专利名称：一株嗜酸异养菌dx-x及其应用的制作方法
技术领域：
本发明为一株嗜酸异养菌DX-X及其应用，主要涉及一株嗜酸异养菌(Acidiphiliumspp.DX-X)及在提高生物冶金浸出率方面的应用，属于生物冶金技术范畴。
背景技术：
由于人们对金属矿物原料的需求不断增长，地球金属矿产资源日益贫乏。同时，常规的金属矿物冶炼方法为环境带来了严重的环境问题。迫使人们开始采用成本低，工艺简单，作用广泛，环境污染小的微生物湿法冶金技术。如今，世界各国通过运用微生物湿法冶金的方法从低品位原料(如废矿石)中回收贵重金属已经达到了前所未有的规模。
1947年，美国colmer和hinkle从矿山酸性废水坑中分离鉴定出氧化亚铁硫杆菌，并证实了微生物在浸矿中的生物化学作用[1]。经过多年来的实验研究以及工作实践，目前已被报告可用于浸矿的微生物已有20多种[2-4]。嗜酸菌属细菌(Acidiphilium spp)是一类嗜酸、兼性异养的G-杆状细菌，能够利用有机物进行异养生长，同时在自养环境中，还可以利用铁矾、无定形氢氧化铁、单质硫和含铁、亚铁或三价铁矿物获得能量进行生长，是微生物浸矿群落的重要组成部分[5-7]，将该属细菌应用在微生物湿法冶金工业上，可以大大提高浸出率[8-13]。
本发明提供的一株嗜酸异养菌DX-X(Acidiphilium spp.DX-X)，是一株性能独特、可大大提高生物冶金浸出率的嗜酸异养菌。
参考文献
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发明内容
本发明提供一株可在低pH值下生长的嗜酸异养菌DX-X(Acidiphilium spp.DX-X)，它与氧化亚铁硫杆菌混合，对金川贫镍矿进行微生物浸出，大大提高了浸出率，显示出其良好的促浸作用。
该菌株可培养在BSYG液体培养基以及固体培养基中，在25～40℃的温度范围内，DX-X菌都可良好生长，DX-X菌的最适温度为3035℃。该菌株为革兰氏阴性菌，短杆状，能运动，单生。在pH2.5～4.5的范围内，该菌株都可良好生长，最适pH值为3.0～3.5，属于嗜酸微生物，可在3％的盐浓度下生长。该菌株不能利用硫粉以及硫代硫酸钠，也不能以Fe2+作为能源。可以利用葡萄糖、甘露糖醇以及甘油作为有机能源。在固体培养基上培养对氧化亚铁硫杆菌的生长有促进作用。氧化酶阴性，接触酶阳性。所测得的16SrRNA寡核苷酸序列比对结果显示与嗜酸菌属细菌(Acidiphilium spp.)同源性>98％。将该菌株与氧化亚铁硫杆菌一同对金川镍矿进行混合浸出，其浸出率优于氧化亚铁硫杆菌单独浸矿的浸出率，具有应用于生物湿法冶金工业的巨大潜力。
具体实施例方式 实施例1 嗜酸异养菌DX-X菌株的特征 1.将DX-X接种于BSYG液体培养基中恒温振荡培养适合时间后染色镜检，进行革兰氏染色。染色结果该细菌为短杆状，G-性，能运动，单生。
2.嗜酸异养菌DX-X菌株的温度适应性 将1ml的等量的菌株接种于50ml BSYG液体培养基中，分别放入20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃恒温摇床中，120rpm下振荡48h后，观察其生长状况。
从上表可以看出，在25～40℃的温度范围内，DX-X菌都可良好生长，DX-X菌的最适温度为30-35℃。
3.嗜酸异养菌DX-X菌株的渗透压适应性 分别制备含0％，1.5％，3％，3.5％，5％NaCl的BSYG液体培养基，将1ml等量的菌种接入30ml上述液体培养基中，并设空白对照，120rpm，30℃下振荡培养，观察其生长状况。
显示嗜酸异养菌DX-X菌株可在3％的盐浓度下生长。
4.嗜酸异养菌DX-X菌株的pH适应性 制备pH2，2.5，3，3.5，4，4.5的BSYG液体培养基，接种方法同上，120rpm，30℃下振荡培养，观察其生长状况。
从上表可以看出，在pH2.5～4.5的范围内，嗜酸异养菌DX-X菌株都可良好生长，其最适pH为3.5。
