在存在降低水平的一或多种污染物的条件下制备重组蛋白的细胞培养方法

专利名称：在存在降低水平的一或多种污染物的条件下制备重组蛋白的细胞培养方法
技术领域：
本发明涉及重组蛋白表达技术的领域。更具体地，本发明提供了在细胞培养中富 集重组蛋白的方法、细胞系以及试剂盒，以及纯化所述蛋白的方法。重组技术的进步允许在合意的宿主细胞中制备重组蛋白，打开了重组制备的蛋白 的多种用途的大门。适合用作治疗剂，诊断剂和/或研究剂的重组蛋白的制备是生物技术 领域广泛了解的。值得注意的，在过去十年中，治疗蛋白逐渐引人注意。通常，制备重组蛋白 的方法包括鉴定产生合适产物的克隆，大规模生产，和产物纯化，并且通常费时费力，需要 大量时间、劳动和资源。由于重组蛋白在治疗领域的开发的深入，需要产生和纯化重组产物 的更有效的方法。然而，仅仅增加重组蛋白的产生还不够。例如，大多数重组制备的蛋白存 在产物的复杂混合物中，使得纯化所需的重组蛋白的任务非常有挑战性并且耗费时间。此 夕卜，由于联邦食品和药品监督管理局对蛋白均一性、质量和纯度的严格的规定，需要更好的 蛋白制备和纯化方法。因此，需要导致更高的蛋白产量和改善的蛋白质量的改进的技术

发明内容
本发明提供了富集细胞培养物中的重组蛋白的方法，例如通过降低一或多种污染 物的水平。一些实施方案中，本发明涉及改良的方法，试剂盒和细胞系，用于蛋白的重组制 备。本发明因此在一些实施方案中提供了与前述适合制备重组蛋白的方法相比应用更为简 便、更为高效以及成本较低的方法。本发明其他实施方案中提供了稳定转染的细胞系，与前 述用于制备重组蛋白的稳定转染的细胞系相比其更容易制备，更容易生长并且可以更低的 成本维持。本发明的其他实施方案提供了从细胞培养物收获重组蛋白的更为快捷、简便、安 全且有效的方法。本发明的蛋白包括全长蛋白，蛋白结构域，蛋白片段，包含两个或多个氨 基酸的多肽和肽。一些实施方案中，利用本发明的方法表达的重组蛋白是治疗蛋白。其他 实施方案中，利用本发明的方法表达的重组蛋白是抗体或其抗原结合片段。本发明一些实施方案中，提供了富集细胞培养物中的重组蛋白的方法。所述方法 包括(a)将包含编码重组蛋白的核苷酸序列的第一核酸分子以及包含编码至少一种抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列的第二核酸分子导入细胞，其中两种核苷酸序列均可操 作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件；和(b)在使得 所述重组蛋白在降低水平的一或多种污染物的存在下产生的条件下培养所述细胞，由此在 细胞培养物中富集所述重组蛋白。一些实施方案中，所述方法还包括从细胞培养物收获重 组蛋白的步骤，由此在降低水平的一或多种污染物的存在下制备重组蛋白。一些实施方案中，含有编码凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列的细胞进一步用 包含编码重组蛋白的核苷酸序列的核酸分子转染，所述编码重组蛋白的核苷酸分子可操作 连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的核苷酸序列，所述细胞在使得可在降 低水平的一或多种污染物的存在下产生重组蛋白的条件下进行培养。所述一或多种污染物包括但不限于，一或多种宿主细胞脂质，一或多种宿主细胞 蛋白，一或多种宿主细胞碳水化合物，一或多种宿主细胞RNA分子和一或多种宿主细胞DNA 分子。在具体实施方案中，重组蛋白在降低水平的一或多种宿主蛋白的存在下产生，其中所 述一或多种宿主细胞蛋白存在的量少于总蛋白的lOOOppm，或少于900ppm，或少于800ppm， 或少于700ppm，或少于600ppm，或少于500ppm，或少于400ppm，或少于300ppm，或少于 200ppm,或少于lOOppm，或少于75ppm，或少于50ppm，或少于25ppm，或少于lOppm，或少于 5ppm，或少于3ppm，或少于lppm。宿主细胞污染物，例如宿主细胞蛋白，可利用一或多种本 领域已知的实验以及可商购的那些容易地测定(例如得自Cygnus Technologies, Inc)。当重组蛋白与抗凋亡蛋白或功能片段利用能开放染色质和/或保持染色质在开 放状态的DNA元件共表达时，一或多种污染物的水平相对于重组蛋白单独表达时的所述水 平可降低任何统计学明显的量。一些实施方案中，当重组蛋白和抗凋亡蛋白或其功能片段 共表达时一或多种污染物的水平相对于所述重组蛋白单独表达时产生的一或多种污染物 的水平降低大约20 %，或大约30 %，或大约40 %，或大约50 %，或大约60 %，或大约70 %， 或大约80%，或大约90%，或大约95%，或大约96%，或大约97%，或大约98%，或大约 99%，或更多。一个实施方案中，宿主细胞首先用包含编码凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列 的核酸分子转染，然后再用包含编码重组蛋白的核苷酸序列的核酸分子转染。
另一实施方案中，宿主细胞用两种核酸分子同时转染。第一核酸分子和第二核酸分子可克隆入同一载体或分离的载体。一些实施方案 中，所述载体是质粒。其他实施方案中，所述载体是病毒载体。一些实施方案中，所述第一核酸分子包含两个核苷酸序列，每个编码重组蛋白，并 且每个可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件。具 体实施方案中，第一核酸分子包括两个核苷酸序列，一个编码抗体轻链，另一个编码抗体重 链。一些实施方案中，重组蛋白是治疗蛋白。其他实施方案中，所述重组蛋白是抗体或 其抗原结合片段。一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。一些实施方案中，第一核酸分子还包括一或多个选自下组的核苷酸序列(a)能 增强翻译的核苷酸序列；(b)能增加分泌的核苷酸序列；和(c)能增加mRNA稳定性的核苷 酸序列，其中(a)-(c)中的一或多个核苷酸序列可操作连接于编码重组蛋白的核苷酸序 列。
一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞，诸如例如BHK21细胞，CHO细胞， CHO-Kl细胞，CHO-DUXX细胞，NSO细胞或Sp2/0细胞。一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)。一些实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件选自(a) —或多种延伸的无甲基化GpG岛；(b) —或多种基质附着区；(c) 一或多种稳定化区和抗阻遏区；以及(d)(a)-(c)的任意组合。一些实施方案中，一或多种延伸的无甲基化GpG岛来自一或多个遍在表达的基因的启动子区。遍在表达基因的例子包括但不限于，人hnRNPA2基因，大鼠hnRNPA2基因，小鼠hnRNPA2基因，人TBP基因，小鼠TBP基因，人rpS3基因和小鼠rpS3基因。用于本发明方法、试剂盒和细胞的示例性延伸的无甲基化GpG岛的序列见SEQ ID NO :1，其描述了小鼠rpS3基因(Genbank登记号AY999160和AY043296)启动子来源的3. 2kb片段，以及见于SEQ ID N0:2，其描述了人hnRNPA2基因(Genbank登记号D28877)启动子区来源的1.5kb片段。此外，人hnRNPA2基因来源的较大片段SEQ ID NO: 3(4kb序列)和SEQ ID NO :4(8kb序列)也可用于本发明的方法中。一些实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件是天然存在的DNA元件。其他实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件是人工合成的DNA元件。其他实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件是天然存在和人工合成的DNA元件的组合。一些实施方案中，编码抗凋亡蛋白的核苷酸序列选自编码下述蛋白的核苷酸序列:bcl-2 ；bcl-xL ；bcl-6 ； ^ M ；xiap ；hiapl ；hiap2 ；aven ；E1B-19K ；P21 ；myrPHK ； HSV-I y 1 34.5;和beclin，或其功能同系物或片段。本发明方法所用抗凋亡基因的示例性 核苷酸序列示于SEQ ID NO :5和SEQID NO :7，其分别代表抗凋亡基因aven的人和小鼠核 苷酸序列，以及SEQID NO :9，其代表人E1B-19K基因的核苷酸序列。应理解这些序列的变体和片段也可使用，只要它们显示与相应的抗凋亡蛋白相关的一或多种功能活性。可选，细胞可与纯化或分离的抗凋亡蛋白或其片段接触。示例性抗凋亡蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO :6，8 和 10。一些实施方案中，用于产生重组蛋白的细胞培养在无血清培养基中。一些实施方案中，所述培养基不含有动物产品。其他实施方案中，所述培养基不含有蛋白。一些实施方案中，所述第一和/或第二核酸分子通过以下方法导入宿主细胞(a)将宿主细胞置于电穿孔装置中，所述装置包含具有适合接受宿主细胞的开口的隔板(barrier) ； (b)将所述宿主细胞固定在开口中；(c)使所述细胞与电流接触，使得电流通过 宿主细胞；(d)监测电穿孔装置中的电流和电压比；和(e)调节电压量级以优化电穿孔。还提供了在降低水平的一或多种污染物的存在下产生重组蛋白的试剂盒。一些实施方案中，根据本发明的试剂盒包括(a)第一核酸分子，包含能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件以及适于克隆编码重组蛋白的核苷酸序列的多克隆位点；和(b)第二核酸分子，包含编码至少一种抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件。一些实施方案中，本发明的试剂盒还包含包括多个适于导入第一和/或第二核酸分子的宿主细胞在内的一或多个细胞系，以及转染剂和转染装置以及所述转染剂或装置例如本发明的电穿孔装置的使用说明。
一些实施方案中，本发明的试剂盒用于制备治疗蛋白。其他实施方案中，所述试剂 盒可用于制备抗体或其抗原结合片段。一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。一些实施方案中，本发明试剂盒中能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的 一或多种DNA元件是天然存在的DNA元件。其他实施方案中，所述能开放染色质和/或保持 染色质在开放状态的一或多种DNA元件是人工合成的DNA元件。其他实施方案中，所述能 开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件是天然存在和人工合成DNA 元件的组合。—些实施方案中，本发明的试剂盒包含一或多种核酸分子，其中包含能开放染色 质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件，所述DNA元件选自(a) —或多种延 伸的无甲基化GpG岛；(b) —或多种基质附着区；(c) 一或多种稳定化区和抗阻遏区；以及 (d) (a)-(c)的任意组合。一些实施方案中，一或多种延伸的无甲基化GpG岛来自一或多个 遍在表达的基因的启动子区。一些实施方案中，本发明试剂盒中编码抗凋亡蛋白的核苷酸序列选自编码下述蛋 白的核 Ρ酸序歹y :bcl-2 ；bcl-xL ；bcl-6 ；存 舌素(survivin) ；xiap ；hiapl ；hiap2 ；aven ； E1B-19K ；P21 ；myrPHK ；HSV-I γ 1 34. 5 ；和 beclin，或其功能片段或同系物。本发明还提供了适合在降低水平的一或多种污染物存在下产生重组蛋白的宿主 细胞。一些实施方案中，所述宿主细胞包括(a)核酸分子，包含编码重组蛋白的核苷酸序 列，所述核苷酸序列可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种 DNA元件；和(b)核酸分子，其包含编码至少一种抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列， 所述核苷酸序列可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA 元件。