专利名称：利用gfp蛋白创造家蚕新型绿茧实用品种的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术、生物工程领域，特别是涉及利用GFP仓ij造家蚕f 型乡录茧实 用品种的一种方法。
背景技术：
天然彩色茧不但色泽鲜艳，而且对皮肤有抗菌保健作用，是人类新型的一种抗菌纤维， 是一种原生态的丝织品，市场前景看好。天然彩色茧丝处理得当便不需要化学染色，可以 避免对环境的污染，是一种绿色环保原料。目前天然彩色茧蚕品种主要包括黄红茧系和绿
茧系两大类1、黄红茧系黄红茧品种的蚕在生长发育过程中受黄色茧基因的调控，食
下桑叶中类胡罗卜素(e —胡罗卜素、新生e _胡罗卜素)和叶黄素色素(叶黄素、蒲公
英黄素、紫黄素、次黄嘌呤黄素)等色素吸收后转导入丝胶中，吐出的有色丝形成金黄、 浅黄、淡红等不同颜色的黄红茧；2、绿茧系绿茧品种的蚕在生长发育过程中受绿色茧 基因的调控，将食下桑叶中的黄酮类色素吸收转入到丝胶和丝素中，吐出的丝呈现淡绿色 而形成绿色茧。不管是黄红茧系还是绿茧系，其茧色的形成都由一个或多个复杂的基因控 制，涉及到一个纷繁复杂的通路并受到多种因素的影响。色素物质要从桑叶到达丝腺内与 丝物质结合，必须要经过家蚕的消化道、透过消化管壁、经过血液、透过丝腺壁而最终与 丝素或丝胶结合。在这个过程中，消化道中消化液的作用、中肠壁的透过能力与透过部位、 血液的氧化能力、色素物质的移动速度、丝腺壁的透过性、丝腺的吸收部位以及色素物质 与丝蛋白的结合能力等均会直接影响到茧色的形成。此外，避开家蚕茧色形成的复杂性不 谈，即使桑叶中的色素全部都能够顺利地"过五关斩六将"，进入丝腺并最终形成有色蚕 茧，对于家蚕茧色来说，仍然存在着一个关键而难以克服的难题，即除了绿色茧的部分色 素存在于丝素中以外，天然彩色茧中的色素几乎都存在于丝胶之中，而丝胶在蚕丝中只起 到保护和粘着的作用，在缫丝过程中随着脱胶作用而部分流失，其内的色素对丝织品的颜 色非但没有贡献，反而成了一种污染，这也是人们在长期以来的品种选育中利用白茧而淘
汰有色茧的最主要原因。目前绿茧品系由于其色素物质大部分仍存在于丝胶中，故其在实 际运用中也存在以上同样的问题，且由于在缫丝过程中大部分色素的流失使获得的生丝颜色极浅而无法形成像天蚕丝那样美丽的淡绿色生丝。
到目前为止，改变和创造有色蚕茧的思路包括以下几种①通过分子遗传工程改造茧 色基因；②添食色素；③利用己有的彩色茧品种育成新的彩茧品种；④突变筛选。这些方 法都能在一定程度上改变或创造家蚕有色茧，但其产生的彩色茧都无法摆脱颜色种类受 限、色素结合不稳定等天然彩茧所具有的缺陷。
家蚕基因组框架图和精细图的先后公布，为家蚕基因和分子水平的研究提供了一个更 为广阔的平台，也为现代蚕业的发展注入了新的生机和活力。尤其是家蚕转基因等技术的 日趋成熟，使得利用现代生物技术创造新型生物素材成为家蚕后基因组时代和现代农业技 术体系中的重要课题。但是生物技术所研究的对象和靶标是基因和蛋白质，对于一般的非 蛋白且没有固定结合蛋白的色素物质却是束手无策。自然界中的天然色素，尤其是生物体 中的色素，绝大多数是烯类等非蛋白的物质，它们分散或集中的固定于某一组织或器官上， 在相应辅基存在的条件下使生物体着色。但是，也有少部分色素物质例外，例如绿色荧光 蛋白(GFP)家族的成员，它们在本质上是纯的蛋白质，由单个基因表达，而且不需要任 何的辅基，仅仅依靠分子内源性的发色基团而呈现出不同的颜色。这类蛋白存在于珊瑚礁 相关的海洋生物之中，鲜艳的色彩是珊瑚礁等相关的海洋生物包括从海绵到鱼类等的最引 人注目的特性，而这些鲜艳的色彩均是取决于一种或几种色素蛋白在其体内的表达情况。