5.嗜酸异养菌DX-X菌株对能源的特性 (1)嗜酸异养菌DX-X菌株对硫粉和硫代硫酸钠的利用 分别制备含硫粉的Wasksman((NH4)2SO4 0.2g，K2HPO4 3g，MgSO4·7H2O 0.5g，Ca(NO3)2 O.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，硫粉10g，蒸馏水1000ml，pH3.0)液体培养基和含硫代硫酸钠的Wasksman((NH4)2SO4 0.2g，K2HPO4 3g，MgSO4·7H2O 0.5g，Ca(NO3)2 0.2g，FeSO4.7H2O 0.01g，Na2S2O3 10g，蒸馏水1000ml，pH3.0)液体培养基，将5ml的嗜酸异养菌DX-X菌株接入30ml的上述液体培养基中，并设两个空白对照，120rpm，30℃下振荡培养，观察培养物的生长情况，结果显示嗜酸异养菌DX-X菌株不能利用硫粉和硫代硫酸钠进行生长。
(2)嗜酸异养菌DX-X菌株对Fe2+的利用 制备含有4％FeSO4的9K(3.0g(NH4)2SO4，0.1g KCl，0.5g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，0.01g Ca(NO3)2，44.7g FeSO4·7H2O，蒸馏水1000ml，pH2.5)液体培养基，将5ml的嗜酸异养菌DX-X菌株接入30ml的上述液体培养基中，设一个空白对照(防止Fe2+自身氧化的干扰)，120rpm，30℃下振荡培养，观察培养物的生长情况，结果显示嗜酸异养菌DX-X菌株不能利用Fe2+进行生长。
(3)嗜酸异养菌DX-X菌株对有机能源的利用 分别制备含有0.1％有机物的基础盐培养基，将5ml的DX-3接入30ml的上述液体培养基中，并设空白对照，120rpm，30℃下振荡培养，观察培养物的生长情况。
“+”表示有生长，“-”表示没有生长。结果显示嗜酸异养菌DX-X菌株只可利用葡萄糖、甘露糖醇和甘油。
6.嗜酸异养菌DX-X菌株的生化反应 (1)氧化酶 在干净的滤纸上滴二甲基对苯撑二胺的1％水溶液，用玻棒蘸取3-5天的菌苔，涂抹在润湿的滤纸上，在10秒内涂抹的菌苔呈现红色者为阳性，10-60秒现红色者为延迟反应，60秒以上现红色者不计，按阴性处理，结果显示DX-3为阴性。
(2)接触酶 将3-5天的菌苔以接种环取一小环涂抹于已滴有3％过氧化氢的玻片上，如有气泡产生则为阳性，无气泡为阴性，结果显示DX-3为阳性。
7.嗜酸异养菌DX-X菌株16SrRNA寡核苷酸序列分析 用CEQXL2000，BECKENMAN-COUNL TERDNA测序仪对DX-3的16SrRNA寡核苷酸序列进行分析，测序引物为1492r5’-TACGGYTACCTTGTTACGACT T-3’ 27f5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 嗜酸异养菌DX-X菌株16SrRNA寡核苷酸序列如下 tggttggctg cctcccttgc gggttagcgc accaacttaa ggtcaaacca aatcccatgg 60 tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120 ttactagcga ttccaccttc atgcactcga gttgcagagt gcaatccgaa ctgagacggc 180 tttttgagat cagctcggtg tcaccacctg gcttcccact gtcaccgcca ttgtagcacg 240 tgtgtagccc aggacataag ggccatgagg acttgacgtc atccccacct tcctccggct 300 tgtcaccggc agttccttca gagtgcccac ccaaacatgc tggcaactga aggcgagggt 360 tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccatgcag 420 cacctgtgcg ggagcccctt gcgggaaagt ccatctctgg accggtactcc ccatgtcaa 480 atcctggtaa ggttctgcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540 gcccccgtca attcctttga gtttcaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtgtgctta 600 ccgcgttagc tacgacactg