一种具有较高免疫原性的融合蛋白及其应用的制作方法

专利名称：：一种具有较高免疫原性的融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种具有较高免疫原性的融合蛋白及其应用。技术背景表位肽研究已经在疫苗学领域得到了越来越广泛的应用。但其免疫原性低，免疫效果差也是亟待解决的问题。使用适当的佐剂是最有效的解决办法。对于蛋白类佐剂效应分子来说，一种解决方法就是构建表位肽-佐剂分子的融合蛋白。JaraesWH将TLR(Toll样受体)5配体鞭毛蛋白基因(STF2)融合于0VA蛋白基因5'端在大肠杆菌中表达为STF2-0VA融合蛋白，这种新型蛋白使OVA蛋白的免疫原性得到明显增强。活化相关的分泌蛋白-UASP-l)是一种来源于盘尾丝虫(Onchocercavolvulus)的蛋白。来自禽流感病毒H5N1的膜蛋白M2的外膜区M2e，由24个氨基酸组成，其免疫原性非常低。
发明内容本发明的目的是提供一种具有较高免疫原性的融合蛋白。本发明所提供的融合蛋白，名称为S1-M2e3，是在S1的氨基末端或羧基末端融合抗原表位肽得到的蛋白质；所述S1是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列l所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列l的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由(a)衍生的蛋白质；所述抗原表位肽(名称为M2e3)是如下(c)或(d)的蛋白质(c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由(c)衍生的蛋白质e所述融合蛋白具体可为如下(1)或(2)的蛋白质(1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且免疫原性高于所述抗原表位肽的由(1)衍生的蛋白质。为了使(a)和(1)中的蛋白便于纯化，可在其N末端或C末端连接上如表1所示的标签。表1.标签的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上述(b)和(2)中的Sl的编码基因可通过将(a)和(I)中的蛋白编码基因的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。为了便于蛋白的分泌表达，还可在所述蛋白的氨基末端添加上信号肽序列。上述融合蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。其中，所述S1的编码基因，具体可为如下3)或4)的基因3)其编码序列是序列表中的序列4;4)在严格条件下可与3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。所述抗原表位肽(名称为M2e3)的编码基因，具体可为如下5)或6)的基因5)其编码序列是序列表中的序列5。6)在严格条件下可与5)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。所述融合蛋白的编码基因，具体可为如下7)或8)的基因7)其编码序列是序列表中的序列6。8)在严格条件下可与7)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。含有上述任一种融合蛋白的编码基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为在PQE30的多克隆位点间插入上述任一种融合蛋白的编码基因得到的pQE30-Sl-M2e3。所述重组菌具体可为将所述pQE30-S1-M2e3转入大肠杆菌M15得到的重组大肠杆菌。本发明还提供了一种表达所述S1-M2e3的方法。本发明所提供的表达所述S1-M2e3的方法，是将含有所述S1-M2e3编码基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到所述蛋白。所述重组表达载体具体可为上述pQE30-Sl-M2e3，所述宿主细胞具体可为将所述pQE30-S1-M2e3转入大肠杆菌M15得到的重组大肠杆菌细胞。本发明还优化了Sl-M2e3的纯化方法。本发明通过分子生物学的方法构建了N端融合串联有3个M2e肽的融合蛋白Sl-M2e3。动物实验表明，S1-M2e3能有效地刺激针对M2e的特异性免疫应答，仅加强免疫一次，IgGl/IgG2aGMT值就可达到1:100，000/1:4525。所以S1-M2e3可作为禽流感疫苗的活性成分，在禽流感的预防和治疗中将发挥重要作用。