基于以上考虑，本发明申请人试图利用家蚕滞育品种转基因的方法，将来自海洋生物 的GFP基因转入家蚕中，令其在丝腺中特异的与丝素蛋白融合表达，则可以巧妙地避开一 般色素物质进入丝蛋白的复杂通路而难以人为操控的难题来快速创造新型绿茧实用品种。 另外，本研究发明中的外源GFP蛋白是在丝素中融合表达，会稳定均匀地存在于丝素分子 中，GFP蛋白在缫丝过程中并不会因为脱胶而流失，从而保证缫出的生丝保留着深的迷人
的绿色。最后，本发明中直接利用目前我国大规模推广的实用品种的母种或原种为材料进 行转基因，获得转基因蚕能够快速育成新型绿茧实用品种，可非常有效地加快转基因蚕到 真正实用化品种的进程。迄今为止，还未见相关的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用GFP蛋白快速创造家蚕新型绿茧实用品种的路线方 法。该路线方法利用家蚕转基因技术，尤其是滞育品种的转基因技术，在家蚕丝素中融合 大量表达决定珊瑚礁等相关海洋生物体颜色的色素蛋白之一 GFP蛋白，从而快速育成新型 绿色茧家蚕实用品种。本发明首次利用GFP蛋白创造家蚕绿色茧，并通过家蚕滞育种转基因技术短期内获得
颜色深浅不同的新型绿茧实用品种。本发明巧妙地突破了人为控制家蚕茧色的技术瓶颈，
建立了一种可靠而高效的创造新型彩色茧特别是绿色茧的技术路线方法，为利用现代生物
技术创造新的生物素材提供了一种新的方法。
本发明利用GFP蛋白创造家蚕新型绿茧实用品种的方法，依次通过以下步骤实现
① GFP蛋白基因的获取选取珊瑚礁等相关海洋生物体的相应组织提取基因组或合成
相关的cDNA，扩增出表达GFP蛋白的基因片段，或者直接向有关生物公司购买含有GFP蛋 白基因的载体；
② 家蚕转基因载体的构建依据家蚕公知公用转基因技术的要求，构建piggyBac表 达载体，以眼和神经特异的启动子3xp3启动的红色荧光蛋白DsRed作为筛选标记，与家 蚕丝素重链启动子启动获得的色素蛋白基因实现融合表达；
③ 家蚕胚胎显微注射用家蚕白色茧母种或原种通过家蚕胚胎显微注射，在家蚕产卵 后3h-6h用显微注射仪将10-15nl、总浓度400ng/ul的重组转座载体质粒和辅助载体质粒， 从蚕卵腹面中央注入已经解除滞育的蚕卵中，并用无毒的胶水封闭卵壳注射留下的小孔；
④ 转基因蚕的筛选将注射完成的蚕卵在35-37y。的甲醛蒸气中消毒5min后，置于25 'C、相对湿度85%以上的条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代GO 的蚕蛾进行自交或回交，获得G1代蚕卵，扫描G1代蚕卵获得转基因个体，即获得相应 绿色蚕茧的转基因个体；
⑤ 绿色蚕茧转基因品系材料的获得将筛选到的转基因阳性个体饲养至上簇采茧并进 一步自交选纯，即获得不同的能稳定遗传的绿色蚕茧转基因品系材料；
(D家蚕新型绿茧转基因实用品种的快速育成上述步骤获得的能稳定遗传的绿色蚕茧 转基因品系材料相互杂交后，再自交选纯即获得颜色深浅不同的日系或华系绿茧实用品种 原种或母种。
相应的日系或华系绿茧实用品种原种杂交便为生产上大规模推广应用绿茧杂交种。 上述步骤中，h表示小时，min表示分钟。用家蚕丝素重链启动子启动外源蛋白基因 融合表达的方法，本发明专利申请人已于2006年7月14日申请专利(申请号 200610054442.x)，现已公开。两种家蚕滞育品种转基因的方法，本发明专利申请人已于 2007年12月21日申请专利(申请号分别为200710303903. 7和200710303904.1)，现已 公开。本发明的优点是
