专利名称：：用于猪皮转染的转染组合物和转染方法
技术领域：
：本发明涉及一种转染组合物，尤其是一种用于猪皮转染的抗冻转染组合物。本发明还涉及采用该转染组合物转染猪皮的方法。
背景技术：
：对烧伤创面进行皮肤移植研究是现代烧伤治疗的迫切需要；烧伤是一类发生率及致残率均较高的特殊类型创伤，其根本问题就是创面问题，如果烧伤创面得不到及时有效的覆盖、封闭，必将引起患者机体内环境的紊乱、感染及多脏器功能障碍的发生；此外，还将出现创面的非生理性愈合，使應痕形成增加，残疾程度加剧。因此，对烧伤创面的研究一直是烧伤界研究的热点及难点。深度烧伤创面需经皮肤移植才能愈合，而大面积、特大面积烧伤患者自体皮源严重不足，需经非自体(同种异体或异种)皮覆盖创面方能取得较好的临床效果。同种异体皮(主要是尸体皮)是目前烧伤创面治疗中公认效果较好的生物敷料，但由于来源和伦理等多种条件限制，同种异体皮无法满足临床需求。猪皮由于与人皮在組织结构和生理功能上的高度相似性，是临床使用最为广泛的异种皮肤，但由于猪和人之间的种属差异，其排斥反应比较严重，无法起到长期覆盖作用。CTLA4Ig是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)与IgGFc段的基因重组融合蛋白，可阻断抗原特异性T细胞活化过程起重要作用的B72CD28共刺激通路，从而导致这类T细胞的无能或凋亡，对控制器官移植排斥反应的发生具有重要作用。利用传统的Ad5腺病毒载体携带免疫抑制基因CTLA4Ig对猪皮进行体外转染，可使CTLA4Ig蛋白在猪皮组织活细胞内表达，从而起到抑制免疫排斥的发生、在烧伤创面诱导移植皮肤局部特异性免疫耐受、达到延长移植异种皮肤成活的目的(参见中国专利申请00103528.2，一种用重组基因转染的异体皮肤)。但作为商品化的基因转染猪皮，需要保持足够的货架期以方便临床随时皮肤在复温后保持足够的细胞活力，在冻存前需要使用抗冻液(主要由DMSO(二曱基亚砜)等组成)对皮肤进行处理，防止在冻存和复温过程中细胞内形成水晶，损伤皮肤活力。基因转染猪皮的生产是先用腺病毒对猪皮组织进行转染，然后再进行常规的抗冻处理，生产时间较长，导致生产工艺烦瑣，成本较高。因此缩短生产时间，简化生产工艺，同时保持最终的基因转染猪皮保持足够的活力和基因导入量，对于基因转染猪皮的生产是亟需解决的问题。
发明内容为解决上述问题，在一方面，本发明提供了一种用于猪皮转染的转染组合物，该组合物包含携带目的基因的病毒载体、抗冻剂和氮酮。在一个实施方案中，所述病毒载体为Ad5腺病毒载体，所述目的基因为CTLA4Ig。在一个实施方案中，所述抗冻剂包含DMSO。在更具体的实施方案中，所述抗冻剂还包含丙二醇。在另一方面，本发明提供了猪皮转染的方法，包括以所述转染组合物转染猪皮的步骤。再一方面，本发明提供了采用上述方法制备的猪皮肤组织。在猪皮转染组合物中包含进氮酮和抗冻剂，将转染和抗冻合二为一，缩短了处理时间，同时维持冻存后的产品活力和基因导入量不受影响，对于基因转染猪皮的生产具有十分重要的意义。具体实施方式下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述。氮酮是一种常规的皮肤促渗剂，能改变表皮角质层的结构，促使药物顺利进入真皮组织，增加细胞通透性，达到促渗透的作用，目前氮酮已广泛应用于外用药物、化妆品、农药及皮革印染等领域。也有报道将氮酮用于血管抗冻处理，以缩短处理时间(中国专利申请03135727.X,—种血管玻璃化保存液及血管保存方法)。本发明人发现，通过向腺病毒转染液中加入一定量的氮酮和DMSO(视情况还可加入丙二醇)，以此腺病毒转染组合物对猪皮组织进行转染，可以提高转染效率2-4倍，同时无须进行额外的抗冻处理，即可直接进行深低温保存，维持皮肤的活力，大大地提高了基因转染的效率，缩短了生产时间，降低了生产成本。在一个具体实例中，向108PFU/mlAd5-CTLA4Ig腺病毒转染液中加入DMSO、丙二醇和氮酮，使终浓度分别为20%、6%和1%，然后在37。C下对0.4-0.8毫米厚的猪皮肤组织进行1小时的转染抗冻处理，最后进行液氮快速冻存。复温后检测发现猪皮的转染效率是单纯使用108PFUAd5-CTLA4Ig腺病毒载体转染2小时猪皮效率的2-4倍，而活力与转染后进行30分钟抗冻处理的基因转染猪皮复温后无显著性差异。因此使用本工艺可节约基因转染猪皮生产时间1.5小时，同时提高转染效率且皮肤活力与传统方法比较没有明显变化。以下以具体实施例进一步阐述本发明。实施例1猪皮的转染抗冻处理猪皮的准备将猪处死后进行清洗，手术刀刮毛，再使用5%进行碘伏消毒，取背部皮肤剖层为0.4-0.8mm厚度，在无菌条件下将皮片裁剪成2cmx3cm小块备用。转染抗冻液的配制将氮酮先加入DMSO中溶解，再加入Ad5-CTLA4Ig腺病毒栽体，使终浓度为1%氮酮、10%DMSO和108PFU/mlAd5-CTLA4Ig。