图1为pQE30-Sl的酶切鉴定图谱图2为pQE30空载体对照的SDS-PAGE鉴定3为Sl-M2e3的SDS-PAGE鉴定4为纯化Sl-M2e3蛋白Ni-FF吸附洗脱与复性图1.Marker2.过柱纯化前原液3.lOraM咪唑缓冲液洗脱4.20mM咪唑缓冲液洗脱5.50mM咪唑缓冲液洗脱6.lOOmM咪唑缓冲液洗脱7.200mM咪唑缓冲液洗脱8.复性后图5为加强免疫后第8天，各组免疫血清中抗M2e特异性IgGl产生情况图6为加强免疫后第8天，各组免疫血清中抗M2e特异性IgG2a产生情况具体实施方式实施例1、融合蛋白Sl-M2e3的表达及鉴定一、融合蛋白Sl-M2e3的表达载体pQE30-Sl-M2e3的构建1、Sl表达载体pQE30-Sl的构建根据大肠杆菌的偏爱密码子，人工合成序列表中序列4所示的Sl(其氨基酸序列是序列表中的序列l)的编码基因(序列4的自5'末端第17-610位(共594个核苷酸)为Sl的编码序列，序列1的自5'末端第11-16位为^s忍M的识别位点，序列1的自5'末端第611-616位为的识别位点。以jfeyzM和沿VMin双酶切Sl的编码基因，与经相同酶切的pQE30(QIAGEN)连接，并转化大肠杆菌XLl-Blue(Stratagene公司)感受态细胞，挑选氨苄青霉素抗性克隆，经菌落PCR及提取质粒双酶切(5孤别和历v^ni)鉴定，将鉴定正确的该重组质粒命名为pQE30-Sl。pQE30-Sl的酶切鉴定图谱如图1所示，得到3.4kb的载体带和594bp的Sl条带(箭头示)。图1中，1为pQE30-Sl，2为DLMarker2，000。2、pQE30-SI-M2e3的构建人工合成序列表中序列5所示的M2e3(其氨基酸序列是序列表中的序列2)的编码基因(序列5的自5'末端第15-275位(共261个核苷酸)为M2e3的编码序列，序列5的自5'末端第9-14位为限制性内切酶Bgin的识别位点，序列5的自5'末端第270-275位为限制性内切酶BamHI的识别位点。以BglII和BamHI双酶切M2e3的编码基因，回收261bp片段与BamHI单酶切的pQE30-Sl载体连接，转化XL1-Blue感受态细胞，得到重组质粒。对重组质粒进行PCR鉴定和序列测定，将含有核苷酸序列是序列表中的序列6的S1-M2e3基因的重组质粒命名为pQE30-Sl-M2e3。该S1-M2e3基因编码氨基酸序列是序列表中的序列3的融合蛋白S1-M2e3。3、融合蛋白S1-M2e3在原核表达系统中的表达和纯化及复性。1)S1-M2e3的诱导表达将pQE30-S1-M2e3转入大肠杆菌M15(QIAGEN公司)，得到重组大肠杆菌pQE30-S1-M2e3/M15。将pQE30(空质粒)转入大肠杆菌M15得到重组大肠杆菌pQE30/M15，作为阴性对照组。从阳性重组质粒表达菌(pQE30-S1-M2e3/M15)及阴性对照菌(pQE30/M15)挑取若干转化子分别接种3mlLB培养基中(含100)ig/ml氨苄青霉素及50吗/ml卡那霉素)，37"振荡培养过夜，将菌液以l:IOO的体积比转接于LB培养基中，37'C震荡培养3h，至OD咖在0.5-1.0之间。加入终浓度为lmM的IPTG,在37r诱导5小时取样；同时设置未用IPTG进行诱导表达的对照。同时收集菌体，以超声缓冲液悬浮后超声破碎，以8M尿素溶解包涵体，对超声上清及包涵体分别取样，SDS-PAGE鉴定。2)S1-M2e3表达的SDS-PAGE鉴定取pQE30-SI-M2e3/M15的诱导表达菌液及未诱导表达菌液各1.5ml，pQE30/M15的诱导表达菌液及未诱导表达菌液各1.5ml。分别移入1.5mlEP管，12000rpm，离心lmin，弃上清，用生理盐水洗涤后，加入IOO1XSDS上样缓冲液，混匀，100°C煮沸IOmin，自然冷却后，12000rpm，离心lmin，取10jil上清(约40吗)上样于凝胶加样孔内。分离胶浓度为12%，积层胶浓度为5%。按积层胶100mA及分离胶150mA的条件进行电泳，溴酚蓝移动至胶底部终止电泳。电泳完毕后，考马斯亮蓝染色观察。结果如图2和图3所示，图2中，l泳道为pQE30/M15诱导表达组；2泳道为pQE30/M15未诱导组；3泳道为蛋白Marker。图3中，l泳道为pQE30-S卜M2e3/M15诱导表达组;2泳道为pQE30-S1-M2e3/M15未诱导组；3泳道为蛋白Marker。表明pQE30-S1-M2e3/M15表达得到了大小为31kDa的S1-M2e3，而pQE30/M15不表达大小为31kDa的S1-M2e3。3)Sl-M2e3表达形式的鉴定A、细菌包涵体的分离和洗涤将pQE30-Sl-M2e3/M15诱导表达的菌液于4'C以5000g离心15min后，收集菌体，将菌体用含30%蔗糖、50raraol/LTris-HC1、lmmol/LEDTApH8.0的溶液重悬，冰浴30min。