本发明首次实现了利用色素蛋白之一 GFP蛋白创造绿色蚕茧，将素材创新的设想与家 蚕转基因技术和用家蚕丝素重链启动子在家蚕后部大量表达外源蛋白有机地结合，巧妙地 突破了人为控制家蚕茧色的技术瓶颈，并首次实现了快速培育颜色深浅不同的新型绿色茧
实用品种。本发明的优点是
① 本发明直接利用目前我国生产上大规模推广的实用品种的母种或原种为转基因家 蚕的材料，获得的转基因家蚕绿茧材料只需简单的几代自交选纯，或者杂交再经几代自交 选纯就可以直接用于实际生产而不需要经过漫长的常规育种过程，大大加速了转基因家蚕 实用化的进程。
② 本发明中使用的表达形式为家蚕丝素重链融合表达，令GFP色素蛋白与茧丝的主体 ——丝素——融合表达，在丝腺分泌丝素的时候GFP色素蛋白就能稳定均匀地分布在丝素 之中，再经过吐丝过程的压榨结晶，使得GFP色素物质与丝素牢固的结合，即使在缫丝和 生丝精炼的过程中GFP色素蛋白也不会因为脱胶而流失。用这种蚕丝生产出的纤维织物， 勿需印染即可直接应用于织绸，将大大简化纺服工艺，节约大量的生产成本。
③ 由于蚕丝结构致密，虽然在染色时比较容易着色，但染料与蚕丝的结合并不是很稳 定，容易造成丝织物的脱色和掉色现象。而本发明中的GFP色素蛋白乃是与丝素彻底的融 合，而且所使用的GFP色素蛋白对热、去垢剂、还原剂、离液剂、极端PH值和蛋白酶等 都具有强的抵抗能力，能够达到丝织物永不退色的效果。
④ 蚕丝染整工艺中所使用的试剂和染料多为酸或碱，这些化学物质不但会影响蚕丝的 品质，还会危害人类的健康。本发明所创造的新型绿色茧则可以越过染整这一个步骤，不 但保证了蚕丝的品质，而且为人类的健康提供了保障。
⑤ 本发明中使用的GFP色素蛋白吸收光谱以紫外光波等短波为主，故用这种材料做成 的织物可以吸收紫外线从而降低紫外线对人类的伤害。
◎GFP色素蛋白可高效地吸收紫外线并将其转化为另一种长波段的光或者热能，用这 种材料做成的织物可能具有独特的光学特性和更广泛的用途。
本发明有效地联合使用了本发明人已经公开的用家蚕丝素重链启动子启动外源蛋白 基因融合表达和家蚕滞育品种转基因的方法， 一次性解决了家蚕有色茧——特别是绿色茧 开发和实际运用中的色素结合不稳定等多个难题，可简化丝织物的纺服工艺，消除染整工 艺对蚕丝品质和人类健康的危害，将为本来就享有"纤维皇后"的美誉的蚕丝增添新的优良特质。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述，以下实施例不构成对本发明 的任何限定。 实施例1:
第一步利用实用家蚕品种"碧波"(日系白色茧原种)作为原始材料，将初产下的
卵解除滞育后于产下后3-6h，用Eppendorf显微注射仪，将10_15nl、总浓度400ng/ul 的带有神经和眼睛特异启动子启动的红色荧光蛋白标记和丝素重链启动子启动的绿色荧 光蛋白(GFP蛋白)的重组piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入1500粒蚕卵中，用 无毒胶水封住注射口，经35y。的甲醛蒸气中消毒5rain以后，置于25'C、相对湿度85%以上 的高湿度环境中催青孵化，将孵化的73头G0代蚁蚕用人工饲料收集饲养至化蛾，获得的 40头GO代蚕蛾，通过自交或回交共获得27蛾圈Gl代蚕卵，用01ympus⑧电动宏观荧光显 微镜观察筛选27蛾圈G1代蚕卵并获得3个阳性蛾圈，共18头转基因蚕。将获得的18头 转基因蚕饲养至上簇采茧，共获得18个呈现出不同程度的淡绿色的蚕茧，通过自交选纯 后再通过杂交，并自交选纯而筛选各种经济性状良好的颜色深浅不同的3个日系"碧波" 绿色茧原种。