一些实施方案中，宿主细胞包括能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一 或多种DNA元件，其为天然存在的DNA元件。其他实施方案中，所述能开放染色质和/或保 持染色质在开放状态的一或多种DNA元件是人工合成的DNA元件。其他实施方案中，所述 能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件是天然存在和人工合成的 DNA元件的组合。一些实施方案中，所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一 或多种DNA元件选自(a) —或多种延伸的无甲基化GpG岛；(b) —或多种基质附着区；(c) 一或多种稳定化区和抗阻遏区；以及(d)(a)-(c)的任意组合。一些实施方案中，一或多种 延伸的无甲基化GpG岛来自一或多个遍在表达的基因的启动子区。一些实施方案中，本发 明的宿主细胞包含与SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO :2的核苷酸序列可操作连接的重组蛋 白编码核苷酸序列，以及也与SEQ ID NO :1和/或SEQ ID NO 2的核苷酸序列可操作连接 的编码抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列，或其同系物或片段。一些实施方案中，所述宿主细胞包含编码选自下组的抗凋亡蛋白的核苷酸序 歹Ij :bcl-2 ；bcl-xL ；bcl-6 ； ^ M ；xiap ；hiap 1 ；hiap2 ；aven ；E1B-19K ；P21 ；myrPHK ； HSV-I y 1 34. 5 ；和beclin，或其功能同系物或片段。一些实施方案中，本发明的细胞系包含多种本发明所述的宿主细胞。示例性宿主细胞包括哺乳动物宿主细胞，例如，BHK21细胞，CHO细胞，CHO-Kl细胞，CHO-DUXX细胞，NSO 细胞或Sp2/0细胞。一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)。一些实施方案中，宿主细胞还包含一或多个选自下组的核苷酸序列(a)能增强重组蛋白翻译的核苷酸序列；(b)能增加重组蛋白分泌到细胞外的核苷酸序列；和(c)能增 加编码重组蛋白的mRNA的稳定性的核苷酸序列。本发明还包括收获利用本发明的方法制备的重组蛋白。一些实施方案中，提供 了收获重组蛋白的方法，所述方法不利用蛋白A。一些实施方案中，所述方法利用选自 下组的一或多个步骤从上清沉淀重组蛋白；结晶；高效切向流过滤(high performance tangential flow filtration) (HPTFF),流式色谱(flow through chromatography)；以及 吸附色谱(adsorptionchromatography)。一些实施方案中，收获本发明的重组蛋白的方法 利用吸附色谱步骤，其为离子交换步骤。一些实施方案中，收获重组蛋白的方法不包括将蛋 白与严格洗脱缓冲液接触。其他实施方案中，收获重组蛋白的方法包括至少一个离心步骤。一些实施方案中，在抗凋亡蛋白或其功能片段存在下由本发明的宿主细胞制备的 重组蛋白与细胞上清中的一或多种污染物的摩尔比与表达单独的重组蛋白的细胞相比增 加统计学显著的量。所述抗凋亡蛋白或其功能片段可通过稳定转染编码抗凋亡蛋白或其功 能片段的核苷酸序列进入也表达重组蛋白的宿主细胞来表达，或者所述宿主细胞可与分离 的抗凋亡蛋白或其功能片段接触。
发明详述本发明至少部分基于下述发现重组蛋白利用细胞培养方法产生时，存在与一或 多种污染物诸如宿主细胞碎片的混合物中。因此，本发明提供了通过降低一或多种污染物 的水平来富集重组蛋白的方法。各种实施方案中，本发明提供了改造转染的细胞系例如稳定转染的细胞系的改进 的方法，从而产生最佳量的所需产物，例如重组蛋白，同时降低开发、筛选和纯化所述产物 的成本和耗时。这些改进可至少部分通过降低在收获细胞培养物分离所需产物过程中存在 的一或多种污染物的水平来实现。
I.定义为了使本发明更容易理解，首先定义一些术语。其他定义在说明书中说明。术语“细胞”，“宿主细胞”包括动物细胞，并包括无脊椎动物，非哺乳动物脊椎动 物和哺乳动物细胞。示例性非_哺乳动物脊椎动物细胞包括例如禽细胞，爬行动物细胞 和两栖动物细胞。示例性无脊椎动物细胞包括但不限于昆虫细胞，诸如毛虫(Spodoptera frugiperda)细Ifi， 子(Aedes aegypti) MM, (Drosophila melanogaster) MM^ Schn eider 细胞，禾口 Bombyx mori 细胞。见，例如，Luckow et al. , Bio/Technology 6 47-55(1988)。所述细胞可分化，部分分化或未分化，例如干细胞，包括胚胎干细胞和造血肝 细胞。另外的源自器官或器官系统的组织样品可根据本发明使用。示例性哺乳动物细胞包括例如，源自人、非人灵长类、猫、犬、绵羊、山羊、牛、马、 猪、兔、啮齿类包括小鼠、仓鼠、大鼠和豚鼠的细胞，包括但不限于，BHK21细胞，CHO细胞， NSO细胞，Sp2/o细胞，以及其任何衍生物或子代。此外，杂交瘤细胞也可用于本发明的方法中。术语"杂交瘤"指将免疫学来源的 永生细胞系与抗体产生细胞融合产生的杂合细胞。该术语包括异源杂合骨髓瘤融合物的 子代，其是人细胞和小鼠骨髓瘤细胞系融合并随后与浆细胞融合的结果，通常称为trioma细胞系。此外，该术语包括任何永生杂交细胞系，其产生抗体，诸如quadromas。见，例如， Milstein etal. , Nature, 537 =3053(1983) 杂合细胞系可为任何物种，包括人，兔和小鼠。一些实施方案中，本发明方法中所用的细胞系是抗体产生细胞系。抗体产生细胞 系可利用本领域已知技术选择并培养。见例如，CurrentProtocols in Immunology,Coligan et al. , Eds., Green Publishing Associates andffiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York(1991)，包括附件在内包含在此作为参考。通常，任何适合在细胞培养物种表达重组蛋白的细胞可用于本发明的方法中。—些实施方案中，本发明的方法中使用的细胞可包括异源核酸分子，其编码所需 的重组蛋白，例如利用本发明的方法产生的所需的治疗性蛋白或抗体。具体实施方案中，本 发明的方法用于在降低水平的一或多种污染物存在下产生高效价所需重组蛋白，例如治疗 蛋白或抗体。术语“细胞培养物”指悬浮、转瓶、烧瓶等中生长的细胞。大规模方法，诸如生物 反应器，包括粘附在搅拌发酵器中的微型载体上生长的粘附细胞，也包含在术语“细胞培养 物”中。此外，不仅可培养接触依赖性细胞，也可用于本发明的悬浮培养技术中。示例性微 型载体包括例如，葡聚糖，胶原蛋白，塑料，明胶和纤维素以及Butler，Spier & Griffiths， Animal Cell Biotechnology 3 :283_303 (1988)中所述其他微型载体。多孔载体，诸如 Cytoline⑧或Cytopore ，以及基于葡聚糖的载体，诸如DEAE-葡聚糖(Cytodex 1 )， 季胺包被的葡聚糖(Cytodex 2 )或基于明胶的载体，诸如明胶包被的葡聚糖(Cytodex 3 )也可使用。大规模和小规模蛋白生产的细胞培养方法包含在本发明中。所述方法包 括但不限于流化床生物反应器，中空纤维生物反应器，转瓶培养，或搅拌式生物反应器系统 (stirredtank bioreactor system)也可使用，其中包含或不包含微型载体，并可选以分 批、补料分批或灌流方式操作。术语“细胞培养基”和“培养基”指用于生长动物细胞的营养溶液，例如，哺乳动物 细胞。所述营养溶液通常包括细胞附着、生长和细胞环境维持必需的各种因子。例如，常 见的营养溶液可包括基本培养基配方，根据细胞类型的各种补充物，以及有时包括抗生素。 一些实施方案中，营养溶液也包括至少一种来自以下一或多个种类的至少一种组分1)能 量源，通常是碳水化合物诸如葡萄糖的形式；2)所有必需氨基酸，通常是20个碱性氨基酸 加上半胱氨酸；3)需要的低浓度维生素和/或其他有机化合物；4)游离脂肪酸；和5)微 量元素，其中微量元素是无机化合物或天然存在元素，通常需要极低浓度，通常是微摩尔范 围。所述营养溶液可选补充一或多种选自下组的任何组分1)激素和其他生长因子例如胰 岛素，转铁蛋白和表皮生长因子；2)盐和缓冲液，例如韩，镁和磷酸盐；3)核苷酸和碱基诸 如腺苷和胸苷，次黄嘌呤；和4)蛋白和组织水解物。通常，可使用任何适宜的细胞培养基。 培养基可包含血清，例如胎牛血清，小牛血清等。可选，所述培养基可不含血清，不含动物 (animal free)，或不含蛋白质。术语“可操作连接”和“可操作连接于”可互换使用，指两个或多个核苷酸序列或 序列元件的位置使得它们可以意图的方式起作用。一些实施方案中，本发明的核酸分子包 括能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件，其可操作连接于编码 重组蛋白的核苷酸序列。其他实施方案中，核酸分子包括可操作连接于编码凋亡蛋白或其 功能片段的核苷酸序列的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件。其他实施方案中，核酸分子还可包括一或多个选自下组的核苷酸序列(a)能增强翻译 的核苷酸序列；(b)能增加重组蛋白分泌到细胞外的核苷酸序列；和(c)能增加mRNA稳定 性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列可操作连接于编码重组蛋白的核苷酸序列。通常但 不是必需的，可操作连接的核苷酸序列是相邻的，必要时在读框内。然而，尽管可操作连接 的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件通常位于编码重组蛋白的核苷酸 序列或编码凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列的上游，其不必与之相邻。各种核苷酸序 列的可操作连接可通过本领域已知的重组法获得，例如利用PCR法，在适宜的限制位点连 接或利用退火。如果适宜的限制位点不存在，合成寡核苷酸连接子或接头可根据常规实践 使用。 术语“表达”指核苷酸序列在宿主细胞中的转录和/或翻译。所需产物在宿主细 胞中的表达水平可基于存在细胞内的相应mRNA的量或所选序列编码的所需多肽的量来测 定。例如，从所选序列转录的mRNA可通过Northern印迹杂交，核糖核酸酶RNA保护，原位 细胞RNA杂交或PCR定量。所选序列编码的蛋白可通过多种方法定量，包括但不限于例如， ELISA，Western印迹，放射免疫测定，免疫沉淀，测定蛋白生物活性或蛋白免疫染色然后进 行FACS分析。本发明的方法制备的“重组蛋白”或“重组多肽”指这样的肽或蛋白，通常比利用 本发明的方法在细胞培养中产生的对应物多大约10个氨基酸。本发明的方法产生的多肽 通常对于产生所述多肽的细胞而言是外源的，即异源或外来的。利用本发明方法，培养的细 胞产生的示例性多肽包括治疗多肽以及抗体及其抗原结合片段。本发明还包括融合蛋白。术语“免疫球蛋白”或“抗体”(在文中可互换)指具有基本四-多肽链结构的蛋 白，所述结构由两个重链和两个轻链组成，所述链被稳定，例如通过链间二硫键稳定，其能 特异性结合抗原。术语“单链免疫球蛋白”或“单链抗体”(可互换使用)指具有重链和轻链 组成的二 _多肽链结构的蛋白，其中所述链通过能特异性结合抗原的链间二硫键稳定。术 语“结构域”指重链或轻链多肽的球状区，包含通过例如β "折叠和/或链间二硫键稳定的 肽环(例如包含3-4个肽环)。结构域还分为“恒定”或“可变”结构域，在“恒定”结构域 的情况中，各个成员的结构域中的序列变化相对缺乏，在“可变”结构域的情况中，各个成员 的结构域中的变化明显。抗体或多肽“结构域”与抗体或多肽“区”通常可互换使用。抗体 轻链“恒定”结构域也称为“轻链恒定区”，“轻链恒定结构域”，“CL”区或“CL”结构域。抗 体重链“恒定”结构域可与“重链恒定区”，“重链恒定结构域”，“CH”区或“CH”结构域互换 使用。抗体轻链“可变“结构域可与“轻链可变区”，“轻链可变结构域”，“VL”区或“VL”结 构域互换使用。抗体重链“可变“结构域可与“重链可变区”，“重链可变结构域”，“VL”区或 “VL”结构域互换使用。免疫球蛋白或抗体可为单克隆或多克隆的，并可以单体或多聚体的 形式存在，例如IgM抗体，其以五聚体的形式存在，和/或IgA抗体，其以单体、二聚体或多 聚体的形式存在。