然后于4。C5000rpm离心10min，沉淀用含IOOmmol/LTris-HC1、2mm。l/LEDTAp朋.0的超声缓冲液重悬，超声破碎仪冰浴破碎(功率100W，超声时间8s，间歇10s，总程10rain)，4°C12000rpm离心10min，获得超声上清液和粗制包涵体沉淀。将分离得到的包涵体依次用包涵体洗液I(TritonX-1000.5%，EDTA10咖ol/L)，II(TritonX-10010%，EDTA10mmol/L)，III(EDTA10mmol/L，尿素2M)分别重悬，4'C12000rpm离心20min，最后剩下的沉淀进一步进行变性处理。将超声上清液进行电泳鉴定，电泳结果如图3中4泳道所示，表明S1-M2e3不是可溶性表达，不存在于菌体超声上清中。B、包涵体的变性将洗涤完毕的包涵体用含8M尿素的缓冲液B(每升中含NaH2P04《&015.6g，Tris碱1.2g，尿素480.5g，用NaOH调至pH8.0)重悬，磁力搅拌器搅拌2h，4°C12000rpm离心20min，保留上清，取样处理后，电泳鉴定。包涵体的电泳结果如图3中5泳道所示，表明S1-M2e3以包涵体形式表达。4)Sl-M2e3的纯化pQE载体表达蛋白带有组氨酸标签，利用这一特性可以采用Ni亲和层析的方法进行纯化，具体操作按照Ni-FF说明书进行，简述如下镍琼脂糖凝胶FF装柱，柱床体积为2ml，用缓冲液l平衡2-5个床体积，上样，流速为lml/min，用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为2ral/min，再分别用含IO、20、50、100、200、300mM咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2ml/min，收集各阶段洗脱液，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度，最后用纯水流洗5个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2ral/min，柱子置于4'C环境中保存。其中，镍亲和层析缓冲液组成缓冲液l:50raMpH7.4的PBS缓冲液。配制0.5MNaH2P0419ml，0.5MNa2HP0481ral，NaCl29.3g,加适量水溶解后定容到1000ml。缓沖液2:50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制0.5MNaH2P0419ml，0.5MNa2HP0481ml，NaCl29.3g和咪唑34g，加适量水溶解后定容到1000ml。不同咪唑浓度的缓冲液3的组成如表2所示表2、缓冲液3的组成咪唑浓度缓冲液l量(ml)缓冲液2量(ml)10mM98220mM96450mM9010100mM8020200函6040300mM4060S卜M2e3蛋白经过Ni-FF时大部分被吸附至柱上，经过含低浓度的洗涤缓冲液洗涤(20mM，50mM)，自100mM洗脱缓冲液后即获得较纯的Sl-M2e3蛋白(图4中的6-7泳道)。5)抗M2e兔多克隆抗血清的制备用人工合成的多肽M2e(MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD)进行抗体制备多肽100wg/只/次，初次免疫与弗氏完全佐剂等体积混匀，充分乳化，总体积2ml，背部皮下多点注射免疫兔子。每l个月加强一次，共加强两次，加强时换用弗氏不完全佐剂。末次免疫后2周静脉采血，ELISA法测定血清中抗体产生效价。其中，以5ixg/ml的多肽M2e包被酶标板。效价达到l:200，000以上则可采用颈动脉放血的方式收集兔血，分离血清，-2(TC保存。6)表达蛋白的ELISA鉴定用纯化的Sl-M2e3蛋白包被(5yg/ml)，用常规间接ELISA检测抗M2e多抗血清(1:20000、1:40000和1:100000稀释)，对照用正常兔血清，结果该重组蛋白只与M2e多抗血清反应。7)表达蛋白S1-M2e3的复性采用透析法进行复性配制含梯度尿素浓度(6M，4M)及5。/。甘油，0.1MTris，2mMEDTA,1%甘氨酸的复性液，进行梯度透析；然后透析至laemmlibuffer(25raMTris，192mM甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3)，最后透析至0.OIM、pH7.4的PBS溶液中。每种浓度的透析时间6h，全部过程在4'C进行。