>736<212>DNA<213>人工序列<400〉9aagtggctttaacatatctgaacacacaatagctaagacccaaactggga50ttagataccccactatgcttagccctaaacctcaacagttaaatcaacaa100aactgctcgccagaacactacgagccacagcttaaaactcaaaggacctg150gcggtgcttcatatccctctagaggagcctgttctgtaatcgataaaccc200cgatcaacctcaccacctcttgctcagcctatataccgccatcttcagca250aaccctgatgaaggctacaaagtaagcgcaagtacccacgtaaagacgtt300aggtcaaggtgtagcccatgaggtggcaagaaatgggctacattttctac350cccagaaaactacgatagcccttatgaaacttaagggtcgaaggtggatt400tagcagtaaactaagagtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgc450gtacacaccgcccgtcaccctcctcaagtatacttcaaaggacatttaac500taaaacccctacgcatttatatagaggagacaagtcgtaacatggtaagt550gtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagca600cccaacttacacttaggagatttcaacttaacttgaccgctctgagctaa650acctagccccaaacccactccaccttactaccagacaaccttagccaaac700catttacccaaataaagtataggcgatagaaattga73权利要求1.一种母系遗传耳聋线粒体基因1494C-T和1555A-G突变的检测方法，其特征在于所述方法设计了四条特异性引物，经PCR扩增和凝胶电泳，突变基因与正常基因扩增出不同的基因片段，从而检测1494C-T和1555A-G突变。2.根据权利要求1所述的母系遗传耳聋线粒体基因1494C~T和1555A—G突变的检测方法，其特征在于所述的四条引物的核苷酸序列如下引物1的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO:l;引物2的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO:2;引物3的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNOJ;引物4的核苷酸序列为序列表中的SEQIDN0:4。3.根据权利要求2所述的母系遗传耳聋线粒体基因1494C一T和1555A—G突变的检测方法，其特征在于以正常线粒体DNA为模板扩增出一条736bp片段；以1494位为T的线粒体DNA为模板扩增出三条片段488bp、736bp和一条错误引发片段；以1555位为G的线粒体DNA为模板扩增出226bp和736bp两条片段，从而检测出1494C一T和1555A—G突变。4.根据权利要求1所述的母系遗传耳聋线粒体基因1494C—T和1555A—G突变的检测方法，其特征在于所述的四条引物的核苷酸序列如下弓l物1的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO:l;引物2的核苷酸序列为序列表中的SEQIDN0:5;引物3的核苷酸序列为序列表中的SEQIDN0:6;引物4的核苷酸序列为序列表中的SEQIDN0:4。5.根据权利要求4所述的母系遗传耳聋线粒体基因1494C一T和1555A—G突变的检测方法，其特征在于以正常线粒体DNA为模板扩增出226bp、488bp和736bp三条片段；对于1494位为T的线粒体DNA为模板扩增出226bp和736bp两条片段；对于1555位为G的线粒体DNA为模板扩增出488bp和736bp两条片段。6.根据权利要求3或5所述的母系遗传耳聋线粒体基因1494C一T和1555A~G突变的检测方法，其特征在于，所述的PCR扩增为Touch-downPCR扩增，所述的凝胶电泳为琼脂糖凝胶电泳。7.根据权利宴求6所述的母系遗传耳聋线粒体基因1494C—T和1555A—G突变的检测方法，其特征在于Touch-downPCR的扩增体系为10Xbuffer(含有15mMMg2+)2.0^1;IXdNTP0.54.0jli1;引物1(10pM)0.2~2.0|il;引物2(10pM)0.22.0|ul;引物3(lOjiM)0.2~2.(V1;引物4(10pM)0.2~2.(Hil;Taq酶(5U/|il)0.1~1.0|il;DNA模板20~400ng;加三蒸水至20nl。8.根据权利要求7所述的母系遗传耳聋线粒体基因1494C一T和1555A—G突变的检测方法，其特征在于Touch-downPCR的扩增条件为95。C变性46分钟；94。C变性30~50秒，53""C退火3050秒，72"C延伸3050秒，每个循环降低1°C，共5个循环；接着9fC变性30-50秒，48。C退火30~50秒，72。C延伸30~50秒，共25个循环；最后72'C延伸68分钟。9.一种用于体外检测权利要求1所述的母系遗传耳聋线粒体基因1494C~~T和1555A—G突变的试剂盒，其特征在于该试剂盒中含有(1)提取血样DNA的试剂；(2)PCR扩增反应试剂，包括dNTP、IOXPCR缓冲液、Mg2+、三蒸水、Taq酶；(3傳比例混合的一组引物；(4)阳性标本对照；(5)阴性标本对照；(6)空白对照；(7)使用说明书。10.根据权利要求9所述的体外检测试剂盒，其特征在于所述的四条引物的核苷酸序列如下弓l物1的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO:l;引物2的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO:2;弓l物3的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO:3;引物4的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO:4。11.根据权利要求9所述的体外检测试剂盒，其特征在于所述的四条引物的核苷酸序列如下引物1的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO:l;引物2的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO:5;引物3的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO:6;引物4的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO:4。12.根据权利要求9所述的体外检测试剂盒，其特征在于有两个阳性标本对照，分别为1494C一T和1555A—G突变基因的人工合成序列，阴性标本对照为正常基因的人工合成序列。13.根据权利要求812之任一项所述的体外检测试剂盒在检测线粒体基因1494C一T和1555A—G突变的应用。全文摘要本发明涉及母系遗传耳聋线粒体基因1494C-T和1555A-G突变的检测方法。该方法设计改良引物，通过Touch-downPCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，检测1494C-T和1555A-G突变。该方法简单，成本低，检测结果直接、可靠，适用于对母系遗传耳聋线粒体基因1494C-T和1555A-G突变的大规模筛查或预防性检查。文档编号C12N15/11GK101684498SQ20081022341公开日2010年3月31日申请日期2008年9月27日优先权日2008年9月27日发明者董大光申请人:董大光