专利名称：酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法
技术领域：
本发明涉及谷胱甘肽的高密度发酵生产法，属于生物技术领域。
背景技术：
谷胱甘肽(GSH)，即Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是由三 个氨基酸组成的小肽，通常所说的谷胱甘肽是指还原型谷胱甘肽，其在生物体 内起重要作用。谷胱甘肽是细胞内存在的最丰富的小分子硫醇类化合物，是保 护酶和其他蛋白质的硫氢基的一种抗氧化剂，是细胞内非蛋白硫氢基团的主要 组成部分，参与细胞内的氧化还原反应，是某些酶的辅酶，并对一些巯基酶有 激活作用。越来越多的临床科学实验显示，人体内的谷胱甘肽增加后，对消化 系统、呼吸系统和新陈代谢等等都有帮助。美国著名的医学专家古特曼博士这 样预测"谷胱甘肽很快就会像胆固醇一样，成为人们衡量健康的指标之一 ！"。 由于谷胱甘肽在细胞内的重要作用，谷胱甘肽在医药领域中的广泛应用早已得 到公认，其在食品添加剂、运动营养学、保健品和化妆品上的应用也越来越广 泛。
谷胱甘肽的生产方法主要有萃取法、化学合成法、酶转化法和发酵法。自 1938年发表的GSH制备的最早专利以来，国内外学者围绕GSH的生产开展了大 量的研究。概括来说，萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从含有GSH的动植 物组织中进行GSH的分离提取，由于原料不易获得且GSH的含量极低，因此该 法的实际应用价值不大。化学合成法生产GSH，即将L一谷氨酸、L一半胱氨酸 和甘氨酸縮合成GSH。该法较早用于GSH生产，但操作过程复杂、耗时且得到的 GSH是左旋体和右旋体的混合物，分离十分困难，造成产品纯度不高，且生物效 价很难保持一致。GSH的酶法合成是利用GSH合成酶系，在三磷酸腺苷(ATP)的 存在下将三种组成氨基酸催化形成GSH。该法首先需要获得GSH合成的相关酶系， 其次需要加入价格昂贵的前体氨基酸和ATP，目前还处于实验室研究阶段(国家专利申请号03113418. 1)。综合比较，发酵法生产GSH最具竞争力，是当前世 界上主要的生产方法，并且由于避免了昂贵的ATP消耗，比较经济实用(詹谷 宇等.药学学报，1990; 25 (7) .494-499)。由于微生物容易培养，肉此该法将 具有极大的应用潜力。国外谷胱甘肽的主要产地在口本，应用的是微生物发酵 法生产谷胱甘肽(詹谷宇等，酵母菌生物合成谷胱甘肽，药学学报，1990; 25(7)) 国内谷胱甘肽的研究起步较晚，现在主要还是在一些研究院校内，处于研究阶 段，没有形成一定的生产规模(李寅，陈坚等.氨基酸和酵母膏对谷胱甘肽发 酵的影响，中国医药工业杂志，1998; 29(12): 537—542.)。饶志明等(饶 志明等.产谷胱甘肽重组巴斯德毕赤氏酵母发酵条件的研究.食品与发酵工业， 2007， 33(5) :l-3)研究利用重组巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)x-33 (pGAPZA-gshl)生产谷胱甘肽其产量只有97. 9mg / L，此法利用摇瓶在试验室进 行且产量过低，在实际生产中无意义。董一群等(董一群等.补料方式对酵母菌 生产谷胱甘肽的影响.工业微生物，2003， 33 (1): 19-21)研究了分批发酵及 恒速流加、指数流加和恒pH流加补料方法。其结果为分批补料中GSH含量 323. 39mg/L;恒速流加巾GSH含量为638. 2 mg/L;指数流加中GSH含量为678. 9 mg/L;而恒pH流加补料中GSH含量为977.8mg/L。该试验中明显GSH含量较高 且采用恒pH流加补料其工艺过程易于控制有利于生产，但是其发酵周期为60 小时，同时GSH含量没有显著提高。王峥，谭天伟等(王峥，谭天伟等.谷胱甘 肽发酵过程中的乙醇控制.生物加工过程，2004， 5 (2): 64-67)研究在酿酒酵 母谷胱甘肽发酵中，比较了乙醇控制在一定浓度和逐步卜降两种乙醇控制方式 对谷胱甘肽合成的影响，其结果为后者较好。该研究中GSH含量较高达到 1620mg/L，而此法只有当乙醇形成后并达到一定的检测浓度时才可以进行控制， 虽有一定的指导意义但很有限。在国家专利(专利申请号200510023119. 1)"谷 胱甘肽的生产方法"中指出将带有谷胱甘肽合成酶A和酶B的两种表达重组基因的基因工程大肠杆菌经大规模培养和大规模分离纯化技术，获得酶A和酶B， 并将它们分别用合适的材料固定。该方法中存在以下几个不利因素(1)基因 工程菌因其稳定性差不适合规模生产；(2)大肠杆菌的培养周期较长，在丁业