透析结束后，蛋白溶液12000rpm离心10min，收集上清，取样电泳鉴定，结果如图4中的8泳道，表明复性后获得了高纯度的S1-M2e3。包涵体一般含有50。/。以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、膜蛋白、质粒DNA，以及磷脂、脂多糖等。可以通过洗涤等方法提高包涵体中重组蛋白的纯度，从而方便后续的变复性操作，提高复性率。根据《分子克隆》及参考崔建武等提供的菌体破碎及包涵体洗漆收集方案，结合实际操作经验，对S1-M2e3表达系统摸索出如下的分离洗涤方案先以30%蔗糖高渗溶液对菌体预处理，在进行超声破碎，与直接进行超声破碎相比，前者的破碎效果较好。对包涵体先用含lOmMEDTA和分别含0.5°/。/10%的Triton-X-100的包涵体洗液I和II洗涤，温和去垢剂TritonX-100洗涤能去除膜碎片和膜蛋白。再以含2M尿素的包涵体洗液III洗涤，这种方案能洗去较多杂质，提高包涵体的纯度，洗涤过程中包涵体蛋白也能保持稳定，未见降解。在包涵体中，重组蛋白处于错误折叠的状态，二硫键大部分也是错搭的。要获得正确折叠的蛋白首先是溶解包涵体，使蛋白变性。变性即破坏非共价键。常用5-6M的盐酸胍或6-8的尿素。本实验采用8M尿素溶解包涵体，溶解性良好，无需加入还原剂等其他成分助溶。获得较高纯度的包涵体后再经过镍亲和层析纯化，得到纯度〉85%的目的蛋白。在摸索纯化的条件时，表达的Sl-M2e3虽然带有His标签，亲和能力并不强，经过Ni-FF柱时吸附比例较少，用50mM洗涤缓冲液洗涤时就有部分目的蛋白连同杂蛋白被洗脱下来，因此会造成最后获得纯品的损失。最终目的蛋白在100-200mM咪唑浓度下被洗脱。变性蛋白纯度越高越有利于复性，在通过上述方法获得高纯度目的蛋白后，开始摸索复性条件。蛋白复性过程是除去变性剂及还原剂，给变性的蛋白分子提供正确的再折叠及恢复活性的环境，重新获得天然的活性蛋白的过程。透析是实验室最常用的方法。透析复性最关键的是低浓度和平缓梯度。待复性蛋白的起始浓度一般为0.l-lmg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定；变性剂浓度(比如尿素)要平缓降低，逐步透析到正常，使蛋白质能够正确折叠。复性液的成分也很重要，一定浓度的Tris和金属离子螯合剂EDTA，以抑制某些蛋白酶的作用减少降解，增加目的蛋白的稳定性；一定浓度的甘油能增加黏度，减少分子碰撞机会；一定浓度的甘氨酸也有助于蛋白的复性。在摸索复性条件时，发现虽然添加了上述多种有助于复性的成分，在尿素浓度从4M降至2M时，蛋白极易产生大量沉淀，复性未获成功。将包涵体蛋白从4M尿素浓度直接透析至含有0.1%的SDS的laemrailibuffer中，再透析至PBS，在此过程中，蛋白虽然还是有沉淀析出，但上清中尚能保留较多可溶性成分。低浓度的SDS也有助于蛋白的复性，但由于SDS具有一定的毒性，而在此后的透析过程中很难被除去，因此并不推荐使用，然而这样获得的蛋白制品用于动物实验还是可行的。实施例2、Sl-M2e3的免疫实验材料RPMI-1640培养基、胎牛血清为Gibco/BRL公司产品；羊抗鼠IgG-HPR酶标抗体购自北京中杉公司，羊抗鼠HPR-IgGl，HPR-IgG2a(lrag/ral)酶标抗体购自BETHYL公司，3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine(TMB)显色液购自Sig腿公司。免疫用抗原肽M2e:MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD，由人工合成(北京赛百胜公司)免疫用蛋白复性的Sl-M2e3。蛋白的定量及内毒素的检测蛋白定量测定蛋白溶液在280nm和260nm波长下的吸光度，用以下的公式计算蛋白浓度蛋白浓度(mg/ml)=1.55XA娜-0.74XA260大肠杆菌表达蛋白往往有内毒素污染，而内毒素(LPS)本身是有一定的免疫激活作用的，因此对每一批试验性Sl-M2e3必须检测内毒素含量范围，确保低于一个限值，才能应用于动物实验。对制备的佐剂蛋白制品采用鲎试剂法进行了内毒素的检测，样品中内毒素含量均低于0.01EU/ng，符合动物实验要求。内毒素的检测；按照鲎试剂使用说明书进行。简述如下在分装有100yl鲎试剂溶液的试管中加入100u1复性的S1-M2e3蛋白，设立阴性对照(无内毒素水)，阳性对照(内毒素标准品)。封闭管口，轻轻摇匀，垂直放入37t:的恒温器中孵育60min，然后取出观察结果，孵育期间严格避免震动。根据是否出现凝胶判断是否阳性。结果表明当测试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180。