aagtgctaag caccccaaca tccagcacac atcgtttaca 660 gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcgc ctcagcgtca 720 gtaatggacc aggttgccgc cttcgccacc ggtgttcttt ccaatatcta cgaatttcac 780 ctctacactg gaaattccac aaccctcttc catactcaag acaacacgtc tcagacgcag 840 tccccaggtt gagcccagga atttcacgcc tgactgtgcc gtccgcctac gcgcccttta 900 cgcccagtca ttccgagcaa cgctagcccc cttcgtatta ccgcggctgc tggcacgaag 960 ttagccggag cttattctgc gggtaccgtc atcatcgtcc ccgccaaaag gactttacat 1020 tccgaaagac cttc 1034 将此序列在网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/上用BLAST软件和已登陆的部分菌株的16SrRNA寡核苷酸序列进行比对，结果表明与嗜酸菌属细菌(Acidiphilium spp.)的同源性>98％。
实施例2嗜酸异养菌DX-X菌株对氧化亚铁硫杆菌生长的促进作用 配置FeTSBo(1.26g(NH4)2SO4，0.5gMgSO4·7H2O，0.25g蛋白胨，6.95gFeSO4.7H2O，12g琼脂，蒸馏水1000ml，pH3.0)双层固体培养基。将50ul DX-3菌液涂布于FeTSBo双层培养基的底层，培养基的上层涂布20ul氧化亚铁硫杆菌菌液，30℃倒置培养，一周后观察细菌生长情况。
“+”表示有生长，“-”表示没有生长。
实施例3嗜酸异养菌DX-X菌株对氧化亚铁硫杆菌镍矿浸出率的促进作用 将采自金川镍矿的矿石处理成粒度为165μm的颗粒，并用10％的硫酸溶液酸化，用蒸馏水冲洗干净并烘干。矿石的镍含量为0.29％。
配置9K培养基(3.0g(NH4)2SO4，0.1g KCl，0.5g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，0.01gCa(NO3)2，44.7g FeSO4·7H2O，蒸馏水1000ml，pH2.5)以及9KYE培养基(3.0g(NH4)2SO4，0.1g KCl，0.5g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，0.01g Ca(NO3)2，44.7g FeSO4·7H2O，1g葡萄糖，0.1g酵母提取物，蒸馏水1000ml，pH2.5)。在两种培养基中分别加入3g已酸化好的矿粉。
接种在9K培养基里接入10％的氧化亚铁硫杆菌，在9KYE培养基中按10％的接种量同时接入氧化亚铁硫杆菌以及DX-3，比例为11。30℃恒温振荡培养，每隔24取样并通过TAS-986原子吸收分光光度计测得镍的含量。
由上表可见，9KYE培养基中氧化亚铁和DX-3混合培养物的浸出率明显高于9K培养基中氧化亚铁硫杆菌的浸出率。这提示我们，在镍矿浸出工业方面，我们可以采用氧化亚铁硫杆菌和嗜酸异养菌DX-3混合浸矿。
权利要求
权利要求1本发明为一株嗜酸异养菌DX-X(Acidiphilium spp.DX-X)及其应用，其特征在于该菌株属于嗜酸硫杆菌属(Acidithiobacillus)，能在微生物冶金混合浸出方面应用。
权利要求2根据权利要求1所述的嗜酸异养菌DX-X，其特征在于
(1)、形态特征该细菌为短杆状，G-性，能运动，单生。
(2)、培养特征
该菌株可培养在BSYG液体培养基以及固体培养基中，在25～40℃的温度范围内，DX-X菌都可良好生长，DX-X菌的最适温度为30～35℃。在pH2.5～4.5的范围内，该菌株都可良好生长，最适pH值为3.0～3.5。该菌株可在3％的盐浓度下生长。
(3)、菌株的生理生化特征
该菌株不能利用硫粉以及硫代硫酸钠，也不能以Fe2+作为能源。可以利用葡萄糖、甘露糖醇以及甘油作为有机能源。氧化酶阴性，接触酶阳性。
(4)、该菌株的16S rRNA基因序列为
