顶泌细胞系的制作方法

专利名称：：顶泌细胞系的制作方法顶泌细胞系本发明涉及顶泌细胞系，特别地涉及展示长期增殖的顶泌细胞系。除了外分泌腺外，顶泌腺分泌含有各种脂类和氨基酸溶质的含水液体(aqueousfluid)，其中，当在人皮肤上暴露于皮肤细菌群时，所述溶质被转化成有臭味的化合物，包括类固醇和短链脂肪酸。换句话说，顶泌腺有助于人出汗。相当多的研究仍在继续进行以发现阻碍在皮肤上产生有臭味的化合物的手段，但这受到缺少准确模拟顶泌腺原位(即在人皮肤中)功能的顶泌细胞系的阻碍。准确模拟顶泌腺原位(即在人皮肤中)功能的顶泌细胞系的开发将非常有价值，因为其可提供本文中提及的一个或多个益处。其使得能够进行更多的体外(相对于体内)研究。这可以(i)帮助鉴定顶泌腺内导致出汗的转运机理，(ii)有助于筛选和鉴定用于减少形成有臭味的化合物的物质，和(iii)帮助测定它们的有效浓度，即，当局部施用于身体时用作除臭剂所需的浓度。存在适当的细胞系还提供了鉴定除了出汗本身以外的腺体新功能的机会。与在长期培养中维持其他分泌细胞的努力一样，从顶泌培养物获得的原代细胞系在丧失顶泌腺的形态学、表型和/或功能方面的特征之前，从未传代超过数代。由RWicher等人的Andrologia35，pp342-350中标题为"Establishingoftwoinvitromodelsofepithelialcellsfromtheapocrinesecretingratcoagulatinggland"的论文涉及来自大鼠的顶泌细胞，但未公开展示长期增殖的人源性顶泌细胞。此外，该论文中用于证明功能的细胞标记不必然与人顶泌模型相关。此外，其作者似乎没有寻求在冷冻和解冻后对它们的细胞进行传代，从而没有证明它们的长期增殖能力。由Z.Maras等人在InVitroCell.Dev.Biol.Animal第35巻，Nov-Dec(1999)，pp606-611中公开的标题为"CultivationofEpitheliafromtheSecretoryCoiloftheOvineApocrineGland;EvidenceofSecretoryCellFunctionandDuctalMorphogenesisinVitro"的论文涉及来自绵羊的顶泌细胞，类似地，其同样没有公开展示长期增殖的人源性顶泌细胞系。由DieterC.Gruenert等人在InVitroCell.Dev.Biol.第26巻，April(1990)，pp411-416中公开的标题为"LongTermCultureofNormalandCysticFibrosoisEpithelialCellsgrownunderSerum—freeConditions"的论文涉及夕卜分泌细胞而非顶泌细胞，因此，其没有公开展示长期增殖的人源性顶泌细胞系。輛,,本发明的目的是提供模拟顶泌腺出汗功能的顶泌细胞系，其可通过传代培养在培养中得到保持，并且展示长期增殖。輛,娜根据本发明，提供了展示长期增殖的培养的顶泌细胞系。增殖，在本文中表示当在适当的培养基中培养时，细胞保持分裂的能力，但并不意味着细胞系是永生的。长期，在本发明中表示细胞在传代培养(传代)至少30代后仍然保持它们增殖的能力。事实上，当细胞系已获得这样的长期增殖时，其通常能够展示经历传代至少100或1000代的增殖。至少对于根据本发明的培养的顶泌细胞系的实际目的来说，经历这样多代增殖的增殖是无限增殖的标志。特别地，提供了已以保藏号07021301保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(EuropeanCollectionofCellCulture)(ECACC)，PortonDown，Salisbury,SP4OJG，England,并且展示至少长期增殖的人顶泌细胞系。輛日扁嫌輔錄麵齢白勺糊娜本文描述了长期增殖的顶泌细胞系的产生以及随后通过电生理、分子和生物化学技术进行的其表征和与原代培养顶泌细胞的比较。具体关于已经被证明至少长期增殖的顶泌细胞系ASG5，类固醇合成和气味(odour)前体化合物的分析得到了特别的关注。丁页薩,m麵代麟通过下列方法获得展示长期增殖能力的顶泌细胞系。在之前已获得相关伦理委员会和受试者的受试者同意书后，通过剪切年龄在30和70之间的妇女的腋窝皮肤(axillaryskin)来分离完整的顶泌腺。通过剪切处理破碎一些顶泌汗腺(apocrinesweatgland)，并且能够从那些碎片培养细胞。显微镜观察和中性红吸收实验显示通过剪切分离的顶泌腺完全由与管道分开的曲腺(coil)组成。从大约50mmx5mm的腋窝皮肤样品分离平均10至IOO个顶泌曲腺(apocrinecoil)。然后使用由Lee等人在J.CellSci.83:103-118，1986中提出的改良方法，在含有II型胶原酶(以2mgml—1的浓度)的WilliamsE培养基(本文中縮写成WEM)中，于37°CT，5%C02/空气、95%相对湿度中温育顶泌曲腺30分钟。