用于切断和/或连结单链dna的组合物的制作方法

专利名称：用于切断和/或连结单链dna的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于切断和/或连结单链DNA的组合物。
背景技术：
运用基因工程方法进行的重组DNA技术，是当前的生物产业JtA不 可或缺的重要技术。例如，近年来，在医疗领域，即侵是其有效性被关注 的蛋白质制剂的开发及制造，若不使用重組DNA技术就几近不可能进行 与需要相称的制剂的供给，即便说没有该技术则现在的医疗发展无从谈 起，也不为过。另外，不仅是为了蛋白质制剂的开发，而且也为了在研究 开发中使用的蛋白质试剂的开发，均要求DNA操作技术的进一步逸艮。
每当进行DNA的重组操作时，作为最基本的技术，可以举出DNA的 切断、自由末端的结合，但成为这样的操作对象的DNA大多是双链DNA。 迄今为止，大多数情况下都是利用DNA作为"编码蛋白质并表达的工具"， 所以研究者们的兴趣集中在双链DNA的操作技术的进步。但是，目前， 随着生命工程的对象领域的扩大，进行单链DNA的操作的机会也增加。 例如，在制作DNA芯片等的情况下，具有需要的序列、长度的单链DNA 的制备是不可或缺的，用于操作单链DNA的酶等变得重要。迄今为止， 切断单链DNA的方法有很多报告，但单链DNA彼此结合的方法仅有数例 报告，如使用T4RNA连接酶的方法(专利文献l、非专利文献l)、使用 源自古细菌的热稳定性连接酶的方法(专利文献2)、 ^"吏用源自嗜热性噬菌 体TS2126的热稳定性连接酶的方法(专利文献3)等。
根据如上所述的状况，更希望开发能对可利用的单链DNA进行操作 的酶或组合物
专利文献1:特开2002 - 171983号公报全文
专利文献2:特开平6 - 62847号Z/^艮全文
专利文献3:美国专利>^才艮第6818425号全文非专利文献l: Nishigaki等，Mol Divers 4: 187 —卯，1998

发明内容
本发明人等鉴于上述情况进行了潜心研究，结果发现，Evl蛋白质具 有切断单链DNA并将单链DNA的5，末端和3'末端结合的活性，以至于完 成了本发明。
由此，本发明的目的在于，提供一种用于切断和/或连结单链DNA的 组合物。
即，本发明涉及以下的(1) ~ (12)。
(1) 本发明的第一技术方案是一种组合物，含有以下的U)或(b) 所示的Evl蛋白质而成，用于进行单链DNA的切断和/或、单链DNA的5， 末端和3，末端的结合。
(a) 由序列编号2、序列编号4、序列编号6、序列编号8、序列编号 10、序列编号12或序列编号20所示的M酸序列构成的蛋白质；
(b) 由在序列编号2、序列编号4、序列编号6、序列编号8、序列 编号IO、序列编号12或序列编号20所示的JL^酸序列中，具有l或数个 氨基酸的取代、缺失或插入的M酸序列所构成，且具有切断单链DNA 及将单链DNA的5，末端和3'末端结合的活性的多肽。
(2) 本发明的第二技术方案，其特征在于，在上述(1)记载的组合 物中，还含有Mg2+或Ca2+。
(3) 本发明的第三技术方案，其特征在于，在上述(2)记载的组合 物中，上述Mg2+的浓度为0.5mM~2.0mM。
(4) 本发明的第四技术方案，其特征在于，在上述(3)记载的组合 物中，还含有Rad51B蛋白质及ATP。
(5) 本发明的第五技术方案，其特征在于，在上述(4)记载的组合 物中，上述Evl蛋白质相对于上述Rad51B蛋白质的摩尔比为1: 0.5~1: 4。(6) 本发明的第六技术方案，其特征在于，在上述(4)或(5)记载 的组合物中，上述ATP的浓度为0.5mM ~ 2.0mM。
(7) 本发明的第七技术方案，其特征在于，在上述(l) ~ (3)中任 意一项记载的组合物中，还含有DNA拓朴异构酶I型蛋白质。
(8 )本发明的第八技术方案是一种组合物，含有包含以下(a)或(b ) 所示核酸的重组载体而成，用于进行单链DNA的切断和/或、单链DNA 的5，末端和3，末端的结合。
(a) 由序列编号l、序列编号3、序列编号5、序列编号7、序列编号 9、序列编号11或序列编号19所示的核苷酸序列构成的核酸；
(b) 与由序列编号1、序列编号3、序列编号5、序列编号7、序列 编号9、序列编号11或序列编号19所示的核苷酸序列构成的核酸的互补 链在严^^件下杂交的核酸，且该核酸编码的多肽具有切断单链DNA及 将单链DNA的5，末端和3，末端结合的活性。
(9 )本发明的第九才支术方案是一种组合物，含有包含以下(a)或(b ) 所示核酸的重组载体而成，用于进行单链DNA的切断和/或、单链DNA 的5'末端和3'末端的结合。
(a) 对由序列编号2、序列编号4、序列编号6、序列编号8、序列编 号10、序列编号12或序列编号20所示的JtJ^酸序列构成的多肽进行编码 的核酸；
(b) 对如下所示的多肽ii行编码的核酸，所述多肽由在序列编号2、 序列编号4、序列编号6、序列编号8、序列编号IO、序列编号12或序列 编号20所示的M酸序列中具有1或数个氨基酸的取代、缺失或插入的氨 基酸序列所构成，且具有切断单链DNA及将单链DNA的5，末端和3'末端 结合的活性。
(10) 本发明的第十技术方案是一种制造单链DNA标记物的方法， 其特征在于，使上述(l) ~ (9)中任意一项记载的组合物与单链DNA 发生反应，来制造单链DNA标记物。
(11) 本发明的第十一技术方案是一种单链DNA标记物，其特征在于，其通过上述(10)记载的方法来制造。
(12 )本发明的第十二技术方案是一种Evl蛋白质活性抑制用组合物， 其特征在于，含有选自阿克拉霉素、克菌定、DIDS、 P -玉红霉素及3-ATA中的一种或多种化合物而成。
根据本发明的方法，可以切断单链DNA和/或，将单链DNA的5，末 端和3，末端结合。


图l表示Evl蛋白质和Rad51B蛋白质结合的结果。(a)是用12%的 SDS - PAGE使已纯化的Evl蛋白质(0.5 ji g)和Rad51B蛋白质(0.5 jn g) 进行泳动，用考马斯亮蓝进行染色。泳道l是标记物。泳道2及3分别是 已纯化的Evl和Rad51B。 ( b )是表示Evl - Rad51B的相互作用的结果。 泳道1及2是在没有Rad51B的存在(泳道1)或有Rad51B存在的情况 下(泳道2 )进行与Evl结合珠的结合实验的结果。泳道3是使用了未结 合蛋白质的Affi - Gd珠的负对照的实验结果。(c)是表示Evl - Rad51B 的相互作用的结果。泳道1及2是在没有Evl的存在(泳道1)或有Evl 存在(泳道2 )的情况下进行与Rad51B结合珠的结合实验的结果。泳道3 是使用了未结合蛋白质的Affi - Gel珠的负对照的实验结果。
图2表示对已纯化的Evl蛋白质进行凝胶过滤的结果。Evl蛋白质在 分子量约600kDa的位置被洗脱。
图3表示对Evl蛋白质的DNA结合性进行研究的结果。泳道1 ~ 6及 泳道7~12分别是研究了对于双链DNA及单链DNA的结合性的结果。泳 道1及7表示未添加Evl蛋白质的负对照的结果。在结合实验中使用的Evl 蛋白质的浓度为0.2juM(泳道2及8)、 0.4jiM(泳道3及9)、 0.8nM(泳 道4及10)、 1.6pM (泳道5及U)、 3'2iliM (泳道6及12)。 nc是指有 切口 (nick)的环状双链DNA， sc是指超螺旋环状双链DNA, ss是指单 链DNA (在其他图中也一样)。
图4表示对单链DNA的切断、及结合单链DNA的5，末端和3，末端的 活性进行研究的结果。(a)是将Evl相对于环状单链DNA的活性进行了 研究的结果。泳道1及2表示使用了 d) x 174环状单链DNA的结果，泳3及4表示使用了 M13mpl8环状单链DNA的结果。另夕卜，泳道1及3表 示无Evl的对照实验的结果，泳道2及4表示使用了 Evl蛋白质的实验的 结果。(b )是将Evl对于双#^_螺旋DNA及有切口的DNA的活性进行了 研究的结果。使用(b x 174环状单链DNA (20 |J M、泳道1 ~ 3 )或(|) x 174 超螺旋及有切口的双链DNA (10 p M、泳道4 ~ 6 )来研究Evl (4 n M、 泳道2及5 )及源自大肠杆菌的拓朴异构酶I (5单位、泳道3及6)的影 响。泳道l及4表示没有Evl蛋白质的对照实验的结果。