术语“片段”指抗体或抗体链的一部分，其中包含的氨基酸残基少于完整 抗体或抗体链。片段可通过化学或酶处理完整抗体或抗体链来获得。片段也可通过重组方 法获得。示例性片段包括Fab，Fab'，F(ab' ) 2，Fabc和/或Fv片段。 术语“抗原结合片段”指免疫球蛋白或抗体的多肽部分，其结合抗原或与完整抗体 竞争(即与其来源的完整抗体竞争)抗原结合(即特异性结合)。结合片段可通过重组DNA 技术制备，或通过酶切或化学裂解完整免疫球蛋白。结合片段包括Fab，Fab’，F(ab' )2，Fabc，Fv，单链和单链抗体。术语“多核苷酸”和“核酸分子”可互换使用，指任何长度的核苷酸形成的多聚体形式，而无论是核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。这些术语包括单_，双-或三-链DNA，基因组 DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA杂合子，或包含嘌呤和嘧啶碱基的多聚体，或其他天然、化学、生物 化学修饰的非天然或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸的主链可包含糖和磷酸基团(如通常在 RNA或DNA中见到的)，或修饰的或取代的糖或磷酸基团。此外，双链多核苷酸可得自化学合 成的单链多核苷酸产物，可通过合成互补链并在适宜条件下退火所述的链，或通过利用DNA 聚合物和适宜的引物从头合成互补链。核酸分子可为多种不同形式，例如基因或基因片段， 一或多种外显子，一或多种内含子，mRNA, tRNA, rRNA，核酶，cDNA，重组多核苷酸，分支的多 核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离DNA，任何序列的分离RNA，核酸探针和引物。多核苷酸 可包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，尿嘧啶，其他糖和连接基团诸如 荧光核糖和硫代物(thioate)，以及核苷酸分支。本发明"DNA"或"核苷酸序列"不仅包 括碱基A，T，C，和G，也包括其任何类似物或修饰的形式，诸如甲基化核苷酸，核苷酸间修饰 诸如不带电的连接和硫代物，糖类似物的利用，以及修饰的和/或可选主链结构，诸如聚酰 胺。具体实施方案中，核酸分子包含编码重组蛋白诸如治疗蛋白或抗体的核苷酸序列。另 一实施方案中，核酸分子包含编码抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列。本发明术语"抗凋亡蛋白，“指任何蛋白或其功能片段，其由抗凋亡基因编码和/ 或能降低、防止或逆转与凋亡相关的一或多种细胞反应。凋亡已知为外来或内在信号导致 的活性细胞自杀程序的活化，所述信号诸如血清剥夺(serum deprivation)，营养限制，氧 限制以及机械应激。凋亡的特征在于胞质膜起泡，细胞体积丧失，核皱缩，和DNA在核苷酸 核小体区间(nucleosomal interval)的核苷酸内切降解。因此，一些实施方案中，抗凋亡蛋 白或其功能片段可减少、防止或逆转细胞中胞质膜起泡，细胞体积丧失，核皱缩，和DNA在 核苷酸核小体区间的核苷酸内切降解中的一或多种。一些实施方案中，抗凋亡蛋白或其功 能片段促进其在表达的细胞中的存活。一些实施方案中，抗凋亡蛋白或其功能片段在宿主 细胞中通过导入包含编码抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列的核酸分子来表达，所述 核苷酸序列可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件。示例性 核苷酸序列包括但不限于，编码以下蛋白的核苷酸序列bcl-2 (Genbank登记号M14745)； bcl-xL ；bcl-6 ； (Genbank 登记号 UOOl 151)；存活素；xiap (Genbank 登记号 NM_001167)； hiapl ；hiap2 ；aven (Genbank 登记号 NM_020371，SEQ ID NOs :5 禾口 6) ；E1B_19K(SEQ IDNO 7) ；P21 ；myrPHK ；HSV-I γ 1 34. 5 ；禾口 beclin (Genbank 登记号 NM_003766)，或其功能同系物 或片段。一些实施方案中，宿主细胞与分离的抗凋亡蛋白或其功能同系物或片段接触。抗 凋亡蛋白、其同系物或片段的功能性抗凋亡活性可利用本领域已知以及本发明所述的一或 多种测定法轻易测定。示例性测定法包括TUNEL测定法，Annexin V测定法，caspase测定 法，吖啶橙/溴乙啶染色或碘化丙啶/吖啶橙染色，其中利用荧光显微检或流式细胞分析进 行(见，例如，Current Protocols in Cytometry, John Wiley &Sons，Inc.)。术语"能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件"指任何能使 得染色质更接近转录因子并易化可操作连接基因的重复表达的DNA序列或元件，其中 所述DNA序列或元件不来自基因座控制区。开放染色质或开放状态的染色质指去浓缩 (de-condensed)状态的染色质并且也指常染色质。浓缩的染色质称为异染色质。闭合(浓缩)状态的染色质是转录沉默的。然而，开放(去浓缩)转录染色质是可转录的。开放染色质结构的建立的特征是DNase I敏感性，DNA低甲基化和组蛋白高乙酰化。鉴定开 放染色质的标准方法是本领域已知的，并且描述于Wu，1989，Meth. EnzymoL, 170，269-289 ； Crane-Robinson et al,1997,Methods,12,48-56 ；Rein et al，1998，N. A. R，26，2255-2264。“基因座控制区"(LCR)指从真核宿主细胞的组织特异性基因座获得的遗传元 件，当与目的基因连接并整合入宿主细胞染色体时，赋予目的基因组织特异性、独立于整合 位点、依赖于拷贝数目的表达。重复表达指这样的DNA元件，当与目的基因可操作连接时，在一段延长的时间内 产生该可操作连接基因的基本相同水平的表达，而与染色质环境和细胞类型无关。一些实 施方案中，基本相同水平的表达是指基于每个基因拷贝，与平均值的标准差少于48%，或少 于40%，或少于25%的表达水平。可选，基本相同水平的表达指基于每个基因拷贝，表达水 平相差少于10倍，少于5倍，或少于3倍。一些实施方案中，能开放染色质和/或保持染色 质在开放状态的DNA元件使得可操作连接基因的表达相对于没有所述可操作连接DNA元件 的表达而言增加至少2倍，或至少3倍，或至少4倍，或至少5倍，或至少10倍，或至少20 倍，或至少30倍，或至少40倍，或至少50倍，或至少60倍，或至少70倍，或至少80倍，或 至少90倍，或至少95倍，或至少100倍，或至少150倍，或至少200倍，或更高。一些实施 方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件在延长的时间中获得可操 作连接基因的重复表达。例如，一些实施方案中，相对于不与开放染色质和/或保持染色 质在开放状态的DNA元件可操作连接的基因而言，所述可操作连接的基因在至少5天，10 天，或至少15天，或至少20天，或至少30天，或至少40天，或至少45天，或至少60天，或 至少70天，或至少80天，至少90天或更长时间中以基本相同的水平表达。其他实施方案 中，可操作连接的基因相对于该基因并非可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在 开放状态的DNA元件时的表达水平而言在延长的时间内高水平表达。示例性能开放染色质 和/或保持染色质在开放状态的DNA元件包括但不限于，源自遍在表达基因(UCOEs)的启 动子区的延伸的无甲基化GpG岛、基质和/或支架附着区(MARs)以及稳定化区和抗阻遏区 (STARs)。本领域技术人员可容易地利用本领域已知的技术以及本发明所述的技术来鉴定 所述DNA元件。—些实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件是天然 存在的DNA元件。天然存在的DNA元件是指所述DNA元件天然存在，例如，其分离自遍在表 达基因的启动子区，并且其序列与天然存在序列相比没有改变。其他实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件是人工 合成的DNA元件。人工合成是指所述DNA元件并非天然存在，例如，分离自遍在表达基因的 启动子区的DNA元件，其与分离自另一种遍在表达基因的启动子区的第二 DNA元件组合，由 此产生人工构建体，其中这两种元件通常不天然地一起出现。可选，DNA元件的序列可利用 本领域已知的多种技术从其天然存在序列修饰，产生通常不天然存在的DNA元件。另一实施方案中，能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件是天然 存在的和人工合成的DNA元件的组合。术语“无甲基化CpG岛‘‘指与大量DNA中的40 %的平均值相比，平均GC含量大 约60%的CpG岛。本领域技术人员可利用标准技术诸如C和G序列特异性限制酶容易地鉴定CpG-岛，这是本领域已知的。示例性鉴定CpG岛的方法见于，例如，Gardiner-Garden et al.，J. MoI. Biol. 1987，196 :261_82，包含在此作为参考，本领域技术人员已知用于分析并 鉴定 CpG 岛的计算机程序诸如CpGplot (例如，http://www. ebi. ac. uk/emboss/cpgplot/) 禾口 Grailexp(http//compbio. ornl. rov/Rrailexp)。术语〃延伸的无甲基化GpG岛，“指这样的无甲基化CpG岛，其长度为至少 300bp,或至少500bp，或至少lOOObp，或至少1500bp，或至少2000bp，或至少2500bp，或至 少3000bp并源自遍在表达基因的启动子区。所述的岛是本领域已知的并且描述于美国专 利 6，964，951 ；6，689，606 ；6，881，556 ；和 6，949，361 和 PCT 申请公开 WO 2004/067701，包
含在此作为参考。一些实施方案中，延伸的无甲基化GpG岛包括一或多个转录因子结合位点。其他 实施方案中，延伸的无甲基化GpG岛包括启动子和/或增强子序列。其他实施方案中，延伸 的无甲基化GpG岛包括双启动子或双向启动子。尽管延伸的无甲基化GpG岛可包括启动子， 如本发明所用的那些，所述的岛通常与一或多种通常不与所述岛结合的异源启动子例如人 或豚鼠CMV启动子一起使用。一些实施方案中，异源启动子取代CpG岛中发现的内源启动 子。延伸的无甲基化GpG岛可被限定，例如，通过鉴定所述到的边界。例如，延伸的无 甲基化GpG岛的边界可通过利用PCR以及限制内切核酸酶的组合限定，所述酶在DNA识别 序列进行消化(切割)的能力对于存在的任何CpG残基的甲基化状态敏感。一种所述的酶 是Hpall，其识别并消化位点CCGG，该位点通常见于CpG岛中，但仅仅在中央CG残基没有被 甲基化的情况下。因此，利用Hpall-消化的DNA在携带Hpall位点的区域进行的PCR不产 生扩增产物，这是由于如果DNA没有被甲基化会发生Hpall消化。PCR仅仅在DNA是甲基 化的情况下才产生扩增产物。因此，除了无甲基化区，Hpall不会消化DNA，从而观察到PCR 扩增产物，确定"延伸的无甲基化GpG岛.“的边界。示例性延伸的无甲基化GpG岛包括但不限于源自以下基因启动组区域的那些人 RNPA2 基因(SEQ ID NOs :2，3 和 4)，RPS3 基因(登记号 NM012052 ；SEQ ID N0:1)，RPL4 基因 (登记号 NT_039474)，RPL5 基因(NT_039308)，RPLIOa 基因(登记号 NT_039649)，RPL 13a 基 因(登记号 NT_039420)，RPL19 基因(登记号 NT_039521)，RPL24 基因(登记号 NT_096987)， RPL27a基因(登记号NT_039433)，Terf2ip基因(登记号AB041557)，人3-磷酸甘油醛脱 氢酶基因(登记号M32599)，微管蛋白alpha-Ι链基因(登记号M13445)，和RPSll基因(登 记号AK011207)。遍在表达基因或看家基因的其他实例可见于例如，Trends in Genetics 19，362-365 (2003)，包含在此作为参考。