专利名称：细胞电融合芯片系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物细胞融合技术领域，特别涉及一种细胞电融合芯片系统。
背景技术：
细胞融合(cell fusion)技术在遗传学、发生生物学、动植物远缘杂交育 种、免疫医学以及医药、食品、农业等应用领域中都有广泛的应用价值。现 代生物学中的一些最具创新性的技术，如在单抗的生产、哺乳动物的克隆以 及抗癌疫苗的生产当中，细胞融合是其中最为基本的步骤。细胞融合有化学 融合方法(如PEG方法)、物理融合方法，其中物理融合方法中，电场融合 方法因其便于精确控制、重复性好、融合率高等优点而得到了广泛的应用。
电场融合方法具有很多优点。首先，不必象显微注射那样使用玻璃针，
不需要昂贵的设备对成百万的细胞进行注射；第二，与用化学物质相比，电 穿孔几乎没有生物或化学副作用；第三，因为是一种物理方法，较少依赖细 胞类型，因而应用广泛。实际上，对大多数细胞类型，使用电场融合方法， 基因的转移效率比化学方法高得多。
细胞电融合通过几个连续的过程来实现细胞在电场中受到介电电泳力， 相互接触形成珠串，该过程称为细胞排队；在成串的细胞上施加高压电脉沖 使细胞膜产生可逆击穿，形成孔洞，两细胞内液通过穿孔交换物质，最后细 胞膜、细"包核融合形成一个新的细月包。
细胞在电场中的排队是基于介电电泳理论。生物细胞处于非均匀电场中 时，被电场激化形成偶极子，该偶极子在非均匀电场作用力下发生运动，即 介电电泳(dielectrophoresis)，利用介电电泳可以控制细月包的运动，在细月包 电融合过程中，利用介电电泳现象使细胞排列成串，压紧相互接触的细胞， 完成细胞电融合过程所需的排队和融合后压紧。而细胞穿孔是基于细胞膜电致穿孔效应。细胞在强电场作用下，会导致
细胞膜穿孔，这种效应称为细胞膜电致穿孔(electroporation )效应。在细胞 电融合过程中利用电致穿孔效应，使两接触的细胞膜穿孔，细胞间进行膜内 物质交换，使细胞质、膜融合，在一定强度的电场作用下的电穿孔是一种可 逆穿孔，细胞膜会在减小或撤销电场强度时回复原状，致使细胞电融合过程 的膜融合。
根据上述分析，为了实现细胞电融合，最关键的是将细胞置于非均匀电 场中，使细胞受到介电电泳力和强电场穿孔力。根据电场基本理论电场强度 E=V/d，为了获得较强的电场强度，必须靠增加电压或缩短电极间距来实现， 在细胞电融合芯片的设计中，以减小电极间距来实现高电场强度，所以，电 极间距可以根据细胞大小进行设计选择，在细胞尺寸数量级范围内，产生足 以使细胞膜穿孔所需电压降低至十几伏至几十伏即可，大大降低了细胞电融 合信号发生器设计制造难度，提高了细胞电融合后细胞的成活率。
目前国内在细胞电融合芯片及其系统方面的研究开发较少，主要存在的 问题在于微电极产生的电场强度和电场梯度较弱，不能实现较为精确的控 制；在增强可视化程度方面很差，不容易(或效果不好)观察芯片内部细胞 电融合过程，不利于细胞电融合过程中实时对细胞进行观察记录，不便于操 控细胞。并且在加工材料选择方面，也存在材料抗腐蚀、抗氧化能力较弱的 问题。
发明内容
有鉴于此，针对现有技术存在的上述不足，本发明提出一种细胞电融合 芯片系统，对现有的芯片系统从结构、材料、加工工艺、封装进行了重新设 计，不但在融合过程中可以更加方便地〗現察和记录细胞融合过程，而且提高 了细胞电融合芯片的抗化学腐蚀能力、耐高温高压能力、生物相容性能。
本发明的可视化细胞电融合芯片系统，包括细胞电融合芯片、PCB板和融合池，所述融合池包括内腔和设置在表面的芯片安装孔，所述芯片安装孔与
内腔相通，所述细胞电融合芯片设置在PCB板上，且嵌入设置在芯片安装孔
内；
所述细胞电融合芯片由硅片和玻璃片键合而成，所述硅片上设置有微电
极组和微通道，所述微电极组上设置有多个微电极，所述微电极通过信号引
出线与PCB板对应焊盘键合；
进一步，所述微电极呈锯齿状排列于微电极组上，设置在相邻微电极组
上的微电极交错相对，；微电极组之间形成连续的孩t通道；
进一步，所述微电极呈尖角锯齿状或矩形锯齿状排列在微电极组上；
进一步，所述硅片上设置有多个微电极组和多条微通道；
进一步，所述硅片厚度为40 60jim，玻璃片厚度为500 1000pm;
进一步，所述微电极的信号引出线采用金丝键合；
进一步，所述微电极组连接的信号引出线各自连接独立的控制信号；
进一步，所述细胞电融合芯片由表及里依次由金电镀层、金溅射层、硅