图5表示Mg"及二价金属离子对Evl蛋白质的活性的影响。(a)是将 Mg"对Evl蛋白质的活性的影响进行了研究的结果。在各种Mg"浓度下进 行Evl蛋白质(4jum)的对于(b xl74环状单链DNA (20jiM)的连环体 (catemer)化反应。泳道1是没有Evl蛋白质的对照实验的结果。另外， 泳道2 8分别表示在0mM、 0.5 mM、 1.0 mM、 1.25 mM、 1. 5mM、 1.75 mM、 2.0 mM的Mg"存在下的实验结果。(b)是将二价金属离子对Evl 蛋白质的活性的影响进行了研究的结果。在各种二价金属离子的存在下进 行Evl蛋白质(4nm)的对于(J) xi74环状单链DNA (20pM)的连环体 化反应。泳道l是没有金属离子的对照实验的结果。另夕卜，泳道2~5表示 在1 mM的图示金属离子的存在下的实验结果。
图6表示对基于Evl蛋白质的反应产物的热稳定性进行了研究的结果。 表示将使(l) x 174环状单链DNA (20 p M)和Evl蛋白质(4 |i m)发生反 应得到的反应产物于IOOX:孵育0分钟(泳道2 )、 0.5分钟(泳道3 )、 1 分钟(泳道4 )、 5分钟(泳道5 )及10分钟(泳道6 )，用琼脂糖凝胶泳动 的结果。泳道l表示没有Evl蛋白质的对照实验的结果。
图7表示用电子显微镜观察Evl蛋白质的反应产物的结果。标度条 (scale bar)为100nm。
图8表示Rad51B蛋白质促进Evl蛋白质的活性的结果。(a)表示将 Rad51B蛋白质对Evl蛋白质的活性的影响进行了研究的结果。泳道1及5 是没有Evl及Rad51B蛋白质的对照实验的结果。泳道2及6是在没有Evl 蛋白质存在的情况下使用Rad51B蛋白质4 nM进行的实验结果。泳道3 及7是在没有Rad51B蛋白质存在的情况下使用Evl蛋白质4 u M进行的 实验结果。泳道4及8是使用Evl蛋白质4 n M、 Rad51B蛋白质4 p M进 行的实验结果。另外，泳道1~4是在有ATP存在的情况下进行的实验结的情况下进行的实验结果。(b)表示将Rad51蛋白质对Evl蛋白质的活性的影响进行了研究的结果。泳道1及5是没有Evl及Rad51蛋白质的对照实验的结果。泳道2及6是在没有Evl蛋白质存在的情况下使用Rad51蛋白质4inM进行的实验结果。泳道3及7是在没有Rad51蛋白质存在的情况下使用Evl蛋白质4 ju M进行的实验结果。泳道4及8是使用Evl蛋白质4 n M、 Rad51蛋白质4 p M进行的实验结果。另外，泳道1~4是在有ATP存在的情况下进行的实验结果，泳道5 ~ 8是在没有ATP存在的情况下进行的实验结果。
图9表示将Rad51B蛋白质对Evl蛋白质的连环体化活性的促i^t果的浓度依赖性进行了研究的结果。相对于Evl蛋白质4nM,以0.5~8"M混合Rad51B蛋白质，测定活性。泳道1是未添加Rad51B蛋白质及Evl蛋白质双方情况下的对照实验的结果，泳道8是添加Rad51B蛋白质8 nM且未添加Evl蛋白质情况下的对照实验的结果。泳道2 ~ 7是在4 |i M的Evl的存在下分另U添加了 0jnM、 0.5pM、 l.OinM、 2.0nM、 4.0jiM、 8.0jiM的Rad51B蛋白质情况下的实验结果。
图10表示Evl (1 - 221)变异体的纯化结果。(a)表示Evl (1 - 221)变异体的纯化工序。(b )表示对纯化的各工序的样品进行15 % SDS - PAGE并用考马斯亮蓝进行染色的结果。泳道l是分子量标记物，泳道2及3分别是IPTG添加前及添加后的全宿主细胞提取液。另外，泳道4 7分别是Ni-NTA琼脂糖组分、羟基磷灰石透过组分、凝血酶处理后的组分、Superdex 200的峰组分。
图11表示Evl (222-418)变异体的纯化结果。(a)表示Evl (222-418 )变异体的纯化工序。(b )表示对纯化的各工序的样品进行15 % SDS-PAGE并用考马斯亮蓝进行染色的结果。泳道l是分子量标记物，泳道2及3分别是IPTG添加前及添加后的全宿主细胞提取液。另夕卜，泳道4 ~7分别是Ni-NTA琼脂糖组分、羟基磷灰石的峰组分、凝血酶处理后的组分、Superdex 200的峰组分。
图12是对Evl蛋白质的EVH2域的活性进行了研究的结果。U)表
示Evi蛋白质的域结构;M^本实施例中使用的缺失变异体的模式图。图中
示出EVH1、富含脯氨酸区域及EVH2。 ( b )表示研究Evl缺失变异体的活性的结果。泳道1~4分别是在无蛋白质时、Evl蛋白质(4jnM)的存在下、Evl (1 - 221)变异体(4 ji M)的存在下、Evl (222 - 418 )变异体(4 |i M)的存在下的活性的研究结果。(c)表示Rad51B蛋白质对Evl缺失变异体的活性的影响的研究结果。泳道1是无蛋白质时的结果，泳道2是仅添加Rad51B蛋白质的结果。泳道3及4、 5及6、 7及8分别是添加Evl蛋白质(4mM)、 Evl (1-221)变异体(4nM)、 Evl (222-418)变异体(4juM)进行实验的结果，泳道4、 6及8是还添加了 Rad51B蛋白质(4mM)进行实验的结果。
图13表示与DNA拓朴异构酶I型蛋白质及Evl蛋白质共存下的单链DNA的连环体化的促进效果有关的结果。(a)示出基于Topol (源自大肠杆菌)的单链DNA的连环体化的促进效果。泳道1表示仅仅是单链DNA的负对照的结果，泳道2表示使1 jjM的Evl蛋白质发生反应时的结果，泳道3表示使5U的Topol (大肠杆菌(E. coli )， New England Biolabs 7>司)发生v^应时的结果，泳道4表示在1 n M的Evl蛋白质和0.05U的Topol的混合存在下使其发生反应时的结果，泳道5表示在1 n M的Evl蛋白质和0.5U的Topol的混合存在下使其发生反应时的结果，泳道6表示在1 pM的Evl蛋白质和5U的Topol的混合存在下使其发生反应时的结果。(b )示出基于hsTopol (源自人)的单链DNA的连环体化的促进效果。泳道1表示仅仅是单链DNA的负对照的结果，泳道2表示使0.5 n M的Evl蛋白质发生反应时的结果，泳道3表示使2.8nM的hsTopoI(人(human )， JenaBioscience公司)发生反应时的结果，泳道4表示在0.5 ju M的Evl蛋白质和2.8nM的hsTopol的混合存在下使其发生反应时的结果。
图14表示阿克拉霉素对Evl蛋白质的单链DNA链接(catenation)活性的影响。(a)是阿克拉霉素对Evl蛋白质的单链DNA链接活性的抑制效果。泳道1表示仅仅是单链DNA的负对照的结果，泳道2表示使4ji M的Evl蛋白质发生反应时的结果，泳道3表示使4 n M的Evl蛋白质和IjliM的阿克拉霉素发生反应时的结果，泳道4表示使4juM的Evl蛋白质和5nM的阿克拉霉素发生>^应时的结果，泳道5表示使4jiM的Evl蛋白质和10jiM的阿克拉霉素发生反应时的结果，泳道6表示使4nM的Evl蛋白质和20nM的阿克拉霉素发生反应时的结果，泳道7表示使20jiM的阿克拉霉素发生反应时的结果。(b)是阿克拉霉素对Evl蛋白质的DNA结合活性的影响。除了佳发生及JL的Evl蛋白质为0.3 [aM之外，其余与(a)相同。图15表示克菌定对Evl蛋白质的单链DNA链接活性的影响。(a)是克菌定对Evl蛋白质的单链DNA链接活性的抑制效果。泳道1表示仅仅是单链DNA的负对照的结果，泳道2表示使4 u M的Evl蛋白质发生反应时的结果，泳道3表示使4nM的Evl蛋白质和liLiM的克菌定发生反应时的结果，泳道4表示使4nM的Evl蛋白质和5jiM的克菌定发生反应时的结果，泳道5表示使4pM的Evl蛋白质和10pM的克菌定发生反应时的结果，泳道6表示使4nM的Evl蛋白质和20pM的克菌定发生反应时的结果，泳道7表示使20nM的克菌定发生反应时的结果。(b)是克菌定对Evl蛋白质的DNA结合活性的影响。除了佳发生反应的Evl蛋白质为0.3nM之外，其余与(a)相同。
