专利名称::去除含有非所需核酸的溶液的污染的方法去除含有非所需核酸的溶液的污染的方法
技术领域:
:本发明涉及对含有非所需核酸的溶液去除污染的方法。本发明还涉及这种处理过的溶液的用途。分子生物学的进步使得有可能对核酸进行操作。扩增方法由此变成了必不可少的工具,这意味着更大量的核酸可以在相对短的时间内从极少量的核酸产生。这类技术的主要缺陷在于在临床检测中会扩增非所需的核酸,产生不正确的结果或者甚至产生假阳性。这被称为污染。这样的污染可有多种来源实验台的清洁差,人员,环境,设备及吸量管装置,或未灭菌的样本。已开发了一定数量的旨在限制这类污染的推荐方法。其都是预防性方法,包括例如操作样本(特别是灭菌技术)或实验室设备(物理限定的工作区域,通风橱的使用,外部与内部的压力梯度,从而气流可以所需方向恒定抽空等等)。污染还可来自由预先扩增产生的扩增子或者样本之间的交叉污染。其他不可忽视的污染来源存在于用于扩增反应的起始材料(酶,试剂)。因此,Corless等人讨论了在实时PCR反应中由污染的taq聚合酶引起的对测定16SRNA的敏感性问题(JClinMicrobio1,38(5),1747-1752(2000))。对扩增所必需的酶污染进行纠正的第一种方式在于酶去除污染方法。因此,专利US-A-5418149描述了使用能够降解来自酶生产细胞的核酸的尿嘧啶-DNA-糖基化酶的方法。该技术应用了所需蛋白的过表达,在这种情况下,其是在尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UNG)和脱氧尿苷三磷酸酶(dUTPase)缺陷的大肠杆菌细胞中的聚合酶。由于UNG缺乏,所述细胞不能够清除掺入的脱氧尿嘧啶碱基。由于dUTPase的缺乏,细胞增加了其脱氧尿苷库。因此,所述培养介质可以允许产生所需的蛋白(聚合酶)并将脱氧尿苷掺入所述核酸。然后使用标准纯化技术对所述合成蛋白进行纯化并采用能够将残留核酸的尿嘧啶残基片段化的尿嘧啶-DNA-糖基化酶处理。所述糖基化酶随后通过加热灭活以防止在扩增反应中对靶DNA的破坏。该方法特异于制备重组蛋白,其主要不足在于该方法的用途。此外,去除污染局限于含有尿嘧啶的核酸。再者,其他可能的不足在于加热处理仅诱导部分尿嘧啶-DNA-糖基化酶失活。与所述蛋白接触的靶DNA因此有可能被破坏。由Ashkenas等人所述的其他酶学方法(Biotechniques;Jul2005;39(1):69-73)包括对含有扩增所必需的全部元件的溶液去除污染。在这种情况下,限制酶的混合物被用于RT-PCR。那些酶降解存在于含有被扩增靶RNA的所述扩增反应介质中的双链DNA。当逆转录发生时,其随后通过加热而失活。也描述了该方法用于PCR应用的替代方法,即在双链耙DNA存在的情况,但仅限于使用一类限制酶(II型RE)。然而,限制酶的使用使得其不足在于仅切割双链核酸,还必需具有识别位点。出于这一原因,以单链和/或具有少数或没有此类位点的形式存在的污染物就不能被清除。其他的酶学去除污染方法包括在与靶核酸进行接触之前就从溶液中清除非所需的核酸。专利申请WO-A-99/07887描述了在与所述靶核酸接触之前在反应介质中含有的能降解双链核酸的不耐热DNAse的应用。该酶随后通过加热失活。该技术的主要不足在于这样的酶不能降解以RNA、单链DNA或RNA/DNA异源双链形式存在的污染物。此外,在反应介质中通过加热使酶失活也需使用热稳定的聚合酶。现有技术还描述了非酶学方法。因此,Mohammadi等人(JClinMicrobiol,Oct2003;41(10):4796-8)描述了包含对提取试剂进行柱过滤以及任选在扩增之前由限制酶Sau3AI消化PCR试剂的技术。过滤技术的不足在于事实上这样的技术还不能够在不改变浓度或性质的条件下应用于复杂介质。此外,这样的补充过滤步骤有可能本身就成为污染源。专利申请WO-A-94/12515描述了由光反应化合物处理含有Taq聚合酶以及潜在污染核酸的溶液的方法。所述光反应化合物例如呋喃香豆素衍生物是通过暴露于紫外线照射而活化的。除了难以使用,该技术的主要不足在于照射对蛋白造成的有害影响。此外,该方法保持了低效率,因为所述核酸的随机降解有可能产生也可被扩增的片段。由Chang等人(RNA,May2005;11(5):831-6)描述的其他非酶学方法使用钴络合物来抑制翻译。该络合物能够水解DNA和RNA的磷酸二酯键。该技术的主要不足在于核酸的不完全降解以及缓慢的去除污染反应(24小时)。为了纯化被核酸污染的生物分子,在专利申请WO-A-2006/034009中还描述了金属络合物。因此,由与铜原子结合的两个菲咯啉分子(双(i,io-菲咯啉/Cu)所构成的片段化络合物可用于纯化含有taq聚合酶的溶液。为了去除污染核酸和/或片段化分子可使用标准层析技术随后纯化所述溶液。该方法的主要不足在于存在纯化步骤,使得其应用困难并增加了新污染的风险。专利EP-B-0646180描述了使用金属螯合物失活核苷酸序列的方法。片段化络合物如双(l,lO-菲咯啉)/Cu被用于在扩增步骤之后对含有全部存在的核酸的溶液去除污染。这可以预防由之前扩增反应所产生的扩增子引起的新样本的污染。该文件还描述了使用片段化分子来去除生物产物制品的污染。在第一种使用的情况下,该方法的主要不足在于其不能降解全部的污染核酸,仅能够降解由之前扩增反应所产生的扩增子。在第二种情况下,其主要不足在于存在纯化步骤(超滤,沉淀,层析),使得其应用困难并增加了新污染的风险。