然后将曲腺在补充有10ngm户表皮生长因子(EGF)、10iigm广胰岛素、10ngml—1氢化可的松、10ygm广全转铁蛋白(holotransferrin)、lmML-谷氨酰胺、100Uml—1青霉素和100ygml—1链霉素的不含酶的WEM中进行清洗。每25cm2烧瓶用lml乳腺上皮生长培养基(MammaryEpithelialGrowthMedium)(MEGM)(补充有10ngm广EGF、10iigml—1胰岛素、0.5ygml—1氢化可的松、30ygml—1牛垂体提取物、50ygml—1庆大霉素和50ngml—1两性霉素)涂板大约15个顶泌腺。在于37°C下，在95%空气/5%C02潮湿的培养箱中温育24小时后，向各烧瓶中再加入3mlMEGM，之后每3天更换一次培养基。长期增殖的顶泌细胞系(ASG5)-无限增殖的细胞系的标志的产生和维持原代汗腺的分离和培养如前面所指出的，通过剪切分离完整未受损的人顶泌汗腺。顶泌腺的组织学检查显示剪切完全除去了短的吸收管(absorptiveduct)，只留下分泌曲腺部分保持完整。将分离的腺涂板在补充MEGM上。在2-3天后常规地观察到，大约50%的被涂板的腺产生突起(outgrowth)。突起持续增殖最高达到20天，并且展示典型的'鹅卵石'上皮细胞形态学(如图1中所示的，其显示在外植后9天从顶泌曲腺生长的细胞(A)和增殖的顶泌细胞(B)的相差显微镜照片)。在培养的早期阶段，在观察到突起之前，经常在外植的腺的周围观察到少量具有伸长的成纤维细胞样形态的细胞。然而，这些细胞不能在MEGM中增殖。增殖的顶泌细胞系来源于顶泌分泌曲腺的原代培养物。在MEGM中培养7天后，将有效的佛波酯(phorbolester)TPA(佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-醋酸酯；exCalbiochem，Nottingham,UK)以250nM的浓度加入到培养基中。获得展示长期增殖能力的细胞系的方法的重要特征是培养基包含有效浓度的佛波醇的酯(佛波醇可替换地也被称为l，la，lb，44，4a，7a，7b，8，9，9a_十氢_4a，7b，9，9a_四羟基_3_(羟甲基)_1，1，6，8_四甲基-5H-环丙[3，4]苯[1，2-e]甘菊环(azulen)-5-酮)。通常，酯特别合适地在12和/或13位包含至少脂肪族取代基，例如长链烷基(C7至C24)和任选地还有短链烷基(C2至C6)。因此，本文中的方法能够实现制备展示无限增殖的顶泌细胞系。在加入后3至4天，TPA诱导提前产生多层(prematuremultilayering)。然而，通过反复清洗除去上面的已分化层，以留下仍然附着至烧瓶的细胞的增殖单层。将增殖层的细胞传代到96孔板中以产生克隆细胞系。将细胞在含有TPA的MEGM中维持、传代和持续培养进行大约2个月。在该时期后，将细胞培养在单独的MEGM中，并且监控持续增殖。最初，许多亚克隆持续生长，但在接下来IO代传代结束时，大部分已开始衰老。一种培养物(特别地ASG5)继续生长，现已在培养中得到维持，增殖超过40代，并且没有生长速率下降的迹象。这是展示无限增殖能力的标志。该培养物在不存在TPA的情况下继续增殖，可在深低温保藏下存活，并被认为是稳定的。通过比较，原代顶泌汗腺培养物生长最长持续1个月和4代，并且不能在深低温保藏下存活。本文中进行传代的展示长期增殖的细胞培养物在形态学上与原代顶泌培养物相似，例如峰激动剂响应(peakagonistresponse)。因而，这类细胞培养物能够用于证明物质是否能够在体外展示除臭的性质和/或物质在体外展示除臭的程度，即是否能够用作个人除臭剂。用于电牛理学的ASG5顶泌细胞的制备在13至18天后，将汇合的ASG5培养物传代至Transwell涂布胶原的可渗透支持物(面积0.33cm2，Costar，货号3495，HighWycombe，Bucks,UK)。这包括在2%EDTA中温育20分钟，接着用胰蛋白酶(0.5%)-EDTA(0.2%)处理大约5分钟。将3xl()S个细胞转移至每个被补充WEM的Transwell中。将Transwell支持物在0.6ml的相同培养基中悬浮于24孔板中。对于原代培养物，只将第一代细胞用于实验中。每两天更换一次在Transwell上水浴培养物的培养基。电生理学使用与欧姆计连接的'筷子(chopstick)，电极(WPI，Alresford，Hants,UK)监控Transwell上的跨上皮电阻(Trans印ithelialresistance)(TER)。通过减去湿润的过滤器空白对照的测量值来估计TER。在峰TER上，将Transwell支持物安装在尤斯灌流室(UssingChamber)中。