时，阳性对照管内容物呈坚实凝胶，不变型，不从管壁滑脱；供试品(制备蛋白样品)虽生成凝胶，但不能保持完整，并从管壁滑脱，也为阴性。阴性对照管内容物未出现凝胶。根据使用的鲎试剂的灵敏度0.5EU/ml，复性的S1-M2e3蛋白浓度为5.0ug/y1，由于测试呈阴性，则最终内毒素含量低于0.01EU/yg。具体的实验方法和实验结果如下5周龄的BALB/c雌性小鼠(由中国人民解放军军事医学科学院动物中心提供，所用实验动物均为清洁级)随机分组，每组6只，分组情况如下S1-M2e3免疫组(S卜M2e3)、M2e免疫组(M2e)。Sl-M2e3免疫组和M2e免疫组共免疫两次，在第一次免疫后的3周，加强免疫一次；免疫时，以0.01M、pH7.4的PBS溶液稀释M2e或复性的S1-M2e3至所需浓度，100n1/只，使M2e或复性的S1-M2e3的免疫剂量为25ug/只/次。分别加强免疫后第8天断尾法采血，收集于EP管中，置37r温箱放置lh，待血清析出后，4000rpra离心10min，吸出血清一2(TC冻存备用。M2e用包被液(Na2C031.59g，NaHC032.93g，加水至1000ml)稀释(5ug/ml)，4°C包被96孔板过夜，加入200iil封闭液，37°C孵育1h，加入100nl稀释的一抗(免疫血清)，同时设阴性对照孔(免疫前正常小鼠血清)和空白孔，37t:孵育lh，PBST洗四遍，加入100y11:10，000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgGl或lgG2a亚型抗体，37°C孵育1h，PBST洗四遍，加入3,3'，5，5'-tetramethylbenzidine(TMB)显色液，37°C避光显色，在每一孔中加入lOOu12M硫酸终止反应。在450nra波长读取每一孔的吸光度。其中，2XELISA封闭和样品稀释液每1000ml含Tris.Cl(pH6.8)12g，NaCl16.5g，Tween-200.05%;临用前稀释一倍，并加入2%BSA。10XPBS缓冲液(pH7.2):NaH2P0420.5g，Na2HP04179.9g，用4升去离子水溶解后加入701.3gNaCl，补至8升。ELISA洗漆缓冲液PBST:1XPBS加入0.2%(v/v)Tween-20。结果的判断OD，大于等于2.1倍阴性对照OD，的平均值判断为阳性。结果如图5和6所示，表明Sl-M2e3加强免疫一次，IgGl/IgG2a几何平均滴度(Ge匿antiter,GMT)值就可分别达到1:100，000/1:4525，S卜M2e3组免疫效果明显高于M2e免疫组(p<0.01)。设立的M2e免疫对照组显示，IgGl/IgG2a值多数都低于检测水平。(图5和6中的结果为6只小鼠的平均值。)序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所〈120〉一种具有较高免疫原性的融合蛋白及其应用<130>PCGNA81912〈160>6<210>1〈211〉198<212>PRT<213>人工序列<220><223><400〉1LysLeuThrAlaLeuGluArgLysLyslieValGlyGinAsnAsnLys151015TyrArgSerAspLeulieAsnGlyLysLeuLysAsnArgAsnGlyThr202530TyrMetProArgGlyLysAsnMetLeuGluLeuThrTrpAspCysLys354045LeuGluSerSerAlaGinArgTrpAlaAsnGinCysliePheGlyHis505560SerProArgGinGinArgGluGlyValGlyGluAsnValTyrAlaTyr65707580TrpSerSerValSerValGluGlyLeuLysLysThrAlaGlyThrAsp859095AlaGlyLysSerTrpTrpSerLysLeuProLysLeuTyrGluAsnAsn100105110ProSerAsnAsnMetThrTrpLysValAlaGlyGinGlyValLeuHis115120125PheThrGinMetAlaTrpGlyLysThrTyrLyslieGlyCysGlyVal130135140AlaThrGinCysAspGlyGlyArgThrLeulieVallieCysHisTyr145150155160SerProGlyGlyAsnMetValGlyGluVallieTyrHisArgGlyAsn165170175ProCysLysValAspLysAspCysTyrThrLysLysCysLeuSerLys180185190SerGlyLeuCysArgLys195<210〉2<211〉87<212>PRT<213>人工序列<220><223>〈400〉2MetSerLeuLeuThrGluValGluThrProThrArgAsnGluTrpGlu1510.15CysArgCysSerAspSerSerAspGlyGlyGlyGlySerMetSerLeu202530LeuThrGluValGluThrProThrArgAsnGluTrpGluSerArgSer354045SerAspSerSerAspGlyGlyGlyGlySerMetSerLeuLeuThrGlu505560ValGluThrProThrArgAsnGluTrpGluSerArgSerSerAspSer65707580SerAspGlyGlyGlyGlySer85<210〉3〈211〉285<212〉PRT〈213〉人工序列<220〉〈223〉<400〉3MetSerLeuLeuThrGluValGluThrProThrArgAsnGluTrpGlu151015CysArgCysSerAspSerSerAspGlyGlyGlyGlySerMetSerLeu202530LeuThrGluValGluThrProThrArgAsnGluTrpGluSerArgSer354045SerAspSerSerAspGlyGlyGlyGlySerMetSerLeuLeuThrGlu50556015ValGluThrProThrArgAsnGluTrpGluServArgSerSerAspSer65707580SerAspGlyGlyGlyGlySerLysLeuThrAlaLeuGluArgLysLys859095lieValGlyGinAsnAsnLysTyrArgSerAspLeulieAsnGlyLys100105110LeuLysAsnArgAsnGlyThrTyrMetProArgGlyLysAsnMetLeu115120125GluLeuThrTrpAspCysLysLeuGluSerSerAlaGinArgTrpAla130135140AsnGinCysliePheGlyHisSerProArgGinGinArgGluGlyVal145150155160GlyGluAsnValTyrAlaTyrTrpSerSerValSerValGluGlyLeu165170175LysLysThrAlaGlyThrAspAlaGlyLysSerTrpTrpSerLysLeu180185190ProLysLeuTyrGluAsnAsnProSerAsnAsnMetThrTrpLysVal195200205AlaGlyGinGlyValLeuHisPheThrGinMetAlaTrpGlyLysThr210215220TyrLyslieGlyCysGlyValAlaThrGinCysAspGlyGlyArgThr225230235240LeulieVallieCysHisTyrSerProGlyGlyAsnMetValGlyGlu245250255VallieTyrHisArgGlyAsnProCysLysValAspLysAspCysTyr260265270ThrLysLysCysLeuSerLysSerGlyLeuCysArgLys275280285〈210〉4<211〉628<212>DNA〈213〉人工序列〈220〉<221>CDS〈222>(17)..(610)<223〉〈400>2gatagcctatggatccaaacttacggccctggaacggaagaaaattgtgggt52LysLeuThrAlaLeuGluArgLysLyslieValGly1510caa,aacaataaataccgtteagacetcateaacggtaagttgaaaaat100GinAsnAsnLysTyrArgSerAspLeulieAsnGlyLysLeuLysAsn152025eggaatggtacctatatgccacgcggcaaaaacatgetcgagctgact148ArgAsnGlyThrTyrMetProArgGlyLysAsnMetLeuGluLeuThr303540tgggattgcaaactggaaageagtgcccagcgttgggcgaatcagtgt196TrpAspCysLysLeuGluSerSerAlaGinArgTrpAlaAsnGinCys45505560atetttgggcactecccgcgccaacagcgcgaaggtgtaggtgaaaat244liePheGlyHisSerProArgGinGinArgGluGlyValGlyGluAsn6.57075gtgtatgcgtattggageagtgttteagtcgaaggtctgaaaaaaacc292ValTyrAlaTyrTrpSerSerValSerValGluGlyLeuLysLysThr808590gcaggtacggatgcgggtaaategtggtggagtaaaetcccgaaactg340AlaGlyThrAspAlaGlyLysSerTrpTrpSerLysLeuProLysLeu95100105tatgagaacaacccgtctaacaacatgacctggaaagttgcggggcag388TyrGluAsnAsnProSerAsnAsnMetThrTrpLysValAlaGlyGin110115120ggagttcttcactttacgcaaatggcgtgggggaaaacctacaagatt436GlyValLeuHisPheThrGinMetAlaTrpGlyLysThrTyrLyslie125130135140ggctgcGlyCysggggtggccGlyValAla145acccagThrGintgtCysgacAspggcGly150ggtGlycgtArgaccThrcULeuatelie155gtgVal484atetgtcactacagtccgggtggtaatatggttggggaggtcatetat532lieCysHisTyrSerProGlyGlyAsnMetValGlyGluVallieTyr160165170catcgtggcaatccatgcaaagtggacaaggattgctatacgaaaaag580HisArgGlyAsnProCysLysValAspLysAspCysTyrThrLysLys175180185aaa肌gcttctagccgagacg628Lys〈210〉5〈211〉284〈212〉DNA〈213〉人工序列tgtctgageaaatecggtctgtgccgcCysLeuSerLysSerGlyLeuCysArg190195〈220〉〈221〉CDS〈222〉(15).■(275)<223〉〈400〉5gatctggaagatctatgtegMetSer1ctgctgaccgaggtcgagacccctacgcgtLeuLeuThrGluValGluThrProThrArg51050肌cg站AsnGlutggTrp15gagtgcaggGluCysArgtgctctgactecagtgacggaggtggaggaCysSerAspSerSerAspGlyGlyGlyGly202598tctatgtegctgctgaccgaggtcgagacccctacgcgtaacgagtgg146SerMetSerLeuLeuThrGluValGluThrProThrArgAsnGluTrp303540gagtecGluSer45aggtectctgacArgSerSerAsp50tecagtgacggaSerSerAspGlyggtGly55ggaGlyggaGlytctSeratgMettegSer60194ctgctgaccgaggtcgagLeuLeuThrGluValGlu65acccctacgThrProThrcgtArg70肌cAsngagGlutggTrpg&gGlutecSer75&ggArg242tectctgactecagtgacggaggtggaggatecttgagcetc284SerSerAspSerSerAspGlyGlyGlyGlySer8085〈210〉6<211〉855<212〉DNA〈213〉人工序列<220〉<223〉〈400〉6atgtxgctgctgaccgaggtcgagacccctacgcgtaacgagtgggagtgcaggtgctct60gactccagtgacggaggtggaggatctatgtcgctgctgaccgaggtcgagacccctacg120cgtaacgagtgggagtccaggtxctctgactccagtgacggaggtggaggatctatgtcg180ctgctgaccgaggt:cgagacccctacgcgtaacgagtgggagtxcagg"tcc"tc"tgac"tcc240agtgacggaggtggaggatxcaaacttacggccc"tgga已cggaagaaa^ttgtgggtcaa300aacaataaataccgttcagacctcatcaacggtaagttgaaaaa^cggaatggtacctat360atgccacgcggcaaaaacatgctxgagctgacttgggattgcaaactggaa￡Lgcagtgcc420cagcgttgggcgaatcagtgtatctttgggcactccccgcgccaacagcgcgaaggtgta480ggtgaaaMgtgtatgcgtat"tggagcagtgtttcagtcg肌ggtxtgaaaaaaaccgca540ggtacggatgcgggtaaatcgtggtggagtaaactcccgaaactgtatgagaacaacccg600tctaacaacatgacctggaaagttgcggggcagggagttcttcactttacgcaaatggcg660tgggggaaaacctac肌gat"tggctgcggggtggccacccag"tgtgacggcggtcgtacc了20cttatcgtgatctgtcactacagtccgggtggtaatatgg"ttggggaggtcatctatcat780cgtggcaatccatgcaaagtggacaaggattgctatacgaaaaagtgtctgagcaaatxc840ggtctgtgccgcaaa85权利要求1、一种融合蛋白，是在S1的氨基末端或羧基末端融合抗原表位肽得到的蛋白质；所述S1是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由(a)衍生的蛋白质；所述抗原表位肽是如下(c)或(d)的蛋白质(c)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由(c)衍生的蛋白质id="icf0001"file="A2008102268960002C1.tif"wi="1"he="2"top="89"left="125"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="yes"/>2、根据权利要求l所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白为如下(1)或(2)的蛋白质(1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列表中序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且免疫原性高于所述抗原表位肽的由(1)衍生的蛋白质。3、权利要求1或2所述的融合蛋白的编码基因。4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述S1的编码基因为如下3)或4)的基因3)其编码序列是序列表中的序列4;4)在严格条件下与3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。5、根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述抗原表位肽的编码基因为如下5)或6)的基因5)其编码序列是序列表中的序列5。6)在严格条件下与5)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。6、根据权利要求5所述的基因，其特征在于所述融合蛋白的编码基因为如下7)或8)的基因7)其编码序列是序列表中的序列6;8)在严格条件下与7)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子。7、含有权利要求3-6中任一项所述融合蛋白的编码基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。8、权利要求1或2所述的融合蛋白在制备疫苗中的应用。9、一种禽流感疫苗，它的活性成分为权利要求1或2所述的融合蛋白。10、权利要求1或2所述的融合蛋白的制备方法，是将所述融合蛋白的编码基因导入大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌，培养该重组大肠杆菌，表达得到融合蛋白。全文摘要本发明公开了一种具有较高免疫原性的融合蛋白及其应用。该融合蛋白，是在S1的氨基末端或羧基末端融合抗原表位肽得到的蛋白质；所述S1是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且免疫原性高于所述抗原表位肽的由(a)衍生的蛋白质。动物实验表明，融合蛋白S1-M2e3能有效的刺激针对M2e的特异性免疫应答，仅加强免疫一次，IgG1/IgG2aGMT值就可达到1∶100,000/1∶4525，S1-M2e3可用于制备禽流感疫苗。文档编号C12N1/15GK101402687SQ20081022689公开日2009年4月8日申请日期2008年11月19日优先权日2008年11月19日发明者虹于,何玉先,周育森,李军锋,洁管,肖文珺,赵光宇,陈万荣申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所