专利名称：一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒及其构建方法
技术领域：
本发明属于质粒构建领域，具体涉及一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒，及该质 粒的构建方法。
背景技术：
随着石油资源的不断消耗，世界范围内的邮价迅速飙升，此外化石能源的大量使用对环 境造成了严重的影响。世界各国都投入大量的人力、财力和物力进行町再生生物质能源的开 发。其屮，乙醇由于可以利用多种可再生原料生产而且对环境几乎没有污染，成为最有前景 的石油替代能源之一。乙醇可以以淀粉、含糖的经济作物作为原料，也可以以木质纤维素类 生物质作为原料通过微生物发酵进行生产。木质纤维素原料是地球上产量最大，成本最低的 原料，是生产乙醇的最理想原料，纤维素乙醇具有非常广阔的发展前景。木质纤维素原料经 过化学或生物的方法可以水解为单糖，其水解物的主要成分是葡萄糖，其次是木糖，再次是 阿拉伯糖，还有很少量的其它糖类。自然界中能发酵生产乙醇的微生物大多数都只能利用木 质纤维素水解物中的葡萄糖，不能利用其中的戊糖，如木糖和阿拉伯糖。因此对原料的利用 率不高，造成纤维素乙醇的生产成本偏高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种携带木糖代谢相关基因的/'宿主质粒及它的构建方法，为培 育能利用木质纤维素水解物中的木糖发酵生产乙醇的优良茼种做了必要的准备工作。
本发明提供的一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒，包括四个木糖代谢相关基因， 其特征在于该质粒的序列如SEQ ID NO:l所示，以大肠杆菌DH5 a为载体菌，转化重组质粒 pBBRlMCS2-ABAT的大肠杆菌DH5 a ，分类命名为大肠埃希氏菌Ajcfe/7'c/z/fl co仏已于2008年 11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏登记号为 CGMCC NO. 2739。
所述四个木糖代谢相关基因为木糖异构酶基因xyL4、木酮糖激酶基因x;;/S、转醛酶基因 to^4和转酮糖酶基因汰"，均来源于￡ co/z'DH5 a菌株。
一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒的构建方法，其特征在于包括如下操作步骤
(1) 分别设计砂"、矽W、 to"和汰"四种目的基因的特异性引物，以￡. DH5a为目的 基因的来源菌株，通过PCR扩增相应基因；
(2) 步骤(1)中得到的4种PCR产物与其对应的pDONR载体进行BP重组，得到4个目 的基因的入门克隆；
(3) 4个目的基因的入门克隆与pDEST14进行LR重组，最终得到pDEST14-ABAT质粒；
(4) J6a I和顺e I双酶切pDEST14-ABAT质粒的产物ABAT与ife I单酶切的载体pBBRlMCS2连接，经转化、筛选、酶切鉴定、测序后，得到重组质粒pBBRlMCS2-ABAT。 所述步骤(1)中的四种目的基因扩增所用引物分别为
(1) 扩增xylA基因所用引物 上游引物
CAGTGTGAA-3' (SEQ ID No: 2)
下游引物
-3' (SEQ ID No: 3)
(2) 扩增xyB基因所用引物 上游引物
G-3， (SEQ ID No: 4 ) 下游引物
ACCAGC-3' (SEQ ID No: 5 )
(3) 扩增talA基因所用引物 上游引物
TCCAA-3' (SEQ ID No: 6 )
下游引物
(SEQ ID No: 7 )
(4)扩增tktA基因所用引物 上游引物
TC-3' (SEQ ID No: 8) 下游引物
ATGCA-3， (SEQ ID No: 9 )
所述步骤(4)中测序引物为
Seq TCA1: 5，-TTAACGCTTACAATTTCC-3' (SEQ ID No: 10 ) Seq TCA2: 5'-ACACGCCTTATCTATTGC隱3， ( SEQ ID No: 11 ) Seq TCA3: 5'-TGGGTGTAAACCATCACC陽3' (SEQ ID No: 12 ) Seq TCA4: 5'-TCATGACCGTCGATGTCG-3' (SEQ ID No: 13 ) Seq TCA5: 5，-TAACGACTTGACGACAGC-3， (SEQ ID No: 14 ) SeqTCA6: 5'-AACAGCAGCGTCAGGTTG-3' (SEQ ID No: 15 ) SeqTCA7: 5，-CATTACGAGTAACCAACG-3， (SEQ ID No: 16) SeqTCA8: 5，-CTTGCTTAAGAACCCTTC-3, (SEQ ID No: 17 ) SeqTCA9: 5，-AGGTGCCAAGATCTATCC-3， (SEQ ID No: 18 ) SeqTCA10: 5，-ATAAGCAACGTGCCCTGG-3' (SEQ ID No: 19 )
所述步骤(4)中ABAT与载体pBBRlMCS2连接为正向连接或反向连接。本发明的特点利用Gateway克隆技术进行4个木糖代谢相关酶基因的克隆构建，可以 大大縮短实验周期。将该质粒转入产乙醇的微生物菌种有望能高效利用木糖生产乙醇，降低 纤维素乙醇的生产成本。
图1为pDEST14-ABAT质粒构建的流程图2为入门克隆环状质粒和质粒酶切电泳分析图谱；
A:质粒电泳图谱
1: pENTRY221-Ll-xylA-R5 (4066bp), 2: pENTRY221-L5-xy旧-L4(4253bp), 3: pENTRY221-R4-talA-R3(3887bp), 4: pENTRY221-L3-tktA-L2(4877bp)
M: DNA分子量标记 B:质粒WteI酶切电泳图谱
5: pENTRY221-Ll-xylA-R5 ( 3800+266bp), 6: pENTRY221-L5-xylB-L4(3987+266bp), 7: pENTRY221-R4-talA-R3 (3621+266bp)，8: pENTRY221誦L3-tktA-L2(461 l+266bp)， M: DNA分子量标记 图3为入门克隆质粒结构A: pENTRY221-Ll-xylA-R5， B: pENTRY221-L5-xy旧-L4， C: pENTRY221-R4-talA-R3 D: pENTRY221-L3-tktA-L2
图4为pDEST14-ABAT环状质粒和质粒酶切电泳分析图谱； A: pDEST14-ABAT质粒及该质粒3g/ II酶切电泳图谱 1: pDEST14-ABAT质粒(11381bp)，
2: pDEST14-ABAT质粒用Bg/II单酶切(1651+2757+6973bp)
M: DNA分子量标记 B: pDEST14-ABAT质粒I酶切电泳图谱
3: pDEST14-ABAT质粒用A^e I单酶切(11381bp)
M: DNA分子量标记 图5为pDEST14-ABAT质粒结构图； 图6为pBBRlMCS2质粒结构图7为pBBRlMCS2-ABAT环状质粒和质粒酶切电泳分析图谱； 1: pBBRlMCS2-ABAT质粒用《/w I单酶切(5484+6756bp) 2: pBBRlMCS2 -ABAT质粒用￡coR I单酶切(1924+3866+6450bp) 3: pBBRlMCS2-ABAT质粒用&oRV单酶切(2836+4149+5255bp) 图8为pBBRlMCS2-ABAT质粒结构图。
具体实施方式
实施例l入门克隆的构建
1.1含木糖异构酶基因(xylA)入门克隆pENTRY221-Ll-xylA-R5的构建
扩增attBl-xylA-attB5r片段以co// DH5 a (Invitrogen, Cat. No. 18263-012)为目的基
因的来源菌株，根据GeneBank上的序列资料(Accession Number: U00096) xylA基因对应的
3727444-3728卯0位核苷酸，并在基因两端引入attBl和attB5r重组片段，设计引物如下 上游弓|物attBl-xylA—for (57bp):_
attBl
CAGTGTGAA-3 ， ( SE Q ID No: 2) 下游弓l物attB5r-xylA一rev (49bp):
attB5r
-3， (SEQ ID No: 3) 使用Taq DNA Polymerase (Sigma, Cat. No. D1806), PCR反应体系如下:
10xPCR Buffer 5率
dNTP mix (10mM each) l単
attB 1 -xylA_for (1 O一) 0.5nl
attB5r-xylA_rev(10nM) 0.5^1
Taq DNA Polymerase (5U 1) 1.0^1