在改良的缓冲液中，在充氧并且维持在37°C，pH7.4，使用95%02/5%C02的条件下，水浴上皮。缓冲液由下列构成(mM):NaC1，117;KC1，4.7;CaCl2，1.5;MgS04，1.2;NaHC03，25;和葡萄糖，ll.1。通过含有溶解在3M氯化钾中的琼脂的电桥(bridge)将与电压/电流钳连接的电压和电流电极(分别为甘荥和银/氯化银，ABBKentTaylor,Stonehouse，Glos，UK)延伸至水浴中。在不存在Transwell的情况下平衡电压电极，通过注入任意直流电补偿电压电极之间的射流电阻(fluidresistance)。在安装Transwell后，上皮发生短路，使电流稳定，通常进行15分钟。考虑到顶泌材料稀少，因此如Braydenetal(1988)J.Physiol，405:657-675，Pedersenetal(1992)Exp.Physiol，77;863-871，和Shenetal，(1994)Am.J.Physiol，266:L493_501所公开的，通常接连加入药物，并且记录短路电流(rE)的变化。实验的持续时间通常为15至60分钟。TER通过使用欧姆定律估计TER，常规地通过将电压钳制在±10mV并5且测量达到这一点时所需的电流。除非另外指出，除了向顶面加入的阿米洛利(amiloride)夕卜，向基底外侧加入图例中列出的所有药物。阿米洛利是上皮Na+通道(ENaC)和Na+/H+交换器的抑制剂。Krebs缓冲液的改良在Krebs缓冲液(其中用葡萄糖酸钠替代NaCl，葡萄糖酸钾替代KC1以及CaS04替代CaCl》中进行氯化物置换实验。使用11.lmM甘露醇作为维持同渗浓度(osmolality)的替代品来进行无葡萄糖实验。在不存在硫酸根离子的情况下进行其中将钡用作钾通道抑制剂的实验，以便MgCl2替代MgS04。;S底膽将增殖的顶泌培养物传代至可渗透的支持物上，并且在峰TER时转移至尤斯灌流室。此类增殖的培养物的平均TER是395±40Qcm2(P<0.001)。对于增殖的顶泌培养物，静息短路电流(Ise)为4.5±0.8Acm—2(p<0.001)。对于增殖的顶泌培养物，静息跨上皮电位差(trans印ithelialpotentialdifference)(TEPD)为l.OmV，顶端为负极。軒銜云抑綱蕴,、P白條瞎軒相表1巾。增殖的培养物中的静息1"对于10PM阿米洛利是敏感的，这确认了钠的重吸收是培养的汗腺上皮中的离子转运的重要组分。在顶端施用的阿米洛利(lOiiM)在增殖的顶泌培养物中减小静息Isc4.5±1.OilAcm—2(n=20，P<0.001)。剂量反应曲线显示阿米洛利的ICs。是2-4iiM，以及10iiM阿米洛利是最大限度以上的剂量。还在顶泌培养物中检查了呋塞米(NKCC1(上皮Na+-K+-Cr的协同运输蛋白(从而为经上皮的氯化物运输载体))的抑制剂)的作用。基底外侧加入lmM呋塞米使已转化的培养物的静息Isc减少0.8±0.30.2iiA(n=20，P<0.001)。表1.阿米洛利和呋塞米对培养的顶泌(原代和增殖的)细胞和外分泌汗腺细胞中的短路电流的作用。原代顶泌增殖的顶泌原代外分泌静息I"8.4±0.94.5±0.88.6±1.0(liAcm—2)(n=57)(n=40)(n=22)Arc(yAcm—2)阿米洛利-6.0±0.9**-4.2±1.0-7.1±0.7(10iiM)(n=49)(n=20)(n=22)呋塞米-0.5±0.2-0.8±0.3nd(ImM)(n=13)(n=20)麵割應乍ffl雄云力齐l薩巾白勺柳用10M阿米洛利预处原代顶泌培养物和增殖的顶泌培养物以确定钠的重吸收在激动剂响应中的作用。附图2显示在存在阿米洛利的情况下原代顶泌培养物、外分泌培6养物和增殖的顶泌培养物中Ise的峰增加。向Transwell上的培养物的基底外侧加入激动齐U。图中的各条块(bar)代表n=10的最小值。显示在存在顶端阿米洛利(10yM)的情况下短路电流的峰增加。向基底外侧加入激动剂卡巴胆碱(Carbachol)(CCh;20yM)、异丙肾上腺素(Iso;10iiM)、L-缓激肽(LBK;170nM)、组胺(His;200yM)和三磷酸腺苷(ATP;100iiM)。使用斯图登(student's)非配对t检验和威尔科克森(Wilcoxon)检验检测显著性。图2显示阿米洛利预处理在长期增殖的顶泌细胞系ASG5中显著减少对CCh、His和ATP的响应，这暗示钠的重吸收是此类反应的组成部分。图3显示原代顶泌培养物、外分泌培养物和增殖的顶泌培养物中Ise的峰增加。向Transwell上的培养物的基底外侧加入激动剂。显示短路电流的峰增加。向基底外侧加入激动剂CCh(20iiM)、Iso(10iiM)、LBK(170nM)、His(200iiM)和ATP(100iiM)。