图16表示DIDS对Evl蛋白质的单链DNA链接活性的影响。(a)是DIDS对Evl蛋白质的单链DNA链接活性的抑制效果。泳道1表示仅仅是单链DNA的负对照的结果，泳道2表示使4 |Li M的Evl蛋白质发生反应时的结果，泳道3表示使4 n M的Evl蛋白质和1 ju M的DIDS发生反应时的结果，泳道4表示使4pM的Evl蛋白质和5pM的DIDS发生反应时的结果，泳道5表示使4 ji M的Evl蛋白质和10 n M的DIDS发生反应时的结果，泳道6表示使4 n M的Evl蛋白质和20 ji M的DIDS发生反应时的结果，泳道7表示使20 n M的DIDS发生反应时的结果。(b )是DIDS对Evl蛋白质的DNA结合活性的影响。除了使发生及^应的Evl蛋白质为0.3nM之外，其余与(a)相同。
图17表示P -玉红霉素对Evl蛋白质的单链DNA链接活性的影响。(a)是P -玉红霉素对Evl蛋白质的单链DNA链接活性的抑制效果。泳道1表示仅仅是单链DNA的负对照的结果，泳道2表示使4 n M的Evl蛋白质发生反应时的结果，泳道3表示使4nM的Evl蛋白质和lpM的P —玉红霉素发生反应时的结果，泳道4表示使4 的Evl蛋白质和5jliM的P -玉红霉素发生反应时的结果，泳道5表示使4nM的Evl蛋白质和10nM的P -玉红霉素发生反应时的结果，泳道6表示使4nM的Evl蛋白质和20 的P -玉红霉素发生反应时的结果，泳道7表示使20juM的P -玉红霉素发生反应时的结果。(b)是P -玉红霉素对Evl蛋白质的DNA结合活性的影响。除了使发生反应的Evl蛋白质为0.3 ji M之外，其余与(a)相同。图18表示3 - ATA对Evl蛋白质的单链DNA链接活性的影响。(a)是3 - ATA对Evl蛋白质的单链DNA链接活性的抑制效果。泳道1表示仅仅是单链DNA的负对照的结果，泳道2表示使4 p M的Evl蛋白质发生反应时的结果，泳道3表示使4nM的Evl蛋白质和lpM的3-ATA发生反应时的结果，泳道4表示使4 )i M的Evl蛋白质和5 n M的3 - ATA发生反应时的结果，泳道5表示使4pM的Evl蛋白质和10juM的3 -ATA发生反应时的结果，泳道6表示使4jnM的Evl蛋白质和20iLiM的3 -ATA发生反应时的结果，泳道7表示使20jiM的3-ATA发生反应时的结果。(b)是3-ATA对Evl蛋白质的DNA结合活性的影响。除了使发生>^应的￡￥1蛋白质为0.3"1\1之外，其余与U)相同。
具体实施例方式
本发明的第一实施方式是"一种组合物，含有以下的(a)或(b)所示的Evl蛋白质而成，用于进行单链DNA的切断和/或、单链DNA的5，末端和3，末端的结合。
(a) 由序列编号2、序列编号4、序列编号6、序列编号8、序列编号10、序列编号12或序列编号20所示的M酸序列构成的蛋白质，
(b) 由在序列编号2、序列编号4、序列编号6、序列编号8、序列编号IO、序列编号12或序列编号20所示的M酸序列中，具有l或数个氨基酸的取代、缺失或插入的M酸序列所构成，且具有切断单链DNA及将单链DNA的5，末端和3'末端结合的活性的多肽。"
这里，"Evl蛋白质"是指含有与序列编号2、 4、 6、 8、 10或12所示的氨基酸序列相同或实质上相同的M酸序列的蛋白质。"含有实质上相同的Jl&酸序列的蛋白质"，是含有与序列编号2、 4、 6、 8、 10或12所示的#^酸序列具有约60%以上、优选约70%以上、更优选约80%、 81%、82%、 83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、 92%、93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、最优选约99%的氨基酸同源性的M酸序列，且具有切断单链DNA、及将单链DNA的5，末端和3，末端的结合的活性的蛋白质。
需要说明的是，在本说明书中，只要没有特别记栽，"多肽"和"蛋白质"的含义相同。
或者，含有与序列编号2、 4、 6、 8、 10或12所示的M酸序列实质上相同的M酸序列的蛋白质，是指由序列编号2、 4、 6、 8、 10或12所示的M酸序列中的1或数个(优选1~30个左右，更优选1~10个左右，进一步优选1 5个)M酸缺失、取代或附加的M酸序列所构成，且具有切断单链DNA及将单链DNA的5，末端和3，末端结合的活性的蛋白质。
上述氨基酸的缺失、附加及取代，可以存在于已分离的天然多肽中，另外，也可以是利用在该技术领域中公知的方法改变对本发明的蛋白质进行编码的基因从而重新导入的情形。例如，关于特定的氨基酸残基的取代，可以使用市售的试剂盒(例如Mutan TM - G( TAKARA 7>司)、Mutan TM-K (TAKARA公司))等，利用G叩pedduplex法、Kunkel法等乂i^p的方法或以它们为基准的方法进行威基的取代而实施。
另外，在本发明的实施中使用的蛋白质的C末端通常为羧基(-COOH)或羧酸酯基(-COO-)，但该^&可以被酰胺(-CONH2)、酯(-COOR)等进行化学修饰。在这里，作为酯中的R，可以举出d-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基)、<:3-8环烷基(例如环戊基、环己基)、d-6芳基(例如苯基、oc -萘基)、苯基-d-2烷基(例如节基、苯乙基)、cx -萘基-d-2烷基(例如a -萘基甲基)等。除此之外，还可以为作为经口用酯而通用的特戊酰氧甲酯。当本发明的Evl蛋
白质除了 c末端之外而在其多肽链中具有a时，该g被酰胺化或被酯
化而得到的化合物也包括在本发明的蛋白质中。作为该酯，可以举出上述的各酯。同样地，本发明的蛋白质的N末端通常为^ ( -NH2)，但该氨基可以被甲酰基、乙晚基等d-6醃基等化学修饰。除此之外，N端侧在
内的氨基酸的侧链上的取代基(例如-OH、 -SH、氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)被合适的官能团(例如甲醃基、乙统基等)化学修饰而得到的化合物、进行糖链结合得到的化合物，也包括在本发明的蛋白质中。
关于含有本发明的Evl蛋白质中的部分^J^酸序列的肽(也称为部分肽)，只要该部分肽具有切断单链DNA及将单链DNA的5'末端和3，末端结合的活性，就可以包括在本发明的组合物中。作为这样的部分肽，是含有与序列编号20所示的JL^酸序列相同或实质上相同的^J^酸序列的多
1肽。在这里，"含有实质上相同的^J^酸序列的多肽"，是指含有与序列编
号20所示的>^酸序列具有约60%以上、优选约70%以上、更优选约80%、 81%、 82%、 83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、卯％、91%、 92%、 93%、 94°/。、 95%、 96%、 97%、 98%、最优选约99%的氨基酸同源性的M酸序列，且具有切断单链DNA、及将单链DNA的5，末端和3，末端结合的活性的多肽。
或者，含有与序列编号20所示的M酸序列实质上相同的M酸序列的多肽，是指由序列编号20所示的M酸序列中的l或数个(优选1~30个左右，更优选1~10个左右，进一步优选1~5个)#^酸缺失、取代或附加的M酸序列所构成，且具有切断单链DNA及将单链DNA的5，末端和3，末端结合的活性的多肽。
上述氨基酸的缺失、附加及取代，可以存在于已分离的天然多肽中，另外，也可以是利用该技术领域中公知的方法改变对本发明的蛋白质进行编码的基因从而重新导入的情形。例如，特定的氨基酸残基的取代，可以使用市售的试剂盒(例如Mutan TM - G (TAKARA公司)、Mutan TM —K (TAKARA^S司))等，利用Guppedduplex法、Kunkel法等7^知的方法或以它们为基准的方法进行威基的取代而实施。
Evl蛋白质或其他部分肽可以从天然来源获得，或者可以作为重组体获得。为了获得重组体，为了表达Evl蛋白质或其部分肽，重组载体成为必需。另外，可以在本发明的组合物中^^有该重组载体。在本重组载体中，对Evl蛋白质或其部分肽进行编码的核酸以可以表达的方式插入。
在这里，所谓"可以表达"，是指为了表达具有所需要的M酸序列的Evl蛋白质或其部分肽而将对它们进行编码的核酸与阅读框一起插入到表达用的载体中的状态，以使其他必要的构成要素例如启动子、选择标记物等发挥功能而将其构建在该载体中的状态。