ddH20 42.0)il
co// DH5a single colony trace
Total Volume 50^1
用bio-radPTC-240PCR仪进行反应，PCR循环条件为:
3min 30s 30s 2min 35 cycles lOmin
PCR产物纯化用QIAquick Gel Extraction Kits (QIAGEN, Cat. No. 28706)对PCR产物
进行回收纯化。
纯化好的attBl-xylA-attB5r片段与pDONR Pl-P5r载体(Invitrogen, Cat. No. 12537-104)
进行BP重组反应，BP反应体系如下
attBl-xylA-attB5r 4.0|il
pDONRPl-P5r 1.0|il
lx TE Buffer, pH 8.0 3都1
BP Clonase II enzyme mix (Invi加gen， Cat No. 11789-020) 2.0|il
Total Volume 10.0^1
25°C反应1小时，加lul蛋白酶K (Invitrogen, Cat. No. 12537-104) , 37°C保温10分钟。 转化￡ co// One Shot Machl T1R感受态细胞(Invitrogen, Cat. No. C8620-03 )，涂含
6
1 94°C
2 94°C
3 50°C
4 72°C
5 Step 2~4
6 720C50mg/L卡那霉素的LB抗性平板，挑取阳性克隆，培养扩增后用QIAprep Spin Miniprep Kit
(QIAGEN， Cat. No. 27106)进行抽提，用MzeI单酶切鉴定(图2-B)，大小正确的命名为
pENTRY221-Ll-xylA-R5，质粒电泳图如图2-A,结构图如图3-A。
1.2含木酮糖激酶基因(xylB)入门克隆pENTRY221-L5-xyffi-L4的构建
扩增attB5-xylB-attB4片段以DH5 a (Invitrogen， Cat. No. 18263-012)为目的基
因的来源菌株，根据GeneBank上的序列资料(AccessionNumber: U00096) xylB基因对应的
3725769- 3727465位核苷酸，并在基因两端引入attB5和attB4重组片段，设计引物如下 上游弓i物attB5-xyffi_for (50bp):
attB5
G-3， (SEQ ID No: 4) 下游引物attB4-xylB—rev (55bp):
attB4
ACCAGC-3， (SEQIDNo:5) 使用Taq DNA Polymerase (Sigma, Cat No. D1806), PCR反应体系如下
10xPCR Buffer 5都1
dNTP mix (10mM each) 1.0|il
attB5-xylB—for(10nM) 0.5^1
attB4-xylB—rev(10nM) 0.5|il
Taq DNA Polymerase (5,) 1 .O^il
ddH20 42.0|al
co// DH5ot single colony trace
Total Volume 50|il
用bio-rad PTC-240 PCR仪进行反应，PCR循环条件为
1 94°C 3min
2 94°C 30s
3 50°C 30s
4 72。C 2min
5 Step 2 4 35 cycles
6 72。C lOmin
PCR产物纯化用QIAquick Gel Extraction Kits (QIAGEN, Cat. No. 28706)对PCR产物
进行回收纯化。
纯化好的attB5-xylB-attB4片段与pDONRP5-P4载体(Invitrogen， Cat. No. 12537-104)进 行BP重组反应，BP反应体系如下
attB5-xy旧-attB4 4.0^1
pDONRP5-P4 l.O^il
lx TE Buffer, pH 8.0 3単
BP Clonase II enzyme mix (Invitrogen， Cat. No. 11789-020) 2.0|jJ
Total Volume lO.O(il25。C反应1小时，加1^1蛋白酶K (Invi加gen, Cat, No. 12537-104) ， 37°C保温10分钟。 转化￡. co/z' One Shot Machl T1R感受态细胞(Invitrogen, Cat. No. C8620-03)，涂含
50mg/L卡那霉素的LB抗性平板，挑取阳性克隆，培养扩增后用QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Cat No. 27106)进行抽提，用iVfe I单酶切鉴定(图2-B)，大小正确的命名为
pENTRY221-L5-xylB-L4，质粒电泳图如图2-A，结构图如图3-B。
1.3含转醛酶基因(talA)入门克隆pENTRY221-R4-talA-R3的构建
扩增attB4r-talA-attB3r片段以co/Z DH5 a (Invitrogen, Cat. No. 18263-012)为目的基
因的来源菌株，根据GeneBank上的序列资料(Accession Number: U000%) talA基因对应的
2576489-2577713位核苷酸，并在基因两端引入attB4r和attB3r重组片段，所用的引物是 上游引物attB4r-talA_for (54bp):
attB4r
TCCAA-3， (SEQ ID No: 6 ) 下游引物attB3r-talA_rev (46bp):
attB3r
(SEQ ID No: 7 )
使用Taq DNA Polymerase (Sigma, Cat. No. D1806), PCR反应体系如下
1 Ox PCR Buffer 5単
dNTP mix (10mM each) l都l
attB4r-talA—for(10|iM) 0.5|il
attB3r-talA—rev(10nM) 0.5|_il
Taq DNA Polymerase (5，) 1都l
ddH20 42.0nl
E. DH5a single colony trace
Total Volume 50(al
用bio-rad PTC-240 PCR仪进行反应，PCR循环条件为
1 94。C 3min
2 94°C 30s
3 50°C 30s
4 72°C 2min
5 Step 2~4 35 cycles
6 72°C lOmin
PCR产物纯化用QIAquick Gel Extraction Kits (QIAGEN, Cat. No. 28706)对PCR产物
进行回收纯化。
纯化好的attB4r-talA-attB3r片段与pDONR P4r-P3r载体(Invitrogen, Cat. No. 12537-104)
进行BP重组反应，BP反应体系如下
attB4r-talA-attB3r 4.0^1 pDONRP4r-P3r l.O^il1 xTE Buffer, pH 8.0 3単 BP Clonase II enzyme mix (Invitrogen, Cat. No. 11789-020) 2.0^1 Total Volume lO.Opl
25。C反应1小时，加lpl蛋白酶K (Invitrogen, Cat. No. 12537-104) ， 37。C保温10分钟。
转化co/,' One Shot Machl T1R感受态细胞(Invitrogen, Cat. No. C8620-03)，涂含
50mg/L卡那霉素的LB抗性平板，挑取阳性克隆，培养扩增后用QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Cat. No. 27106)进行抽提，用iVtel单酶切鉴定(图2-B)，大小正确的命名为
pENTRY221-R44alA-R3,质粒电泳图如图2-A,结构图如图3-C。
1.4含转酮糖酶基因(tktA)入门克隆pENTRY221-L3-tktA-L2的构建
扩增attB3-tktA-attB2片段以co// DH5 a (Invitrogen, Cat. No. 18263-012)为目的基因
的来源菌株，根据GeneBank上的序列资料(Accession Number: U00096) tktA基因对应的
3077508-3079827位核苷酸，并在基因两端引入attB3和attB2重组片段，所用的引物是 上游引物attB3-tktA一for (51 bp):
attB3
ATC-3， (SEQ ID No: 8 ) 下游弓0勿attB2-tktA一rev (54bp):
attB2
ATGCA誦3' (SEQ ID No: 9 ) 使用Taq DNA Polymerase (Sigma， Cat. No. D1806), PCR反应体系如下