图4A和4B是关于ASG5细胞中离子通道抑制剂对响应卡巴胆碱影响的代表性Ise的记录(迹线(trace))。图4A显示使用阿米洛利(lOyM)的顶端预处理和ImM呋塞米(Fru)禾P50iiM氯化钡(Ba;maxi-K通道阻断剂)的加入对响应CCh(20yM)的影响。图4B显示使用lmM阿米洛利的顶端预处理和阿米洛利和氯化钡对响应CCh的影响。图4A中的增殖的顶泌培养物的代表性迹线也显示，与图3中观察到的激动剂剌激的值相比较，卡巴胆碱剌激在阿米洛利预处理后减小。在四种情况下，将完整的顶泌分泌曲腺直接外植至可渗透的支持物上，以确定顶泌培养物的原代培养和传代是否影响它们的电生理特性。在被检测的培养物中，无论在存在阿米洛利或不存在阿米洛利的情况下，基础电生理特性和经激动剂剌激的电生理特性与原代培养物没有显著差异(数据未显示)。跨上皮氯化物转运在响应瞬时激动剂中的作用为了进一步表征原代和增殖的顶泌培养中激动剂诱导的响应的离子基础，检查跨上皮氯化物转运的作用。在无氯化物的条件下，原代和增殖的顶泌培养物的静息I"分别是6.0士0.8iiAcm—2禾P3.1±0.6iiAcm—2。静息TEPD是-0.9mV(对于原代培养物)和-1.8mV(对于增殖的培养物)。10i!M阿米洛利的加入使基线I"在原代培养物中减小3.6iiAcm—2以及在增殖的培养物中减小2.5iiAcm—2。当与在存在氯化物的情况下的相同实验相比时，在原代和增殖的顶泌培养物中对卡巴胆碱、组胺和ATP的响应显著减小(表2)，这暗示氯化物的转运确实在介导响应激动剂中发挥重要作用。此外，图4B显示来自增殖的培养物的代表性迹线，其显示，与图3中的值相比较，使用呋塞米的预处理减小了对卡巴胆碱响应的强度(magnitude)。在激动剂剌激后加入呋塞米在原代和经转化的顶泌培养物中诱导了响应的快速减小，这证明了NKCC1在调节氯化物吸收中的作用。(表3)。表2.在无氯化物的缓冲液中顶泌培养物的峰激动剂响应。A:原代顶泌培养物B:增殖的顶泌培养物(ASG5)。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>当与在含有氯化物的缓冲盐中进行的阿米洛利预处理相比较时，阿米洛利预处理显著减小激动剂响应，但它们未完全消失(特别是在增殖的培养物中)，这暗示其他离子转运途径也在这些响应中起作用(表4)。表4.射可雄禾l予麵,a氯扁,蘭时隱咅斜勿謹敫云力齐l薩。A:原代顶泌培养物B:增殖的顶泌培养物。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>总地说来，这些结果表明增殖的细胞系继续展示与原代培养物相同的特征。錢鹏白垂必,麵巾顿人皮肤和其相连的附属物能够行使许多种代谢功能，包括参与激素代谢和合成的那些功能。在需要许多酶转化的生物合成途径中从亲本前体胆固醇合成雄激素(性类固醇激素)。当顶泌腺在青春期开始发挥作用时，雄激素很可能在调控腺的活性中起一些作用。这进一步得到已在存在于腋窝皮肤中的顶泌腺的分泌细胞中检测到雄激素受体(Beier等人，(2005)Histochem.CellBiol.，123:61-65)的事实的支持。因为类固醇的局部或胞内分泌生成潜在地在介导细胞功能中起着重要作用(Labrie，F.等人，(1991)，Mol.CellEndocrinol.，78:113-118)，因而就本文中的无限增殖的顶泌细胞系中活性雄激素和雌激素以及它们的相关受体的形成研究相关(responsible)转录物的表达。肝石蹄白備柳诚化学试剂TaqDNA聚合酶和分子标记III购自Roche，MannheimGermany。按照厂商的推荐使用TaqDNA聚合酶。从Sigma-Aldrich，Gillingham，區获得所有其他试剂。菌株(Styain)、质粒、培养某和培养条件9在所有克隆方法中将大肠杆菌(E.coli)菌株T0P10(Invitrogen，Carlsbad,CA，USA)用作宿主菌株。从Invitrogen获得预先消化的包含poly-T突出端的载体pCR4-T0P0⑧并且按照厂商说明书使用。在37t:下于旋转振荡器(250rpm)上，在补充有适当的选择压力(卡那霉素50g/ml)的LB培养基(10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/1NaCl)中培养细菌。细胞材料如上文中所述，培养作为无限增殖标志的长期增殖的顶泌腺细胞。为了克隆目的，在37t:下培养10天后收获细胞。誠棚白始成扁薛所使用的所有寡核苷酸都由Sigma-GenosysLtd，Pampisford，區合成。使用ABIPrism3100GeneticAnalyser，利用通用的M13正向和反向引物进行测序。质粒DNA的分离使用Qiagen(Crawley，區)mini-pr印试剂盒获得质粒DNA用于进行克隆和测序。