术语"基质附着蛋白，"或"支架附着蛋白，"或"支架/基质附着蛋白，“ 或“MAR"或"S/MAR，“可互换使用，指能体外高亲和力结合分离的细胞核支架或细 胞核基质的 DNA 元件。(见例如，Hart and Laemmli (1988) Curr. Opin. Genet. Dev.，8 519-525)。据报道MAR DNA元件可增加细胞培养物中异源基因的表达。(见，例如，Kalos and Fournier (1995)MoI. Cell Biol. 15 198-207 ；Phi-Van et al. (1990)MoI. Cell Biol. 10 2302-2307 ；Klehr et al. (1991)Biochemistry 30 :1264_1270 ；和 Poljak et al(1994) Nuc. Acid Res. 22 :4386-4394)。示例性 MAR DNA 元件可见于，例如，美国专利 7，129，062， 包含在此作为参考。具体实施方案中，本发明中所用MAR元件是鸡溶菌酶MAR元件，如美国专利7，129，062所述，以及其功能片段。本领域技术人员可基于已知测定法以及本发明所 述的方法轻易鉴定MAR元件，例如，Mesner et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. , 3281-3286 和 Weber et al.，MoI CellBiol. (2003)December ；23 (24) :8953_8959。另一实施方案中， 本发明方法中所用的MAR DNA元件是人[beta]-球蛋白MAR元件。用于本发明方法中的示 例性MAR DNA元件如SEQ ID NOs 11-14所述。术语〃稳定化区和抗阻遏区〃或〃 STAR"指这样的DNA元件，其能阻断异染色质 介导的转基因表达。STAR DNA元件可利用已知的测定DNA元件的基因转录调节性质的技 术轻易鉴定，例如，W003/004704, W02004/056986和EP01202581. 3中所述，包含在此作为 参考。可用于本发明方法的STAR序列的非限制性实例包括美国专利公开20060141577中 SEQ. ID. NOs. 1-66 所示的序列。
术语"能增强翻译的核苷酸序列"指能增加多肽从mRNA合成的核苷酸序列。多 肽合成的增加可以是产生多肽总量的增加或多肽合成率的增加。一个实施方案中，能增强 翻译的核苷酸序列可操作连接于编码重组蛋白的核苷酸序列。能增强翻译的核苷酸序列的 能力可通过测定所述能增强翻译的核苷酸序列存在下产生的重组蛋白量的增加或重组蛋 白合成率随时间的增加来测定。术语"能增加分泌的核苷酸序列"指这样的核苷酸序列，当可操作连接于编码蛋 白的核苷酸序列时，能促进蛋白分泌到细胞外。通常，所述的核苷酸序列包含适宜的天然或 异源信号肽(前导序列)。信号肽或前导的选择有赖于其中产生重组蛋白的宿主细胞的类 型，并且可用异源信号序列取代天然信号序列。可用于本发明方法的示例性序列包括例如 源自Gaussia princeps的萤光素酶基因的信号肽(Genbank登记号AY015993)。能增加分泌 的核苷酸序列也称为信号肽序列，可利用本领域已知的软件程序鉴定，诸如，例如，SignalP Server (http//www, cbs. dtu. dk/services/SiRnalP)。术语"能增加mRNA稳定性的核苷酸序列"指这样的核苷酸序列，其与编码重组 蛋白的核苷酸序列可操作连接时增加翻译为重组蛋白的mRNA的半寿期。通常，所述核苷酸 序列源自基因的3'或5'非翻译区(或UTRs)。
II.细胞举例
不受任何理论限制，认为能产生重组蛋白的任何细胞系可用于本发明的方法中。 具体实施方案中，本发明方法中所用的细胞用包含编码重组多肽例如治疗蛋白或抗体的 核苷酸序列的核酸分子转染。具体实施方案中，本发明方法中的细胞是真核细胞，例如，哺 乳动物细胞。哺乳动物细胞的实例包括但不限于，例如，SV40转染的猴肾CVl系(C0S-7， ATCCCRL 1651)；人胚胎肾细胞系(亚克隆用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞， Graham et al.，J. Gen Virol. ,36 59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK, ATCCCCL 10)；中国仓 鼠卵巢细胞/-DHFR (CHO，Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 4216 (1980))； 小鼠 Sertoli 细胞(TM4，Mather，Biol. R印rod. ,23 :243_251 (1980))；猴肾细胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VER0-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HeLa, ATCC CCL 2)； 犬肾细胞(MDCK, ATCC CCL 34) ；buffalo 大鼠肝细胞(BRL 3A, ATCC CRL1442)；人肺细 胞(W138, ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51) ；TRI 细胞(Mather et al.，Annals N. Y. Acad. ScL, 383 44-68 (1982)) ；MRC 5 细胞；FS4细胞；NSO小鼠myeloma细胞(ECACC ;SIGMA)，和人肝细胞瘤系Ofep G2)。其他示 例性有用细胞系包括但不限于，HT1080细胞(ATCC CCL 121)，MCF-7乳腺癌细胞(ATCCBTH 22)，K-562 白血病细胞(ATCC CCL 243)，KB 癌细胞(ATCC CCL 17)，2780AD 卵巢癌细胞(见 Van der Blick,A. Μ. et al. ,Cancer Res. 48 :5927_5932(1988)，Raji 细胞(ATCC CCL 86)， Jurkat 细胞(ATCC TIB 152)，Namalwa细胞(ATCC CRL 1432)，HL-60 细胞(ATCC CCL 240)， Daudi 细胞(ATCCCCL 213)，RPMI 8226 细胞(ATCC CCL 155)，U-937 细胞(ATCC CRL 1593)， Bowes 黑素瘤细胞(ATCC CRL 9607) ,WI-38VA13 亚系 2R4 细胞(ATCCCLL 75. 1)，禾口 M0LT-4 细胞(ATCC CRL 1582)，以及通过将人细胞与其他物种的细胞融合产生的异源杂交瘤细胞。 这些以及其他细胞和细胞系可商购，例如得自美国典型培养物保藏中心(Virginia，USA)。 许多其他细胞系是本领域已知的，并且是本领域技术人员熟悉的；所述细胞系因此同样可 用于本发明的方法。具体实施方案中，本发明方法所用细胞是CHO细胞或NSO细胞。杂交瘤和抗体产生细胞也可用于本发明的方法中。
III.示例性核苷酸序列和载体—些实施方案中，包含编码目的重组蛋白的核苷酸序列的第一核酸与包含编码抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列的第二核酸分子被导入宿主细胞。例如，包含编码所 需目的重组蛋白的核苷酸序列的第一核酸分子被克隆入适当表达载体，其中包含可操作连 接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件的编码重组蛋白的核苷酸序 列。此外，包含编码抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列的第二核酸分子被克隆入与重 组蛋白相同的表达载体或不同的表达载体，其中编码抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序 列也可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件。任何适宜载体可根据本发明使用。核苷酸序列可利用例如以下载体稳定整合入 宿主细胞基因组逆转录病毒载体(Miller，1992，Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158 1 ； Miller et al, 1993, Meth. Enzymol. 217 581)或腺伴随病毒(AAV)载体(Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol. , 158 97 ；Flotte and Carter, 1995, Gene Ther. 2 357)。可 选，编码蛋白的核苷酸序列可掺入包含病毒复制起点的自我复制游离体载体，所述复制起 点可来自例如 EBV (Yates et al.，1985，Nature 313 :812)，人乳多空病毒 BK (DeBenedetti and Rhoads,1991, Nucl. Acids Res. , 19 1925 ；Cooper and Miron,1993, Hum. Gene Ther. 4 557 ；禾口 BPV-I (Piirsoo et al, 1996，EMBO J. 15 :1)。用于遗传改造细胞和/或细胞系以表达目的蛋白的载体和方法是本领域已知的； 例如以下文献中所列的各种技术 Current Protocols inMolecular Biology, Ausubel et al. , eds. (Wiley & Sons, New York,1988, andquarterly updates) ；Sambrook et al., Molecular Cloning :A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press,1989)禾口 Kaufman, R. J. , Large ScaleMammalian Cell Culture(1990, pp.15-69)。其他调节序列也可包含在本发明的表达载体中。其可来自哺乳动物，微生物，病毒 和/或昆虫基因。调节序列的实例包括转录启动子，操作子，和增强子，核糖体结合位点(见 例如Kozak (1991)，J. Biol. Chem. 266 19867-70)，可控制转录和翻译终止的序列以及多腺 苷酸信号。(见例如 McLauchlan et al. (1988)，Nucleic Acids Res. 16 :5323_33)。一些 实施方案中，本发明方法所用表达载体包括人或豚鼠CMV启动子。
一些常用启动子和增强子序列源自病毒基因组，例如多瘤病毒，腺病毒2，猴病毒 40(SV40)，和人巨细胞病毒。例如，立即早期基因1的人CMV启动子/增强子可使用(见， 例如，Patterson et al. (1994)，AppliedMicrobiol. Biotechnol. 40 :691_98)。来自 SV40 病毒基因组的DNA序列，例如，SV40起点，早期和晚期启动子，增强子，拼接，和多腺苷酸化 位点可用于提供其他基因元件用于在真核宿主细胞中表达多肽。病毒早期和晚期启动子尤 其有用，因为它们都容易作为片段得自病毒基因组，其中也可选包含病毒复制起点(Fiers et al. (1978) ,Nature 273 113 ；Kaufman(1990) ,Meth. inEnzymol. 185 :487_511)。较小或 较大的SV40片段也可使用。一些实施方案中，编码重组蛋白的核苷酸序列可操作连接于选自下组的一或多个 核苷酸序列(a)能增强翻译的核苷酸序列；(b)能增加分泌的核苷酸序列；和(c)能增加 mRNA稳定性的核苷酸序列。