10xPCR Buffer 5羊
dNTP mix (lOmM each) 1.0)^1
attB3-tktA—for(lO同 0.5^il
atffi2-tktAjrev(10nM) 0.5nl
Taq DNA Polymerase (5U/Vl) 1 ~1
ddH20 42%1
五.co// DH5a single colony trace
Total Volume 50^1
用bio-rad PTC-240 PCR仪进行反应，PCR循环条件为
1 94°C 3min
2 94°C 30s
3 50°C 30s
4 72。C 2min
5 Step 2~4 35 cycles
6 72°C lOmin
PCR产物纯化用QIAquick Gel Extraction Kits (QIAGEN， Cat. No. 28706)对PCR产物
进行回收纯化。
纯化好的attB3-tktA-attB2片段与pDONR P3-P2载体(Invitrogen, Cat. No. 12537-104)进行BP重组反应，BP反应体系如下:
pDONR P3-P2
lx TE Buffer, pH 8.0
BP Clonase II enzyme mix (Invitrogen, Cat. No. 11789-020) Total Volume
attB3-tktA-attB2
4単
2， 10単
25。C反应1小时，加1^1蛋白酶K (Invitrogen, Cat. No. 12537-104) , 37。C保温10分钟。 转化￡. co/Z One Shot MachlTMTlR感受态细胞(Invitrogen, Cat. No. C8620-03)'涂含
50mg/L卡那霉素的LB抗性平板，挑取阳性克隆，培养扩增后用QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Cat. No. 27106)进行抽提，用I单酶切鉴定(图2-B)，大小正确的命名为
pENTRY221-L3-tktA-L2,质粒电泳图如图2-A，结构图如图3-D。
得到的4个入门克隆环状质粒和质粒酶切鉴定的电泳分析图谱见图2，结构图见图3。用
下面的1对引物分别对得到的4个入门克隆进行测序，以确定目的基因在PCR扩增和其它操
作过程中没有发生突变或移码。
正向引物M13 Forward (16bp) 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' (SEQ ID No: 20) 反向引物M 13 Reverse (17bp) 5 ，-CAGGAAACAGCTATGAC-3' (SEQ ID No: 21)
实施例2 pDEST14-ABAT质粒的构建
用pDEST14质粒(Invitrogen)与得到的4个入门克隆进行LR重组反应，pDEST14-ABAT
质粒构建流程见图l，将4个入门克隆稀释到大约10fmoles/nl，反应体系如下 pENTRY221-L l-xylA-R5
pENTRY221-L5-xy旧-L4 ^
pENTRY22卜R4-talA陽R3 " pENTRY221 -L34ktA-L2
pDEST14 (20fmoles/nl) l.O(il lxTE Buffer, pH 8.0
LR ClonaseTM Plus enzyme mix (Invitrogen, Cat. No. 12538-120) 2.0|ul
Total Volume lO-Opl
25。C反应16小时，加lyl蛋白酶K (Invitrogen, Cat. No. 12537-104) ， 37。C保温10分钟。
转化One Shot Machl T1R感受态细胞(Invitrogen, Cat. No. C8620-03),涂含 100mg/L氨苄青霉素的LB抗性平板，挑取阳性克隆，培养扩增后用QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Cat. No. 27106)进行抽提，用Mze I或￡g/II单酶切鉴定，大小正确的重组质粒 命名为pDEST14-ABAT，环状质粒和质粒酶切鉴定的电泳分析图谱见图4-A和图4-B，质粒
结构图见图5。
实施例3 pBBRlMCS2-ABAT质粒的构建
pDEST14-ABAT质粒用A》al (Takara, Catalog No. D1093A)和iW e I (Takara， CatalogNo.D1162A)(与力al为同尾酶，产生相同的粘性末端)双酶切，pBBRlMCS2质粒用Ma I 单酶切，酶切体系如下
AB
10xM buffer5.0fil10xM buffer
勘I2単2単
齒I
0.1% BSA5単0.1% BSA5都1
pDEST14-ABAT20牟pBBRlMCS220都1
ddH2016.0|xlddH2018.0^1
Total volume50羊Total volume50単
将pBBRlMCS2质粒(Kovach et al 1995，谢菲尔德大学Wei Huang博士赠送，见图6)
用力a I单酶切的产物去磷酸化，pDEST14-ABAT质粒用JKw I和I双酶切得到7096bp
的ABAT片段，将二者用QIAquick Gel Extraction Kits (QIAGEN， Cat. No. 28706)进行回收
纯化。纯化后的ABAT片段和载体pBBRlMCS2用T4 DNA连接酶(Takam， Cat. No. D2011A)
进行连接，连接反应体系如下
10xT4 DNA ligase buffer 2単 Xbal-pBBRlMCS2-Xbal
Xbal-ABAT-Nhel 10単
T4 DNA ligase 1.0|al
ddH20 _5,1
Total volume 20.0^1
将上述体系混匀，瞬时离心，16。C连接过夜。
连接产物转化co" DH5a感受态细胞(TIANGEN， Cat. No. CB101-02)，涂含50mg/L 卡那霉素、0.5mM IPTG和80mg/L X-Gal的LB筛选平板，挑取白色的阳性克隆，培养扩增 后用QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN， Cat. No. 27106)进行抽提，用K/w I、 ￡coR I或 5coRV单酶切鉴定，大小正确的重组质粒命名为pBBRlMCS2-ABAT，环状质粒和质粒酶切 鉴定的电泳分析图谱见图7，质粒结构图见图8。
设计了引物对重组质粒pBBRlMCS2-ABAT进行单向测序，经测序证实目的片段与预期 一致。
序列
5 '-TTAACGCTTACAATTTCC-3' 5'-ACACGCCTTATCTATTGC-3' 5' -TGGGTGTA AACC A TC A CC-3' 5 '-TCATGACCGTCGATGTCG-3' 5' -TAACGACTTGACGACAGC-3 5'-AACAGCAGCGTCAGGTTG-3 5'-CATTACGAGTAACCAACG-3
序列表中编号
(SEQ ID No (SEQIDNo (SEQ ID No (SEQIDNo (SEQ ID No (SEQIDNo (SEQ ID No
10 )
11 )
12 )
13 )
14 )
15 )
16 )
J定的目的序列在重组质粒 上的定位 3006-3805 3619-4418 4318-5117 504N5840 5735-6534 6444-7243 7165-79645 ，-CTTGCTTAAGAACCCTTC-3 ， (SEQIDNo:17 ) 7955-8754
5'-AGGTGCCAAGATCTATCC-3， (SEQIDNo:18 ) 8734-9533
5'-ATAAGCAACGTGCCCTGG-3， (SEQIDNo:19 ) 9507-10316SEQUENCE LISTING
<110>清华大学
<120> —种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒及其构建方法
<160> 21
< 170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 12240
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pBBRlMCS2-ABAT重组质粒全序列
<400> 1
ctcgggccgt ctcttgggct tgatcggcct tcttgcgcat ctcacgcgct cctgcggcgg 60
cctgtagggc aggctcatac ccctgccgaa ccgcttttgt cagccggtcg gccacggctt 120