在这里，所谓"对Evl蛋白质进行编码的核酸"，不仅包括由序列编号l、 3、 5、 7、 9或ll所示的磁Jjf列构成的核酸，还包括跟由与序列编号l、 3、 5、 7、 9或11所示的4^序列互补的减基序列构成的核酸在严^件下进行杂交，且对具有切断单链DNA及将单链DNA的5，末端和3，末端结合的活性的多肽进行编码的核酸。作为能够跟含有序列编号l、 3、 5、 7、 9或ll所示的g序列的核酸在严4MHf下进行杂交的DNA,可以举出含有与序列编号l、 3、 5、 7、 9或11所示的g序列具有优选约70 %以上、更优选约80 % 、 81 % 、 82 % 、83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、卯％、 91%、 92%、 93%、94%、 95%、 96%、 97%、 98%、最优选约99%的多核苷酸序列同源性的4^序列的核酸等。
在这里，所谓"对Evl蛋白质的部分肽进行编码的核酸"，不仅包括由序列编号19所示的a序列构成的核酸，还包括跟由与序列编号19所示的4序列互补的磁基序列构成的核酸在严;fMHf下进行杂交，且对具有切断单链DNA及将单链DNA的5'末端和3，末端结合的活性的多肽进行编码的核酸。
作为能够跟含有序列编号19所示的g序列的核酸在严旨降下进行杂交的DNA，可以举出含有如下所示M序列的核酸等，该^序列与序列编号19所示的4^序列具有优选约70 %以上、更优选约80 % 、 81 % 、82%、 83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、卯％、 91%、 92%、93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、最优选约99%的多核普酸序列同源性。
在这里，所谓严4^4K是指容易被本领域普通技术人员确定的用于杂交的条件，通常是依赖探针长度、清洗温度、及盐浓度的经验性诸条件。通常，如果探针变长则用于适度退火的温度升高，如果探针变短则温度降低。关于杂交物的形成，通常互补链在比其熔点稍低的温度条件下依赖再次退火的核酸的能力。
具体而言，例如，作为低严格条件，可以举出在杂交后的过滤器的清洗阶段，在37"C 42X:的温度条件下，在O.lxSSC、 0.1。/。SDS溶液中进行清洗等。另外，作为高严格条件，例如可以举出在清洗阶段，在65n、5xSSC及0.1。/。SDS中进行清洗等。通过进一步提高严^^ff，可以得到同源性高的多核普酸。
对Evl蛋白质或其部分肽进行编码的核酸，可以按照常规方法从包括人、大鼠、小鼠、羊等哺乳类的真核生物的细胞获得。或者，也可以从数据库等获得已经公知的Evl蛋白质的核酸序列信息，根据其序列信息得到源自需要的生物种的Evl基因。Evl基因的克隆可以根据该技术领域的一般知识进行。该基因可以M达该基因的细胞制备cDNA文库，利用常规的筛选方法获得。或者，^达该基因的细胞制备RNA，通过逆转录S^成了 cDNA，然后根据该基因序列制备PCR用引物，扩增cDNA，由此可以获得该cDNA。
已整合了对Evl蛋白质或其部分肽进行编码的核酸的重组载体，可以通过在适当的载体上连结该核酸而得到。重组载体在供于克隆的情况下，只要可以在宿主中复制，就没有特别限定。另外，作为用于表达Evl蛋白质或其部分肽的载体，可以使用能在宿主中复制且能够使编码该蛋白质的DNA片段表达的启动子等。
作为可以使用的载体，例如可以举出质粒DNA、噬菌体DNA等。作为质粒DNA,可以举出源自大肠杆菌的质粒(例如pBR322、 pBR325、pUC118、 pUC119、 pUC18、 pUC19、 pCBD-C、 pET15b等)、源白枯草菌的质粒(例如pUB110、pTP5、pC194等)、源自酵母的质粒(例如YEpl3、YEp24、 YCp50、 YIp30 )等；作为噬菌体DNA，可以举出入噬菌体等。进而，也可以使用逆转录病毒、痘苗病毒等动物病毒、杆状病毒、披膜病毒(Togaviridae)等昆虫病毒载体。
作为在本发明中使用的启动子，只要是对应于在基因表达中使用的宿主的合适的启动子，就没有特别限定。
例如，在使用动物细胞作为宿主的情况下，可以举出SRoc启动子、CMV启动子、SV40启动子、LTR启动子、HSV-TK启动子、EF - 1 oc启动子等。
在宿主是大肠杆菌的情况下，可以举出tac启动子、trp启动子、lac启动子、recA启动子、入PL启动子、Ipp启动子、T7启动子等；在宿主是枯草菌的情况下，可以举出SPOl启动子、SP02启动子、penP启动子等。
在宿主是酵母的情况下，可以举出PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。
在宿主是昆虫细胞的情况下，优选多角体蛋白启动子、P10启动子等。在本发明的重组载体上，除了对Evl蛋白质或对其部分进行编码的核酸序列、启动子序列之外，还可以连结选择标记物、终止子、增强子、剪切信号、PolyA附加信号、核糖体结合序列(SD序列)、SV40复制起点(SV40ori)等。
作为选择标记物，没有限定，但潮霉素耐受性标记物(Hygf)、 二氢叶酸还原酶基因(dhfr)、氨节青霉素耐受性基因(Ampr)、卡那霉素耐受性基因(Kanr)、新霉素耐受性基因(Neor、 G418)等是可以利用的。
另外，为了使容易进行重组蛋白质的分离、纯化等，也可以在要表达的蛋白质或其一部分的N末端侧、C末端侧等融合纯化用的标签序列例如His标签、HA标签、GST等。
在宿主是大肠杆菌的情况下，可以利用碱性磷酸酶信号、OmpA信号等；在宿主是枯草菌的情况下，可以利用oc -淀粉酶信号序列、枯草芽孢杆菌信号序列等；在宿主是酵母的情况下，可以利用oc因子信号序列、转化酶信号序列等；在宿主是动物细胞的情况下，例如可以利用胰岛素信号序列、oc干扰素信号序列等。
对Evl蛋白质进行编码的DNA或其一部分向上述载体的插入，可以直接或根据需要利用限制酶对克隆的DNA进行消化，附加连接物，整合到载体DNA的限制酶部位或多克隆位点而进行。连结的DNA可以在其5，末端侧具有作为翻"^始密码子的ATG,另外，在3，末端侧具有作为翻译终止密码子的TAA、 TGA或TAG。这些翻if^始密码子、翻译终止密码子，也可以使用合适的合成DNA接头进行附加。连结的DNA有必要I^到载体中以使被该DNA编码的本发明的多肽在宿主细胞中表达。
为了表达Evl蛋白质或其部分肽，有必要将已插入有编码它们的核酸的表达载体转化到合适的宿主细胞。作为用于进行转化的宿主，只要可以表达Evl蛋白质就没有特别限定。例如，可以举出属于大肠杆菌
(Escherichia coli)等的埃希氏菌属、枯草菌(Bacillus Subtilis)等杆菌属、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等假单胞菌属、苜蓿根瘤菌
(Rhizobium meliloti)等根瘤菌属的细菌；酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae )、 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe )、 毕赤酵母
(Pichia pastoris )等酵母；猴细胞COS - 7、 Vero、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、或Sf9、 Sf21等昆虫细胞。
作为重组载体向大肠杆菌的导入方法，可以利用^f吏用钓离子的方法、电穿孔法等。作为重组载体向酵母的导入方法，可以利用电穿孔法、原生质球法、乙酸锂法等。作为动物细胞或重组载体向动物细胞的导入方法，可以使用DEAE葡彩瞎法、电穿孔法、磷酸钾法、利用阳离子性脂质的方法等。
Evl蛋白质或其部分肽，可以通过培养转化体，使该蛋白质或其部分肽表达，从转化体的培养物分离该蛋白质或其部分肽，由此进行制造。所谓"培养物"，是指培养上清、或者培养细胞或培养菌体或细胞或菌体的破碎物的任意。