考虑到现有技术的不足,本发明人提出了新的方法,该方法可简单快速地对含有非所需核酸的溶液去除污染。在此,本发明在第一方面提供了去除溶液中存在的任意核酸的污染的方法,所述方法包括以下步骤*将所述溶液与称作片段化分子的具有通过片段化降解核酸的性质的至少一类分子作用充分的时间,直到所述称作污染核酸的核酸完全降解;*终止所述片段化分子的活性。本发明的一个优势在于这种去除污染方法不需要纯化步骤清除片段化分子。被处理的核酸是以单链或双链形式存在的RNA或DNA以及RNA/DNA异源双链。这一方法对污染起始材料例如来自天然来源例如细菌的酶特别有用。这些酶因此被得自所述细菌的天然核酸高度污染。另一方面,本发明提供了去除含有污染核酸及感兴趣核酸的溶液的污染的方法,包括以下步骤*将所述溶液与称作片段化分子的具有通过片段化降解污染核酸的性质的至少一类分子作用充分的时间,直到所述污染核酸完全降解,保留了感兴趣核酸;终止所述片段化分子的活性。所述污染核酸可以是人类基因组DNA,感兴趣核酸可以是以极少量存在于混合物中的病毒或细菌核酸。所述感兴趣核酸可以通过片段化分子的作用而受到保护。例如,其可由外包膜(衣壳,细菌细胞壁等等)天然保护,而所述污染核酸则否。在本发明的一个有利的实施方案中,在终止所述片段化分子的活性之后,该方法还包括含有扩增反应的补充步骤。优选地,本发明所述去除污染方法特征在于所使用的片段化分子具有以随机方式水解所述污染核酸的磷酸二酯键的性质。如一个实施方案所述,所述片段化分子是由形成双(1,10-菲咯啉)/金属络合物的结合于金属原子的两个UO-菲咯啉分子所构成的络合物。优选地,所述金属是过渡金属,例如铜,钌,镍,铁,锌,铑,钴或锰。优选地,所述片段化分子的两个菲咯啉核通过连接臂相互连接形成了ClipPhen分子。ClipPhen分子已在文献中广泛描述。可有多种连接臂连接两个菲咯啉核。优选地,两个菲咯啉核之间的连接臂是由三个连续碳原子组成的链构成的,其中在中间位置的碳原子是取代的且其中每个末端碳原子都通过氧原子例如丝氨醇连接于菲咯啉核。优选地,中间位置的碳原子是由-NH2或-皿-(:0-0^取代的且每个末端碳原子都通过所述核上的2位或3位的氧原子连接于菲咯啉核。许多其他的连接也是可能的,例如二氨基-环己垸(ChemistryLetters,vol33,No.6,p684-985,Hayashi等人)或乙二醇,丙二醇或戊二醇(Synlett2001,No.lO,1629-1631,Boldron等人)。与金属相连的ClipPhen分子的片段化活性是本领域技术人员公知的(ChemicalReview,1993,93,2295-2316,DSigman等人;JChemSoc1961,2007-2019,James等人)。出于改善其水解性质的目的,该分子已在众多研究中进行了检测。其具有降解全部核酸即以单链或双链形式存在的DNA和RNA以及RNA/DNA异源双链的优势。因此,与双(l,lO-菲咯啉)/金属络合物相比,2-ClipPhen/金属((1,3-双(1,10-菲咯啉-2-基氧基)丙-2-胺/金属)禾卩3-ClipPhen/金属(1,3-双(1,10-菲咯啉-3-基氧基)丙-2-胺/金属)表现出了大大增强的核酸酶活性(InorganicChemistry1998,3486-3489,Pitie等人;Chemcommun1998,2597-2598,Pitie等人;EurJInorgChem2003,528-540,Pitie等人以及BioconjugateChemistry2000,11,892-900,PitieM等人)。类似地,与铜络合的ClipPhen分子可高效并以随机方式水解DNA或RNA的磷酸二酯键。其可与铜原子络合从而产生具有氧化态I或II的络合物,如James等人在JChemSoc1961,2007-2019出版物中所示。分子2-ClipPhen-Cu和3-ClipPhen-Cu如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>因此,本发明还涉及去除溶液中的存在的任意核酸的污染的方法,所述方法包括将所述溶液与ClipPhen/金属分子作用充分的时间,直到所述污染核酸完全降解。又一方面,本发明包含去除含有污染核酸和感兴趣核酸的溶液的污染的方法,包括将所述溶液与ClipPhen/金属分子作用充分的时间,直到所述污染核酸完全降解,保留了感兴趣的核酸。如本发明的一个实施方案所述,可通过加入过量的有机还原剂终止所述片段化分子的片段化活性。当所述有机还原剂由硫醇构成时,片段化分子与终止所述反应的有机还原剂之间的比例大于1比100,优选大于1比1000。本实施方案的一大优点在于所述片段化分子是原位失活的。这些分子因此并不需要从溶液中移出。后者可在各种应用例如扩增中使用。因此,根据存在有机还原剂的浓度,所述片段化分子可被活化或失活。如本发明的另一实施方案所述,可通过加入对金属比ClipPhen具有更高亲和性的络合剂(CA)例如EDTA或任意其他络合剂终止所述片段化分子的片段化活性,并替换平衡ClipPhen-金属+CA—ClipPhen+金属画CA在本发明的一个特别实施方案中,所述片段化分子是结合过氧化氢H202的I型铜络合物,并任选具有其他还原剂,优选为有机还原剂。优选地,所述片段化分子是I型ClipPhen/Cu分子。在I型铜络合物的情况下,所述核酸酶活性如以下两个阶段进行a)阳性电荷的铜络合物与所述核酸形成络合物;b)在一系列反应之后,通过与H202形成Cu-氧或Cu-OH中间体氧化所述核酸,从而导致核酸切割。