专利名称：：一种新的抗蛋白酶的酸性α-半乳糖苷酶AGA36及其基因和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新a-半乳糖苷酶八6八36及其基因、包含该基因的重组载体和应用。
背景技术：
：a-半乳糖苷酶(a-galactosidase，EC3.2.1.22)即蜜二糖酶，属于外切糖苷酶类，能够专一性催化糖链非还原末端a-半乳糖苷键的水解，它不仅能够水解含a-半乳糖苷键的寡糖，而且还能够催化含该键的多糖。棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖是豆类植物中广泛存在的低聚寡糖，在a-半乳糖苷酶的作用下，这些寡糖可以被分解为D-半乳糖和其他相应的单糖和寡糖。豆粕是非常优秀的植物性蛋白质饲料原料，一般在日粮中的用量为2530%。但在豆粕中含有56%的单胃动物不能消化的a-半乳糖苷类的低聚寡糖，如棉子糖、水苏糖等，这些寡糖一方面会引起动物的肠胃胀气疾病，另一方面会增加食糜的粘度，从而降低了动物对营养物质的消化与吸收。而在豆科饲料中添加a-半乳糖苷酶能够增加饲料中低聚寡糖的消化，减少此类低聚寡糖的抗营养作用，减轻或消除单胃动物的消化紊乱，从而提高饲料中营养物质的利用率和代谢能(GhaziS，etal.BritishPoultryScience.44(3):410-418)。在制糖工业中，由于甜菜中棉子糖的存在，造成糖蜜粘度增加而阻碍蔗糖结晶析出，以致产生大量的废糖蜜，使糖产量降低。应用a-半乳糖苷酶处理废糖蜜能将阻碍蔗糖结晶的棉子糖清除，在分解一分子棉子糖的同时，还产生一分子的蔗糖，因而提高蔗糖的得率(GanterC.，etal.JournalofBiotechnology.8(4):301-310)。同时酶法制糖可使蔗糖的粒状结晶的均匀性、色泽和纯度得到改善。在大豆及其制品中，含有1%的棉子糖、4%的水苏糖和微量的毛蕊花糖。这些寡糖阻碍人类对豆类的消化吸收，能够产生胀气等疾病，而人胃肠道不分泌a-半乳糖苷酶，因此在豆制品中加入a-半乳糖苷酶，可以分解这些寡糖，增加人类对豆类营养的吸收(PrashanthSJandMulimaniVH.，ProcessBiochemistry.40:1199-1205)。a-半乳糖苷酶广泛存在于微生物、植物、动物和人体内。在微生物中，细菌、放线菌、丝状真菌、酵母等都能合成a-半乳糖苷酶。目前，已分离筛选出许多产a-半乳糖苷酶的微生物，如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、青霉、红曲霉、米曲霉、黑曲霉、焦曲霉、泡盛曲霉、葡酒色被包霉、毛霉、根霉、黄曲霉、啤酒酵母等等。微生物a-半乳糖苷酶有较高的产量，特别是丝状真菌，每升培养基可以分泌30g蛋白质，它们产生的a-半乳糖苷酶可以分泌到胞外、具有合适的酸碱度和良好的稳定性从而最有利于技术应用(denHerderI.F.，etal.Mol.Gen.Genet.233,404-410)。因此产a_半乳糖苷酶的真菌受到越来越广泛的关注。由于a-半乳糖苷酶在食品及饲料工业或某些医药领域的应用中，需要具备化学试剂抗性、蛋白酶抗性以加强其应用效果。且在应用过程中，该酶常与包括蛋白酶在内的各种酶混合使用，酶的蛋白酶抗性尤显重要。含有a-半乳糖苷键的寡糖和多聚糖包括多种，而以前报道的a-半乳糖苷酶其底物特异性不能水解多种底物，在应用上各具有其局限性。本发明公开了一个新的a-半乳糖苷酶基因，其编码的a-半乳糖苷酶具有适宜的作用PH值，较强的金属离子和表面活性剂抗性，较强的蛋白酶抗性和较好的水解各种底物的能力，可作为一种新型饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。
发明内容本发明的目的之一是提供一种根霉。本发明的目的之一是提供一种a-半乳糖苷酶AGA36。本发明的再一目的是提供编码上述a-半乳糖苷酶AGA36的基因。本发明的再一目的是提供包含上述a-半乳糖苷酶AGA36的重组酶。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。本发明的另一目的是提供一种制备上述a-半乳糖苷酶AGA36的基因工程方法。本发明的另一目的提供上述a-半乳糖苷酶AGA36的应用。本发明提供了一种根霉AG708(Rhizopus.sp.AG708)，于2008年9月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCCNo.2675。本发明了提供一种a-半乳糖苷酶AGA36，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明的还提供了编码上述a-半乳糖苷酶的基因aga36，其碱基序列如SEQIDNO.2所示。本发明还提供了包含上述a-半乳糖苷酶AGA36的重组酶。