其他显示增加异源基因从哺乳动物表达载体的表达的控制序列包括这样的元件， 例如来自CHO细胞的表达增强序列元件(EASE) (Morriset al. ,Animal Cell Technology, pp. 529-534(1997) ；U. S. Pat. No. 6，312，951 B I ；U. S. Pat. No. 6，027，915 ；U. S. Pat. No. 6, 309, 841 B 1)和来自腺病毒2的三分前导(tripartite leader) (TPL)以及VA基因 RNA(Gingeras et al. (1982)，J. Biol. Chem. 257 :13475_13491)以及允许 mRNA 的翻译的内 部核糖体进入位点(IRES)序列。编码可选标记的基因通常用于易化重组细胞的鉴定。转化体的选择可利用例如 二氢叶酸还原酶(DHTR)选择方案或对细胞毒药物的抗性来进行(见，例如，Kaufman et al. (1990)，Meth. in Enzymology 185:487-511)。DHFR 选择的适宜细胞系可为，例如，CHO 系 DX-B 11，其缺乏 DHFR(见，例如，Urlaub and Chasin(1980)，Proc. Natl Acad. Sci. USA 77 =4216-4220) 0其他可选标记的例子包括赋予抗生素抗性的那些，诸如G418和潮霉素B。本发明的一些实施方案中，编码可选标记的基因由于利用能开放染色质和/或保 持染色质在开放状态的DNA元件而不是必需的，这是因为可使用细胞集合而不必选择表达 重组蛋白的特定克隆。一些实施方案中，用于通过本发明的方法制备蛋白的外源核酸分离自cDNA文库 或基因组文库。例如，为了分离编码目的蛋白的核酸，可利用设计为鉴定编码所述蛋白的基 因或cDNA克隆的探针来筛选cDNA文库。对于cDNA表达文库，适宜探针包括单克隆或多克 隆抗体，其识别并特异性结合目的蛋白；长度大约20-80的寡核苷酸，其编码相同或不同物 种来源蛋白的已知或可疑部分；和/或相同或相似基因的互补或同源cDNA或其片段。筛 选基因组DNA文库的适宜探针包括但不限于，寡核苷酸，cDNA,或其片段，其编码相同或相 似的基因，和/或同源基因组DNA或其片段。利用所选探针筛选cDNA或基因组文库可利 用 Sambrook et al. , Molecular Cloning :A Laboratory Manual(New York :Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)的10-12章所述的标准方法进行。本发明的各种实施方案中，本发明所述具体序列以及其同系物和片段均可用于本 发明的方法中，只要它们具有所需的活性。例如，一些实施方案中，与本发明包含的具体序 列至少70 %相同，或至少80 %相同，或至少90 %相同，或至少95 %相同或更高的序列可用 于本发明的方法中。IV.示例性抗凋亡基因和蛋白 细胞死亡通常有方式。容易识别的方式是坏死，一种通常由严重和突然的损伤造 成的细胞死亡过程。坏死中，细胞稳态中的改变随细胞膜完整性的丧失而出现。渗透压失 调导致细胞肿胀最终破裂。细胞成分进入周围环境间隙，通常随后出现炎性反应。这与第 二种形式的细胞死亡即凋亡不同。凋亡或细胞〃自杀〃途径或“程序性细胞死亡”通常快速出现，并且是细胞活跃 参加自我死亡的过程。凋亡主要通过形态学标准定义。这些基因中的一些抑制细胞中的 caspase依赖性凋亡途径。凋亡的特征包括细胞皱缩，染色质皱缩，以及DNA片段化成寡核 小体梯状单位(oligonucleosomal ladder size units)。最后，死亡细胞的片段形成封闭 小泡，称为凋亡小体，其快速被邻近细胞去除(Wylie, et al.，1980，Int. Rev. Cytol. ,68 251)。已经鉴定了真核细胞中的多个抑制凋亡效应开始或减弱凋亡效应的基因。这些 基因中的一些抑制细胞中的caspase依赖性凋亡途径。大规模生物反应器中生长到高密 度的细胞显示对凋亡的易感性增加部分是由无血清生长条件造成的(Zanghi et al. 1999， Biotechnol. Bioeng. 64 108)。其他可能导致凋亡的条件包括生长因子撤回，电离辐射，和 氧化应激。利用凋亡基因转染细胞已经描述(Al-Rubeai et al. 1998，Current Opinion Biotech9(2) :152)。利用抗凋亡基因转染细胞可用于延长转染细胞的寿命以及生产力，所 述的转染细胞生长在严苛的(demanding)生物条件下，由此产生更为健康强壮的细胞。因此本发明的一些实施方案提供了经改造的细胞，其表达的抗凋亡基因的水平 足以减少细胞培养中凋亡的发生或影响，例如包括从T25培养瓶或更小到大规模生物反 应器到更大的容器。所述细胞可用一或多个拷贝的抗凋亡基因或其功能片段转染。抗凋 亡基因的功能片段可包含少于克隆基因的全长序列，但仍保持降低培养细胞中凋亡的发 生或影响的能力。利用多拷贝抗凋亡基因的情况下，所述基因可为相同的基因或者包含2 个或多个不同基因的混合物。适合用于本发明的抗凋亡基因的实例包括bcl家族成员诸 如 bcl-2 (Genbank 登记号 M14745) ；bcl-xL ；bcl-6 ；aven(SEQID NOs 5 和 6)，mcl-1 存 活素(U. S. Patent No. 6, 077, 709) ；xiap (Genbank 登记号 NM_001167) ；hiapl，hiap2 (U. S. Patent No. 5，919，912) ；E1B—19K (SEQID NO 7)禾口 P21 ；myrPHK ；HSV-I γ 1 34. 5 (U. S. Patent No. 6，172，047)；以及 beclin(U. S. Patent No. 6，432，914) ；p35 ；ced9 ；Crm A ； BHFR(Al-Rubeai et al. 1998, Current Opinion Biotech 9(2) :152)。一些实施方案中，细胞用包含编码抗凋亡基因或其功能片段的核苷酸序列的核苷 酸分子转染，所述核苷酸序列可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的 DNA元件。一些实施方案中，相对于其中的基因不与开放染色质和/或保持染色质在开放状 态的DNA元件可操作连接的细胞而言，利用能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的 DNA元件导致在延长的时间内表达可操作连接的抗凋亡基因的细胞的百分比增加(例如， 至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少95%，或更高)，由 此无需选择步骤，和/或扩增步骤。一些实施方案中，本发明的方法使得无需基因扩增步骤。 一些实施方案中，表达所需重组蛋白的细胞与抗凋亡蛋白或其功能片段的连接导致相对于仅仅表达抗凋亡蛋白的细胞而言一或多种污染物的水平降低，由此增加产生的重 组蛋白的总体质量以及数量，并减少与收获重组蛋白相关的时间以及资源。
V.示例性重组蛋白 本发明的方法可用于制备任何所需重组蛋白或其片段。一些实施方案中，利用本发明的方法制备的重组的那白是治疗蛋白。其他实施方案中，所述重组蛋白是抗体或其功 能片段。可利用本发明的方法制备的抗体包括例如多克隆，单克隆，单特异性，多特异性，完 全人的，人源化的，单链的，嵌合的，杂合的，突变体以及CDR移植的抗体，及其其抗体结合 片段，诸如例如，Fab，F(ab' )2，Fv，和scFv。所述抗体可特异于任何包含适宜表位的所需 抗原。所需抗原可包括例如，见于哺乳细胞中或与哺乳细胞相关的标记物，与肿瘤相关的标 记物，或与疾病或病症相关的标记物。肿瘤标记的实例包括肿瘤抗原CA 125，肿瘤抗原gp72 LCG(其为与肺癌相关表达的基因产物)，肿瘤相关糖蛋白HER-2，以及肿瘤抗原MUC 1。其 他癌标记包括 hTERT (Ferber et al. 2003，Oncogene 22 3813), Ki-67 (Kruseet al. 2002， Am. J. Surg. Pathol.，26 :1501)，细胞周期蛋白 E(Yasmeen et al. 2003, Expert Rev. Mo I. Diagn. 3 (5) 617)禾口组蛋白 H3 (Rakowicz-Szulczynska, et al. 1996, Cancer Biother. Radiopharm. 11 77)。一些实施方案中，本发明的方法用于制备高效价抗体或其抗原结合片段。抗体可 特异于细胞表面蛋白诸如生长因子或激素受体。本发明的抗体包括但不限于抗-HER2抗体包括Trastuzumab (HERCEPTIN (Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USAl 89 =4285-4289 (1992) , U. S. Pat. No. 5，725，856)；抗-CD20 抗体诸如 U. S. Pat. No. 5，736，137 中的嵌合 抗-CD20 “ C2B8 “ (RITUXAN )，嵌合或2H7抗体的人源化变体，见于U. S. Pat. No. 5，721，108，Bi,或 Tositumomab (BEXXAR )；抗 _IL_8(St Johnet al.，Chest, 103 932 (1993)，以及国际公开WO 95/23865)；抗-VEGF抗体包括人源化和/或亲和成熟 的抗-VEGF 抗体诸如人源化抗-VEGF 抗体 huA4. 6. 1 AVASTIN (Kim et al.，Growth Factors，7 :53-64(1992)，国际公开 WO 96/30046，和 WO 98/45331，公开于 1998-10-15)； 抗-PSCA抗体(W001/40309)；抗-CD40抗体，包括S2C6及其人源化变体(W000/75348)； 抗-CDlIa(U. S. Pat. No. 5，622，700，WO 98/23761，Steppe et al.，TransplantIntl. 4 3-7(1991)，禾口 Hourmant et al. , Transplantation 58:377—380(1994))；抗一IgE (Presta et al.，J Immunol. 151 :2623_2632 (1993)，和国际公开 W095/19181)；抗-CD18 (U. S. Pat. No. 5，622，700，1997-4-22 公开，或 W097/26912,1997-7-31 公开)；抗-IgE (包括 E25, E26 和 E27 ；U. S. Pat. No. 5，714，338，公开于 1998-2-3 或 U. S. Pat. No. 5，091，313，公开于 1992-2-25，WO 93/04173，公开于 1993-3-4，或国际公开 PCT/US98/13410,1998-6-30 提 交，U. S. Pat. No. 5，714，338)；抗-Apo_2 受体抗体(W0 98/51793，公开于 1998-11-19)； 抗-TNF- α 抗体包括 cA2 (REMICADE )，CDP571 和 MAK-195 (见，U. S. Pat. No. 5，672，347， 公开于 S印· 30，1997，Lorenz et al J. Immunol. 156 (4) 1646—1653 (1996)，禾口 Dhainaut et al. Crit. Care Med. 23 (9) 1461-1469 (1995))；抗-组织因子(TF) (European Patent No. 0 420 937 Bl granted Nov. 9,1994)；抗-人 α 4α β 7 整联蛋白(W0 98/06248，公 开于Feb. 19，1998)；抗_EGFR(嵌合或人源化225抗体，WO 96/40210，公开于Dec. 19，1996)；抗-CD3 抗体诸如 0KT3 (U. S. Pat. No. 4，515，893 公开于 May 7，1985)；抗-CD25 或 抗-tac 抗体诸如 CHI-621 (SIMULECT )和(ΖΕΝΑΡΑΧ )(见 U. S. Pat. No. 5，693，762 公开于06(；.2，1997);抗-004抗体诸如0]\1-7412抗体(0107 et al. Arthritis Rheum 39(1) 52-56(1996))；抗-CD52 抗体诸如 CAMPATH-1 H(Riechmann et al. Nature 332 323-337 (1988))；抗-Fe 受体抗体诸如抗 Fc γ RI 的 Μ22 抗体，见 Graziano et al. J. Immunol. 155(10) 4996-5002 (1995)；抗-癌胚抗原(CEA)抗体诸如 hMN-14 (Sharkey et al. Cancer Res. 55 (23Suppl) :5935s_5945s (1995)；抗乳腺上皮细胞的抗体，包括 huBrE-3, hu-Mc 3 禾口 CHL6(Ceriani et al. Cancer Res. 55(23) :5852s_5856s(1995)； 和 Richman et al. Cancer Res. 55(23 Supp) :5916s_5920s (1995))；结合结肠癌细胞 的抗体诸如 C242 (Litton et al. Eur J. Immunol. 