第二步利用实用家蚕品种"洞庭"(华系白色茧原种)作为原始材料，将初产下的 卵解除滞育后于产下后3-6h，用E卯endorf显微注射仪，将10_15nl、总浓度400ng/ul 的带有神经和眼睛特异启动子启动的红色荧光蛋白标记和丝素重链启动子启动的绿色荧 光蛋白(GFP蛋白)的重组piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入1100粒蚕卵中，用 无毒胶水封住注射口，经35y。的甲醛蒸气中消毒5min以后，置于25'C、相对湿度85%以上 的高湿度环境中催青孵化，将孵化的220头GO代蚁蚕用人工饲料收集饲养至化蛾，获得 的180头G0代蚕蛾，通过自交或回交共获得97蛾圈G1代蚕卵，用Olympus恋电动宏观荧 光显微镜观察筛选97蛾圈G1代蚕卵并获得20个阳性蛾圈，共198头转基因蚕。将获得 的198头转基因蚕饲养至上簇采茧，共获得162个呈现出不同程度的绿色的蚕茧，通过自 交选纯后再通过杂交，并自交选纯而筛选各种经济性状良好的颜色深浅不同的3个华系"洞 庭"绿色茧原种。
第三步将第一步和第二步获得的3个华系"洞庭"绿色茧原种和3个日系"碧波" 绿色茧原种分别杂交，获得颜色深浅不同的新型家蚕绿茧实用品种的生产用杂交种。 实施例2:
8第一步利用实用家蚕品种"872"(日系白色茧原种)作为原始材料，将初产下的卵 解除滞育后于产下后3-6h，用Eppendorf显微注射仪，将10_15nl、总浓度400ng/ul的 带有神经和眼睛特异启动子启动的红色荧光蛋白标记和丝素重链启动子启动的绿色荧光 蛋白(GFP蛋白)的重组piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入2500粒蚕卵中，用无 毒胶水封住注射口，经35。/。的甲醛蒸气中消毒5min以后，置于25'C、相对湿度85%以上的 高湿度环境中催青孵化，将孵化的163头G0代蚁蚕用人工饲料收集饲养至化蛾，获得的 121头G0代蚕蛾，通过自交或回交共获得63蛾圈G1代蚕卵，用01ympu^电动宏观荧光 显微镜观察筛选63蛾圈Gl代蚕卵并获得14个阳性蛾圈，共91头转基因蚕。将获得的91 头转基因蚕词养至上簇采茧，共获得72个呈现出不同程度的绿色的蚕茧，通过自交选纯 后再通过杂交，并自交选纯而筛选各种经济性状良好的颜色深浅不同的3个日系"872" 绿色茧原种。
第二步利用实用家蚕品种"871"(华系白色茧原种)作为原始材料，将初产下的卵 解除滞育后于产下后3-6h，用Eppendorf显微注射仪，将10_15nl、总浓度400ng/ul的 带有神经和眼睛特异启动子启动的红色荧光蛋白标记和丝素重链启动子启动的绿色荧光 蛋白(GFP蛋白)的重组piggyBac载体和辅助载体，共同注射进入2200粒蚕卵中，用无 毒胶水封住注射口，经35Q/。的甲醛蒸气中消毒5min以后，置于25。C、相对湿度85%以上的 高湿度环境中催青孵化，将孵化的320头G0代蚁蚕用人工饲料收集饲养至化蛾，获得的 218头GO代蚕蛾，通过自交或回交共获得115蛾圈Gl代蚕卵，用01711^1^ 电动宏观荧光 显微镜观察筛选115蛾圈Gl代蚕卵并获得9个阳性蛾圈，共86头转基因蚕。将获得的86 头转基因蚕饲养至上簇采茧，共获得134个呈现出不同程度的绿色的蚕茧，通过自交选纯 后再通过杂交，并自交选纯而筛选各种经济性状良好的颜色深浅不同的3个华系"871" 绿色茧原种。