tggttggctg cctcccttgc gggttagcgc accaacttaa ggtcaaacca aatcccatgg 60
tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120
ttactagcga ttccaccttc atgcactcga gttgcagagt gcaatccgaa ctgagacggc 180
tttttgagat cagctcggtg tcaccacctg gcttcccact gtcaccgcca ttgtagcacg 240
tgtgtagccc aggacataag ggccatgagg acttgacgtc atccccacct tcctccggct 300
tgtcaccggc agttccttca gagtgcccac ccaaacatgc tggcaactga aggcgagggt 360
tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac agccatgcag 420
cacctgtgcg ggagcccctt gcgggaaagt ccatctctgg accggtactc cccatgtcaa 480
atcctggtaa ggttctgcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcctttga gtttcaacct tgcggccgta ctccccaggc ggtgtgctta 600
ccgcgttagc tacgacactg aagtgctaag caccccaaca tccagcacac atcgtttaca 660
gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt tgctccccac gctttcgcgc ctcagcgtca720
gtaatggacc aggttgccgc cttcgccacc ggtgttcttt ccaatatcta cgaatttcac780
ctctacactg gaaattccac aaccctcttc catactcaag acaacacgtc tcagacgcag840
tccccaggtt gagcccagga atttcacgcc tgactgtgcc gtccgcctac gcgcccttta900
cgcccagtca ttccgagcaa cgctagcccc cttcgtatta ccgcggctgc tggcacgaag960
ttagccggag cttattctgc gggtaccgtc atcatcgtcc ccgccaaaag gactttacat1020
tccgaaagac cttc 103权利要求3根据权利要求1和2所述的嗜酸异养菌DX-X，其特征在于嗜酸异养菌DX-X菌株在固体培养基上培养对氧化亚铁硫杆菌的生长有促进作用。将该菌株与氧化亚铁硫杆菌一同对硫化矿进行混合浸出，其浸出率优于氧化亚铁硫杆菌单独浸矿的浸出率，可应用于生物湿法冶金工业。
权利要求4根据权利要求1至3所述的嗜酸异养菌DX-X，其特征在于该菌株可以不但可应用于微生物冶金，也可广泛工业酸性废气污染脱硫治理、煤炭脱硫、矿物药处理等方面，这是一般技术人员可以理解的。
全文摘要
本发明为一株嗜酸异养菌DX-X(Acidiphilium spp.DX-X)及其应用，该菌株可培养在BSYG液体培养基以及固体培养基中，在25～40℃的温度范围内，pH2.5～4.5的范围内，都可良好生长。该菌株为革兰氏阴性菌，短杆状，能运动，单生，属于嗜酸微生物，可在3％的盐浓度下生长。该菌株不能利用硫粉以及硫代硫酸钠，也不能以Fe2+作为能源。可以利用葡萄糖、甘露糖醇以及甘油作为有机能源，氧化酶阴性，接触酶阳性。该菌在固体培养基上培养对氧化亚铁硫杆菌的生长有促进作用，且在与氧化亚铁硫杆菌一同对金川镍矿进行混合浸出时，浸出率优于氧化亚铁硫杆菌单独浸矿的浸出率，具有应用于生物湿法冶金工业的巨大潜力。
文档编号C12N1/20GK101481667SQ20081030524
公开日2009年7月15日 申请日期2008年10月28日 优先权日2008年10月28日
发明者李红玉, 张晓雪, 鲍婧婷 申请人:李红玉, 兰州大学