如另一实施方案所述,所述分子是结合其他还原剂优选有机还原剂的II型铜络合物。在这种情况下,在空气与还原剂的作用下可在原位产生过氧化氢。再优选地,所述片段化分子是II型ClipPhen/Cu分子。当其他有机还原剂是羧酸或羧酸衍生物时,所述片段化分子与有机还原剂之间的比例范围为1比1至1比100。至于前述实施方案的功能,所述有机还原剂构为*硫醇如二硫苏糖醇(DTT),硫代酸如巯基丙酸;或*羧酸;或*羧酸的衍生物如抗坏血酸;或*磷化氢如三羧乙基磷化氢(TCEP)。在一个特别实施方案中,所述片段化分子和/或还原剂被固定化于固相支持物上。这类固相支持物可以是乳胶颗粒(任选磁性的),玻璃(CPG),硅石,聚苯乙烯,琼脂糖,琼脂糖(sepharose),尼龙等等。其还可以是滤器,膜,条或薄膜。当其上固定有片段化分子和/或还原剂的固相支持物从溶液中移出时,所述片段化分子的片段化活性也可被终止。所述片段化分子还可通过共价键或通过吸附于被考虑的支持物上得以固定。有许多涉及支持试剂的参考文献业已存在;可特别参考Laurent等人的TetrahedronLetters45,8883-8887,2004。本发明与现有技术相比的又一优势在于核酸所经历反应的快速性。对浓度范围为lnM至lOOnM的ClipPhen/金属分子而言,处理时间的范围为5分钟至60分钟,优选范围为10分钟至30分钟。在本发明的优选方式中,所述溶液含有除核酸外用于扩增反应必需的全部组分,即靶,扩增引物以及检测探针。本发明还涉及如本发明所述处理的溶液的用途,在有机还原剂存在的条件下将所述溶液混合于含有拟进行扩增的靶核酸以及特异于所述靶核酸的扩增引物和检测探针的生物样本,从而产生能够终止所述片段化分子作用的过量有机还原剂。终止所述片段化分子作用的有机还原剂可以与加入活化所述片段化分子的核酸反应的其他有机还原剂相同或不同。定义术语"核酸"是指至少2个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的串联。所述核酸可以是天然或合成的,寡核苷酸,多核苷酸,核酸片段,基闵会日DNA,核糖休RNA,信使RNA,转运RNA,或通过酶扩增技术获得的核酸,例如*PCR(聚合酶链反应),见于专利USA-4683195,USA-4683202以及USA-4800159,及其衍生RT-PCR(逆转录PCR),特别是以一步形式描述的,例如见于专利EP-B-0589272;*LCR(连接酶链反应),例如描述于专利申请EP-A-0201184;*RCR(RepairChainReaction),描述于专利申请WO-A-90/01069;*3SR(自我持续序列复制),参见专利申请WO-A-卯/06995;*NASBA(基于核酸序列的扩增),参见专利申请WO-A-91/02818;以及*TMA(转录介导的扩增),参见专利US-A-5399491。我们应该使用术语"扩增子"来指代通过酶扩增技术产生的核酸。术语"任意核酸"是指以单链或双链形式的RNA或DNA序列以及RNA/DNA异源双链。术语"终止所述片段化分子的活性"是指*加入过量的有机还原剂;或參加入络合剂。术语"降解"是指降解或片段化至少90%的污染核酸。优选地,所述降解被称为"完全的",其意味着对DNA或RNA的降解,优选为通过水解磷酸二酯键的降解,导致形成了"不可扩增的"核酸序列。术语"不可扩增的"核酸意味着在存在有至少10个核苷酸优选大小的引物条件下所述核酸不能被扩增。这些"不可扩增的"核酸大小因此小于20个核苷酸,优选为小于10个核苷酸。术语"溶液"是指同质或异质水溶液。其可以是作为混合物或其他的含有酶,有机分子(三磷酸核苷酸,糖,糖类,多糖,小有机分子等),无机分子(盐等)的复合溶液。所述溶液还可含有固相支持物,例如从乳胶,任选是磁性的乳胶,玻璃(CPG),二氧化硅,聚苯乙烯,琼脂糖,琼脂糖,尼龙等形成的颗粒。其还可以是滤器,薄膜,膜或条。所述溶液还可以由与固相表面例如塑料管(Eppendorf类型)接触的溶液组成,从而允许对所述表面去除污染。附图与实施例描述了特定的实施方案,且不应被理解为对本发明范围的限制。图1:对用ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物在37°C作用1小时的1080碱基转录物(野生型沙门氏菌)降解情况的生物分析仪研究(Agilent,RNA6000PicoKit,USA)。在柱2,3,4,6和7中31秒的暗条带对应于所述1080碱基转录物。*柱1:核苷酸大小规模。注射入一系列增加的RNA大小,允许对所分析核酸的大小进行定量并计算,作为在该时间其通过生物分析仪检测器前方的时间函数。在垂直轴上的测定单位是秒。通过时间与所述核酸质量的转化是通过生物分析仪软件实现的。*柱2:在存在5iaM(微摩)ClipPhen-Cu条件下的5nM(纳摩)转录物。*柱3:在存在500nM的ClipPhen-Cu条件下的5nM转录物。*柱4:在存在50nM的ClipPhen-Cu条件下的5nM转录物。*柱5:加入500pM抗坏血酸的上述柱2。*柱6:加入50inM抗坏血酸的上述柱3。*柱7:加入5^iM抗坏血酸的上述柱4。图2:通过增加DTT浓度(0-16mM)对核酸片段化的抑制。曲线A对应于OmM的DTT。曲线B对应于lmM的DTT。曲线C对应于3mM的DTT。曲线D对应于5mM的DTT。