化生产中容易染菌并延长了生产周期；(3)酶A和酶B的分离纯化也存在难度; (4)用合适的材料固定也使得生产工艺复杂化。国家专利(申请号03113418. 1) "一种提高产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽产量的方法"中指出采用产朊假丝 酵母(Candidautilis) WSH02-08为出发菌株，经斜面培养和种子培养后，接种 在摇瓶培养或发酵罐培养，在发酵液中添加L-半胱氨酸，添加时间0-20小时， 添加浓度6-1O腿ol/L。该方法所得最后产量为400mg/L-520mg/L。该方法虽然 时间短工艺简单，但最后目标产量却较低，仍很难用于生产。国家专利(申请 号200510059998. 3)"酵母发酵联产麦角固醇和谷胱甘肽的方法"中利用同一种 酵母发酵菌种发酵同时生产两种代谢产物-麦角固醇和谷胱甘肽。该方法在生产 谷胱甘肽的情况下又得到了麦角固醇，做到了产业链的良好延伸，谷胱甘肽产 量930mg/L-1561mg/L，但从GSH的产量来看结果仍不理想，并且乙醇含量的控
制仍然存在滞后的问题
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺设计更合理、且能够提高谷胱甘 肽产量的酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法。 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为
一种酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，包括以下歩骤
a. 将斜面酿酒酵母菌种接入摇瓶种子培养基中，在28 32"C温度条件下， 震荡培养10 15小时，震荡频率为100 300rpm;
b. 将震荡培养的种子培养液按发酵培养基体积的10%接入发酵培养基，在 温度为28 32。C、初始搅拌转速为50 150rpm、通风比为0. 5 1. 5VVM条件下 培养6 12小时，当溶解氧低于20% 30%时，提高搅拌转速50 100rpm，使溶解氧保持在20% 30%以上；
c.按发酵培养基体积的10%接入步骤b中的种子培养液，在温度为28 32 。C、初始搅拌转速为50 150rpm,之后每过2 4h增加50 150rpm直到升至 500rpm，初始通气量为0. 5 1VVM，当转速升至500rpm 2 4h后增加至1. 5 2VVM，在此条件下培养10 14h后，开始按2 6g/l.h均速加入流加培养基， 流加培养基的灭菌参数为100 110°C， 10 20分钟；
当呼吸商RQ值大于0.85时，要仅以RQ为补料依据，立即降低流加补料速 率至原流加补料速率的10% 80%，当RQ小于等于0. 85时，每过1 2小时流速 增加10% 50%，同时再以尿素或氨水控制发酵液的pH值在4. 5 5. 5之间，至 28 36h向发酵液中分别添加2 6mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸， 并同时开始降温1 6"，且同时降低流加培养基补料速度的10% 50%，经过36 48h发酵停止发酵，此时酵母的生物量干重达到98 128g/L， GSH总量稳定在 1800mg/L 2470mg/L。
上述步骤a中的摇瓶种子培养基，其配方为葡萄糖20 50g/l;酵母粉3 10g/l; (NH4)2HP04 l 6g/l; MgS04 7H20 0 . 5 1. 5g/l; K2HP04 0. 5 2g/l; KH2P04 0. 5 2g/l。
上述步骤b中的发酵培养基，其配方为葡萄糖40 70g/l;酵母粉10 30 g/1;麦芽汁40 80 g/1; ( 04 5 16 g/1;糖蜜20 50 g/1; MgS04 7H20 2 6 g/1;玉米浆10 30 g/1; K2HP040. 5 2 g/1; KH2PO40. 5 2 g/1; ZnS04 5 15mg/l; FeS04 5 15mg/l; MnS04 5 15mg/l; CuS04 5 15mg/l。
上述步骤c中的流加培养基，其配方为葡萄糖500 700 g/l，酵母粉5 20 g/l，麦芽汁40 80 g/l，玉米浆3 10g/1。
本发明提供的上述酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，对培 养基的配方进行了优化，在过程控制当中实时对发酵尾气进行检测分析，更超