作为培养以大肠杆菌、酵母菌等微生物为宿主的转化体的培养基，只要是含有微生物可以同化的碳源、氮源、无机盐类等，且可以有效进行转化体的培养的培养基，可以使用天然培养基、合成培养基的任意。作为碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等碳水化物，乙酸、丙酸等有机酸，乙醇、丙醇等醇类。作为氮源，除了氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐或其他含氮化合物之外，还可以使用蛋白胨、肉提取物、玉米浆等。作为无机盐类，可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钓等。
培养是在适于宿主细胞的条件下进行的。例如，作为培养大肠杆菌时的培养基，优选LB培养基、M9培养基等。为了才艮据需凍—吏启动子有效发挥功能，可以添加异丙基-P-D-硫代半乳糖苷、3P -吲咮基丙烯酸类的药剂。在是大肠杆菌的情况下，培养通常在约15 37t:下进行约3 24小时，根据需要还可以增加通气、搅拌。在宿主是枯草菌的情况下，培养通常在约30 40X:下进行约6 24小时，根据需要还可以增加通气、搅拌。
作为用于培养酵母的培养基，可以举出SD培养基、YPD培养基。培养基的pH优选调节至约5~8。培养通常在约20 35"C下进行约24~72小时，根据需要增加通气、搅拌。在培养宿主是昆虫细胞或昆虫的转化体时，作为培养基，可以举出含有牛血清的Grace昆虫培养基等。培养基的pH优选调节至约6.2 6.4。培养通常在约27X:下进行约3 5天，根据需要增加通气、搅拌。在培养宿主是动物细胞的转化体时，作为培养基，例如可以使用含有
约5 ~ 20 %的胎牛血清的MEM培养基、DMEM培养基、RPMI - 1640培养基等。pH优选约6 8。培养通常在约30 40X:下进行约15 60小时，根据需要增加通气、搅拌。为了从上述培养物分离纯化Evl蛋白质或其部分肽，例如可以通过下述的方法进行。
当从培养菌体或细胞中提取Evl蛋白质或其部分肽时，可以适当使用如下所示的方法等，即培养后，利用^^知的方法收集菌体或细胞，将其在合适的緩冲液中悬浮，通it^声波、溶菌酶和/或冻结融解等破坏菌体或细胞，然后通过离心分离、过滤得到Evl蛋白质或其部分肽的粗提取液。可以在緩冲液中含有尿素、盐酸胍等蛋白质变性剂、Triton X-100等表面活性剂。当培养液中有Evl蛋白质或其部分肽被分泌出来时，在培养结束后，用其自身公知的方法分离菌体或细胞和上清，收集上清。如此得到的培养
上清或提取液中含有的Evl蛋白质或其部分肽的纯化，可以适当组合乂^的分离、纯化法来进行。作为这些公知的分离、纯化法，可以使用盐析或溶剂沉淀法等利用溶解度的方法，透析法、超滤法、^Jt滤法、及SDS- PAGE等主要利用分子量的差的方法，离子交换层析法等利用电荷差的方法，亲和层析法等利用特异亲和性的方法，逆相高速液体层析法等利用疏水性的差的方法，等电点电泳法等利用等电点的差的方法等。
含有Evl蛋白质或其部分肽、或者它们的表达载体而成的组合物，可以用于将单链DNA切断、和/或将单链DNA的5，末端和3，末端结合。在本组合物中，除了 Evl蛋白质或其部分肽、或者它们的表达载体等之外，只要是单链DNA的切断、结合反应所需的物质，就可以含有任意物质。例如，除了 Mg"等金属离子、ATP等之外，还可以含有将pH保持恒定的緩冲液等辅助物质。
在本发明的其他实施方式中，也包括如下所示的的组合物，所述组合物除了上述的有效成分及辅助物质等之外，还含有Rad51B蛋白质或Rad51B蛋白质的表达载体。
在这里，"Rad51B蛋白质"是指含有与序列编号14、 16或18所示的^J^酸序列相同或实质上相同的Jl^酸序列的蛋白质。在这里，所谓"含有实质上相同的M酸序列的蛋白质"，是指含有与序列编号14、 16或18所示的M酸序列具有约60%以上、优选约70%以上、更优选约80%、81%、 82%、 83%、 84%、 85%、 86%、 87%、 88%、 89%、 90%、 91%、92%、 93%、 94%、 95%、 96%、 97%、 98%、最优选约99°/。的絲酸同源性的M酸序列，且具有ATPase (三磷酸腺苷酶)活性及与作为对同源重组特异的DNA结构的霍利迪(HoUiday)结构结合的活性的蛋白质。
或者，含有与序列编号14、 16或18所示的M酸序列实质上相同的M酸序列的蛋白质，是指由序列编号14、 16或18所示的M^列中的l或数个(优选1 30个左右，更优选1 10个左右，进一步优选1~5个)Jl&酸缺失、取代或附加的M酸序列所构成，且具有ATPase (三磷酸腺苷酶)活性及与对同源重组特异的作为DNA结构的霍利迪(Holliday)结构结合的活性的蛋白质。
上述氨基酸的缺失、附加及取代，可以存在于已分离的天然多肽中，另外，也可以是利用在该技术领域中公知的方法改变对本发明的蛋白质进行编码的基因从而重新导入的情形。例如，关于特定的氨基酸戎基的取代，可以使用市售的试剂封例如Mutan TM - G( TAKARA公司)、Mutan TM-K ( TAKARA公司))等，利用Guppedduplex法、Kunkel法等'i^p的方法或以它们为基准的方法进行威基的取代而实施。
Rad51B蛋白质可以从天然环境获得，或者可以通过使重组体表达而获得。在使Rad51B蛋白质的重组体表达的情况下，可以根据使上述的Evl蛋白质表达的方法，选择表达用载体及表达所需的构成要素，另外，关于重组体的获得，也可以根据获得上述的Evl蛋白质的重组体的方法来实施。
另外，在本发明的实施方式中，也包含如下所示的组合物，所述组合物除了 Evl蛋白质或Evl蛋白质的表达载体之外，还含有DNA拓朴异构酶I型蛋白质或DNA拓朴异构酶I型蛋白质的表达载体。在这里，"DNA拓朴异构酶I型"通常也被称为"TopoI"等，但并不拘泥于其惯用名称，包括具有下述活性的酶的全部，所述活性是指向环状(双链)DNA的一个链导入切口，使另一个链通过，然后使切口再结合，结果DNA的超螺旋被消除的活性。因此，关于本发明中的"DNA拓朴异构酶I型"，包括源自原核生物及真核生物中任意的物质，另外，还包括将DNA超螺旋的正向或反向的任意一方消除的物质、将DNA超螺旋的正向瓦良向双方消除的物质中的任意物质。DNA拓朴异构酶I型蛋白质，可以从天然环境获得，还可以通过使重组体表达而获得，或者可以购入市售品。在使DNA拓朴异构酶I型蛋白质的重组体表达的情况下，可以根据使上述的Evl蛋白质
表达的方法，选^^表达用的载体;s^达所必需的构成要素，另外，关于重
组体的获得，也可以根据获得上述的Evl蛋白质的重组体的方法来实施。
进而，在本发明的实施方式中，含有抑制Evl活性的组合物。Evl蛋白质具有将单链DNA切断和/或结合的活性，但该活性通过抑制Evl活性的组合物进行适时的抑制调节，由此可以实现具有更优选形式的单链DNA的形成。作为抑制Evl活性的组合物的有效成分而含有的化合物，是阿克拉霉素(Aclarubicin )、克菌定(Dequalinium )、 DIDS (Disodium Salt )、p -玉红霉素(P - Rubromycin)和/或3-ATA (3 - - 9 -硫代(10H)-吖咬酮3 - amino — 9 — thio (10H) -acridone)。这些4匕合物可以以盐的形式含于抑制Evl活性的组合物中。
本发明的组合物，除了作为有效成分的化合物、蛋白质、DNA等之外，还可以含有用于调节pH的緩冲剂、用于调节离子强度的盐、蛋白酶抑制剂等通常在作为试剂等提供时所必需的添加物质。关于该添加物质，可以根据本发明的组合物的用途，由本领域普通技术人员适当选择及使用。
在本发明的其他实施方式中，提儉使用了本发明的组合物的单链DNA分子量标记物的制作方法、及所制作的单链DNA分子量标记物。本发明的单链DNA分子量标记物通过如下制备从分子量已知的单链DNA制作分子量为该分子量的整数倍的分子量的单链DNA。因此，本发明的分子量标记物，提供的是用作起始物质的单链DNA和/或分子量为该分子量的整数倍的单链DNA的混合物。进而，通过琼脂糖电泳等分离该混合物的分子量标记物，切出与各分子量相对应的单链DNA而进行生成，就可以提供具有特定分子量的单链DNA。在本发明的单链分子量标记物的制作方法中，只要是单链DNA就可以使用任意DNA,但优选环状单链DNA。