26 (1) 1-9 (1996))；抗-CD38 抗体， 例如 AT13/5 (Ellis et al. J Immunol. 155(2) :925_937 (1995))；抗-CD33 抗体诸如 HuM195(Jurcic et al. Cancer Res 55(23 Supp1) :5908s_5910s (1995)和 CMA-676 或 CDP771 ；抗-CD22 抗体诸如 LL2 或 LymphoCide (Juweid et al. Cancer Res 55(23 Supp 1) 5899s-5907s(1995))；抗-EpCAM 抗体诸如 17-1A(PANOREX )；抗-GpIIb/IIIa 抗体诸如 abciximab 或 c7E3 Fab(REOPRO )；抗-RSV 抗体诸如 MEDI-493 (SYNAGIS )；抗-CMV 抗体 诸如PROTOVIR ；抗-HIV抗体诸如PR0542 ；抗-肝炎抗体诸如抗-H印B抗体OSTAVIR ；抗-CA 125抗体OvaRex ；抗-独特型GD3表位抗体BEC2 ；抗-α ν β 3抗体VITAXI N .； 抗_人肾细胞癌抗体诸如ch-G250 ； ING-I ；抗-人17-1A抗 体(3622W94)；抗-人结肠直肠 肿瘤抗体(A33)；抗-人黑素瘤抗体R24，针对⑶3神经节苷脂；抗-人鳞状细胞癌(SF-25)； 和抗-人白细胞抗原(HLA)抗体诸如Smart IDlO和抗-HLA DR抗体Oncolym(Lym-I)。抗 体的优选靶抗原是HER2 受体，VEGF, IgE, CD20，CDllaJP CD40。重组蛋白可为细胞蛋白诸如受体(例如，膜结合或胞液型)或结构蛋白(例如细 胞骨架蛋白)。所述重组蛋白可为细胞分泌的细胞因子或一或多个信号转导途径中内部使 用的细胞因子。非限制性实例包括但不限于，CD2, CD3, CD4, CD8, CDlla,⑶14，⑶18，⑶20， CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7. 1)，CD86 (B7. 2)，CD147, IL-1.，IL-2， IL-3, IL-7, IL-4, IL-5，IL-8，IL-10，IL-2 受体，IL-4 受体，IL-6 受体，IL-13 受体，IL-18 受体亚基，PDGF, EGF受体，VEGF受体，干细胞生长因子，护骨素(osteoprotegerin)配体， 干扰素、，B淋巴细胞刺激物C5补体TAG-72，整联蛋白α 4β 7，整联蛋白VLA-4，Β2整联 蛋白，TRAIL受体1，2，3，和4，RANK, RANK配体，TNF，粘附分子VAP-1，表皮细胞粘附分子 (EpCAM)，细胞间粘附分子-3(ICAM-3)，白细胞整联蛋白粘附素(leukointegrin adhesin)， 血小板糖蛋白gp Ilb/IIIa，心脏肌球蛋白重链(cardiac myosin heavy chain)，甲状旁腺 激素，rNAPc2，和CTLA4 (细胞毒T淋巴细胞相关抗原)。重组蛋白也可源自感染因子，诸如病毒、细菌或真菌。例如所述蛋白可来自病毒包 衣或可为病毒酶或转录因子。所述蛋白可源自细菌膜或细胞壁，或可源自细菌的胞质。所 述蛋白可为酵母菌酶，转录因子或结构蛋白。酵母菌蛋白可为膜结合蛋白，胞质蛋白或分泌 蛋白。感染因子的例子包括但不限于，呼吸道合胞病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，乙型肝炎病 毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，葡萄球菌变体和金黄色葡萄球菌，以及白色念珠菌。本发明的方法也可用于制备重组融合蛋白，其中包含全部或部分任何上述的蛋 白。例如，包含上述蛋白之一和多聚体化结构域诸如亮氨酸拉链、螺旋结构、抗体Fc部分或基本相似的蛋白的重组融合蛋白可利用本领域已知方法制备。见例如国际公开WO 94/10308 ；Lovejoy et al. (1993)，Science 259 1288-1293 ；Harbury et al. (1993)， Science 262 1401-05 ；Harbury et al (1994)，Nature 371 80-83 ；Hang, kansson et a/· (1999)，Structure :255_64。 本发明还包括包含通过本发明的方法制备的一或多种重组蛋白的药物组合物。药 物组合物还包括可药用载体。术语"可药用载体"指一或多种相容的固体或液体填充物， 稀释剂或包囊化物质，其适合给予对象。
VI.将核苷酸序列和载体导入细胞的方法本发明的方法可用于在降低水平的一或多种污染物的存在下制备重组蛋白，具 体可在降低水平的一或多种污染物的存在下制备治疗蛋白和抗体。将核苷酸序列和载体 导入细胞的方法包括是本领域已知的，其中利用多种可商购的实际，诸如阳离子脂质剂 LIPOFECTAMINE , LIP0FECTAMINE -2000,或 LIPOFECTAMINE -PLUS(INVITR0GEN)，可用于 转染细胞(见，例如，Feigner et al. (1987)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA84 :7413_7417)。此 夕卜，利用核酸包被的微粒进行电穿孔或轰击可用于转染细胞，所述转染利用诸如Sambrook et al, Molecular Cloning :A LaboratoryManual,2nd ed. Vol. 1-3(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)和Fitzpatrick-McElligott ((1992)，Biotechnology (NY) 10(9) 1036-40)中所述的方法进行。基因改造技术包括但不限于，转染，转化，和/或利用表达载 体转到细胞，靶向同源重组和基因活化(见例如U. S. Pat. No. 5，272，071，Chappel)，以及 通过改造的转录因子反式活化(见例如Segal et al. (1999)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(6) 275 8-63)。具体实施方案中，高效受控电穿孔(high efficiency controlledelectroporation)用于导入各种核酸分子到宿主细胞。用于进行受控电穿孔 的示例性装置和方法可见于，例如，U. S. Patent Nos. 6，300，108 ；6，562，604 ；6，387，671 ； 6，403，348 ；6, 482，619 ；7, 053，063，每篇都包含在此作为参考。受控电穿孔基于这样的发现，即电穿孔在生物细胞中的发生和程度与生物细胞 或包含生物细胞的导电介质的电阻(本文指电流与电压之比)改变相关。生物细胞的电 流-电压比增加见于细胞膜由于孔形成而变为通透时。同样，通过流动导电流体的电流-电 压比降低见于流体将生物细胞带入流通电池(flow-through electric cell)中的电极之 间的区域中时。因此，通过监测生物细胞或悬浮有所述细胞的电解液的电阻，可检测到细胞 膜形成孔的时间点，同时检测由于孔形成细胞膜通透性的相对程度。该信息随后可用于确 定给定细胞的确发生了电穿孔，或通过控制电压量级的选择控制电穿孔过程。受控电穿孔 也可用于同时对多个细胞进行电穿孔，这是由于其直接指示电穿孔的实际发生并且指示细 胞整体平均电穿孔程度。该方法也可基于相同理由用于对生物组织(细胞膜相邻的大量生 物细胞)进行电穿孔。 受控电穿孔涉及利用其中置有生物细胞并且包含指导电流通过的隔板的电穿孔 装置，由此离子流经生物细胞同时使得基本上没有电流从该生物细胞旁边通过。这涉及利 用含有被隔板分离的两个储液小室，该隔板基本上不允许电流通过。所述的隔板包含小于 生物细胞的开口使得生物细胞一旦到达该开口就会堵住或关闭该开口。为了实现电穿孔，通过机械或化学手段将该生物细胞固定在开口处，例如以可逆方式进行使得生物细胞随后 可被移开而不受到破坏。一旦生物细胞固定在开口处，将电压加在两个小室之间并通过固 定在开口处的生物细胞。经过小室的电流由此被限制通过该开口以及生物细胞。通过监测 电池的电流-电压关系，检测电穿孔的开始以及控制孔形成的程度，以保证电穿孔的发生 以及防止过度孔形成和细胞死亡。使用者由此确切了解并控制生物细胞膜的状况以及电通 量。所述装置由此包含两个电极。每个电极的极性可交替改变由此允许靶核酸从至少两个 不同的点通过细胞膜。例如，所述的点在细胞的平面中呈大约180°分开。
电穿孔装置可包含内部支持物以固定单个生物细胞或多个生物细胞，以及包含内 部隔板，其限制装置中的电流使其路径经过生物细胞。电穿孔装置可包含一或多个适合盛 装缓冲液的小室。存在多个小室时，每个小室可盛装相同缓冲液或不同缓冲液。如果没有施 加电压，所述结构可用于仅仅进行扩散转运，其无需电压诱导的孔形成进行辅助。该隔板的 结构，以及在含有两个小室的实施方案中的两个小室，对于电穿孔细胞(electroporation cell)而言不是关键的，可进行多种变化但仍起作用。生物细胞的体积是显微镜下可见的， 而该装置可为电子芯片的大小，通过微细加工技术诸如电子芯片生产中的技术来制造。所 述小室可构建为流通小室以允许流体连续流过，间歇流过，或在使用者的指导下流过，或构 建为允许浓度、压力以及其他实现对通过生物细胞膜的种类的密切控制的条件发生改变。 该装置可包含层状结构或板状结构，其上具有适当的开口，当所述层状结构或板状结构结 合在一起时形成流动通道。流通小室具有允许单个细胞连续进入和去除的优势，从而大量细胞可被连续处 理。流通小室还允许补充溶液中消耗的溶质，使得浓度梯度可在需要时连续维持。流通小 室的其他功能是增加或降低压力，对于下述多种目的而言该功能是有用的。生物细胞在该结构中的支持可为任何将生物细胞固定在确定位置并允许电流通 过的结构。最方便的支持物是隔板中的开口。将生物细胞固定于开口处使得开口被封闭、闭 合或堵塞，由此指导电流通过和/或扩散转运经过细胞并消除或最小化细胞周围的泄露。 实现这一点的机械装置是将压差施加在开口两侧，其方向将把细胞压迫在开口处。开口的 直径应小于细胞直径，细胞进入该装置时会进入两个小室之一。通过增加细胞存留的小室 中的压力，或降低另一小室中的压力，所述细胞可被压在开口处，使得开口闭合。一旦该方 法完成，通过使得两个小室中的压力相等或逆转压差使得高压施加在另外的小室而非导入 细胞的小室即可容易地释放细胞。导入了细胞的小室中液体的流动随后将细胞从开口去移 开，将开口暴露于另一个细胞。利用细胞封闭开口的另一方法是通过在隔板表面或在开口边缘处利用结合细胞 膜的物质进行包被。由于生物细胞膜带负电，所述包被物可带正电，诸如聚赖氨酸，聚精氨 酸或聚组氨酸。所述生物细胞可通过跨开口压差导向开口，并被包被物固定。一旦完成该 过程，所述细胞可通过即刻增加开口细胞侧小室中液体的流速而从包被物释放，或通过施 加反向的跨开口压差来使得细胞离开开口。另一方面，利用电穿孔装置来进行受控电穿孔，所述装置诸如Wang et al. ,Anal. Chem, (2006)78 :5158_5164 中所述。一方面，高效受控电穿孔利用包含一或多个毛细管的装置进行。受控电穿孔的方 法包括以下步骤1)将一或多个细胞置于包含至少一个伸长毛细管的电穿孔装置中，所述伸长毛细管的管腔具有第一和第二末端，其中第一末端和第二末端的开口都进入储池中并且一或多个细胞可流经至少一个毛细管管腔进入储池；2)将一或多个细胞与包含与编码 重组蛋白的核苷酸序列可操作连接的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或 多种DNA元件的核酸接触；3)使所述一或多个细胞与电流接触使得电流通过该一或多个细 胞；4)监测电穿孔装置中电流和电压的比值；和5)调节局部场强的量级使其适合实现对一 或多个细胞的电穿孔。一些实施方案中，毛细管管腔直径比该管腔中细胞直径大不超过大约20%。一些 实施方案中，毛细管的直径比多个细胞的直径(例如管腔中细胞组的周界)大不超过大约 20%。本发明的各种受控电穿孔方法中，适合实现特定细胞类型电穿孔的最佳局部场强 可通过本领域已知方法轻易确定，例如通过测定细胞暴露于各种场强时细胞直径随时间的 改变(例如增加)。一些实施方案中，本发明方法中所用局部场强是大约150-500V/cm。其 他实施方案中，用于本发明方法中的局部场强是大约250-400V/cm。具体实施方案中，本发 明方法中的局部场强是大约400V/cm(例如，在CHO细胞的情况下)。本发明其他实施方案中，转染可利用化学药剂诸如磷酸钙作为沉淀剂，或阳离子 月旨质等例如 Lipofectamine (INVITROGEN，Carlsbad, CA)进行。不受任何理论限制，本发明的方法中可利用任何适宜的转染方法，只要其可使得 至少50 %以上，或至少60 %以上，或至少70 %以上，或至少80 %以上，或至少90 %以上，或 至少95%以上，或至少99%以上的细胞被转染。其他用于本发明方法中的示例性方法包 括，利用例如磁性纳米颗粒颗粒(例如，见OZ Biosciences的试剂盒)和纳米颗粒转染(例 如，见SIGMA-ALDRICH的试剂盒)。具体实施方案中，任何可使得至少70%的细胞被转染的 方法可用于本发明的方法中。其他实施方案中，任何使得至少80%的细胞被转染的方法用 于本发明的方法中。
VII.细胞培养基任何适合的培养基或适合细胞生长和蛋白产生的补料培养基(feed medium)可 用于本发明。适合的培养基或补料培养基可根据其与宿主细胞以及目的多肽的相容性选 择。适合的培养基或补料培养基是本领域已知的，包括但不限于，商购的培养基诸如Ham' s FlO (SIGMA)，极限必需培养基(SIGMA)，RPMI-1640 (SIGMA)，和 Dulbecco ‘ s 改良 Eagle ‘ s 培养基(SIGMA)适合培养动物细胞。此外，任何描述于下述文献的培养基可用作宿主细胞的培养基或补料培养基 Ham and Wallace, Meth. Enz. ,58 44(1979) , Barnes andSato, Anal. Biochem. , 102 255 (1980)，U. S. Pat. Nos. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；或 4，560，655 ；WO 90/03430 ； WO 87/00195 ；U. S. Pat. No. Re. 30, 985 ；或 U. S. Pat. No. 5，122，469，包含在此作为参考。任 何这些培养基可添加另外的成分以满足被培养细胞的特定需要。
VIII.细胞培养方法目的多肽可利用任何适合特定细胞类型的方案或途径以及合意的制备方案来制 备。因此，在本发明的方法中，可利用单步或多步培养方法。例如，在单步培养中，将细胞接种在培养环境中，随后在细胞培养的单个生产阶段添加任何营养或补充物。可选，多阶段培养也可使用。多阶段培养中，细胞可在多个步骤或阶段中培养。例如，细胞可在第一步或生长阶段培养中生长，其中细胞，可能从储存物取出，接种在适合促进生长和高存活力的培养基中。细胞可通过添加新鲜培养基到宿主细胞培养物中来保持在生长阶段适当的时间。具体的实施方案中，细胞生长在多阶段培养中，其中包括一或多个生长阶段以及生产阶段。本发明方法的一些实施方案中，生长阶段包括大约5L培养体积到大约200L培养体积，而生产阶段包含大约15000L培养体积。一些实施方案中，细胞培养中存在高比例存活细胞，从而使得相对于本领域已知的其他方法产生产量显著提高的高质量蛋白。多种细胞培养条件，诸如渗透度，温度和pH可被控制以在细胞培养过程中获得最佳蛋白产生(例如高效价)并减少批次差异。所述条件也可在细胞培养的生长阶段和/或生产阶段受到控制。此外，任何适合培养细胞的模式(例如补料分批或连续)可用于本发明的方法中。本发明方法的一些实施方案中，补料分批或连续细胞培养用于促进细胞培养物中生长期的哺乳动物细胞的生长。本发明方法的其他实施方案中，涉及大量细胞培养方法使得细胞生长。在补料分批或连续细胞培养条件下，生长期细胞在适合最大生长的条件和时间下生长。特定细胞类型的最佳培养条件，诸如温度，PH，渗透性，溶解氧(D02)，等，对于本领域技术人员是显而易见的或可由本领域技术人员轻易确定。本发明还涉及培养产生弹性细胞系(resilient cell line)的方法，所述弹性细胞系能适应改变并且仍可产生改善的量的蛋白并保持细胞活力，例如通过将编码抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列导入细胞系和/或使得细胞系与分离的抗凋亡蛋白或其功能片段接触。一些实施方案中，所述方法导致多细胞培养批次中质量特征一致。具体实施方案中，本发明的方法提供一致的存活细胞密度以及存活细胞百分比，代谢一致性，产品质量，以及蛋白生产水平。
IX.试剂盒本发明还涉及降低一或多种污染物水平的试剂盒。一些实施方案中，本发明的试剂盒包括(a)第一核酸分子，包含能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件以及适于克隆编码重组蛋白的核苷酸序列的多克隆位点；和(b)第二核酸分子，包含编码至少一种抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件。一些实施方案中，本发明的试剂盒包括(a)宿主细胞，其用包含可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件的编码至少一个抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列的核苷酸分子稳定转染；和(b)核酸分子，其包含可操作连接于适合克隆编码重组蛋白的核苷酸序列的多克隆位点的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件，其中所述核酸分子能被导入宿主细胞。一些实施方案中，本发明的试剂盒包括说明书和宣传材料，包括转染装置或转染剂使用的详细说明。通常，试剂盒可包含以下一或多个组分以及使用说明一或多个核酸分子，其包含可操作连接于用于克隆编码重组蛋白的核苷酸序列的多克隆位点的能开放染色 质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件；(b) —或多个核酸分子，其包含可操 作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件的编码一或多个 抗凋亡蛋白或其功能片段的一或多个核苷酸序列；(c) 一或多个纯化的抗凋亡蛋白或其功 能片段；(d)用于导入多种核酸分子的一或多个适宜的细胞系；和(e)适合转染所述细胞系 的一或多种药剂和/或装置。适宜的转染剂可包含一或多种化学工具用于利用核酸转染细胞，诸如磷酸钙，或 可商购的制备的阳离子脂质，例如LipofectamineTM(INVITROGEN，Carlsbad，CA)。其他可商 购的试剂包括 si Importer (MILLIPORE，Temecula, CA) ；FuGene (ROCHE，Indianapolis, IN)。转染装置可包括电穿孔装置诸如受控电穿孔装置(EXCELLIN LIFESCIENCES, Menlo Park,CA)。所述系统还可包含能量供应，电脑，例如包含适宜软件和硬件的个人电脑用于检 测或记录细胞存活、生长数据、转染效率、孔形成(如果利用电穿孔)以及蛋白生产。
X.纯化方法本发明还提供了收获或纯化利用本发明的方法制备的重组蛋白的方法。通常，任 何本领域已知的适宜纯化方案均可使用。然而本发明的方法简化了通过降低通常存在利用 细胞培养方法进行的重组蛋白表达过程中的一或多种污染物的水平的纯化过程。一些实施方案中，收获细胞培养物中的重组蛋白的方法不利用蛋白A。一些实施方 案中，可进行一或多个色谱步骤，例如一个色谱步骤，两个色谱步骤，超过两个色谱步骤来 从细胞培养物中收获重组产物。色谱步骤也不需要利用严格洗涤剂或洗脱缓冲液。一些实施方案中，收获步骤包括离心步骤，从而重组蛋在降低水平的一或多种污 染物存在下存在于细胞上清中。收获或纯化步骤可通过本领域技术人员基于产品蛋白质进行选择。适宜纯化本发 明重组产物的纯化方法可包括一或多个如下步骤从上清沉淀重组蛋白；使得重组蛋白结 晶；高效切向流过滤(HPTFF)，流通色谱，其中污染物保持在固相支持物上，重组蛋白则流 出色谱介质(例如 Intercept (MILLIPORE CORPORATION, Billerica, MA)；吸附纯化，例 如离子交换色谱，亲和色谱。一种合适的纯化步骤可选自本领域已知的任何色谱装置，例如大小排阻，离子交 换，亲和，反相色谱等。一些实施方案中，色谱步骤包括离子交换色谱步骤。其他实施方案 中，色谱步骤不需要亲和色谱步骤以及通常用于洗脱的潜在的严苛条件。一些实施方案中，重组蛋白在降低水平的一或多种污染物的存在下产生，所述 污染物是宿主细胞蛋白，其存在的量少于总蛋白的大约百万分之1000 (ppm)，或少于大约 900ppm,或少于大约800ppm，或少于大约700ppm，或少于大约600ppm，或少于大约500ppm， 或少于大约400ppm，或少于大约300ppm，或少于大约200ppm，或少于大约lOOpprn，或少于大 约90ppm，或少于大约80ppm，或少于大约70ppm，或少于大约60ppm，或少于大约50ppm，或少 于大约40ppm，或少于大约30ppm，或少于大约20ppm，或少于大约lOppm。本发明还通过以下实施例说明，其不应理解为限制性的。所有参考文献，专利和引 用的公开的专利申请以及附图
的内容都包含在此作为参考。实施例
实施例I 产生稳定的CHO细胞克隆CHO细胞的稳定克隆通过利用可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件的aven基因或可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状 态的DNA元件(例如，延伸的无甲基化GpG岛)的E1B-19K基因转染细胞来产生。另一试 验中产生这样的CHO细胞的稳定克隆，其利用aven基因和E1B-19K基因转染，每个基因都 可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件(例如，延伸的无甲 基化GpG岛)。产生包含一或两个所述的抗凋亡基因的稳定CHO细胞之后，利用编码重组蛋白 (例如抗体或抗体的轻链或重链)的核苷酸序列稳定转染所述细胞，所述核苷酸序列可操 作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元件(例如，延伸的无甲基化 GpG岛)，并任选可操作连接于能增加重组蛋白分泌到细胞外、增强重组蛋白翻译以及提高 mRNA稳定性的一或多个核苷酸序列。筛选稳定转染的细胞的集合而不是单个克隆，由此减少与选择方法相关的时间，此外，不需要基因扩增。对照实验中，CHO细胞仅仅利用可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在 开放状态的DNA元件并任选可操作连接于一或多个上述核苷酸序列的重组蛋白编码核苷 酸序列来转染。
实施例2 评估细胞的重组蛋白产生随后评估稳定转染的CHO细胞的集合的抗凋亡基因和重组蛋白的产生。评估抗凋 亡基因的表达，例如通过taqman分析来进行，并评估重组蛋白的表达，例如通过分析重组 蛋白与已知的结合配偶体或任何其他可能适合检测具体重组蛋白的测定法来进行。收集细胞上清以评估宿主细胞污染物，例如宿主细胞蛋白，其可利用例如ELISA 或可用于测定CHO细胞中的宿主细胞蛋白的测定法来测定。表达抗凋亡蛋白和重组蛋白的 细胞的细胞上清与来自仅仅表达重组蛋白的细胞的细胞上清进行比较。离心表达重组蛋白以及一或两种抗凋亡基因的细胞之后收获的细胞上清相对于 得自仅仅表达重组蛋白的细胞的细胞上清而言包含降低水平的宿主细胞污染物，例如宿主 细胞蛋白。说明书通篇可根据引用的参考文献来理解。说明书中的实施方案提供了本发明的 举例说明，而并非限制本发明的范围。本领域技术人员容易理解本发明还包含许多其他实 施方案。所有公开物和发明都包含在此作为参考。如果包含的文献与本发明的说明书抵触 或不相符，以本发明为准。引用的参考文献并非承认其为本发明的现有技术。除非另有说明，说明书和权利要求书中所有表达成分、细胞培养物、治疗条件等的 量的数均理解为用“大约”修饰。因此，除非有相反的说明，数量参数都是大约值并且可根 据本发明所需而变化。除非另有说明，系列元素之前的术语“至少”理解为指该系列中的每 个元素。本领域技术人员将理解，或能利用常规实验确定，本发明的具体实施方案的等同方 案。所述等同方案包含在本发明中。
本发明可进行多种修饰和改变而不偏离其精神和范围，这对于本领域技术人员而言显而易见。本发明的具体实施方案仅仅用于举例说明而不以任何方式限制。应理解说明 书和实施例均用于示例，权利要求显示本发明的范围。
权利要求