从来源于无限增殖的顶泌腺细胞的cDNA克隆参与类固醇雄激素代谢的转录物的片段。使用来自Ambion，Huntingdon,UK的RNAqueousTM-4PCR试剂盒从细胞分离RNA。使用AmbionRETROscript试剂盒，用oligo(dt)进行第一链cDNA的合成。用于扩增的PCR反应程序是1个循环(120秒@95°C)，30个循环(30秒@95°C，30秒@60°C，45秒或60秒@72°0，1个循环(7分钟t72tO，使用T叫DNA聚合酶)。用于从各转录物克隆片段的引物列出于表5中。表5.用于克隆参与雄激素代谢的基因片段的引物。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>所有基因片断(其引物对设计成如表5所列)都能被检测。附图5展示了产生的所有PCR产物的1.2%琼脂糖凝胶。图5显示下列基因片段的表达1.类固醇硫酸酯酶；2.313羟基-A-5-类固醇脱氢酶1;3.羟基类固醇17P-脱氢酶3;4.羟基类固醇17P-脱氢酶5;5.羟基类固醇17P-脱氢酶7;6.5a还原酶I;7.CYP19A1芳香酶；8.雄激素受体；9.雌激素受体P;M.DNA标记III。然后将这些PCR产物克隆到准备用于测序的TOPO载体中。对各PCR产物进行测序以确认各克隆的片段的身份。下面给出基因测序的结果。类固醇硫酸酯tt的片段的序列GCAGCGCCTGGGGACCAGACAGACGCATGTGGAAGGGC3P羟某-A-5-类固醇脱氢酶l的片段的序列CCCGGCTACCTCTGGGCTACTGGTGTAGATGAAGACTGGCAAGGGC羟某类固醇17P-脱,氢酶3的片段的序列GAGGTGATGTTACAATGGATGAGGAAGGGC羟某类固醇17P-脱,氢酶5的片段的序列5a还原酶I的片段的序列TCCTACTGTGTAACAGGTCAGAATTNCANGGGCCYP19A1芳香酶的片段的序列TTTGCGCATGACCAAGTCCACGACAGGCAAGGGC友慰敫素受体的片段的序列14ATGGCAAACACCATGAGCCCCATCCAGAAGGGC隱m别本P白勺服白術llACAGCTCTCCAAGAAGGGC这些结果清楚地表明无限增殖的顶泌腺细胞系正在表达雄激素和雌激素合成所需的许多基因。附图6列出了可基于已显示在无限增殖的顶泌腺细胞系中表达的基因阐明的类固醇合成途径。此外，这些细胞还表达介导对此类雄激素和雌激素的产生的细胞内应答所必需的受体即雄激素受体和雌激素13受体。有趣地，未检测到用于雌激素a受体表达的转录物(数据未显示)。这与之前的研究相一致，所述研究证明，通过使用针对两者受体类型的免疫组织化学染色，可在腋窝皮肤切片的顶泌腺分泌细胞中检测到雌激素P受体，但未检测到雌激素a受体(Beier，K.等人(2005)Histochem.CellBiol.，123:61-65)。相同的研究还证明在顶泌腺分泌细胞中存在雄性受体。附图6中的数据证明，无限增殖的顶泌细胞系保持在体内和原代培养物中观察到的分泌顶泌腺细胞的许多生成类固醇的特征。该细胞系提供了用于研究顶泌腺中类固醇代谢和类固醇在调节腺的活性中的作用的优秀工具。此外，细胞系将用作非常重要的工具，所述工具用于估计化合物在通过干扰这些细胞中生成类固醇的途径而调节腺活性中的功效。无限增殖的顶泌腺细胞系中顶泌分泌活性的细胞标记。顶泌汗腺的主要功能是在对情绪剌激的直接反应中产生富含脂的分泌物，该分泌物通过毛囊的管道被递送至皮肤表面。分泌物是没有气味的，但经历细菌分解后，其导致腋15窝臭味的产生。顶泌腺的分泌功能与参与这些至关重要过程的许多蛋白质相关。ABCC11蛋白属于参与嘌呤和嘧啶核苷酸类似物例如cAMP和cGMP流出(efflux)的ATP-结合盒运载体的家族(Guo等人.，(2003)J.Biol.Chem.，278:29509-29514)。该蛋白质牵涉人的耵聍顶泌腺(ce進i丽sapocrinegland)中耳柜的分泌(Yoshiura等人.，(2006)Nat.Geh.，38:324-330)。人耳垢通常由干和湿类型组成。干耳垢通常存在于东亚人中，然而湿耳垢通常存在于其他群体。ABCCll基因中的SNP538G—A被认为负责耳垢类型的确定。具有A等位基因的细胞显示比具有G等位基因的细胞低的cGMP分泌活性。A等位基因频率显示全球从北至南以及从东至西的下降地理梯度。在世界范围内，在这些区域的各种族人群中保持干耳垢类型比例最高的是中国人和朝鲜人。腋窝气味水平的提高与湿型耳垢相关，这被认为是腋窝顶泌腺功能的直接结果。已显示在顶泌腺分泌中起着重要作用的另一种蛋白质是载脂蛋白D，Spielman，A.I.(1995)Experientia，50:40-47。已显示该蛋白质用作丰富的气味分子E-3-甲基_2_己酸(3M2H)的载体媒介物。