本发明还提供了包含a-半乳糖苷酶基因aga36的重组载体。本发明还提供了包含上述a-半乳糖苷酶基因aga36的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。本发明还提供了一种制备a_半乳糖苷酶八6八36的方法，其特征在于，包括以下步骤1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组a-半乳糖苷酶表达；以及3)回收并纯化所表达的a-半乳糖苷酶AGA36。本发明还提供了a-半乳糖苷酶AGA36的应用。相较于目前报道或用于生产的a-半乳糖苷酶，该酶具有适宜的作用pH值，抗多种金属离子和表面活性剂，较强的蛋白酶抗性和优良的水解各种底物的能力，可作为一种饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。根霉AG708(Rhizopus.sp.AG708)，于2008年9月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCCNo.2675。图1重组a-半乳糖苷酶的SDS-PAGE分析，M:低分子量蛋白质Marker;1:未诱导对照，对照空载体pET-22b(+)转化E.coliBL21诱导后的CTP;2:载体pET-22b(+)/aga36转化E.coliBL21诱导后的CTP;3:纯化的a-半乳糖苷酶AGA36。图2显示a-半乳糖苷酶AGA36的最适pH。图3显示a-半乳糖苷酶AGA36pH稳定性。图4显示a-半乳糖苷酶AGA36作用的最适温度。图5显示a-半乳糖苷酶AGA36的热稳定性。图6显示a-半乳糖苷酶AGA36的蛋白酶抗性分析。具体实施方式实验条件1、菌株及载体根霉AG708(Rhizopus.sp.AG708)由发明人筛选，宿主大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)，载体pET-22b(+)均购自于Invitrogen公司。2、酶类及其他生化试剂内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。胰蛋白酶(Trypsin)、a-糜蛋白酶(a-Chymotrypsin)、蛋白酶K(ProteinaseK)、枯草杆菌蛋白酶A(SubtilisinA)、胶原蛋白酶(Collagenase)为Sigma(USA)产品；蛋白酶proleather为AmanoEnzymeInc.(Japan)产品，减性蛋白酶(Alkalin印rotease)来源于BacilluspumilusSMJ-P;IPTG为Promega公司产品；蜜二糖、棉子糖、水苏糖、角豆胶和牛血清白蛋白为Sigma(USA)产品；其它都为国产试剂。3、培养基青霉培养基为马铃薯汁培养基1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂。诱导产酶培养基(0.4%K2HP04，0.28%(wt/vol)(NH4)2S04，0.12%(wt/vol)CaCl2，0.12%(wt/vol)尿素，O.12%(wt/vol)MgS04，0.02%(wt/vol)甘露糖，0.02%(wt/vol)酵母提取物和3%(wt/vol)豆粕)。大肠杆菌培养基为LB(1X蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0)。说明本发明中所用到重组遗传学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中未作详细介绍的技术，均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分来进行，包括Sambrook等人，MolecularCloning,ALaboratoryManual(第3片反.2001);Kriegler，GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual(1990);禾口CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等人编，1994)。实施例1分离根霉AG708(Rhizopus.sp.AG708)及其产酶特性菌株根霉AG708(Rhizopus.sp.AG708)在PDA培养基上生长3-5天后，根据丝状真菌18SrDNA的保守序列设计的引物对菌株的18SrDNA进行PCR扩增，测序结果与Genbank数据库中的核苷酸序列比对，发现AG708的18srDNA核苷酸序列与Rhizopus.oryzaeCBS278.38(GenbankaccessionNo.AB250174)据有最高的相似性为99%，与R.stolonifer(GenbankaccessionNo.DQ536474)禾口R.caespitosusCBS427.87(GenbankaccessionNo.AB250168)的相似性为97%，由此可证明该菌株为根霉，将其命名为Rhizopus.sp.AG708。