曲线E对应于10mM的DTT。曲线F对应于16mM的DTT。曲线G对应于对照OmM的DTT和OmM的抗坏血酸。图3:在所述混合物中作为DTT浓度函数的模型荧光寡核苷酸片段化率(相对荧光单位(RFU)每分钟)。图4:ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物对含有核酸的水溶液(100细胞当量(叫uivalent)/ul蜡状芽孢杆菌(5Ce^w)的总RNA)的效果。曲线A对应于未经任何处理的扩增对照(+对照)。曲线B对应于50pMClipPhen-Cu/500pM抗坏血酸混合物,通过加入17rnMDTT并保温30分钟,其活性被立即抑制。曲线C对应于保温30分钟的50pMClipPhen-Cu/500pM抗坏血酸混合物,在这一时间之后用DTT终止片段化。图5:通过ClipPhen-Cu(与或不与抗坏血酸)对DNA或单链RNA片段化的比较。曲线被标准化为l。曲线a:用于ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物作用的荧光寡核苷酸(DNA)No16025。曲线b:用于ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物作用的荧光寡核苷酸(RNA)No16027。曲线c:实验a的阴性对照用于ClipPhen-Cu混合物单独作用的荧光寡核苷酸(DNA)No16025。曲线d:实验b的阴性对照用于ClipPhen-Cu混合物单独作用的荧光寡核苷酸(RNA)No16027。图6:ClipPhen-Cu混合物(与或不与抗坏血酸)对单链或双链DNA片段化的比较。所述曲线代表对应于每分钟荧光升高的片段化速率(RFU/分)。曲线a:用于ClipPhen-Cu混合物作用的荧光寡核苷酸(DNA)No16025/互补DNA耙(No16026)双链(阴性对照)。曲线b:用于ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物作用的荧光寡核苷酸(DNA)No16025/互补DNA耙(No16026)双链。曲线c:用于ClipPhen-Cu混合物作用的荧光寡核苷酸(DNA)No16025(阴性对照)。曲线d:用于ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物作用的荧光寡核苷酸(DNA)No16025。图7:ClipPhen-Cu(与或不与抗坏血酸)对DNA或RNA双链或RNA/DNA异源双链的片段化比较。曲线被标准化为l。曲线a:用于ClipPhen-Cu混合物作用的荧光寡核苷酸(DNA)No16025/互补DNA耙(No16026)双链(阴性对照)。曲线b:用于ClipPhen-Cu混合物作用的荧光寡核苷酸(RNA)No16027/互补RNA耙(No16028)双链(阴性对照)。曲线c:用于ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物作用的荧光寡核苷酸(DNA)No16025/互补DNA耙(No16026)双链。曲线d:用于ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物作用的荧光寡核苷(RNA)No16027/互补RNA耙(No16028)双链。曲线e:用于ClipPhen-Cu混合物作用的荧光寡核苷酸(RNA)No16027/互补DNA耙(No16026)异源双链(阴性对照)。曲线f:用于ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物作用的荧光寡核苷酸(RNA)No16027/互补DNA革巴(No16026)异源双链。图8:在存在5mM抗坏血酸的条件下,由固定于Tentagel珠的ClipPhen-Cu切割16sRNA(13ng/uL)的生物分析仪(Agilent)观察。电泳图A:在水中降解之前的RNA靶。电泳图B:在存在抗坏血酸条件下降解之前的RNA靶。电泳图C:在存在抗坏血酸和固定于Tentagel树脂的ClipPhen-Cu条件下降解的RNA耙(1个Tentagel珠,30分钟)。实施例1:ClipPhen-Cu分子对转录物的水解及抗坏血酸的起始物作用目的本实施例证明了ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物对模型核酸(沙门氏菌RNA转录物1080碱基)的片段化作用。其还证明了抗坏血酸对片段化反应起始的作用。将所述转录物用于多种浓度的ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物进行作用。将对照也用于在缺乏抗坏血酸条件下的ClipPhen-Cu作用。随后使用Agilent的生物分析仪对所述片段进行分析(图1)。操作程序转录物溶液(沙门氏菌野生型,1080碱基)是由2pl的于水中lpM浓度的转录物和18|ul的pH7.2的80mM(毫摩尔)磷酸缓冲液、20mMMgCl2、100mMNaCl组成的。将该溶液加热至70°C保持2分钟然后投入冰中。然后,向5nl这一溶液中加入1^1ClipPhen-Cu(500,50和5pM)和4|nl上述使用的缓冲液。所得为溶液2并在37°C放置1小时。然后,取5nl溶液2并加入42.5^1缓冲液和2.5nl新配制的抗坏血酸溶液(对ClipPhen-Cu而言为100eq)或在对照情况下为水。