7前的预测酵母细胞的代谢情况，为补料提供了更及时、更准确的指导，给出了 更有利于积累谷胱甘肽的工艺技术参数。同时本发明发现在适量添加前体氨基 酸的同时，降低发酵温度和流加补料的速率可以明显提高酵母中GSH的含量，
此方法在发酵的后段可以节省流加补料的用量，降低生产成本。最终GSH含量 可达1800mg/L以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，实施例中的酿 酒酵母是以从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的1253热带假丝酵母为培
养菌株。
实施例l
a. 将摇瓶种子培养基在12rC灭菌30分钟，自然冷却至室温后，接入斜面 酿洒酵母菌种，在28。C温度条件下，震荡培养15小时，震荡频率为100rpm，
其中摇瓶种子培养基配方为葡萄糖50g/l;酵母粉10g/l; (NH4) 2HP04 3g/l;
MgS04.7H20 lg/l; K2HP04 0.5g/l; KH2P04 0. 5g/l;
b. 将发酵培养基在12rC灭菌30分钟，自然冷却至室温后，将震荡培养的 种子培养液按发酵培养基体积的10%接入，在温度为28t:、初始搅拌转速为 100rpm、通风比为1VVM条件下培养12小时，当溶解氧低于20%时提高搅拌转速 50rpm使溶解氧保持在20。/。以上。其中发酵培养基配方为葡萄糖70g/l;酵 母粉10g/l;麦芽汁80g/l; (NH4)2HP0410g/l;糖蜜20g/l; MgS04 7H20 4 g/1; 玉米浆20 g/l; K2HP04lg/l; KH2P04 lg/l; ZnS04 10mg/l; FeS04 5mg/l; MnS04 5mg/l; CuS04 5mg/l;
c. 将发酵培养基在12rC灭菌30分钟，自然冷却至室温后，按发酵培养基 体积的1(F。接入步骤b中的种子培养液，在温度为28"C、初始搅拌转速为100rpm， 之后每过2h增加50rpm直到升至500rpm，初始通气量为1VVM，当转速升至500rpm2h后增加至2VVM，在此条件下培养14h后，开始按2g/l.h均速加入流加培养 基。流加培养基的配方为葡萄糖700 g/1，酵母粉20 g/1，麦芽汁80 g/1， 玉米浆10g/1。流加培养基的灭菌参数为IO(TC， 20分钟.
当呼吸商RQ值大于0.85时，要仅以RQ为补料依据，立即降低流加补料速 率至原流加补料速率的80%。当RQ小于等于0. 85时，每过1小时流速增加10%。 同时再以尿素控制发酵液的PH值为4. 5，至36h向发酵液中分别添加4mmol/L
的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同时开始降温rc，且同时降低流加培
养基补料速度的10。/。，至48h停止发酵，此时酵母的生物量为108g/L(干重)，GSH 总量为2470mg/L。 实施例2
a. 将摇瓶种子培养基在12rC灭菌30分钟，自然冷却至室温后，接入斜面 酿酒酵母菌种，在32。C温度条件下，震荡培养10小时，震荡频率为300rpm，
其中摇瓶种子培养基配方为葡萄糖40g/l;酵母粉5g/l; (NH4) 2HP04 lg/1;
MgS04*7H20 0. 5g/l; K2HP042g/l; KH2P04 2g/l;
b. 将发酵培养基在12rC灭菌30分钟，自然冷却至室温后，将震荡培养的 种子培养液按发酵培养基体积的10%接入，在温度为32t:、初始搅拌转速为 150rpm、通风比为0.5VVM条件下培养6小时，当溶解氧低于25%时提高搅拌转 速150rpm使溶解氧保持在25。/。以上。其中发酵培养基配方为葡萄糖60g/l; 酵母粉30g/l;麦芽汁40 g/l; (NH4)2HP045 g/l;糖蜜40 g/l; MgS04*7H20 2 g/l;玉米浆10 g/l; K2HP040 . 5 g/l; KH2P04 0. 5 g/l; ZnS04 5mg/l; FeS04 10mg/l; MnS04 15mg/l; CuS04 15mg/l;
c. 将发酵培养基在12rc灭菌30分钟，自然冷却至室温后，按发酵培养基
体积的IO財妾入步骤b中的种子培养液，在温度为32°C 、初始搅拌转速为150rpm， 之后每过4h增加150rpm直到升至500rpm，初始通气量为0. 5VVM，当转速升至500rpm4h后增加至1.5VVM，在此条件下培养10h后，开始按6g/l. h均速加入 流加培养基。流加培养基的配方为葡萄糖600 g/l，酵母粉IO g/l，麦芽汁 60 g/l，玉米浆5g/1。流加培养基的灭菌参数为ll(TC， IO分钟.