将豆粕作为诱导物和碳源加入产酶培养基中(4%K2HP04，0.28%(NH4)2S04，0.12%CaCl2，0.12%Urea，O.12%MgS04，0.02%Mannanose，0.02%Yeastextract,3%的豆粕为碳源)，30°C、250rpm摇振培养5天后，将菌液离心，取上清测酶活。结果108h(约4.5天)后在含有豆粕的培养基中AG708表现出较高的约0.2U/mL(以pNPG为底物)的a-半乳糖苷酶活。实施例2根霉菌a-半乳糖苷酶编码基因aga36的克隆提取根霉菌(Rhizopus.sp.AG708)基因组DNA:取30。C培养7天后的根霉菌液6000rpm离心10min。取lOOmg菌丝体加500yL无菌水清洗，离心取沉淀。沉淀重悬于500iiL提取液混合液，于37t:温育60min，10000rpm离心lOmin去沉淀。上清液用等体积酚、酚氯仿、氯仿依次抽提。取上层溶液加0.6-l倍体积的异丙醇常温沉淀10min。12000rpm离心15min。沉淀用70%乙醇清洗，稍离心，将沉淀烘干后用30yL无菌水溶解，备用。根据发表的a_半乳糖苷酶的保守序列设计合成了简并引物Pl:5，-TYGTBMTKGAYGAYGGYTGG-3'和P2:5，-GACCATYTCNGGYTCNAMCC-3'，以根霉菌AG708总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为94t:变性3min后冷却至4°C;然后94。C变性30sec，5(TC退火30sec，72t:延伸lmin，32个循环后72"保温10min。得到一片段测序。根据测序得到的核苷酸序列设计Tail-PCR引物，进行PCR扩增。获得片段上下游序列后进行测序，拼接得到全长基因序列。进一步进行a-半乳糖苷酶基因的RT-PCR分析。提取菌丝体的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的一条链，然后设计并利用引物aga36up:5'-AATAATGAAACTACTTCAAATTGGTATTTCTC-3，；禾Paga36down:5'-CTTCATATTTATTTCGGAATAAAATAATC-3，，扩增获得a_半乳糖苷酶基因aga36的完整cDNA序列。结果表明，该基因为一个长2175bp的基因片段(SEQIDN0.2)，编码724个氨基酸和一个终止密码子。其与已发现的伞枝梨头霉(Absidiacorymbifera)的ct-半乳糖苷酶(GenbankaccessionNo.AAF68953)存在最高的相似性为45%，与阿维氏链霉菌(Str印tomycesavermitilisMA-4680)的a-半乳糖苷酶(GenbankaccessionNo.NP_822257)的相似性为37%，为一个新基因。实施例3a-半乳糖苷酶的活性分析。酶活性测定方法采用pNPG法。将pNPG溶于0.lmol/LMcllvaine缓冲液中，使其终浓度为2mmol/L。将20iiL酶液，230iiL的Mcllvaine缓冲液禾口250iiL2mM的pNPG混合，摇匀。37。C温育5min后，反应液中加入1.5mL1M的Na2C03溶液来终止反应。在405nm处测其0D值，以对硝基酚(pNP)的生成量表示酶活力。对照管加酶液和缓冲液后，先加化20)3溶液再加pNPG溶液。酶活(U/mL)单位定义在37。C下每分钟分解pNPG释放1ymolpNP需的酶量被定义为一个酶活单位。实施例4制备含有a-半乳糖苷酶编码基因aga36的重组酶根据测序结果设计引物AG3:5'-CCCGAATTCATGAAACTACTTCAAATTGGTATTTCTC-3'、AG42:5'-ATAGCGGCCGCTCTACCTTCTATAGCTTTCGTCAACAGGAC-3'，在引物的末端分别引入内切酶EcoRI和NotI酶切位点，进行PCR扩增。质粒pET22b(+)和基因片断进行双酶切后连接形成载体pET22b(+)/aga36，制备BL21(DH3)感受态细胞，将重组质粒pET22b(+)/aga36电击转化宿主菌。鉴定阳性重组子，并诱导检测酶活。取含有重组体质粒的BL21(DE3)菌株和含有pET-22b(+)-lic空质粒的BL21(DE3)菌株(作对照)，分别接种于3mLLB(加有100yg/mL的氨苄青霉素)培养液中，37t:快速振荡培养过夜。分别取100iiL过夜培养液加入含100iig/mL氨苄青霉素的10mLLB培养液(1%接种量)中，37。C振荡培养约2_3h(0D6。。达到0.6-0.8)后加入终浓度lmol/L的诱导剂IPTG，18°C180rpm震荡培养12h。