由此,分别制备含有5nM转录物,(5pM,500nM和50nM)CIipPhen-Cu以及(500,50和5]liM)抗坏血酸的一系列管或在对照情况下为水。立即将lpl所述6种溶液注射在RNAPico芯片(参考号码为5067-1512的商业试剂盒,Agilent,USA,用于Agilent,USA的生物分析仪系统)上从而观察片段化产物。结果与结论在柱5到7中,对于所述转录物的片段化作用可根据出现的低于20个核苷酸大小的各种条带(在20秒时右侧箭头)来观察。因此,经过ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物处理的转录物部分或全部降解,作为ClipPhen-Cu浓度的函数。在5nM至0.5jxM之间,可观察到初始条带消失。采用5nM转录物,5一ClipPhen-Cu和500nM抗坏血酸,获得完全降解全部扩增子的反应时间是30-60分钟的量级。全部降解所述转录物所需的ClipPhen-Cu数量为微摩尔量级(柱5)。相反,未用抗坏血酸(柱2)进行的相同实验清楚显示完整的条带。这因此证明了当抗坏血酸未加入时(过量量级为l-100eq),所述ClipPhen-Cu混合物没有活性。实施例2:通过还原剂抑制ClipPhen-Cu分子目的本实施例旨在表明通过ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物对核酸的降解可以被加入过量的还原剂如DTT完全抑制。将模型荧光寡核苷酸(由Eurogentec(Liege,比利时)合成的序列16025:与ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物的作用。通过片段化,其允许在520nm出现荧光,因为所述FAM荧光团物理上与TARMA荧光淬灭剂有一定距离。荧光的出现是使用荧光计(NucliSenEasyQ分析仪,NasbaDiagnostic,BioMerieux,Boxtel(NL))随时间进行测量的。所述实验是针对固定浓度的ClipPhen/抗坏血酸使用增加浓度的DTT来进行的,以测定通过弱化释放的荧光而由DTT提供的抑制。操作程序将含有下列元件的一系列管在37°C保温5分钟*荧光寡核苷酸16025,10nM(1)Lil至200nM);*DTT(以在终体积中制备从1到16mM—系列浓度的lnl);以及*17pl磷酸缓冲液,80mM,pH7.2,MgCl220mM,NaCl100mM。然后,加入如下制备的lplClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物临时制备的于50/50DMF/水中的200pMClipPhen和200pMCuCl2以及于水中的20rnM抗坏血酸(来自10mMClipPhen和1M抗坏血酸的浓縮溶液)。最后,所述20nl溶液含有10nM荧光寡核苷酸,10pMCIipPhen+Cu2+,lmM抗坏血酸和0/1/3/5/10/16mMDTT。对照是不使用抗坏血酸和不使用ClipPhen-Cu制备的。然后,将所释放的荧光测定60分钟(图2)。条件如下exc/em滤器(485/518nm),时间间隔(l分钟),积分时间(100ms)。使用所获得的曲线,对所述反应前两分钟的片段化反应速率进行了测定,还绘制了图,即描述作为DTT浓度函数的片段化速率的图3。结果与结论可以看出对增加的DTT浓度而言,从lOmM开始不再出现荧光(图2和图3)。这意味着所述ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物的活性完全被过量的还原剂终止了。这个实验证明了向核酸/ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物中加入10-16mM的DTT能够终止所述反应并使得该混合物符合于扩增反应的未来应用。实施例3:ClipPhen在水溶液中的去除污染作用目的以200细胞当量/ul量的蜡状芽孢杆菌总RNA混合物污染的水溶液被用于与ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物(50nM/500nM)作用30分钟去除污染。通过以10mM的量加入DTT使得ClipPhen-Cu的活性随后被完全终止。然后,进行了NASBA扩增反应(来自于bioMerieux的NuclisensBasic试剂盒V2,参考号码60079136,Boxtel(NL))从而评价片段化效率并证明了可扩增核酸的缺乏。在对这一混合物进行扩增之前无需进行纯化。制备了对照以测定此后的任意抑制作用,其中ClipPhen-Cu活性从tO就被抑制。至此,DTT是在加入靶RNA之前在充分的条件下(10mM)加入的并保温30分钟。操作程序对富含总RNA的水溶液通过ClbPhen-Cu/抗坏血酸混合物去除污染lOplClipPhen-Cu(250nM于水/DMF,50/50),20|il水和10^1浓度为2.5mM于水中的抗坏血酸被加入蜡状芽孢杆菌RNA的总RNA溶液中(以2000细胞当量/ul水的5^1)。将该拟去除污染溶液在环境温度下保温30分钟。终止ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物的片段化活性向前述溶液加入5inl173.7mMDTT(终DTT浓度17.3mM)从而终止水解反应并灭活ClipPhen。