研究已证明，在顶泌分泌中，3M2H通过与两个蛋白质顶分泌气味蛋白1和2(AS0B1和AS0B2)结合而被运送至皮肤表面。AS0B2蛋白后来被鉴定为载脂蛋白D(即oD)，已知的载体蛋白(也称为脂钙蛋白(lipocalin))的a^-微球蛋白超家族的成员(Zeng等人.，(1996)，93:6626-6630)。对于即oD的免疫反应性已被定位至腋窝组织切片的顶泌腺(Spielman等人，(1998)134，813-818)，这表明至少一种3M2H的糖蛋白载体定位在顶泌腺中。巨囊性病(Grosscysticdisease)分泌液是由几种糖蛋白(包括GCDFP-15)组成的来自乳腺的病理分泌物。GCDFP-15已被定位在顶泌汗腺化生被覆上皮乳腺囊肿(apocrinemetaplasticepitheliumliningbreastcyst)中禾口月夜窝、夕卜阴、目艮险禾口耳道(earcanal)的顶泌腺中(Mazoujian等人.，1983Am.J.Pathol.，110:105-112)。GCDFP-15与Gpl7/分泌型肌动蛋白结合蛋白(已在精囊、唾液腺和汗腺中鉴定的SABP/额外腮腺糖蛋白(EP-GP)(Autiero等人，(1991);Exp.CellRes.，197:268-271)相同，该蛋白质还与催乳素诱导型蛋白质(PIP)(Murphy等人.，(1987);J.Biol.Chem.，262:15236-15241)相同。GCDFP-15因而是顶泌上皮的特异性组织标记。锌…糖蛋白(ZAG)是最早从人血浆分离的(Burgi等人，(1961);J.BiolChem;236，1066-1074)，并且随后在肝、乳腺、胃肠道和汗腺的分泌型上皮细胞(Tada等人.，(1991)J.HistochemCytochem，39，1221-1226)中发现的43kDa可溶性糖蛋白。ZAG在某些恶性肿瘤中过表达，这样其可用作癌症标记(Diez-Itza等人.，(1993)，Eur.J.CancerA29，1256-1260;Hale等人，(2001)，CancerRes.，7,846-853)。ZAG的生物学功能大部分是未知的，但已显示其用作脂肪动员因子(lipidmobilizingfactor)(Todorov等人.，(1998)，CancerRes.，58,2353-2358)和新型脂肪因子(adipokine)，其可参与脂肪组织功能的局部调节(Bao，等人，(2005)FEBSLetters,579，41-47)。由于ABCCll、ApoD、GCDFP-15和锌-a-糖蛋白在顶泌腺的分泌和转运过程中起着重要作用，因而我们在无限增殖的顶泌细胞系中观察负责此类蛋白质的翻译的转录物的表达。用于克隆基因转录物片段的引物示于表6中。表6.用于克隆参与顶泌分泌过程的基因片段的引物。16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>所有基因片断(其引物对被设计成表6所示)都能被检测。附图7展示了产生的所有PCR产物的1.2%琼脂糖凝胶。附图7.展示顶泌标记的琼脂糖凝胶公开了下列产物分别示于第1至4泳道。l.ABCCll转运体；2.载脂蛋白D;3.锌-a-糖蛋白；4.GCDFP—15然后将这些PCR产物克隆到准备用于测序的TOPO载体中。对各PCR产物进行测序以确认各克隆的片段的身份。下面给出基因测序的结果。ABCC11的片段的序列AGCAGTTGGGGAATGTTG载脂蛋白D的片段的序列GCDFP-15的片段的序列锌-a-糖蛋白CCCCCGCAGGACACAGCCCCCTACTCCTGCCACAAGGGC无限增殖的顶泌细胞系表达与细胞分泌过程相关的ABCC11基因。测序数据确认了ABCCI1转运体基因的本体。该细胞系中基因的基因型是G(538G—A，被加亮并且在下面划线强调的)并且与湿耳垢类型和腋窝气味水平的提高相关。载脂蛋白D载体基因也被表达，这表明在细胞系中也正在制造气味运输所必需的机制。数据提供了该细胞系的顶泌表型和其在提供用于顶泌腺生物学的研究的强有力工具中的有用性的进一步证据。细胞化学组成-材料和方法分别在第7和14天收获无限增殖的顶泌细胞(第44代)。以1000rpm离心细胞5分钟，然后在PBS中清洗1次，再离心，然后在-S(TC下贮存以备分析。3M2H谷氨酰胺缀合物的分析使用10iil(N-甲基-N-叔-丁基二甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MTBSTFA)、1%18叔-丁基二甲基甲硅烷(TB匿S)禾PlOiU嘧啶和liU三乙胺，从冷冻的细胞沉淀提取3-甲基-2-己酸谷氨酰胺缀合物。在试剂中对样品进行衍生化作用。将混合物在7(TC下保持1小时。使用AgilentTechnologies6890/5973气相色谱仪/质谱选择数据系统和AgilentHP5-MS柱子(30mx0.25mmidxO.25ym薄膜)(具有经选择的离子监控)通过气相色谱分析3M2H谷氨酰胺衍生物，id表示内径。