培养液12，OOOrpm离心5min，分别收集培养基上清和沉淀，细胞沉淀用pH4.8的0.lmol/L的Mcllvaine缓冲液重悬，超声破碎后12，000rpm离心10min，收集上清为细胞总蛋白(CTP)。按上述酶活测定方法分别检测培养基上清和CTP酶活。结果重组酶主要在大肠杆菌胞内表达，CTP中酶活性为1.69U/ml。经SDS-PAGE电泳检测，可以看见一条明显的特异性条带(图1，LANE2)。大肠杆菌诱导产生的a-半乳糖苷酶AGA36经一步NTA柱纯化(NEB)，比活提高至56.61U/mg。纯化AGA36经SDS-PAGE得到电泳纯的单一条带，分子量约为80kDa与预测分子量相近(图1，LANE3)。实施例5a-半乳糖苷酶AGA36的酶学性质经纯化的a-半乳糖苷酶AGA36在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH2.08.0的0.lmol/L的Mcllvaine缓冲液和pH9.011.0的0.lmol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液。纯化的a-半乳糖苷酶AGA36在不同pH的缓冲体系，37t:下测定的pH适性结果(图2)表明AGA36的最适作用pH为4.8，在pH4.6-5.2保持80%以上的相对酶活性。将酶液在不同pH值的缓冲液中于常温下处理12h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，AGA36在pH范围为5.0-10.0间都很稳定，保持80X以上的酶活。最适温度的测定在pH4.8的0.lmol/L的Mcllvaine缓冲液体系及不同的温度(070°C)下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，AGA36的最适作用温度50。C，温度高于60。C时仍有30%左右的酶活。测定a-半乳糖苷酶在不同的温度(50，60°C)下分别保温2、5、10、15、20、30分钟时的相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。结果在5(TC下处理5min后仍有60以上％的酶活，温度稳定性较好(图5)。实施例6a-半乳糖苷酶AGA36对相关化学试剂的抗性在酶促反应体系中加入不同的金属离子及化学试剂(K+、Na+、Ca2+、Li+、Co+、Cr3+、Ni2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Ag+、Hg2+、Al3+、EDTA和SDS)，使这些物质的的终浓度为lmmo1/L。在37t:、pH4.8的条件下测定酶活性，以未加金属离子和化学试剂的稀释酶液为对照。表1为经过不同离子或化学物质处理后，AGA36酶活的变化情况。从表中可以看出一些离子如Na+、K+、Li+、Fe3+、Pb+，随着离子浓度的提高对酶活有不同程度的促进作用；而另一些离子如Ag+、Cu2+、Zn2+离子浓度的提高对酶活有不同程度的抑制作用；Mn2+、Hg2+几乎完全抑制AGA36的酶活。EDTA在不同浓度下均能提高酶活，中性和阳性的表面活性剂-Triton和CTAB对酶活没影响，阴性表面活性剂-SDS完全抑制酶活。表1金属离子及相关化学试剂对AGA36的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例6a-半乳糖苷酶AGA36对蛋白酶的抗性将蛋白酶分别用下列溶液配制成lmg/mL的溶液用pH7.00.lmol/LTris-HCl将胰蛋白酶、a-糜蛋白酶配成lmg/mL的溶液；用pH7.50.lmol/LTris-HCl将蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶A、胶原蛋白酶配成lmg/mL的溶液；用pH10.00.lmol/L甘氨酸-NaOH将proleather、碱性蛋白酶配成lmg/mL的溶液。将纯化的a-半乳糖苷酶与蛋白酶按10:1(w/V)在该蛋白酶缓冲液中处理30min后，按标准方法检测处理酶的剩余酶活。结果表明，用不同蛋白酶处理后Aga36的剩余酶活分别为94.47%(胰蛋白酶)，113.18%(a-糜蛋白酶)，70.10%(蛋白酶K)，75.28X(枯草芽孢杆菌蛋白酶A)，122.13%(胶原蛋白酶)，97.17%(proleather)和104.47%(碱性蛋白酶)，由此可以看出AGA36对多种蛋白酶都具有较强的抗性(图6)。实施例7a-半乳糖苷酶AGA36的底物特异性将蜜二糖、棉子糖、水苏糖溶解于0.lmol/L，pH4.0的Mcllvaine缓冲液中，浓度各lmg/mL，用1U/mL和3U/mL的a-半乳糖苷酶分别与这些底物在37。C下作用24h。半乳糖的释放用离子交换色谱仪CARBOPACPA10(DionexCorporation,USA)进行测定。