获得溶液A。对照表明ClipPhen-Cu/抗坏血酸/DTT混合物没有片段化活性且如果通过加入DTT立即终止所述片段化活性则不抑制NASBA同时进行了对照实验,其中蜡状芽孢杆菌RNA的总RNA溶液在存在5|nl173.7mMDTT,10plClipPhen國Cu(250(iM在水/DMF50/50,20^1水和lOinl抗坏血酸,2.5mM于水中)的条件下保温。将其中ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物被立即灭活的这类溶液在环境温度下保温30分钟。这个实验可以测定由ClipPhen-Cu/抗坏血酸/DTT混合物对扩增反应的任意抑制。此为溶液B。去除污染后对残留于溶液A中且仍存在于溶液B中核酸的扩增接下来,向5^1溶液A或B中加入10^"反应混合物REAG"(来自NecliSensEasyQBasic试剂盒,bioMerieux,商业参考号码285006,Boxtel(NL))。这样的混合物含有扩增所需的试剂,两种引物以及检测扩增所需的探针。这样的溶液还含有足量的DTT(6mM)以防止ClipPhen的反应性。因此所述混合物的终浓度为lOmMDTT。所述溶液在65°C保温2分钟然后在41。C保温2分钟。然后,向前述溶液中加入5jli1来自BasicKitNucliSensbioMerieux"酶混合物ENZ"混合物以进行扩增。所述反应介质在bioMerieux的"NucliSensEasyQ,,荧光计(NucliSenEasyQ分析仪,NasbaDiagnostic,BioMerieux,Boxtel(NL))中在41。C保持了l小时30分钟。记录所述荧光检测结果并绘制曲线(图4)。结果与结论在对应于通过加入DTT溶液立即抑制ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物作用的对照的曲线B中观察到了轻微的延迟。在扩增中的这种延迟完全不会改变所述检测的灵敏度,因为扩增起始的斜率是相同幅度的。这是因为对阳性对照而言DTT的浓度增加(曲线A)。在这种情况下,表明ClipPhen-Cu/抗坏血酸/DTT混合物对NASBA没有作用且适于这一扩增反应的酶也不会受到这一化合物混合物的影响。此外,还表明DTT抑制ClipPhen-Cu的片段化活性,因为当加入足量的DTT之后,没有观察到降解活性。曲线C表示尽管ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物的活性已经维持了30分钟,然后通过加入DTT(17mM)终止,所述片段化依然终止以至于所述扩增曲线不再延迟。在此已经证明络合物混合物(ClipPhen-Cu/抗坏血酸)可用于降解核酸,且这样的活性可通过加入过量的DTT而终止,且这样的溶液(没有纯化)可用于随后的酶学扩增。这一技术因此可方便地解决核酸污染的问题。实施例4:ClipPhen-Cu对除了RNA的核酸的片段化;对单链DNA、双链DNA和双链RNA以及RNA/DNA异源双链的应用目的本实施例证明了ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物可降解单链RNA或DNA以及相应的双链或异源双链。操作程序由荧光寡核苷酸(探针)和由Eurogentec订购的互补靶制备下表所示的溶液(表l)。表l:用于实施例4中的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>荧光寡核苷酸母液的浓度在水中为200nM,其在18^1的80mM磷酸缓冲液,pH7.2,MgCl220mM,NaCl100mM中被稀释成10nM(lpl)。以相同浓度加入互补靶作为本实施例的功能。将所述溶液随后变性,并在37。C放置1小时从而允许两条链杂交。然后,在使用EasyQ(bioMerieux,参见实施例1)在37°C实施120分钟的荧光测定之前,除了对照,还需加入ClipPhen-Cu溶液(luL至20pM在水/DMF中,[终ClipPhen-Cu]=lpM),然后是抗坏血酸溶液(1^1至2pM在水中,[终抗坏血酸]-100i^M)。根据所对应的不含有抗坏血酸的对照实验,这些测定进行4次。将平均值列示于图5,6禾口7。表2:用于实施例4中的寡核苷酸混合物ODN混合物在缓冲液中的ClipPhen-Cu抗坏血酸摩尔浓度(mM)摩尔浓度荧光DNA探160251010100针荧光RNA探160271010100针DNA/DNA16025/1602610/1010100RNA/RNA16027/1602810/1010100RNA/DNA16027/1602610/1010100结果与结论图5所示为与ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物作用的对单链荧光DNA(16025,曲线a)或荧光RNA(16027,曲线b)随时间进行荧光测定的结果。在两种情况下,与对照相比(曲线c和d)都可观察到非常清楚的荧光增加。这种荧光的出现证明了DNA以及RNA都被片段化了且荧光的出现在反应的最初瞬间是以相当的速率进行的。图6所示为DNA/DNA双链的片段化。在DNA/DNA双链的形成过程中(曲线a和b),我们观察到与单链对照相比(曲线c和d)荧光水平升高6倍。这种升高并非由于ClipPhen-Cu,而是因为两条链之间的杂交。