如前所述，如果使用含有本发明的Evl蛋白质而成的组合物，就可以切断单链DNA并使其再次结合，所以可以制作含有各种长度(或分子量)的单链DNA。例如，当参考本发明的实施例进行说明时，如图14~图18的a所示，如果使含有本发明的Evl蛋白质而成的组合物作用于(J) xi74环状单链DNA (5368个碱基)，就可以制作5368 x n个碱基(n为1以上的整数)的分子量标记物(以图14~图18的a的皿的相片的右侧横向椭圆模式地表示单链DNA。 一个椭圆表示5368个M的单链DNA的位置，两个椭圆表示5368 x 2个碱基的单链DNA的位置，三个椭圆表示5368x 3个碱基的单链DNA的位置)。同样地,如果使用不同分子量的单链DNA例如M13mpl8 (7250个碱基)，就可以制作7250 x n (n为1以上的整数)的分子量标记物(参考图4)。
如果使用所制作的单链DNA分子量标记物，在通过辅助噬菌体等提取单链DNA时，可以对已取出的DNA的分子量进行研究。
需要说明的是，由本发明的组合物制作的单链DNA标记物，在经乙醇沉淀等之后，即便进行冻结干燥，其分子量也不会发生变化，所以可以用作稳定的单链DNA分子量标记物。
以下示出实施例，本发明并不限于此。
实施例
1.人Evl蛋白质的纯化
利用PCR法从人cDNA库(Clontech公司)分离Evl蛋白质(NCBI登录号AAF21709) DNA片段(例如序列编号1)，在pET15b载体的Ndel位点进行克隆(Novagen公司)。在该构造中，使His标签序列在已分离的基因的N末端侧融合。Evl蛋白质使用:U^杆菌BL21 (DE3 )codonplus - RP林(Stratagene公司)来表达，通过包括除去6 x His标签的步骤的四步骤进行纯化。首先，佳束达Evl蛋白质的细胞在A緩冲液(20mM磷酸钾(pH8.5 )、 700mM的NaCl、 5mM的2 -巯基乙醇、10mM的咪唑、10%的甘油)中悬浮，使用超声波破碎器使细胞破碎。以30000 xg、 4"C离心分离得到的细胞破碎液20分钟，平稳混合得到的上清和8ml的Ni -NTA琼脂糖珠(QIAGEN公司)。在4匸下，利用一小时分批处理法使His标签融合Evl蛋白质(His-Evl)结合。
用80ml的B緩冲液(20mM磷酸钾(pH8.5 )、 700mM的NaCl、 5mM的2-巯基乙醇、30mM的咪唑、10 %的甘油)清洗Evl -结合珠，接着，用80ml的C緩冲液(20mM裤酸钾(pH8.5)、 700mM的NaCl、 5mM的2-巯基乙醇、60mM的咪唑、10%的甘油)清洗，再次用80ml的B緩冲液清洗，然后将得到的Evl-结合珠填充到Econo-Column柱(BIO-RAD公司)。用300ml的D緩冲液(20mM磷酸钾(pH8.5)、 lOOmM的NaCl、 5mM的2-巯基乙醇、30mM的咪唑、10%的甘油)清洗填充的Evl 一结合珠，通过30 ~ 300mM咪唑的直线浓度梯度将His — Evl洗脱出来。
向含有His-Evl的组分中添加等量的F緩冲液(10mM磷酸钾(pH8.5 )、 100mM的NaCl、 5mM的2 -巯基乙醇、10 %的甘油)，进而与10ml的羟基磷灰石(BIO-RAD公司)在4"C下通过一小时分批处理法平稳混合。随后，用80ml的G緩冲液(20mM磷酸钾(pH8.5)、 100mM的NaCl、 5mM的2-巯基乙醇、10%的甘油)清洗树脂，填充到Econo-Column柱中。用300ml的H緩冲液(10mM裤酸钾(pH8.5 )、225mM的NaCl、 5mM的2-St基乙醇、10 %的甘油)清洗填充的树脂，然后通过225 ~ 1000mM的NaCl及10 ~ 300mM的裤酸钾(pH8.5 )的直线浓度梯度将His - Evl洗脱出来。
对于得到的His - Evl,每lmg添加5单位的凝血斷GE Healthcare Bio- Science公司)，对4L的J緩冲液(20mM磷酸钾(pH8.5 )、 130mM的NaCl、 5mM的2-巯基乙醇、10%的甘油)，在4^下进行透氺斤。
在除去His标签之后，Evl蛋白质进而使用Superdex 200凝胶过滤柱(HiLoad 26/60 Superdex 200 prep grade 、 GE Healthcare Bio -Science )层析法进行纯化。纯化后，对K緩冲液(20mM HEPES( pH7.3 )、lOOmM的NaCl、 5mM M 2 -巯基乙醇、30 %的甘油)、或L緩沖液(20mM的磷酸钾(pH8.5 )、 700mM的NaCl、 5mM的2 -巯基乙醇、30 %的甘油)，将Evl蛋白质进行透析，在-20"C下保存。已纯化的Evl蛋白质的浓度，利用Bradford法并以BSA为基准进行测定。图la是已纯化的Evl蛋白质进行12 % SDS - PAGE的结果。
2.使用了 Evl -或Rad51B -结合珠的下拉(Pull-down)测定
Rad51B蛋白质按照已经損 l"的方法进行纯化(Yokoyama等，J. Biol.Chem.278: 2767-2772, 2003)。
根据说明书使Evl蛋白质及Rad51B蛋白质结合在Affi-gel 10珠(Bio-Rad公司)上。添加乙醇胺(pH8.0)以使残留的酯瓶基的最终浓度成为lOOmM,在4X:下孵育一晚。用500 p 1的清洗緩冲液-1 ( 20mM的磷酸钾(pH8.5 )、 30 %的甘油、700mM的NaCl、 5mM的2 -巯基乙醇、0.05% Triton X-100 )三次清洗Affi-gel 10-Evl珠，用清洗緩冲液-2(20mM HEPES — NaOH (pH7.3 )、 30%的甘油、卯mM的NaCl、 2mM的2 -巯基乙醇、0.1 %的Triton X-IOO、 2mM的硫酸铵、O.lmM的EDTA)三次清洗Affi-gel 10-Rad51B珠，然后将Affi-gel 10-蛋白质制备成50%悬浮液，在4C下保存。
在进行结合测定的情况下，将Affi-gel10-蛋白质悬浮液(30jLil)与10 n g的Evl或Rad51B蛋白质在室温下孵育150分钟。用100 M1的緩沖液-1 ( 20mM的磷酸钾(pH8.5 )、 30 %的甘油、700mM的NaCl、 5mM的2 -巯基乙醇、0.3 %的Triton X-100 )四次清洗Affi - gel 10 - Evl珠。另外，用100 M1的緩沖液-2 (20mM HEPES - NaOH (pH7.3 )、 30 %的甘油、卯mM的NaCl、 2mM的2 -巯基乙醇、2mM的石克酸铵、O.lmM的EDTA、 0.35%的Triton X-100)四次清洗Affi-gel 10-Rad51B珠。将SDS - PAGE样品处理緩沖液(2 x )和清洗后的珠直接混合，在100■€下进行2分钟热处理，用12%的SDS-PAGE分离之后，用考马斯亮蓝对蛋白质进行染色。
如图lb所示，Rad51B蛋白质被Ev1-结合^Mi下。另外，Evl蛋白质被Rad51B结合^Mi下(图lc )。
根据这些结果，可知Evl蛋白质与Rad51B直接结合。在Evl-结合珠用于Pull-down测定的情况下，Rad51B通过与Evl -结合珠1: 1的化学计量法结合(图lb )。另一方面，大量的Evl蛋白质与Rad51B结^^珠一起沉降(图lc)。因此，认为Evl蛋白质彼此聚合而形成复合体。通过凝胶过滤分析，Evl蛋白质在约600kDa的组分处被洗脱出来，示出Evl蛋白质形成了约13亚基的多聚体(multimer)(图2 )。
3. DNA结合测定
接着，对Evl蛋白质和DNA的结合性进行了研究。
在10 jLi 1的反应溶液(20mM的HEPES (pH7.5 )、 lmM的DTT、lmM的MgCl2、 100mg/ml的BSA)中混合(J) x 174环状单链DNA (40M M)或(|) x 174超螺旋双链DNA (10 in M )，在37"C下使其^^应15分钟。反应产物，使用1 x TAE (40mM的TRIS乙酸、lmM的EDTA)緩沖液，用0.8 %琼脂糖^电泳(3V/cm、 3小时)进行解析。DNA带用溴化乙锭染色(图3)。由测定的结果可知，Evl蛋白质与单链DNA及超螺旋双链DNA高效地结合(图3 )。
4.单链DNA的连环体化测定
在20mM的HEPES — NaOH( pH7.5 )、 lmM的DTT、 lmM的MgCl2、O.lmg/ml的BSA中，在37匸下孵育(|) x 174或M13mpl8环状单链DNA