当呼吸商RQ值大于0.85时，仅以RQ为补料依据，立即降低流加补料速率 至原流加补料速率的10%。当RQ小于等于0. 85时，每过2小时流加补料速率增 加50%。同时再以氨水控制发酵液的pH值为5. 5，至28h向发酵液中分别添加 6mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同时开始降温6"，且同时降低 流加培养基补料速度的50%，至36h停止发酵，此时酵母的生物量可达到 98g/L (干重)，GSH总量为1895mg/L。
实施例3
a. 将摇瓶种子培养基在12rC灭菌30分钟，自然冷却至室温后，接入斜面 酿酒酵母菌种，在30。C温度条件下，震荡培养12小时，震荡频率为150rpm, 其中摇瓶种子培养基配方为葡萄糖20g/l;酵母粉3g/l; (NH4) 2HP04 6g/1;
MgS04*7H20 1. 5g/l; K2HP04 lg/l; KH2P04 lg/l;
b. 将发酵培养基在12rC灭菌30分钟，自然冷却至室温后，将震荡培养的 种子培养液按发酵培养基体积的10%接入，在温度为3(TC、初始搅拌转速为 50rpm、通风比为1. 5VVM条件下培养8小时，当溶解氧低于30%时提高搅拌转速 100rpm使溶解氧保持在30。/。以上。其中发酵培养基配方为葡萄糖40g/l; 酵母粉20g/l;麦芽汁60g/l; (NH4)2HP0416 g/l;糖蜜50g/l; MgS04*7H20 6 g/l;玉米浆30g/l; K2HP042 g/l; KH2P04 2 g/l; ZnS0415mg/l; FeS04 15mg/l; MnS04 10mg/l; CuS04 10mg/l;
c. 将发酵培养基在12rC灭菌3Q分钟，自然冷却至室温后，按发酵培养基 体积的10。/。接入步骤b中的种子培养液，在温度为30。C、初始搅拌转速为50rpm， 之后每过3h增加100rpm直到升至500rpm，初始通气量为0. 8VVM，当转速升至500rpm 3h后增加至1. 8VVM，在此条件下培养12h后，开始按4g/l. h均速加入 流加培养基。流加培养基的配方为葡萄糖500g/l，酵母粉5g/l，麦芽汁40 g/l， 玉米浆3g/1。流加培养基的灭菌参数为105°C， 15分钟.