结果表明(表1)，AGA36分解天然底物的能力为蜜二糖〉水苏糖〉棉子糖。并且3个单位的酶要比1个单位的酶分解能力更强一些。表2AGA36对不同底物的降解能力<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>0070]序列表0071]〈110〉广东溢多利生物科技股份有限公司0072]〈120〉一种新的抗蛋白酶的酸性a-半乳糖苷酶AGA36及其基因和应用0073]〈160>20074]〈210>10075]〈211>7240076]〈212>PRT0077]〈213〉根霉(Rhizopus.sp.AG708)0078]〈400>10079]MKLLQIGISQHPTKNLWYLVTNNSTYVIGVVDDLVLNFHWGPRLATIQDV0080]KLPETLQAQQ600081]DSHDTSLTPAREEFPVFGGLRYGPDVLRVEFSNGTRELDLVFNYGQVKKA0082]DELLVVLNDR1200083]V服NFTVELTYKLDIE亂IIRGASLKLDDSMADDIVLRKAQTGAWHLGP0084]PAHGCNRELI1800085]TLAGAWSCETQVQKHSLRPGTSQVLQSKRGMPSAQAYPYFAIKDQNKDGE0086]YGDCEVYFGT2400087]LAWSG丽SIEITTDIEGKVRIIGGYHDRDFNIIQSQGQEHVLPEFVAGYS0088]DEGLSGARKR3000089]LTRHIQSSRENDCLDQISPVLFNGWEACGFDVNMDNQLELAKMAANLGAE0090]LFVVDDGWFK3600091]GRKSDNAGLGDWYPDKSKFPQGLGPLANYCHELGMKFGLWFEPEMVNPDS0092]DLYRQHPDWV4200093]YHYPDRVRHLARNQLVLDITRDDVRSYIVGLIRTMVSENGIDYIKWDMDR0094]PLSEVNSKAS■0095]GGEVWLAHVRCVYDIIRSLKQEFSHLRIETCCSGGGRADMAILKLTDICW0096]PSDNTRPDAR5400097]LKIQYGSSLVMPPNLMSSWVTDMPSDDPYCHFPISYRFHVSFMGALGIGS0098]NL廳SDSDL6000099]EQYAGWVELYKKIRSIQQLGDLDFLVTPSNDDQAYTVVTQTTLEDASVVL0100]AFRESSPFWL6600101]SLHPIRLRHLKKLCVYRVQIWKDSPFDPVFDDKITGNSLMSKGLEMPYLD0102]SKAYSSVIVL7200103]LTKA7240104]〈210>20105]〈211>21750106]〈212>DNA0107]〈213〉根霉(Rhizopus.sp.AG708)0108]〈400>2:3tga朋ctecttcaaattggtetttctcaagtetcttgte60caacttetgttettggtgtcgttgacgacttegtectteatttccattgg120ggacctcgtttggctecgat皿gtteccag3gCgC3gC皿180gactctcatgacacaagccttectccagctcgtga卿gttccctgtctttggtggccte240agatetggccctgatgtcttacgagtcg皿ttttccaatggC3C3Cggg3attggatcte300gtettteattatggcc朋gtgatg皿ctecttgtggtett360gtecac朋gaattttecggtcgagttgacctecaagcttgcgatttgatt420atccgtggtgc朋gttte朋gCtgg3tg3ttccatggcagacgatetcgtccttcgteaa■gCgC3朋C3ggtgcctggcatctgggcccgcctgctcacggttgcaatcg540acacttgctggtgcctggtcagcactcactccggccaggc600acatctcaagtectgcagtcg皿gcgcggcatgccatcagcccaagcctetccttetttt660gccatc朋ggggacggtg皿tetggagactgtg皿gtctettttggaacc720ctggcttggagtggt雄tggtcteteg皿atettg皿gg咖ggtg郷780atcattggtggttetcatgatcgtgatttcgC3gg皿C3C840gttcttcccgagtttgttgctggatettctgatg皿ggcttetcaggtgctcg皿皿cga■ctgacacgtcatetec皿3gC3gC3g3g3gaatgactgcctcgatcaaatctcacctgtg960