片层和玻璃片组成；
进一步，所述融合池设置有进样通道和出样通道，所述进样通道的出液
端与出样通道的进液端均与融合池的内腔相通，所述进样通道和出样通道采
用管状结构。
本发明的有益效果是
极的排列方式可以为矩形锯齿状，也可以为尖角锯齿状或其它形状，这一独 特i殳计能够大大提高微电极周围和微通道内部的电场强度和电场梯度，提高 了融合过程中的电场诱导力，从而提高了融合效率；
2.细胞电融合芯片采用硅片和玻璃片键合，提高微电极和硅接触面的密 封性，不会发生液体渗漏。硅玻具有很强的抗腐蚀能力，提高了芯片对细胞 緩冲液的抗化学腐蚀能力。硅玻耐高温能力强，便于芯片进行高温灭菌、消毒。硅玻具有较低的热膨胀系数，使芯片结构在高温条件下不会发生形变。 硅玻具有很好的生物适应性(相容性)，由硅玻构成的细胞融合环境，便于
融合后的细胞直接在芯片中培养，提高细胞成活率；
3. 玻璃作为细胞融合芯片的基底，与微电极共同构成了细胞电融合的微 通道，玻璃具有良好的光学可视性，便于观察、记录芯片内细胞融合过程。 玻璃还具有极高的绝缘性能，扩大了芯片适应的电压范围，为芯片适应各种 细胞融合所需电压奠定了基础，扩大了芯片的应用范围；
4. 通过在融合池上设置带有细胞融合芯片的PCB板，不但结构紧凑，并 且增强了整个系统的整体性，使得操作更为方便快捷。
本发明的其他优点、目标，和特征在某种程度上将在随后的说明书中进 行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言 将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其 他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本 发明作进一步的详细描述，其中
图1是细胞电融合芯片系统结构示意图2是细胞电融合芯片结构示意图3是细胞电融合芯片分层示意图4是PCB板的结构示意图5是细胞融合芯片与PCB装配示意图6是融合池结构示意图7是细胞融合过程的荧光显微镜图片。
具体实施例方式
l一细胞电融合芯片；2—PCB板；3 —融合池；4—芯片安装孔；5—硅 片；6—玻璃片；7—微电极组；8—微电极；9—孩吏通道；10—金电镀层；11 —金賊射层；12—进样通道；13—出样通道；14一芯片固定孔。
如图l所示，系统由细月包电融合芯片1、 PCB斧反2、融合池3共同组成， 其中融合池3包括内腔和设置在表面的芯片安装孔4,芯片安装孔4与内腔 相通，细胞电融合芯片1设置在PCB板2上，且嵌入设置在芯片安装孔4内。
图2为一种细胞电融合芯片结构示意图；如图2所示细胞电融合芯片 由硅片5和玻璃片6键合而成，硅片5上设置有微电极组7和微通道9，微 电极组上设置有多个微电极8,所述微电极8通过信号引出线与PCB板2对 应焊盘键合；微电极组7两两相对排列且微电极8交错相向，微电极组7之 间形成连续的微通道9;其中硅片5厚度为40 6(Him,玻璃片6厚度为 500 1000pm; ^t电才及8的信号引出线采用金丝。
微电极8也可以呈尖角锯齿状或其他形状排列于微电极组7上。
图3是细胞电融合芯片分层示意图，如图所示采用现代微电子加工工 艺制成的细胞电融合芯片1由表及里依次由金电镀层10、金賊射层11、硅片 层5和玻璃片6组成。
图4是PCB板的结构示意图，如图所示PCB板2 (铝金属基双面印制 板)用于固定硅玻结合的细胞电融合芯片1以及将芯片上的信号引出线引至 实验系统，是细胞电融合系统l中芯片信号与系统外细胞电融合信号源相连 接的中介。本实施例中的PCB板2采用厚度为1.5mm厚的铝基作为基板， 确保该系统在高温消毒过程中能承受较高温度(〉150°C )。
PCB板2上设计有用于安装、固定芯片的芯片固定孔14,其尺度大小为 25 x 10mm;
布线选择在顶层(Top Layer)，键合点焊盘中心距离孔边界为2.8mm, 焊盘倒圆角，大小为105x 1.5mm, PCB四角开有①4的固定孔，融合池3上也设置有与之对应的固定孔。
图5是细胞融合芯片1与PCB板2装配示意图，如图所示在PCB板2 的底层面(Bottom Layer)的线框内涂覆AE-02丙烯酸酯胶，将细胞融合芯 片1的玻璃面与PCB板2的地层面相粘结。将粘结上的PCB板2和细胞融 合芯片l放入烘箱(15CTC)烘烤15分钟后在室温保存8小时后即可。