转染抗冻液处理将准备好的猪皮放入六孔细胞培养板内，每孔加入4ml配制的转染抗冻液，在C02培养箱内37。C处理1小时，然后快速置于液氮内保存。在对照组中，将准备好的猪皮放入六孔细胞培养板内，每孔加入4ml108PFU/mlAd5-CTLA4Ig转染液，在C02培养箱内37。C处理2小时，再放入4ml10。/。DMSO于4。C抗冻30分钟，然后快速置于液氮内保存。实施例2冻存后猪皮组织中CTLA4基因含量的检测提取实施例1中氮酮处理组和对照组中的基因组总DNA(提取方法参照《分子克隆实验指南》(第3版)463-471，科学出版社)。然后进行目的基因转染的定量检测，以确定目的基因CTLA4的转入量。目的基因转染的定量检测的方法如下用目的引物与内参引物分别对样品DNA进行扩增。目的引物5，AGGTCAAGTTCAACTGGTACG3，(SEQIDNO1)5，CTTGTACTCCTTGCCATTCA3'(SEQIDNO2)内参引物5，TTTAACTCTGGCAAAGTGGAC3，(SEQIDNO3)5,GGTGGAATCATACTGGAACAT3'(SEQIDNO4)定量PCR反应程序95°C3min94QC30s60QC30s读板40个循环72°C3min95°C1min55°C1min熔解曲线从55。C到95。C，每0.5。C循环一次，10s。以目的基因的量与内参基因的量的比值表示目的基因的导入量。实验结果表明，氮酮处理组转染猪皮内目的基因导入量较对照组提高了2.9倍。实施例3冻存后猪皮组织活力^r测将猪皮肤组织从液氮中取出后快速复温，用生理盐水进行漂洗，再用打孔器在皮肤组织上获取相同面积的皮块，每组各取8块，分别加入lml0.5。/。MTT溶液，置于37°C恒温震荡箱内反应1小时。吸去MTT液，再加入2.5mlDMSO，置于振荡箱，在20~25。C下以100rpm振荡2小时。取反应后的液体在570nm的条件下测量光吸收值，即可反映皮肤的活力。皮肤活力测量结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>从上面结果可以看出，氮酮组和对照组在皮肤活力方面无显著差异。尽管以上仅以猪皮和CTLA4Ig基因为例阐述了本发明，但本领域技术人员显而易见的是，可以以类似方式以其它目的基因转染其它动物皮肤，这些实施方案也以应包括在本发明范围内。最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。序列表<110>重庆宗申军辉生物技术有限公司<120>用于猪皮转染的转染组合物和转染方法<130〉082435GF<160>4<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1aggtcaagttcaactggtacg21<210>2<211>20<212>DNA<213〉人工序列<楊〉2cttgtactccttgccattca20<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<權>3tttaactctggcaaagtggac21<210>4<211>21<212>DNA<213〉人工序列<400>4ggtggaatcatactggaacat2权利要求1.一种用于猪皮转染的转染组合物，包含携带目的基因的病毒载体、抗冻剂和氮酮。2.根据权利要求1所述的转染组合物，其中所述病毒载体为Ad5腺病毒载体，所述目的基因为CTLA4Ig。3.根据权利要求1或2所述的转染组合物，其中所述抗冻剂包含二甲基亚砜。4.根据权利要求3所述的转染组合物，其中按重量计，二曱基亚砜和氮酮在所述转染组合物中的浓度分别为10-20%和1-2%。5.根据权利要求3所述的转染组合物，其中所述抗冻剂还包含丙二醇。6.根据权利要求5所述的转染组合物，其中按重量计，二曱基亚砜、丙二醇和氮酮在所述转染组合物中的浓度分别为20%、6%和1%。7.—种猪皮转染的方法，包括以权利要求1-6中任一项所述的转染组合物转染猪皮肤组织的步骤。8.根据权利要求7所述的方法，还包括在所述转染后将所述猪皮肤组织置于液氮内保存的步骤。9.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述的转染步骤在37。C下进行1小时。10.—种采用权利要求7-9中任一项所述的方法制备的猪皮肤组织。全文摘要本发明公开了一种转染组合物，尤其是一种用于猪皮转染的抗冻转染组合物。本发明还公开了采用该转染组合物转染猪皮的方法。在该转染组合物中包含了氮酮和抗冻剂，将转染和抗冻合二为一，缩短了猪皮转染时间，同时维持冻存后的产品活力和基因导入量不受影响，对于基因转染猪皮的生产具有十分重要的意义。文档编号C12N5/10GK101402971SQ20081022681公开日2009年4月8日申请日期2008年11月17日优先权日2008年11月17日发明者军吴,孙力华,葛良鹏,泓魏申请人:重庆宗申军辉生物技术有限公司