ccggcgtctc aacgcgcttt gagattccca gcttttcggc caatccctgc ggtgcatagg 180
cgcgtggctc gaccgcttgc gggctgatgg tgacgtggcc cactggtggc cgctcc鄉g 240
cctcgtagaa cgcctgaatg cgcgtgtgac gtgccttgct gccctcgatg ccccgttgca 300
gccctagatc ggccacagcg gccgcaaacg tggtctggtc gcgggtcatc tgcgctttgt 360
tgccgatgaa ctccttggcc gacagcctgc cgtcctgcgt cagcggcacc acgaacgcgg 420
tcatgtgcgg gctggtttcg tcacggtgga tgctggccgt cacgatgcga tccgccccgt 480
acttgtccgc cagccacttg tgcgccttct cgaagaacgc cgcctgctgt tcttggctgg 540
ccgacttcca ccattccggg ctggccgtca tgacgtactc gaccgccaac acagcgtcct 600
tgcgccgctt ctctggcagc aactcgcgca gtcggcccat cgcttcatcg gtgctgctgg 660
ccgcccagtg ctcgttctct ggcgtcctgc tggcgtcagc gttgggcgtc tcgcgctcgc 720
ggtaggcgtg cttgagactg gccgccacgt tgcccatttt cgccagcttc ttgcatcgca 780
tgatcgcgta tgccgccatg cctgcccctc ccttttggtg tccaaccggc tcgacggggg 840
cagcgcaagg cggtgcctcc ggcgggccac tcaatgcttg agtatactca ctagactttg 900
cttcgcaaag tegtgaccgc ctacggcggc tgcggcgccc tacgggcttg ctctccgggc 960
ttcgccctgc gcggtcgctg cgctcccttg ccagcccgtg gatatgtgga cgatggccgc 1020
gagcggccac cggctggctc gcttcgctcg gcccgtggac aaccctgctg gacaagctga 1080
tggacaggct gcgcctgccc acgagcttga ccacagggat tgcccaccgg ctacccagcc 1140
ttcgaccaca tacccaccgg ctccaactgc gcggcctgcg gccttgcccc atcaattttt 1200
ttaattttct ctggggaaaa gcctccggcc tgcggcctgc gcgcttcgct tgccggttgg 1260acaccaagtg ga鄉cgggt caaggctcgc gcagcgaccg cgcagcggct tggccttgac 1320
gcgcctggaa cgacccaagc ctatgcgagt gggggcagtc gaaggcgaag cccgcccgcc 1380
tgccccccga gcctcacggc ggcgagtgcg ggggttccaa gggggcagcg ccaccttggg 1440
caaggccgaa ggccgcgcag tcgatcaaca agccccggag gggccacttt ttgccggagg 1500 gggagccgcg ccgaaggcgt gggggaaccc cgc鄉ggtg cccttctttg ggcacc雄g 1560
aactagatat agggcgaaat gcgaaagact t犯,tcaa caacttaaaa aaggggggta 1620 cgcaacagct cattgcggca ccccccgcaa tagctcattg cgtaggttaa agaaaatctg 1680 taattgactg ccacttttac gc咖gcata attgttgtcg cgctgccgaa aagttgcagc 1740 tgattgcgca tggtgccgca accgtgcggc accctaccgc atggagataa gcatggccac 1800 gcagtccaga gaaatcggca ttcaagccaa gaacaagccc ggtcactggg tgcaaacgga I860 acgcaaagcg catgaggcgt gggccgggct tattgcgagg aaacccacgg cggcaatgct 1920 gctgcatcac ctcgtggcgc agatgggcca ccagaacgcc gtggtggtca gccagaagac 1980
actttccaag ctcatcggac gttctttgcg gacggtccaa tacgcagtca aggacttggt 2040 ggccgagcgc tggatctccg tcgtgaagct caacggcccc ggcaccgtgt cggcctacgt 2100 ggtcaatgac cgcgtggcgt ggggccagcc ccgcgaccag ttgcgcctgt cggtgttcag 2160 tgccgccgtg gtggttgatc acgacgacca ggacgaatcg ctgttggggc atggcgacct 2220 gcgccgcatc ccgaccctgt atccgggcga gcagcaacta ccgaccggcc ccggcgagga 2280
gccgcccagc cagcccggca ttccgggcat ggaaccagac ctgccagcct tgaccgaaac 2340 ggaggaatgg gaacggcgcg ggcagcagcg cctgccgatg cccgatgagc cgtgttttct 2400 ggacgatggc gagccgttgg agccgccgac acgggtcacg ctgccgcgcc ggtagcactt 2460 gggttgcgca gcaacccgta agtgcgctgt tecagactat cggctgtagc cgcctcgccg 2520
ccctatacct tgtctgcctc cccgcgttgc gtcgcggtgc atggagccgg gccacctcga 2580 cctgaatgga agccggcggc acctcgct犯cggattcacc gtttttatca ggctctggga 2640 ggcagaataa atgatcatat cgtcaattat tacctccacg gggagagcct gagcaaactg 2700
gcctcaggca tttgagaagc acacggtcac actgcttccg gtagtcaata aaccggtaaa 2760
ccagcaatag acataagcgg ctatttaacg accctgccct gaaccgacga ccgggtcgaa 2820
tttgctttcg aatttctgcc attcatccgc ttattatcac ttattcaggc gtagcaccag 2880
gcgtttaagg gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc cactcatcgc 2940
agtcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca 3000
aaatattaac gcttacaatt tccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg 3060
atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 3120
attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga 3180
gcgcgcgtaa tacgacteac tat鄉gcga attggagctc caccgcggtg gcggccgctc 3240
14tagcgctata tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc 3300
gctttggccg ccgcccagtc ctgctegctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga 3360