(20nM)。随后，利用0.2。/。的SDS、 1.3mg/ml的蛋白酶K对样品进行除蛋白处理。用0.9%的琼脂糖凝胶电泳分离得到的产物，用SYBR Gold
(Invitrogen公司)对DNA带进行染色。
与Evl蛋白质作用的DNA当中，环状单链DNA形成了多聚体(图4a中的泳道2、 4，图4b中的泳道2),与此相对，超螺旋双链DNA未见特别变化(图4b中的泳道5)。 Evl蛋白质未诱导超螺旋双链DNA的拓朴结构变化，所以认为Evl蛋白质的活性与拓朴异构酶I之类的活性(图4b中的泳道6)不同。
接着，对针对Evl蛋白质活性的金属离子的要求性进行了研究，结果示出强烈要求Mg2+ (图5a)。虽在没有M^+存在的情况下，认为也具有Evl蛋白质的连环体化活性，但活性通过Mg"而得到促进。关于MgS+的最佳浓度，受反应条件(其他成分，例如甘油浓度、盐浓度)左右，例如为0.1mM~20mM,优选0.5mM ~ 15mM，更优选0.5mM ~10mM,进一步优选0.5mM 2mM左右。另外，关于Mg2+以外的金属离子，Ca"也示出相同的效果(图5b)。就Mn"而言，在本实验条件下，形成巨大的DNA复合体样的生成物，另外，就Zn"而言，未见类似MgH那样的促进活性(图5b )。
另外，形成的单链DNA的多聚体，即便在ioox:下处理IO分钟也
不被消除(图6),所以表明这些多聚体是在环上连结的环状单链DNA的连环体。
接着，为了通过视觉捕捉环状单链DNA因Evl蛋白质的作用而被连环体化的状态，而用电子显微镜来观察生成产物。5. 电子显微镜观察
利用苯酚/氯仿法提取由Evl蛋白质形成的单链DNA连环体，随后 通过乙醇沉淀进行回收。接着，在没有ATP存在的情况下用RecA蛋白 质(New England Biolabs公司)覆盖单链DNA连环体，在镀碳的铜制 载网上用2%乙酸双氧铀进行染色。经染色的样品通过基于钨的旋转喷 涂法而视觉化，用JEOLJEM2000FX电子显微镜进行观察。
如图7所示，观察到含有2或3个单链DNA分子的环状单链DNA 连环体。
综上，根据单链DNA的连环体化的测定及电子显微镜的观察结果， 认为Evl蛋白质通过切断环状单链DNA，随后将5'末端和3，末端结合， 来形成连环体。因此，可以得出下述结论，即Evl蛋白质具有切断单链 DNA的活性及将5'末端和3，末端结合的活性。
需要说明的是，得出即便是直链状单链DNA也可以发生连环体化 的结果。
6. Rad51B的影响
接着，研究基于Evl蛋白质的单链DNA的连环体化是否受Rad51B 的影响。如图8a所示，可知通过Evl蛋白质的DNA的连环体化，在ATP 的存在下，被Rad51B显著促进(泳道4 )。与此相对，Rad51B依赖性的 促ii^没有ATP存在的情况下并不那么显著(图8a中的泳道8)。因此， 提示ATP结合Rad51B蛋白质促i4^于Evl蛋白质的DNA的连环体化。 基于Rad51B的Evl蛋白质活性的促进效果，依赖于Rad51B的添加浓 度而上升，^M目对于4 n M的Evl蛋白质，即^f更添加1 n M以上的Rad51B， 也未见在其以上的促进效果(图9 )。
另一方面，与Rad51B示出序列类似性的Rad51蛋白质，无论有无 ATP都抑制通过Evl蛋白质的DNA的连环体化(图8b)。才艮据这些结 果，提示在Evl和Rad51B蛋白质之间，通过特异的功能性相互作用，Evl 蛋白质的活性得到促进。
7. Evl蛋白质的EVH2域为了对成为通过Evl蛋白质将单链DNA连环体化的原因的功能域 进行鉴定，对含有1 - 221及222 - 418的氨基酸残基的两个Evl片段、 Evl (1 - 221)及Evl ( 222 - 418 )进行了纯化。Evl (1 - 221)及Evl (222 - 418 )的纯化以在纯化Evl蛋白质全长时使用的方案为基准进行。
按照常规方法，制作用于表达Evl (1-221)及Evl (222-418) 的构造体后，分别转化到大肠杆菌(BL21(DE3))，使蛋白质得以表达。 关于Evl (1-221)，在回收了细胞提取物之后，通过Ni-NTA琼脂糖 柱(Invitrogen公司)，将得到的峰组分与羟基磷灰石(Bio - Rad公司) 混合。离心分离后，回收未与羟基磷灰石结合的上清，通过凝血酶处理 除去His标签，利用Superdex 200 ( GE Healthcare公司)柱层析法， 分离Evl (1 - 221)和标签。将通过Superdex 200柱层析法得到的Evl
(1-221)用于实验(图10)。关于Evl (222-418)，在回收了细胞提 取物之后，通过Ni - NTA琼脂糖柱(Invitrogen公司)，使得到的峰组 分通过羟基磷灰石(Bio-Radz>3 )，回收峰组分。对于已回收的Evl
(222-418)，通过凝血酶处理除去His标签，利用Superdex 200 ( GE Healthcare公司)柱层析法，分离Evl (222-418)和标签。将通过 Superdex 200柱层析法得到的Evl ( 222 - 418)用于实验(图11 )。
Evl (1 - 221)变异体含有EVH1及富含脯氨酸域，Evl ( 222 - 418 ) 变异体含有EVH2域(图12a )。如图12b所示，Evl ( 222 - 418 )变异 体示出ssDNA连环体化活性(泳道4 ),而Evl (1 - 221)变异体未示 出ssDNA连环体化活性(泳道3)。另外，Evl (222-418)变异体的活 性被Rad51B蛋白质促进(图12c中的泳道8 )，关于Evl (1 - 221)变异 体，即l更是添加Rad51B蛋白质也未检测出活性(图12c中的泳道6 )。
因此，EVH2域认为是Evl蛋白质的ssDNA连环体化活性所必需的。
8.在DNA拓朴异构酶I型蛋白质及Evl蛋白质共存下的单链DNA 的连环体化的促进效果
在10pl的反应液(20mM的HEPES、 ImM的DTT、 100pg/ml的 BSA、 lmM的MgCl2)中，添加20 jiM的(J) x 174单链DNA、 4pM的 Evl、及各浓度或单位数的DNA拓朴异构酶I型蛋白质(源自大肠杆菌 或源自人)，在371C下使其反应1小时。随后，用(K2。/。的SDS、 1.3mg/ml的蛋白酶K对样品进行除蛋白处理。用0.9 %的琼脂糖皿电泳分离得到 的产物，用SYBRGold (Invitrogen公司)对DNA带进行染色(图13 )。
其结果可知，单链DNA的连环体化，在源自大肠杆菌(图13a中 的泳道4~5)或源自人(图13b中的泳道4)的DNA拓朴异构酶I型 蛋白质的共存下得到促进。
9.对影响Evl蛋白质引起的单链DNA链接活性的低分子化合物的 探索
对可以用于适时调节Evl蛋白质引起的单链DNA链接活性的低分 子化合物进行了探索，结果发现阿克拉霉素、克菌定、DIDS、 p -玉红 霉素及3 — ATA ^ft合物。
上述^f匕合物的抑制活性如下所示被检测出。
关于对链接活性的影响(图14 ~图18的a )，向反应液10 n 1 ( 20mM 的HEPES、 lmM的DTT、 100 n g/ml的BSA、 lmM的MgCl2)中，添 加各化合物使其终浓度为1、 5、 10、 20jiM，添加(J) xl74单链DNA使 其为20juM,添加Evl蛋白质使其为4jliM，在37"C下使其反应1小时。 反应后，添加2pl的PK溶液(0.2。/。的SDS、 1.3mg/ml的蛋白酶K)，在 37C下使其反应15分钟。用0.8 %的HGT琼脂糖皿将反应物进行电泳， 通过SYBR Gold检测出DNA。
另外，关于单链DNA结合活性涉及的凝胶阻滞(gel shift)法(图14 ~ 图18的b )，向反应液20 p l( 20mM的HEPES、 lmM的DTT、 100 M g/ml 的BSA、 lmM的MgCl2)中，添加各化合物使其终浓度为1、 5、 10、 20 ji M，添加(|) x 174单链DNA使其为20 p M,添加Evl蛋白质使其为 0.3 )i M，在37"C下使其反应15分钟。用0.8 %的HGT琼脂糖舰将其进 行电泳，用溴化乙锭进行检测。
9 - 1.阿克拉霉素(Aclarubicin )