当呼吸商RQ值大于0. 85时，要仅以RQ为补料依据，立即降低流加补料速 率至原流加补料速率的30%。当RQ小于等于0.85时，每过1.5小时流速增加 30%。同时再以氨水控制发酵液的pH值为5. 0，至30h向发酵液屮分别添加 2mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同时开始降温3'C，且同时降低 流加培养基补料速度的20%，至42h停止发酵，此时酵母的生物量为128g/L(干 重)，GSH总量为2080mg/L。
对比实施例1
将实施例1流加培养基配方中的麦芽汁、酵母粉和玉米浆去掉，只以700g/L 的葡萄糖配制补料，其它条件不变。这样导致补料以后，培养基中的营养成分 逐渐单一化，不利于细胞的生长和GSH的积累，最终下罐结果为生物量50g/L (细胞干重)，GSH含量452mg/L。
对比实施例2
在实施例2中，28h添加氨基酸后，同时降温6。C，现将降温6"C改为升温 2°C，其它条件不变。由于环境温度的改变，使GSH的积累受到了严重影响，最 终下罐结果为生物量80g/L (细胞干重)，GSH含量352mg/L。
对比实施例3
在实施例3中添加氨基酸为2mmol/L，现将添加量升高为12mmol/L.改变氨 基酸添加量后的最终下罐结果为生物量75g/L (细胞干重),GSH含量630mg/L。 对比实施例4
在实施例3中发酵至30h时，将流加补料的速率降低了 20°/。，现将流加补料 的速率升高20%,其它条件不变。最终下罐结果为生物量65g/L(细胞干重)，GSH 含量430mg/L。
权利要求
1. 一种酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，其特征在于该方法包括以下步骤a. 将斜面酿酒酵母菌种接入摇瓶种子培养基中，在28～32℃温度条件下，震荡培养10～15小时，震荡频率为100～300rpm；b. 将震荡培养的种子培养液按发酵培养基体积的10％接入发酵培养基，在温度为28～32℃、初始搅拌转速为50～150rpm、通风比为0.5～1.5VVM条件下培养6～12小时，当溶解氧低于20％～30％时，提高搅拌转速50～100rpm，使溶解氧保持在20％～30％以上；c. 按发酵培养基体积的10％接入步骤b中的种子培养液，在温度为28～32℃、初始搅拌转速为50～150rpm，之后每过2～4h增加50～150rpm直到升至500rpm，初始通气量为0.5～1VVM，当转速升至500rpm2～4h后增加至1.5～2VVM，在此条件下培养10～14h后，开始按2～6g/l.h均速加入流加培养基，流加培养基的灭菌参数为100～110℃，10～20分钟；当呼吸商RQ值大于0.85时，要仅以RQ为补料依据，立即降低流加补料速率至原流加补料速率的10％～80％，当RQ小于等于0.85时，每过1～2小时流速增加10％～50％，同时再以尿素或氨水控制发酵液的pH值在4.5～5.5之间，至28～36h向发酵液中分别添加2～6mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同时开始降温1～6℃，且同时降低流加培养基补料速度的10％～50％，经过36～48h发酵停止发酵，此时酵母的生物量干重达到98～128g/L，GSH总量稳定在1800mg/L～2470mg/L。
2. 根据权利要求1所述的酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法， 其特征在于该方法的步骤a中所述的摇瓶种子培养基，其配方为葡萄糖20 50g/l;酵母粉3 10g/l;(丽4)2跳l 6g/l; MgS04 7H20 0. 5 1. 5g/1; K2HP(X 0. 5 2g/l; KH2P04 0. 5 2g/l。
3. 根据权利要求1所述的酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，其特征在于该方法的步骤b中所述的发酵培养基，其配方为葡萄糖40 70 g/l;酵母粉10 30g/l;麦芽汁40 80g/l;(丽4)2跳5 16g/l;糖蜜20 50g/l; MgS04 7H20 2 6 g/l;玉米浆10 30 g/l; K2HP040 . 5 2 g/l; KH2P04 0. 5 2g/l; ZnS04 5 15mg/l; FeS04 5 15mg/l; MnS04 5 15mg/l; CuS04 5 15mg/l。
4. 根据权利要求1所述的酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方 法，其特征在于该方法的步骤c中所述的流加培养基，其配方为葡萄糖500 700 g/l，酵母粉5 20 g/l，麦芽汁40 80 g/l，玉米浆3 10g/1。
全文摘要
本发明提供了一种酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，以酿酒酵母为培养菌株，经过扩大培养，在过程控制中实时对发酵尾气进行检测分析，超前预测酵母细胞的代谢情况，为补料提供更及时、更准确的指导，给出了更有利于积累谷胱甘肽的工艺技术参数。同时本发明发现在适量添加前体氨基酸的同时，降低发酵温度和流加补料的速率可以明显提高酵母中GSH的含量，此方法在发酵的后段可以节省流加补料的用量，降低生产成本。最终GSH含量可达1800mg/L以上。
文档编号C12R1/865GK101429537SQ20081023383
公开日2009年5月13日 申请日期2008年12月14日 优先权日2008年12月14日
发明者曲国臣, 彬 段, 王选性, 贾子龙 申请人:甘肃正生生物科技有限公司