tcatggcgac cacacccgtc ctgtggatat ccggatatag ttcctccttt cagcaaaaaa 3420
cccctcaaga cccgtttaga ggccccaagg ggttatgcta gttattgctc agcggtggca 3480
gcagccaact cagcttcctt tcgggctttg ttagcagccg gateatcacc actttgtaca 3540
agaaagctgt gtcaatacgc atatcgtgat gcatattaca taattgatat ttattgcata 3600
taaatatttg tgatctacaa cacgccttat ctattgcttg tccgcaaacg gacatatcaa 3660
ggtaataaaa a鄉tcgccg aagcgacctt tttacccgaa atgctoatta cagcagttct 3720
tttgctttcg caacaacgtt atcaacagtg aagccgaact cttcaaacag cagctctgcc 3780
ggagcagatt caccgaaggt ggtcataccg acgatagcac cgttcaggcc aacatacttg 3840
taccagtagt cagcaatacc cgcttctaca gcaacgcgtg cagtaaccgc tttcggcagt 3900
acggattcac ggtaagcagc atcctgcttg tcaaatgcgt cggtagacgg catggacacc 3960
acgcgcgctt tcacgccttc ggcagtcagt ttttcgtagg cagcaacagc cagttcaact 4020
tctgaaccgg tagcgatgaa aatcagttcc ggctgaccgg cgcagtcttt cagcacataa 4080
ccaccgcgcg cgatgtttgc cagttgctct tcagttcgtt cctgctgcgc caggttctga 4140
cgggagagga tcagtgcggt cgggccgtcc tgacgctcaa caccgtattt ccacgcgacc 4200
gcggattcaa cctggtcaca cggacgccat gtagacatgt tcggggttac gcgcagagaa 4260
gcgacctgct caaccggctg gtgagtcggg ccgtcttcgc ccagaccgat ggagtcgtgg 4320
gtgtaaacca tcacctgacg ctgtttcatc agcgcagcca tacgtacggc gttacgtgcg 4380
tattccacga acatcaggaa ggtggaggtg tacggcagga agccaccgtg cagggagata 4440
ccgttagcaa tcgcggtcat accgaactcg cgaacaccgt agtggatgta gttacccgca 4500
gcatcttcgt tgattgcttt agaaccagac cacagggtca ggttagacgg cgccaggtca 4560
gcagaaccgc cgaggaattc cggcaacagc ggaccgaacg cttcgatagc attctgagac 4620
gctttacggc tggcgatttt cgccggatta gcctgcagtt tagcgatgaa ctotttcgct 4680
ttagcgtcga agtcagacgg catttcgcct ttcatacggc gggtaaattc agcggcttcc 4740
tgcggataag ctttcgcgta agcagcgaat ttctcgttcc atgcggattc tttcgcctgg 4800
cctgcttctt tcgcatccca ctgagcatag atttcagacg ggatttcgaa cggcgcatat 4860
ttccagccca gttgttcgcg ggtcagggca atttcagcgt cgcccagcgg cgcaccgtgg 4920
gagtcgtggg taccggcttt gttcggggaa ccg認ccga tgatggtttt gcacatcagc 4980
agggaaggtt tgtcagtcac tgcgcgcgct tcttctactg cgcgtttgat agatgccgcg 5040
tcatgaccgt cgatgtcgcg aataacgtgc cagccgtaag cttcgaaacg cattgcggtg 5100
tcgtcggtga accagccttc aacgtgacca tcgatagaaa taccgttgte atcgtagaat 5160
gcaatcagtt tacccagctt cagcgtaccc gccagagagc aaacttegtg ggagatgcct 5220tccatcatgc agccgtcgcc catgaaggcg taggtgtagt ggtcgacaat gtcgtggccc 5 280
ggacggttaa actgcgccgc cagcgttttt tctgcaatcg ccataccgac tgcgttggca 5340
ataccctgac ccagcggacc ggtggtggtt tccacaccag cggtgtaacc cacttccggg 5400
tgacccggag ttttagagtg cagctgacgg aagtttttca gttcttocat cggcagatcg 5460
taaccggtga ggtgcagcag gctgtagatc agcatggagc cgtggccgtt ggacagcacg 5520
aagcggtcac ggtcagccca ggacggattc tgcgggttgt gtttcaggaa atcacgccac 5580 aggacttcgg caatgtoagc catacccata ggggcacccg ggtgaccgga tttggcttte 5640
tgtactgcgt ccatgctcag cgcacgaata gcattggcaa gctctttacg tgaggacatt 5700
ttgactccag atcggatgat gaagggcacg cccttaacga cttgacgaca gcgcgttttg 5760 ggctacgccg gaaaatttgc caacaattta ccgcaagccg cgcgtcatgt acatggaaca 5820
tccttttgcc gcttcagaaa tctctggatc atgctcgcat gttgcgcaac aactttatta 5880
tacaaagttg tgtaccgcat ccatactgag tgcgcggatc gcattggcaa ggtcttttcg 5940 ggacatataa cactccgtgg ctggtttata gtttggcggc aagaagatct tccagtttgc 6000
gttgatcaac ggcgaacaga cgaatgcctt cagacagttt ttctaccgcc atcgcatcct 6060
gattgtgctc ccaacggaac tccgcttcgc teatgggagc tgggcgtggg aacgtctgag 6120
gaggtgggat taatttacgt accactggcg aaactttttc ctgcagctcc ttcagtaaat 6180
tcggtgcgat agtcagtcga tcgcagccgg ttaaggcgag gatttgttcg gtgcgacgga 6240
agctcgcgcc catcacaatg gtttcatagt ggtgttgctt atagtagtcg tagatattgc 6300
gcaccgattt aacgcccgga tcttcttcca ccacatacgg gtccatcggc ttgcgtgcct 6360
gataccagtc ataaatacgc ccgacaaacg gcgaaatcag aaaaacgcct gcttccgcac 6420
鄉cccgtgc ctgtgca犯a ga犯acagca gcgtcaggtt gcagtteata ccttcttttt 6480
ccagctcttc tgccgcgcga attccttccc aggtcgaagc cagcttgatc agaatgcgtg 6540
atttctcaac gccttgttgc tgatacaagt ccaccagatg gcgcgccttc tcaatactct 6600