阿克拉霉素是大幅度降低心脏毒性的蒽环类抗肿瘤药。也是拓朴异 构酶I/II的催化活性抑制剂。另外，通过抑制20S蛋白酶体的胰凝乳蛋 白酶样活性，也抑制泛素化蛋白质的分解。已知会抑制大动脉平滑肌细胞的IL - 1 P诱导性iNOS产生。临床上是作为抗肺瘤性抗生素(产品 名Aclacinon )进行试用，与癌细胞的DNA结合而强烈抑制核酸合成、 RNA合成，由此用于緩解及改善胃癌、肺癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤、 急性白血病的自觉以及他觉症状。此次，发现阿克拉霉素抑制Evl蛋白 质引起的单链DNA的链接活性(图14a)。另外，4吏用凝胶阻滞试验法 研究阿克拉霉素对Evl蛋白质向单链DNA的结合活性的影响(图14b )。 其结果可知，阿克拉霉素不使Evl蛋白质的单链DNA的结合活性发生 变化。根据以上的解析，可知阿克拉霉素在不抑制Evl蛋白质向单链 DNA的结合活性的情况下，抑制单链DNA链接活性。
9 - 2. 克菌定(Dequalinium )
克菌定(氯化克菌定)是抗肿瘤及PKC抑制剂。另外，当照射UV 时，克菌定与PKCa或PKCP共价结合，对它们进行不可逆抑制。是 针对蜂神经毒肽敏感性低传递性Ca^活化K+通道的强力且选择性的非 肽阻断剂，阻滞神经传递。另外，选择性地蓄积在癌细胞的线粒体中，
抑制能量产生。临床上以产品名乂一卜'^ i;》卜口一f而使用。该药剂
作用于细菌的蛋白质而杀灭口腔、咽喉的细菌，用于预防咽炎、扁桃体 炎、口炎、包括拔牙伤的口腔创伤的感染。此次，发现克菌定抑制Evl 蛋白质的单链DNA链接活性(图15a)。另外，使用凝胶阻滞试验法研 究克菌定对Evl蛋白质向单链DNA的结合活性的影响(图15b)。其结 果可知，克菌定使Evl蛋白质向单链DNA的结合样式发生变化。根据 以上的解析，认为克菌定使Evl蛋白质向单链DNA的结合样式发生变 化，抑制Evl蛋白质的环状单链DNA链接活性。
9 - 3. DIDS (Disodium Salt)
dids是对神经母细胞瘤细胞中的cr^uv进行抑制的阴离子输送抑
制剂，显示出抗溃疡作用。另夕卜，还已知抑制向内质网的ATP输送。此次， 发现DIDS抑制Evl蛋白质引起的单链DNA链接活性(图16a)。另夕卜， 使用凝胶阻滞试验法研究DIDS对Evl蛋白质向单链DNA的结合活性 的影响(图16b)。其结果可知，DIDS抑制Evl蛋白质向单链DNA的 结合活性。根据以上的解析，认为DIDS通过抑制Evl蛋白质的单链DNA 结合活性来抑制Evl蛋白质的单链DNA链接活性。9 - 4. P -玉红霉素
P -玉红霉素是HIV-I逆转录酶的抑制剂。另外，还知作为端粒酶 的抑制剂。此次，发现P -玉红霉素抑制Evl蛋白质的单链DNA链接活 性(图17a)。另外，使用凝胶阻滞试验法研究P -玉红霉素对Evl蛋白 质向单链DNA的结合活性的影响(图17b)。其结果可知，由于P-玉 红霉素而使Evl蛋白质向单链DNA的结合样式发生变化。才艮据以上的 解析，认为P -玉红霉素使Evl蛋白质的单链DNA结合样式发生变化， 抑制Evl蛋白质的单链DNA链接活性。
9一5. 3-ATA (3-^^ — 9—石危4戈(10H)—吖咬酮；3 —amino-9 - thio (10H) - acridone)
3-ATA是CDK4的抑制剂。另外，还知进行p - 16变异肺瘤的增殖 抑制。此次，发现3 - ATA抑制Evl蛋白质的单链DNA链接活性(图 18a )。另夕卜，使用凝胶阻滞试验法研究3 - ATA对Evl蛋白质向单链DNA 的结合活性的影响(图18b)。其结果可知，3-ATA不使Evl蛋白质的 单链DNA结合活性发生变化。根据以上的解析，认为3-ATA在不抑 制Evl蛋白质的单链DNA结合活性的情况下，抑制Evl的单链DNA链 接活性。
工业上的可利用性
本发明的组合物，同时具有单链DNA的切断活性及将单链DNA的5， 末端和3，末端结合的活性，所以对单链DNA进行基因工程上的操作， 可作为有效的工具而发挥作用。另外，当使用本发明的组合物时，也可 以提供单链DNA的分子量标记物等，所以本发明的组合物有望能在生 物、医学领域的研究开发的发展中做出较大的贡献。
权利要求
1.一种组合物，其特征在于，含有以下的(a)或(b)所示的Evl蛋白质而成，用于进行单链DNA的切断和/或、单链DNA的5’末端和3’末端的结合；(a)由序列编号2、序列编号4、序列编号6、序列编号8、序列编号10、序列编号12或序列编号20所示的氨基酸序列构成的蛋白质；(b)由在序列编号2、序列编号4、序列编号6、序列编号8、序列编号10、序列编号12或序列编号20所示的氨基酸序列中，具有1或数个氨基酸的取代、缺失或插入的氨基酸序列所构成，且具有切断单链DNA及将单链DNA的5’末端和3’末端结合的活性的多肽。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，还含有M^ +或Ca2 + 。
3. 根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述Mg^的浓度为0.5mM ~ 2.0mM。
4. 根据权利要求1~3中任意一项所述的组合物，其特征在于，还含有Rad51B蛋白质及ATP。
5. 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述Evl蛋白质相对于所述Rad51B蛋白质的摩尔比为1: 0.5~1: 4。
6. 根据权利要求4或者5所述的组合物，其特征在于，所述ATP的浓度为0.5mM ~ 2.0mM。
7. 根据权利要求1~3中任意一项所述的组合物，其特征在于，还含有DNA拓朴异构酶I型蛋白质。
8. —种组合物，其特征在于，含有包含以下(a)或(b)所示核酸的重组载体而成，用于进行单链DNA的切断和/或、单链DNA的5，末端和3，末端的结合；(a) 由序列编号l、序列编号3、序列编号5、序列编号7、序列编号9、序列编号11或序列编号19所示的核苷酸序列构成的核酸，(b) 与由序列编号1、序列编号3、序列编号5、序列编号7、序列编号9、序列编号11或序列编号19所示的核苷酸序列构成的核酸的互补链在严^件下杂交的核酸，且该核酸编码的多肽具有切断单链DNA及将单链DNA的5，末端和3，末端结合的活性。
9. 一种组合物，其特征在于，含有包含以下(a)或(b)所示核酸的重组载体而成，用于进行单链DNA的切断和/或、单链DNA的5，末端和3，末端的结合，(a)对由序列编号2、序列编号4、序列编号6、序列编号8、序列编号10、序列编号12或序列编号20所示的^酸序列构成的多肽进行编码的核酸；(b)对如下所示的多肽进行编码的核酸，所述多肽由在序列编号2、序列编号4、序列编号6、序列编号8、序列编号IO、序列编号12或序列编号20所示的JL&酸序列中具有1或数个氨基酸的取代、缺失或插入的氨基酸序列所构成，且具有切断单链DNA及将单链DNA的5，末端和3，末端结合的活性。
10. —种制造单链DNA标记物的方法，其特征在于，使权利要求1~9中任意一项所述的组合物与单链DNA发生反应，来制造单链DNA标记物。
11. 一种单链DNA标记物，其特征在于，是用权利要求10所述的方法制造的。
12. —种Evl蛋白质活性抑制用组合物，其特征在于，含有选自阿克拉霉素、克菌定、DIDS、 P -玉红霉素及3-ATA中的一种或多种化合物而成。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种用于催化单链DNA的切断及单链DNA的结合的组合物。本发明提供含有Evl蛋白质而成的用于进行单链DNA的切断和/或、单链DNA的5’末端和3’末端的结合的组合物。进而，本发明提供除了Evl蛋白质之外还含有Rad51B蛋白质和/或DNA拓扑异构酶I型蛋白质而成的、用于进行单链DNA的切断和/或、单链DNA的5’末端和3’末端的结合的组合物。
文档编号C12N15/00GK101627120SQ20088000701
公开日2010年1月13日 申请日期2008年3月7日 优先权日2007年3月7日
发明者町田晋一, 胡桃坂仁志, 高久誉大 申请人:学校法人早稻田大学