使用的温度程序是以10°C/分钟从7(TC至270°C。使用嵌入式软件自动计算峰面积。通过质谱测定法和已知标准的保留时间鉴定结构。剛酉享禾口爐、'琉白彌斤使用201氯仿从冷冻的细胞沉淀提取胆固醇和角鲨烯。然后将该提取物直接注射入GC(详情如上)并且使用AgilentHP5-MS柱(30mx0.25mmidxO.25ym薄膜)在完全扫描下对其进行分析。烘箱程序是以1(TC/分钟从7(TC至27(rC。通过质谱测定法和已知标准的保留时间鉴定结构。,月旨隨使用201氯仿从冷冻的细胞沉淀提取短链脂肪酸。然后将该提取物直接注射入GC(详情如上)并且使用HP-Innowax柱子(30mx0.25mmidx0.25ym薄膜)利用选择离子监控对其进行分析。烘箱程序是以5t:/分钟从7(rC至24(rC。通过质谱测定法和已知标准的保留时间鉴定结构。3M2H谷氨酰胺缀合物的相对水平示于附图8中。在培养7天和14天后收获的顶泌细胞中胆固醇的相对水平示于附图9中。在培养7天和14天后收获的顶泌细胞中角鲨烯的相对水平示于附图10中。短链脂肪酸的相对水平示于附图11中。还在14天的样品中检测到C16/18脂肪酸。本文中概述的显示各种挥发性脂肪酸的数据进一步证明，无限增殖的细胞系成功地模拟了顶泌腺的功能。抑制剂的研究有臭味的前体化合物的产生和细胞生长的增殖预期受到化合物(已知所述化合物干扰代谢雄激素的酶)的作用的调控。可通过向培养基加入已知干扰代谢雄激素的酶的拮抗剂或直接使用雄激素受体来使细胞的增殖和有臭味的前体化合物的产生减弱。此类化合物预期在培养物中和在存在于腋窝皮肤中的顶泌腺中减少气味前体分子的合成和分泌。此类化合物包括但不限于17a-取代的节基雌二醇三环香豆素氨基磺酸盐雌酮-3-0-氨基磺酸盐三环噁庚氨基磺酸盐2-甲氧基雌酮-3-0-氨基磺酸盐取代的色烯酮(chromenone)氨基磺酸盐17a-节基(或4'_叔_丁基节基)雌_1，3，5(10)-三烯]1713-(N-烷基氨甲酰基)_雌-1，3，5(10)-三亚乙基四胺-3_0_氨基磺酸盐曲洛司坦环丙氯地孕酮(Cyanoketone)醋酸环丙氯地孕酮(Cyproteroneacetate)炔诺孕酮(Norethidrone)炔诺酮噻唑烷二酮类16-(溴烷基)-雌二醇黄酮类异黄酮类木脂素类(Lignans)三氟甲基乙炔secoestradiol雌二醇的6P-(thiah印tanamide)衍生物在第17位上包含螺旋_Y_内酯的雌酮7a-硫代烷基和7a-硫代芳基螺内酯的衍生物N-丁基-N-甲基-ll-(3'-羟基_21'，17'-羧内酯_19'_去甲_17'a-孕甾-l'，3'，5'(10')-三烯-7'a-基)-^^一酰胺(undecanamide)1，4-雄烯二醇_1，6，17-三酮雄酮33-取代的衍生物4-氮杂类固醇(MK386)6-氮杂甾体17P_氨甲酰三芳基酯(carboxamidetriaryl)8-氯-4-甲基-l，2，3，4，4a，5，6，10b-八氢-苯并[f]喹啉-3(2H)-酮(LY191704)6-[4-(N，N-二异丙基氨甲酰基)苯基]_N_甲基-喹啉_2_酮5)苯并[c]喹嗪-3-酮表儿茶精-3-没食子酸酯表没食子儿茶精-3-没食子酸酯苏拉明(Suramin)锌壬二酸6-[4-(N，N-二异丙基氨甲酰基)苯基]-1H-喹啉_2_酮44-[3-[5-苄基-8-(2_甲基)丙基_10，11-二氢二苯[b，f]氮杂萆_2_]羧氨基]苯氧基]丁酸妥罗雄脲(Turosteride)MK-434二氢非那雄胺醋酸氯地孕酮(chlormadinone)TZP-4238依立雄胺(SK&F105657，0N0-9302)17a-雌二醇17-(5'-异噁唑基)雄-4，16-二烯-3-酮N-(1，1，1，3，3，3-六氟苯基_丙基)_3_氧代_4_氮杂_5a-雄-1-烯-17P-羧20酰胺(PNU157706)度他雄胺异乙诺酮(TSAA-291:16P-乙基-17P羟基_4_雌_3_酮)19-去甲-10-偶氮甾醇类具有与甾体D-环连接的肟基的基于黄体酮的类固醇类苯喹唑啉锯叶棕榈提取物(Serenoar印ensextract)哌米松Artocarpusincisus茜素姜黄素盐酸异丙嗪衍生物肉豆蔻酸Y-亚麻酸4-[3-[3-[双(4-异丁基苯基)_甲基氨基]苯甲酰基]_1H_喷哚_1_基]丁酸(FK143)氟他米特螺内酯已显示许多化合物减少皮肤中的细胞(包括来源于表皮附属物例如皮脂腺的那些细胞)的增殖。此类化合物，当与顶泌细胞接触时，预期在培养物中和在存在于腋窝皮肤中的顶泌腺中减少气味前体分子的合成和分泌。此类化合物包括但不限于13-顺-视黄酸视黄酸通过透射电子显微镜(TEM)进行的人顶泌细胞系ASG5的超微结构分析样品制备如之前所描述的，将传代数47的ASG5细胞在37。