tttctttatc aaaagagagg cgtgcatcaa cttctgttga cacgcgaccg ggtacgattt 6660
tgaggatttc agcaccgaaa ttgaccgcca gtttgtcaca cgctgcgacc acctgttgtt 6720
cctgggtctt gccatttttt ttaccccagg cgatagcatc gtctattaaa tgctcatatt 6780
gtgataatcc ggcagctttg agtaacagcg aaggattggt ggtggcatcc tggggatgat 6840
aatggcgaat ggactcaata tcgccgctgt ctgccacgac agtggtgaac tgtttgatgc 6900
cgtctaactc gttcat鄉a aatectcctt gaaaagtaaa gtgttagatg agtgcgttea 6960
ttcacacttc tgagaaattt cgctaaacgc atcaaaaaag catagcagac aggcatggta 7020
ttgctggatt aagcaggtaa catcagtgtt ataggattat taccaaaaca ttatattaat 7080
ggtgagagtt tggacttgct caagtctgta gactcaactt tgtatagaaa agttgcataa 7140
cgatctccat atcteccagc gatacattac gagtaaccaa cgaaagacaa aactgaaaaa 7200tgccattaac aaatgatttt cagaataaat tcatectaaa tattaattaa ttectgagat 7260
atatagatgt gaattatccc ccacccggtc aggcagggga taacgtttac gccattaatg 73 20
gcagaagttg ctgatagagg cgacggaacg tttctcgtcg tggctgatea gcggcataac 7380
gctgcgcatc tggtagatgc gactgttcta acggtagttg cggcaacaat tcaatgagcg 7 440
atttctctgg attcgccgcg atctgcgcca gccttgctgc gcccagtgct ggccccacat 75 00
ccccccccgt acggtaatcg agctgctgac cgctgatatc cgccagcatc tgacgccagt 7560
actcactacg cgccccgccc ccaatcaacg taacactttg cggtttaata ccgcaggcat 7 620
gcacgacatc catgccatct gccagcgcat aacccacgcc ttccagcact gctcgcgcca 7680
gttcattggg gccatgttga tgagtcaaac caaagaaaac ccccttcgcc tggggattat 7740
tgtgtggcgt acgctcgccg gaaagataag gcagaaacca aactggctcg gcactttcat 7800
cagcctgttg agctgcagcg attaaagctg ggacattgct caggccggtt aatttcgcgg 7860
cccaatccag acacgacgct gcactcagca tcacagacac taaatgccaa cgttgcggta 7 920
gcgcatggca aaagctatgt acggcgcttt ctggcttgct taagaaccct tcgctgacag 7980
caaaatagac ccccgacgtc cccagcgata acattgcctg attagcatca accattccca 8040
caccaactgc accagctgca ttgtcgccac cgcctgcgac aactggcacc gtcgccatac 8100
cccacgcttt cgcaacttca ggtaacaaag caccagtaat ttcgctgcct tcgtataatg 8160
cgggcatctg gtcacgagat aagtcgcaag cctgcagcat gacgtcactc cagtcacgct 8220
ttgcgacatc cagccacatg gtgccagctg cgtcagacat atcgctggca aactcccccg 8 280
tcatacgcag acgcaagtaa tctttcggta ataatacttt gtcgatttga cggaatatct 8340
ccggctcatg ccgctgaacc catagcaatt taggcgcagt aaatccgggc atcatcaggt 8 400
tgccggtaat cacccgcgat tgcggaactc gcgcttccag caaagtgcac tcttgcgcac 8 460
agcgcccgtc gttccacaaa atggcagggc gtaacacccg ttgctgagca tccagcaagg 8520
ttgctccgtg catctggccg gcaataccca atgctttaac gtcctgcaga gaatgctgat 8580
cgcccagagc tttcattgcg cgatcagttg cctgccacca ctgttccggg tcttgttccg 8640
accagagtgg atgcgggcgc gaaacggtca gcttttccgt ttgcgcagca accacctcac 8700
cctgctcgtt gagcaaaata acttttacgc ccgaggtgca aatgcccggt atcgctaccg 8760
ataaccgggc caacggactg cacagttagc cgcaagatct atcccgatat acatatcgat 8820
cgttccttaa aacaactttt gtatacaaag ttgcaacgga ctgcacagtt agccgttatt 8880
tgtcgaacag ataatggttt accagatttt ccagttgttc ctggcggcca ctctgatgca 8940
ccggagacaa atgatgttcc tgagcatatt tggctaaatc tgccagtgac atttggcctt 9000
tcaggatttg ctggcccaat tcgctattcc agccggaata acgctgcgcg atgcgtttat 9060
ccagctcgcc atcttcaatc atgcgcgctg caattttcag cgccagtgcc atcgtatcca 9120
tcgcgccgat atgaccgtaa aacagatcat atttatcagt actttgacga cgtactttgg 9180catcgaagtt cagaccaccg gtggtgaaac cgcctgcttt gagaatttca tacatcacca 9 240
gcgcattctc ttccacactg ttcgggaact ggtcggtgtc ccagcccagt tgcgcatcgc 93 00
cacggttggc gtcgacagaa ccgaacaggc caagcgcaat ggcggtggct atttcatgat 9360
ggaaagagtg acctgccagc gtcgcgtggt tagcttcaat gttcagttta atctcttttt 9420
ccagaccaaa ctgtttcagg aagccataga ccgtcgcggc atcgtaatca tattgatgtt 9480
tggtcggttc ttgcggtttc ggttcgataa gcaacgtgcc ctggaaaccg attttatgtt 9540
tatgctcaac caccatctgc ataaagcggc ccagttgttc acgctcctga cgcaagtcgg 9600
tatttaacag cgtttcgtaa ccttcacgac cgccccacag gacatagttt tcaccgccca 96 60
atttatgggt tgcttccatc gctgtaacaa cttgcgttgc cgcccagctg aagacttcag 97 20
gatctgggtt cgtcgccgca cccgcgccgt agcgagggtt tgtaaagcag ttggccgttc 9780
cccacagcag cttcacgccg ctctcttctt gcttgcctgc caggacatca accatttgcg 9840