从抗坏血酸加入的瞬间开始可观察到在曲线b中荧光的下降,其达到了曲线d的荧光水平,对应于全部切割的单链所释放的荧光。与对照相比,荧光的修饰清楚地表明单链DNA和双链DNA/DNA是以完全类似的方式进行切割的。最终,我们评估了作为被片段化的核酸是双链RNA或RNA或RNA/DNA异源双链的函数的片段化速率的区别(图7)。在这种情况下,对于3种对照及图6所示,我们根据双链的形成观察到了荧光的增加,在随后通过加入抗坏血酸诱导的片段化中观察到了荧光的降低,达到了完全切割的单链的荧光水平。在所有情况下且不考虑杂合体的性质时,片段化发生,说明ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物完全适合于降解任意类型的核酸。实施例5:固定于固相支持物上片段化分子的去除污染作用目的为了将ClipPhen固定于固相支持物并证明其活性在固定于Tentagel聚苯乙烯珠(商品参考号码MB250002,RappPolymers,德国)之后依然能够保持。操作程序将61.5mgTentagelNH2大珠(macrobead)(商品参考号码MB250002,RappPolymers,德国)放置于SnapFit柱(ABI,美国)或Handee离心柱(参考号码69705,Pierce,美国)中,相当于n=16.6pmol。用无水二甲亚砜(DMSO)洗涤珠从而去除任何可能存在的痕量水。萃取DMSO。将其放置于氩气流。用于600pl无水DMSO中的14pl三乙胺(6eq,99pmol,-150mM)渗滤(l分钟)。这一步骤确保胺基团是以适当的NH2形式而非NH/形式存在。所述溶液用三乙胺提取。用于400]Li1无水DMSO中的36.4mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)(6当量,99pmol,-250mM,Pierce)渗滤(10分钟)。萃取含有过量DSS的溶液。对在所述反应这一阶段的取出的几个珠进行了茚三酮检测,从而确保所有胺官能团都与连接物反应了。如果不是这种情况,珠子会变成蓝色。将含有以下成分的反应混合物在环境温度下渗滤至少1小时(1小时15分钟-1小时30分钟)于800^1DMSO中的3-ClipPhen(2.8叫,45pmol,56mM),4-二甲基氨基吡啶(2.8eq,45|nmol,56mM),6.3|il三乙胺(2.8eq,45|umol,56mM)。有可能在反应之前和之后取出几pl反应混合物以在328nm在UV下的微分分析来确定珠官能化的程度。由于3-ClipPhen,所述反应混合物具有棕色。用无水DMSO进行洗涤直到洗涤溶液中的这种棕色消失。初始黄色的珠所具有的黄色在反应之后略微变暗。将于SO(HiI无水DMSO中的5.9^1乙醇胺(10eq,99nmol,-130mM)加入以灭活所有未反应的NHS基团。允许反应10分钟。用1mlDMSO洗涤珠5次,然后用DMSO提取。用乙腈重复相同的操作(为了能够干燥珠)。用氩冲洗,然后在旋转蒸发仪中蒸发。与铜络合用于50/50DMSO/水中的lml的1MCuCV溶液渗滤(对55mg珠,即相对于官能化程度的145当量)10分钟。用DMSO和水洗涤直到洗涤液无色(如果初始CuCl2溶液有色),然后用乙腈洗。用氩冲洗。在旋转蒸发仪中蒸发。切割检测如下进行向Eppendorf管(最大容量200nl)中加入需要量的树脂,于lmg与单个珠之间,即引入125nmol的ClipPhen/12.5mMTentage的量(即引入1.25-2.5nmol的ClipPhen/125uM-250uM的量)。向所述树脂中加入靶RNA(1600碱基16sRNA转录物,根据实验浓度介于6-70ng/pL),类似地以所需的浓度(5mM)加入抗坏血酸。样本的总体积为IO^iL;所使用的缓冲液是pH7.4的tris缓冲液,终浓度为20mM。一个Tentagd树脂珠就足以观察切割。制备了与ClipPhen-Cu络合物对照样本偶联的"单独靶"(图8电泳图A),"存在有抗坏血酸的靶(电泳图B)","存在有树脂的靶"。"存在有树脂的靶"对照意味着所使用抗坏血酸的量对荧光没有作用这一事实可以被检测。根据所使用的靶,在放入AgilentRNA6000Nanochip(商业参考号码为5067-1512的商业试剂盒,Agilent,美国)之前将所制备的样本在环境温度搅动30分钟(lOOOrpm)。lpl上清液足以在生物分析仪(Agilent,美国)上进行分析。结果与结论所得结果与图8所示(电泳图C)表明只有在存在抗坏血酸,最少量树脂(仅仅1珠Tentagd,即假定lmg树脂含有50-100珠,支持ClipPhen的量为1.25-2.5nmol,即浓度范围为125-250^M)的情况下,在半小时之内确实发生了对靶的切割。在RNA模型上这样的切割是非常容易观察到的,因为所产生的片段在电泳图上是可见的(电泳图C)。因此,证明了固化的ClipPhen依然具有活性并保持了其核酸降解性质。实施例6:去除含有污染核酸和感兴趣核酸的溶液的污染的证明目的为了消除以较少量存在且由病毒衣壳保护的没有降解存在的病毒核酸的病毒培养物上清中发现的"基因组细胞DNA"污染物,其目的在于在不抑制感兴趣靶的特异性扩增条件下降低从细胞DNA发生的非特异性扩增。为此,在ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物作用之前和之后,对上清中的基因组18SDNA浓度进行了分析(SearchLC+基因组DNA商业分析试剂盒,Promega,商业参考号码G3041,美国)以产生一定范围的稀释。