ctattcaatggttggg郷cgtgtggatttgatgtc^catggateatca3ttggagttg1020gc朋3gatggcagcteatttgggcgctgagctctttgtggtgg3tg3tggttggttcaaa1080ggacga朋gtC3g3C朋tgCtggccttggagattggtetcC3g3C皿gtCaaagtttcca1140c朋ggttteggacccttggccaattettgtcatg朋ttggtggcttgtgg1200tttgaaccagagatggte皿tcctgattcagacttgtetcgacagcaccccgactgggte1260teccactatcctgaccgtgttcgtcatcttgc皿ga皿tcaacttgttttggatattect1320Cg卿tgEltgtgcgttcctetattgttggacttettcgcacratggtgagcg皿皿tggt1380ategattecatca^tgggacatggatcgacccttgtcagte皿gc皿gc1440ggtgg卿ggtatggcttgcacatgtgcgttgtgtctetgatetcatccgtegcctcaaa1500cagg朋tttegtcatttgcgtattgaaacttgctgcagtgg郷tgg皿g1560gccatcttgatatetgctggcc皿gcgateatec皿gacctgatgcccgt1620ctcaagatccaatetggttcttcgcttgtgatgcctccaaatctgatgagragctgggte16803C3g3C3tgCcttctgatgatccgtectgccactttcctetctccteccgttttcatgtg1740tcctttetgggtgctctgggtatcggatct皿tttgagagcaatgtctgattcggatttg1800g朋cagtecgc郷atgggtcgagttgtetgatccattca3C皿ttgggt1860gatcttgatttccttgteactccttcaaatgatgatc^gcatetectgt1920acaacacttgaagacgcctcagttgtcctgaatcaagcccattttggttg1980tcccttcatcctetccggtt朋gacacttggcgtgteteg3gtecagate2040tgga朋gategcccttttgaccctgtatttgatgate^ateac3gg皿3ttctcttetg21003gC3朋gg3ttgga皿tgccttetttggattcteaagcat3cagtegcgtaattgtcctg2160ttgacgaaagcttaa217权利要求一种根霉AG708，其特征在于，保藏号为CGMCCNo.2675。2.—种抗蛋白酶的酸性a-半乳糖苷酶AGA36，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.—种抗蛋白酶的酸性a-半乳糖苷酶基因aga36，其特征在于，编码权利要求2所述的a-半乳糖苷酶AGA36。4.如权利要求3所述的a-半乳糖苷酶基因aga36，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO.2所示。5.包含权利要求2所述a-半乳糖苷酶AGA36的重组酶。6.包含权利要求3或4所述a-半乳糖苷酶基因aga36的重组载体。7.包含权利要求3或4所述a-半乳糖苷酶基因aga36的重组菌株。8.如权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。9.一种制备a-半乳糖苷酶AGA36的方法，其特征在于，包括以下步骤1)用权利要求6的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组a-半乳糖苷酶AGA36表达；以及3)回收并纯化所表达的a-半乳糖苷酶AGA36。10.权利要求2所述a-半乳糖苷酶AGA36的应用。全文摘要本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明提供了一种新的抗蛋白酶的酸性α-半乳糖苷酶AGA36及其基因和应用。所述α-半乳糖苷酶AGA36的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，该酶具有适宜的作用pH值，较强的金属离子和表面活性剂抗性，较强的蛋白酶抗性和较好的水解各种底物的能力，可作为一种饲料或食品添加剂应用于饲料与食品行业。文档编号C12N1/14GK101712930SQ20081022358公开日2010年5月26日申请日期2008年10月8日优先权日2008年10月8日发明者史宝军,曹雅男,罗长财,胡爱红申请人:广东溢多利生物科技股份有限公司