caaaattatt gatgtactct tttaacgacg cgccctcagg ggaaacatcc acatcgtgga 9900
agcaataaaa tggcacatgt aacttgtgga aaaactcaaa tgcgacatct gctttacgct 9960
tcgccaacgc cagtgcctca ccaggctgct gccacggacg attaaacgcc cccacaccaa 10020
acatatccgc cccgttccag cagaaggtgt gccagtagca ggcggcaaaa cgcaagtgct 10080
cttccatacg cttacccaac accagttcgt cgggattgta gtgacggaat gctaacgggt 10140
ttgaggattt tgagccttca taacgaacgc gatcgagctg gtcaaaatag gcttgcatat 10200
tgaactccat aatcaggtaa tgccgcgggt gatggatgat gtcgtaatat tgggcactcc 10260
ctttcagttg ctcaattatg ttatttcaca ctgctattga gataattcac ctgctttttt 10320
gtacaaactt gtgatctaga actagtggat cccccgggct gcaggaattc gatatcaagc 10380
ttatcgatac cgtcgacctc gagggggggc ccggtaccca gcttttgttc cctttagtga 10440
gggttaattg cgcgcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat 10500
ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc 10560
taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga 10620
aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggcc肌cgcg cggggagagg cggtttgcgt 10680
attgggcgca tgcataaaaa ctgttgtaat tcattaagca ttctgccgac atggaagcca 10740
tcaca犯cgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca gcaccttgtc gccttgcgta 雨OO
taatatttgc ccatgggggt gggcgaagaa ctccagcatg agatccccgc gctggaggat 10860
catccagccg gcgtcccgga aaacgattcc gaagcccaac ctttcataga aggcggcggt 10920
ggaatcgaaa tctcgtgatg gcaggttggg cgtcgcttgg tcggtcattt cg犯ccccag 10980
agtcccgctc agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg cgaatcggga 11040
gcggcgatac cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag ctcttcagca 11100
atatcacggg tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag ccggccacag 11160tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat tcggcaagca ggcatcgcca 11220
tgggtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atgcgcgcct tgagcctggc gaacagttcg 11280
gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag accggcttcc 1 1340
atccgagtac gtgctcgctc gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg gcaggtagcc 1 1400
ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt ctcggcagga 1 1460
gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag ccagtccctt 11520
cccgcttcag tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac 11580
gatagccgcg ctgcctcgtc ctgcagttca ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca 1 1640
aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt 11700
gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg 1 1760
tgcaatccat cttgttcaat catgcgaaac gatcctcatc ctgtctcttg atcagatctt 11820
gatcccctgc gccatcagat ccttggcggc aagaaagcca tccagtttac tttgcagggc 11880
ttcccaacct taccagaggg cgccccagct ggcaattccg gttcgcttgc tgtocataaa 11940
accgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc ccactgcaag ctacctgctt tctctttgcg 12000
cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag tagctgacat tcatcccagg tggcactttt 12060
cggggaaatg tgcgcgcccg cgttcctgct ggcgctgggc ctgtttctgg cgctggactt 12120
cccgctgttc cgtcagcagc ttttcgccca cggccttgat gatcgcggcg gccttggcct 12180
gcatatcccg attcaacggc cccagggcgt ccagaacggg cttcaggcgc tcccgaaggt 12240
<210> 2
<211〉 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223〉扩增xylA基因的上游引物
<220>
<221 > misc—feature
<222〉 (30)..(31)
<223> n is a， c, g， or t
<400> 2
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctn ngtgaattat ctcaatagca gtgtgaa 57
<210> 3<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>扩增xylA基因的下游引物
<400> 3
ggggacaact tttgtataca aagttgtcaa cggactgcac agttagccg 49
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>扩增xylB基因的上游引物
<220>
<221> misc_feature
<222〉 (27). .(28)
<223> n is a， c, g， or t
<400〉 4
ggggacaact ttgtatecaa aagttg皿cg gctaactgtg cagtccgttg 50
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>扩增xy旧基因的下游引物
<400> 5
ggggacaact ttgtatagaa aagttgggtg cataacgatc tccatatcta ccagc 55