第三步将第一步和第二步获得的3个华系"871"绿色茧原种和3个日系"872"绿 色茧原种分别杂交，获得颜色深浅不同的新型家蚕绿茧实用品种的生产用杂交种。
权利要求
1、利用GFP蛋白创造家蚕新型绿茧实用品种的方法，其特征是将GFP家族色素蛋白基因整合到家蚕染色体上而获得相应转基因家蚕，获得的这些转基因家蚕在其后部丝腺大量融合表达GFP家族色素蛋白，并吐丝形成相应的有色茧。
2、 权利要求1所述的利用GFP蛋白创造家蚕新型绿茧实用品种的方法，其特征是依 次通过以下步骤实现① GFP蛋白基因的获取选取珊瑚礁等相关海洋生物体的相应组织提取基因组或合成 相关的cDNA，扩增出表达GFP蛋白的基因片段，或者直接向有关生物公司购买含有GFP蛋 白基因的载体；② 家蚕转基因载体的构建依据家蚕公知公用转基因技术的要求，构建piggyBac表 达载体，以眼和神经特异的启动子3xp3启动的红色荧光蛋白DsRed作为筛选标记，与家 蚕丝素重链启动子启动获得的色素蛋白基因实现融合表达；③ 家蚕胚胎显微注射用家蚕白色茧母种或原种通过家蚕胚胎显微注射，在家蚕产卵 后3h-6h用显微注射仪将10-15nl、总浓度400ng/ul的重组转座载体质粒和辅助载体质粒， 从蚕卵腹面中央注入已经解除滞育的蚕卵中，并用无毒的胶水封闭卵壳注射留下的小孔；④ 转基因蚕的筛选将注射完成的蚕卵在35-37y。的甲醛蒸气中消毒5min后，置于25 °C、相对湿度85%以上的条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代GO 的蚕蛾进行自交或回交，获得G1代蚕卵，扫描G1代蚕卵获得转基因个体，即获得相应 绿色蚕茧的转基因个体；⑤ 绿色蚕茧转基因品系材料的获得将筛选到的转基因阳性个体饲养至上簇采茧并进 一步自交选纯，即获得不同的能稳定遗传的绿色蚕茧转基因品系材料；(D家蚕新型绿茧转基因实用品种的快速育成上述步骤获得的能稳定遗传的绿色蚕茧 转基因品系材料相互杂交后，再自交选纯即获得颜色深浅不同的日系或华系绿茧实用品种 原种或母种。
3、 权利要求1或2所述的方法，其特征是禾U用来自鳞翅目的转座子piggyBac和家 蚕胚胎显微注射的方法将GFP家族色素蛋白和丝心蛋白重链基因融合基因整合到家蚕染 色体中。
4、 权利要求1或2所述的方法，其特征是利用家蚕滞育品种作为转基因胚胎显微注射的原始材料而获得滞育品种转基因后代。
5、权利要求4所述的方法，其特征是利用目前推广的实用品种原种对或母种对作 为转基因胚胎显微注射的原始材料而获得相应品种转基因后代，并通过简单的自交或者杂 交再自交选纯的方法，获得相应的转基因后代的原种对或母种对。
全文摘要
利用GFP蛋白创造家蚕新型绿茧实用品种的方法，利用家蚕转基因技术，尤其是滞育品种的转基因技术，在家蚕丝素中融合大量表达决定珊瑚礁等相关海洋生物体颜色的色素蛋白之一GFP蛋白，从而快速育成新型绿色茧家蚕实用品种。该方法不仅大大加速了转基因家蚕实用化的进程，而且用这种蚕丝生产出的纤维织物，勿需印染即可直接应用于织绸，将大大简化纺服工艺，节约生产成本并有利于环保。
文档编号C12N15/63GK101423841SQ20081023323
公开日2009年5月6日 申请日期2008年12月5日 优先权日2008年12月5日
发明者向仲怀, 周泽扬, 夏庆友, 徐汉福, 赵爱春, 成 鲁 申请人:西南大学