C下于95%空气/5%C02的湿润的培养箱中培养于MEGM中。分别在温育3和14天后收获细胞。在固定之前，将细胞在磷酸盐缓冲盐水pH7.5中清洗两次。透射电子显微镜术将经清洗的细胞培养物在室温下于3%的0.1M二甲砷酸盐缓冲液pH7.4中的戊二醛中固定l小时。将样品在O.1M二甲砷酸盐缓冲液pH7.4中清洗3次，每次5分钟。在初期固定后，将样品在室温下于1%的0.1M二甲砷酸盐缓冲液pH7.4中的四氧化锇中固定1小时。将样品在0.1M二甲砷酸盐缓冲液pH7.4中再清洗3次，每次5分钟。然后通过乙醇的系列梯度对样品进行脱水。将细胞包埋在Luft'sEpon树脂中并且在6(TC下聚合48小时。在设置成产生大约120nm厚切片的Reichert"UltracutS"超薄切片机上对包埋块进行切片。将切片捞在200目六角形的薄板(thinbar)铜网上。在LeicaEM染色机上，将切片在醋酸铀中染色，然后进行硝酸铅染色。在于120kV下运行的PhilipsCM120透射电子显微镜中检查经染色的切片。将图像数字化记录为.tif文件，在本文中显示为图12至15(对于3天大小的培养细胞)和图16及17(对于14天大小的培养细胞)。结果图12、13和16中显示的细胞展示培养中的上皮细胞典型的圆形或"鹅卵石样"外观。根据大量鉴定为"M"的微绒毛(图12U3、14、16和17)和称为"A"的顶小泡(即icalbleb)(图12、15和16)在管腔膜上的存在，结合大量称为"S"的分泌粒(图12至17)在整个细胞质中的存在，证明了细胞的分泌性质。顶端细胞质(apicalcytoplasm)的小部分即微绒毛"M"和顶小泡"A"的挤压断离构成了顶分泌过程(Montagna等人.(1953)Histologyandcytochemistryofhumanskin.V.Axillaryapocrinesweatglands.Am.J.Anat.，92:451-470)。所有细胞包含大量称为"S"的分泌粒(图12至17)，尽管不可會g按照(Bell(1974)Theult:rastructureofhumanaxillary即ocrineglandsafter印in印hrineinjection.J.Invest.Dermatol.，63:147-159)来区分I型和II型颗粒。颗粒包含高电子_不透明颗粒，从而推测包含小脂滴。在大多数细胞中观察到称为"V"的许多"空"囊泡(图12、13、14、16和17)。这可能是固定过程使囊泡的内含物丢失导致的结果。此类囊泡可能参与分泌过程。图13和16中的细胞在外观上是相当扁平的并且清楚地显示称为"NI"的核仁。在来自3和14天大小的ASG5培养物的所有细胞中，观察到顶小泡"A"、管腔微绒毛"M"和大量分泌粒"S"，确认了这些细胞展示典型的活性顶分泌形态学。这些发现进一步证明ASG5细胞系的顶泌性质和提供了该细胞系用作人腋窝顶泌汗腺的功能代表性细胞模型的有效性的额外证据。2权利要求展示长期增殖的顶泌细胞系。2.根据权利要求l的细胞系，其来源于人顶泌腺。3.根据权利要求l的细胞系，其展示顶泌腺的特征性质。4.根据前述权利要求任一项的细胞系，其能够无限增殖。5.保藏号为ECACC07021301的细胞系。6.获得展示长期增殖的培养细胞系的方法，其包括下列步骤从初生组织分离顶泌细胞，在第一培养基中培养所分离的细胞，从所述第一培养基中取出未附着的细胞，以及将所述未附着的细胞转移至包含有效浓度佛波酯的第二培养基中，从而建立展示长期增殖能力的顶泌细胞系。7.权利要求1至5的任一项的顶泌细胞系或根据权利要求6产生的顶泌细胞系用于诊断性、治疗性或化妆品制剂的用途。8.权利要求1至5的任一项的顶泌细胞系或根据权利要求6产生的顶泌细胞系用于体外估计在对皮肤局部施用时，材料是否是除臭剂的用途。9.权利要求1至5的任一项的顶泌细胞系或根据权利要求6产生的顶泌细胞系用于检查人顶泌腺的生理学或病理生理学的用途。10.权利要求1至5的任一项的顶泌细胞系或根据权利要求6产生的顶泌细胞系用于测试化合物或试剂抵抗疾病的用途。11.权利要求1至5的任一项的顶泌细胞系或根据权利要求6产生的顶泌细胞系用于制备来源于所述细胞的产品的用途。全文摘要顶泌细胞系。通过下列步骤获得顶泌细胞系从初生组织分离顶泌细胞，将所分离的细胞培养在第一培养基中，从所述第一培养基中取出未附着的细胞，并将所述未附着的细胞转移至含有有效浓度佛波酯的第二培养基中，从而建立展示长期增殖能力的顶泌细胞系，其在培养许多代后是无限增殖的标志。文档编号C12N5/071GK101743307SQ200880009733公开日2010年6月16日申请日期2008年2月22日优先权日2007年3月26日发明者D·F·麦唐纳,G·T·E·基利,J·S·伯里,M·哈克,R·L·埃文斯申请人:荷兰联合利华有限公司