<210> 6
<211〉 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence<220>
<223>扩增talA基因的上游引物 <220>
<221> misc—feature
<222> (27)..(28)
<223> n is a， c, g, or t
<400> 6
ggggacaact tttctataca aagttgnnag tctecagact ttgagcaagt ccaa 54
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>扩增talA基因的下游引物
<400> 7
ggggacaact ttattataca aagttgtacc gcatccatac tgagtg 46
<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>扩增tktA基因的上游引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(28)
<223> n is a, c， g, or t
<400> 8
ggggacaact ttgtataata aagttgnntt gcgcaacatg cgagcatgat c 51
<210> 9
<211> 54<212> DNA
<213〉 Artificial Sequence
<220>
<223>扩增tktA基因的下游引物 <400> 9
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta tgtcaatacg catatcgtga tgca 54
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>测序引物l
<400> 10
ttaacgctta caatttcc 18
<210〉 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>测序引物2
<400> 11
acacgcctta tctattgc 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220〉
<223>测序引物3
<400> 12
tgggtgt犯3 ccatcacc 18<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>测序引物4
<400> 13 tcatgaccgt cgatgtcg
<210> 14
<211> 18
<212〉 DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>测序引物5
<400〉 14
taacgacttg acgacagc 18
<210> 15
<211〉 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>测序引物6
<400> 15
aacagcagcg tcaggttg 18
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220><223>测序引物7 <400> 16 cattecgagt aaccaacg
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 测序引物8
<400> 17 cttgcttaag aacccttc
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 测序引物9
<400> 18 aggtgccaag atctatcc
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>测序引物IO
<400> 19 ataagcaacg tgccctgg
<210> 20 <211> 16
说明书第22/23页
18
18
18<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>测序正向引物M13 <400> 20
gtaaaacgac ggccag 16
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>测序反向引物M13
<400> 21
caggaaacag ctatgac 1权利要求
1、一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒，包括四个木糖代谢相关基因，其特征在于该质粒的序列如SEQ ID NO1所示。
2、 根据权利要求1所述的携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒，其特征在于所述四个木糖代 谢相关基因为来源于五.co"DH5a菌株的木糖异构酶基因x少M、木酮糖激酶基W转醛 酶基因toM和转酮糖酶基因汰"。
3、 一种转化体，其特征在于该转化体含有序列如SEQ IDNO:l所示的质粒，分类命名为大 肠埃希氏菌五w/^/c/^co/"已于2008年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心CGMCC，保藏登记号为CGWX NO. 2739。
4、 一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒的构建方法，其特征在于包括如下操作步骤(1) 分别设计x^4、 xy/S、 toM和汰"四种目的基因的特异性引物，以￡ "//011501为目的 基因的来源菌株，通过PCR扩增相应基因；(2) 步骤(1)中得到的4种PCR产物与其对应的pDONR载体进行BP重组，得到4个目 的基因的入门克隆；(3) 4个目的基因的入门克隆与pDEST14进行LR重组，最终得到pDEST14-ABAT质粒；(4) Jfe I和船e I双酶切pDEST14-ABAT质粒的产物ABAT与Jfe I单酶切的载体pBBRlMCS2 连接，经转化、筛选、酶切鉴定、测序后，得到重组质粒pBBRlMCS2-ABAT。
5、 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述步骤(1)中的四种目的基因的特异性 引物分别为(1) 扩增xyL4基因所用引物上游引物序列如SEQ ID No: 2,下游引物序列如SEQ ID No: 3;(2) 扩增xylB基因所用引物h游引物序列如SEQ ID No:4，下游引物序列如SEQ ID No:5;(3) 扩增talA基因所用引物上游引物序列如SEQ IDNo:6，下游引物序列如SEQ IDNo:7;(4) 扩增tktA基因所用引物上游引物序列如SEQIDNo:8，下游引物序列如SEQIDNo:9。
6、 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述步骤(4)中的测序引物共10条，其序 列如SEQIDNo:lO， SEQIDNo:ll， SEQIDNo:12, SEQIDNo:13， SEQIDNo:14， SEQ ID No:15， SEQIDNo:16， SEQIDNo:17， SEQ ID No:18和SEQ ID No:19。
7、 根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于所述步骤(4)中ABAT与载体pBBRlMCS2连接为正向连接或反向连接。
全文摘要
本发明公开了一种携带木糖代谢相关基因的广宿主质粒及其构建方法，属于分子生物学技术领域。该质粒含有4个木糖代谢相关的酶基因，木糖异构酶(xylA)、木酮糖激酶(xylB)、转醛酶(talA)和转酮糖酶(tktA)，均来源于E.coli DH5α菌株。该质粒的构建方法是利用Gateway技术，分别设计xylA、xylB、talA和tktA四种目的基因的特异性引物，以E.coliDH5α为目的基因的来源菌株，通过PCR扩增相应基因；PCR产物与其对应的pDONR载体进行BP重组，获得的入门克隆(Entry clones)与pDEST14进行LR重组，得到pDEST14-ABAT质粒；pDEST14-ABAT质粒用Xba I和Nhe I双酶切的产物ABAT与Xha I单酶切的载体pBBR1MCS2进行连接，得到重组质粒pBBR1MCS2-ABAT。转入该质粒的优良菌种可大大降低纤维素乙醇的生产成本。
文档编号C12N15/63GK101475955SQ20081024656
公开日2009年7月8日 申请日期2008年12月25日 优先权日2008年12月25日
发明者李十中, 郑焕娣 申请人:清华大学