图6是融合池结构示意图，如图所示融合池3采用玻璃制作。中间方 孔为芯片安装孔4，尺度为34xl9.3mm，外形尺寸为100 x 60mm。进样通 道12和出样通道13为玻璃管状结构，进样通道12的出液端与出样通道13 的进液端均与融合池3的内腔相通，使用0.45 x 16mmRWLB无菌注射针制 成。中空C^0.5mm,外径04.5-2mm。通道口略低于玻璃池底部(约0.2mm ) 且与底部平滑连接。融合池3同时也可以作为细胞培养池。
实验效果(试验对象采用Hek293细胞)
如图7 (a) 7 (d)所示(图中的A为融合前的细胞，图中的B为融合 后的细胞)，在型号为LeicaDMIRE2的显微镜下，可以清楚地看到在施加 了排对信号后，细胞集中在电极尖端，在25v直流脉冲控制电压条件下，紧 挨在一起的细胞间发生了明显的融合，其融合效率超过了 10%,大大优于传 统的化学(PEG小于1%)方法，也高于传统电融合方法(小于10%),这 表明，该设计方案可以大大提高融合效率，实现高通量的细胞融合。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽 管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理 解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案 的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
权利要求
1. 一种细胞电融合芯片系统，系统由细胞电融合芯片(1)、PCB板(2)、融合池(3)共同组成，其特征在于所述融合池(3)包括内腔和设置在表面的芯片安装孔(4)，所述芯片安装孔(4)与内腔相通，所述细胞电融合芯片(1)设置在PCB板(2)上，且嵌入设置在芯片安装孔(4)内；所述细胞电融合芯片由硅片(5)和玻璃片(6)键合而成，所述硅片(5)上设置有微电极组(7)和微通道(9)，所述微电极组(7)上设置有多个微电极(8)，所述微电极组(7)通过信号引出线与PCB板(2)对应焊盘键合。
2. 根据权利要求1所述的细胞电融合芯片系统，其特征在于所述微电 极(8)呈锯齿状排列于微电极组(7)上，设置在相邻微电极组(7)上的微 电极(8)交错相对，微电极组(7)之间形成连续的微通道(9)。
3. 根据权利要求l或2所述的细胞电融合芯片系统，其特征在于所述 微电极(8)呈尖角锯齿状或矩形锯齿状排列在微电极组(7)上。
4. 根据权利要求3所述的细胞电融合芯片系统，其特征在于所述硅片 (5)上设置有多个微电极组(7)和多条微通道(9)。
5. 根据权利要求4所述的细胞电融合芯片系统，其特征在于所述硅片 (5)厚度为40 60pm,玻璃片(6)厚度为500 1000nm。
6. 根据权利要求1所述的细胞电融合芯片系统，其特征在于所述微电 极(8)的信号引出线釆用金丝。
7. 根据权利要求1至6任一权利要求所述的细胞电融合芯片系统，其特 征在于所述微电极组连接的信号引出线各自连接独立的控制信号。
8. 根据权利要求7所述的细胞电融合芯片系统，其特征在于所述细胞 电融合芯片由表及里依次由金电镀层(10)、金溅射层(11 )、硅片(5)层 和玻璃片(6)组成。
9.根据权利要求1所述的细胞电融合芯片系统，其特征在于所述融合 池(3)设置有进样通道(12)和出样通道(13)，所述进样通道(12)的出 液端与出样通道(13)的进液端均与融合池(3)的内腔相通，所述进样通道 (12)和出样通道(13)采用管状结构。
全文摘要
本发明公开了一种细胞电融合芯片系统，包括细胞电融合芯片、PCB板、融合池，融合池包括内腔和设置在表面的芯片安装孔，芯片安装孔与内腔相通，细胞电融合芯片设置在PCB板上，且嵌入设置在芯片安装孔内；细胞电融合芯片由硅片和玻璃片键合而成，硅片上设置有微电极组和微通道，微电机组上设置有多个微电极，本发明不但可以在融合过程中更加方便地观察和记录细胞融合过程，而且提高了细胞电融合芯片的抗化学腐蚀能力、耐高温高压能力、生物相容性能。
文档编号C12M3/00GK101434903SQ20081023327
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月8日 优先权日2008年12月8日
发明者斌 夏, 徐海伟, 毅 曹, 军 杨, 静 杨, 宁 胡, 蓉 许, 郑小林, 阴正勤 申请人:中国人民解放军第三军医大学