富集细胞培养物中的重组蛋白的方法，所述方法包括(a)将包含编码重组蛋白的核苷酸序列的第一核酸分子以及包含编码至少一种抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列的第二核酸分子导入细胞，其中两种核苷酸序列均可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件；和(b)在使得所述重组蛋白在降低水平的一或多种污染物的存在下产生的条件下培养所述细胞，由此在细胞培养物中富集所述重组蛋白。
2.权利要求1的方法，还包括从细胞培养物收获所述重组蛋白的步骤。
3.权利要求2的方法，其中一或多种污染物的水平在收获步骤中是降低的。
4.权利要求1或3的方法，其中所述一或多种污染物选自一或多种宿主细胞脂质，一 或多种宿主细胞蛋白，一或多种宿主细胞碳水化合物，一或多种宿主细胞RNA分子和一或 多种宿主细胞DNA分子。
5.权利要求4的方法，其中当重组蛋白和抗凋亡蛋白或其功能片段共表达时，一或多 种污染物的水平相对于所述重组蛋白单独表达时产生的一或多种污染物的水平降低大约 20 %，或大约30 %，或大约40 %，或大约50 %，或大约60 %，或大约70 %，或大约80 %，或大 约90 %，或大约95 %，或大约96 %，或大约97 %，或大约98 %，或大约99 %，或更多。
6.权利要求1的方法，其中所述第一核酸分子和第二核酸分子被克隆入同一载体。
7.权利要求1的方法，其中所述第一核酸分子和第二核酸分子被克隆入分离的载体。
8.权利要求6或7的方法，其中所述载体是质粒。
9.权利要求6或7的方法，其中所述载体是病毒载体。
10.权利要求1的方法，其中所述第二核酸分子在所述第一核酸分子之前导入。
11.权利要求1的方法，其中所述第一和第二核酸分子被同时导入。
12.权利要求1的方法，其中所述第一核酸分子包含两个核苷酸序列，每一个核苷酸序 列编码重组蛋白，并且每一个核苷酸序列可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在 开放状态的一或多种DNA元件。
13.权利要求1的方法，其中所述第一核酸分子还包括一或多个选自下组的核苷酸序 列(a)能增强翻译的核苷酸序列；(b)能增加分泌的核苷酸序列；和(c)能增加mRNA稳定 性的核苷酸序列，其中(a)-(c)中的一或多个核苷酸序列可操作连接于编码重组蛋白的核 苷酸序列。
14.权利要求1的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述哺乳动物细胞选自BHK21细胞，CHO细胞，CHO-Kl细 胞，CHO-DUXX细胞，NSO细胞或Sp2/0细胞。
16.权利要求14的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞(CH0细胞)。
17.权利要求1的方法，其中所述重组蛋白是治疗蛋白。
18.权利要求1的方法，其中所述重组蛋白是抗体或其抗原结合片段。
19.权利要求18的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
20.权利要求1的方法，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多 种DNA元件选自(a) —或多种延伸的无甲基化GpG岛；(b) —或多种基质附着区；(c) 一或 多种稳定化区和抗阻遏区；以及(d) (a)-(c)的任意组合。
21.权利要求20的方法，其中一或多种延伸的无甲基化GpG岛来自一或多个遍在表达的基因的启动子区。
22.权利要求1的方法，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多 种DNA元件是天然存在的DNA元件。
23.权利要求1的方法，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多 种DNA元件是人工合成的DNA元件。
24.权利要求1的方法，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多 种DNA元件是天然存在的DNA元件与人工合成的DNA元件的组合。
25.权利要求1的方法，其中编码抗凋亡蛋白的核苷酸序列选自编码下述蛋白的核苷 W.Ff H :bcl"2 ；bcl-xL ；bcl-6；xiap ；hiapl ；aven ；hiap2 ；E1B-19K ；P21 ；myrPHK ； HSV-I γ 134. 5 ；和beclin，或其功能同系物或片段。
26.权利要求1的方法，其中所述细胞在无血清培养基中培养。
27.权利要求26的方法，其中所述培养基不包含动物产物。
28.权利要求26的方法，其中所述培养基是无蛋白培养基。
29.权利要求1的方法，其中所述第一和/或第二核酸分子通过以下方法导入细胞 (a)将细胞置于电穿孔装置中，所述装置包含具有适合接收所述细胞的开口的隔板；(b)将 所述细胞固定在开口中；(c)使所述细胞与电流接触，使得电流通过该细胞；(d)监测电穿 孔装置中的电流和电压比；和(e)调节电压量级以优化电穿孔。
30.权利要求29的方法，其中所述隔板包含绝缘材料。
31.权利要求29的方法，其中所述开口的直径小于所述的细胞。
32.权利要求1的方法，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的DNA元 件选自SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示序列，或其组合。
33.在降低水平的一或多种污染物的存在下制备重组蛋白的试剂盒，包含(a)第一核 酸分子，包含能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件以及适于将 编码重组蛋白的核苷酸序列克隆到所述分子的多克隆位点；和(b)第二核酸分子，包含编 码至少一种抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作连接于能开放 染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件。
34.权利要求33的试剂盒，还包含含有多个适于导入所述第一和第二核酸分子的宿主 细胞的细胞系。
35.权利要求33的试剂盒，还包含转染剂或转染装置，用于将所述第一和/或第二核酸 分子导入细胞，以及包含使用说明。
36.权利要求35的试剂盒，其中所述转染装置是电穿孔装置。
37.权利要求35的试剂盒，其中所述重组蛋白是抗体或其抗原结合片段。
38.权利要求37的试剂盒，其中所述抗体是单克隆抗体。
39.权利要求35的试剂盒，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一 或多种DNA元件是天然存在的DNA元件。
40.权利要求35的试剂盒，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一 或多种DNA元件是人工合成的DNA元件。
41.权利要求35的试剂盒，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一 或多种DNA元件是天然存在的DNA元件和人工合成的DNA元件的组合。
42.权利要求35的试剂盒，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一 或多种DNA元件选自(a) —或多种延伸的无甲基化GpG岛；(b) —或多种基质附着区；(c) 一或多种稳定化区和抗阻遏区；以及(d) (a)-(c)的任意组合。
43.权利要求42的试剂盒，其中一或多种延伸的无甲基化GpG岛来自一或多个遍在表 达的基因的启动子区。
44.权利要求35的试剂盒，其中编码抗凋亡蛋白的核苷酸序列选自编码下述蛋白 的核苷酸序列:bcl-2 ；bcl-xL ；bcl-6 ；存活素；xiap ；hiapl ；hiap2 ；aven ；E1B-19K ；P21 ； myrPHK ；HSV-I γ 134. 5 ；和beclin，或其功能片段或同系物。
45.在降低水平的一或多种污染物的存在下制备重组蛋白的试剂盒，包含(a)用核苷 酸分子稳定转染的宿主细胞，所述核苷酸分子包含可操作连接于能开放染色质和/或保持 染色质在开放状态的一或多种DNA元件的编码至少一种抗凋亡蛋白或其功能片段的核苷 酸序列；和(b)核酸分子，其包含可操作连接于适合克隆编码重组蛋白的核苷酸序列的多 克隆位点的能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件，其中所述核 酸分子能被导入所述宿主细胞。
46.权利要求45的试剂盒，还包含转染剂或转染装置以及使用说明。
47.权利要求46的试剂盒，其中所述转染装置是电穿孔装置。
48.适合在降低水平的一或多种污染物存在下表达重组蛋白的宿主细胞，所述宿主细 胞用以下分子稳定转染(a)包含可操作连接于能开放染色质和/或保持染色质在开放状 态的一或多种DNA元件的编码重组蛋白的核苷酸序列的核酸分子；和(b)包含可操作连接 于能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的一或多种DNA元件的编码至少一种抗凋亡 蛋白或其功能片段的核苷酸序列的核酸分子。
49.权利要求48的宿主细胞，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的 一或多种DNA元件是天然存在的DNA元件。
50.权利要求48的宿主细胞，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的 一或多种DNA元件是人工合成的DNA元件。
51.权利要求48的宿主细胞，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的 一或多种DNA元件是天然存在的DNA元件和人工合成的DNA元件的组合。
52.权利要求48的宿主细胞，其中所述能开放染色质和/或保持染色质在开放状态的 一或多种DNA元件选自(a) —或多种延伸的无甲基化GpG岛；(b) —或多种基质附着区； (c) 一或多种稳定化区和抗阻遏区；以及(d) (a)-(c)的任意组合。
53.权利要求52的宿主细胞，其中一或多种延伸的无甲基化GpG岛来自一或多个遍在 表达的基因的启动子区。
54.权利要求53的宿主细胞，其中所述一或多个遍在表达的基因选自人hnRNPA2，小鼠 hnRNPA2,人 TBP，小鼠 TBP，人 rpS3 和小鼠 rpS3。
55.权利要求48的宿主细胞，其中编码抗凋亡蛋白的核苷酸序列选自编码下述蛋白 的核苷酸序列:bcl-2 ；bcl-xL ；bcl-6 ；存活素；xiap ；aven ；hiapl ；hiap2 ；E1B-19K ；P21 ； myrPHK ；HSV-I γ 134. 5 ；和beclin，或其功能片段或同系物。
56.权利要求48的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
57.权利要求48的宿主细胞，其中哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢细胞系(CHO细胞系)。
58.权利要求48的宿主细胞，还包含一或多个选自下组的核苷酸序列(a)能增强翻译 的核苷酸序列；(b)能增加分泌的核苷酸序列；和(c)能增加mRNA的稳定性的核苷酸序列， 所述核苷酸序列可操作连接于编码重组蛋白的核苷酸序列。
59.收获根据权利要求1的方法表达的重组蛋白的方法，其中所述收获步骤不包含利 用蛋白A并且包含一或多个选自下组的步骤从上清沉淀重组蛋白；结晶；高效切向流过滤 (HPTFF)，流式色谱；以及吸附色谱。
60.权利要求59的方法，其中吸附色谱步骤是离子交换步骤。
61.权利要求59的方法，其中所述收获步骤不包括使得所述蛋白与严格洗脱缓冲液接触。
62.权利要求59的方法，其中所述收获步骤包括至少一个离心步骤。
63.权利要求59的方法，其中一或多种污染物的水平是降低的。
全文摘要
提供了修饰的促红细胞生成素(EPO)多肽和其它修饰的治疗性多肽。所述的EPO多肽和其它修饰的治疗性多肽经修饰显示与相应的未修饰的EPO多肽和其它未修饰的治疗性多肽不同的物理性质和活性。还提供了编码这些多肽的核酸分子。还提供了利用所述多肽进行治疗或诊断的方法。
文档编号C12N5/00GK101802170SQ200880007589
公开日2010年8月11日 申请日期2008年1月8日 优先权日2007年1月8日
发明者A·迪莱奥 申请人:米利波尔公司