同时,在ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物作用之前和之后的病毒RNA的浓度也通过PCR用特异性异物和用LightCycler,SybrGreen(Roche,美国)进行了分析。操作程序将感染了病毒的细胞进行培养。在对照实验中,使用KitSearchLC对上清中残留的基因组DNA(18S)进行分析(下表中的条目B)。还使用LightCycler(Roche)测定了相应于所述病毒的核酸的量(使用特异性引物的扩增技术)(下表中的条目B)。在其他实验中(下表中的条目A),将上清用于ClipPhen-Cu/抗坏血酸混合物(ClipPhen-CuIOO一,抗坏血酸50mM,30分钟,用2.5M终浓度DTT灭活)作用30分钟,然后测定残留基因组DNA(18S)的量以及相应于所述病毒的核酸的量。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>结果与结论在该情况中可观察到在病毒核酸的浓度基本未受到影响的条件下,采用切割物质处理的上清中基因组DNA的浓度降低了10倍(条目A)。通过基本上降低背景噪音,这项技术因此能够增强分析病毒核酸的灵敏度。权利要求1.一种去除溶液中存在的任意核酸的污染的方法,所述方法包括以下步骤-将所述溶液与由形成双(1,10-菲咯啉)/金属络合物的结合于金属原子的两个1,10-菲咯啉分子所构成的络合物所形成的至少一种片段化分子作用充分时间,直到所述核酸完全降解;以及-通过加入以下物质终止所述片段化分子的活性●过量的有机还原剂;或●络合物质,例如EDTA。2.—种去除含有污染核酸及感兴趣核酸的溶液的污染的方法,包括以下步骤-将所述溶液与由形成双(1,10-菲咯啉)/金属络合物的结合于金属原子的两个l,10-菲咯啉分子所构成的络合物形成的至少一种片段化分子作用充分的时间,直到所述污染核酸完全降解,同时保留感兴趣的核酸;以及-通过加入以下物质终止所述片段化分子的活性*过量的有机还原剂;或*络合物质,例如EDTA。3.权利要求1或2所述的方法,其特征在于在终止所述片段化分子的活性之后,所述方法还含有由扩增反应组成的补充步骤。4.权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于所述金属是过渡金属,例如铜,钌,镍,铁,锌,铑,钴或锰。5.权利要求1-4任一项所述的方法,其特征在于所述片段化分子的两个菲咯啉核通过连接臂相互连接形成ClipPhen分子。6.权利要求5所述的方法,其特征在于两个菲咯啉核之间的连接臂是由三个连续碳原子的链构成的,其中在中间位置的碳原子是取代的且其中每个末端碳原子都通过氧原子连接于菲咯啉核。7.权利要求6所述的方法,其特征在于在中间位置的碳原子是由-NH2或-NH-CO-CH3取代的且每个末端碳原子都通过所述核上的2位或3位的氧原子连接于菲咯啉核。8.权利要求5-7任一项所述的方法,其特征在于所述ClipPhen分子是3-ClipPhen(1,3-双(1,10-菲咯啉-3-基氧基)丙-2-胺)。9.一种去除溶液中存在的任意核酸的污染的方法,所述方法包括将所述溶液与ClipPhen/金属分子作用充分时间,直到称为污染核酸的所述核酸完全降解。10.—种去除含有污染核酸和感兴趣核酸的溶液的污染的方法,包括将所述溶液与ClipPhen/金属分子作用充分的时间,直到所述污染核酸完全降解,而保留感兴趣的核酸。11.权利要求1-10任一项所述的方法,其特征在于所述片段化分子是结合过氧化氢1^202的1型铜络合物,并任选具有其他还原剂,优选有机还原剂。12.权利要求1-10任一项所述的方法,其特征在于所述片段化分子是优选结合于其他有机还原剂的II型铜络合物。13.权利要求1-12任一项所述的方法,其特征在于权利要求1-8任一项中所述的还原剂或权利要求11或12中所述的其他还原剂是有机还原剂,由以下组成*硫醇如二硫苏糖醇(DTT),硫代酸如巯基丙酸;或*羧酸;或*羧酸的衍生物如抗坏血酸;或*磷化氢如三羧乙基磷化氢(TCEP);或*至少两种所述有机还原剂的组合。14.权利要求1-10任一项所述的方法,其特征在于所述片段化分子被固定于固相支持物上。15.权利要求1-14任一项所述的方法,其特征在于权利要求1-8任一项中所述的还原剂或权利要求11或12中所述的其他还原剂被固定于固相支持物上。16.权利要求14或15所述的方法,其特征在于所述固相支持物是颗粒,膜,条,薄膜或滤器。17.权利要求11或12所述的方法,其特征在于所述片段化分子与由羧酸或羧酸衍生物组成的其他有机还原剂之间的比例在1比1到1比100的范围内。18.权利要求1-17任一项所述的方法,其中所述片段化分子与权利要求l-8任一项中所述的、由硫醇组成的还原剂之间的比例大于l比100,优选地大于1比1000。19.权利要求1-18任一项所述的方法,其特征在于除了核酸外,所述溶液含有用于扩增反应必需的全部成分,艮口*靶;*扩增引物;以及*检测探针。20.权利要求1-19任一项所述的方法,其特征在于被处理的所述核酸是单链或双链形式的RNA或DNA、以及RNA/DNA异源双链。21.权利要求l-19任一项所述的方法,其特征在于对于ClipPhen/金属的浓度范围为l(iM到100pM而言,所述被处理的核酸所经受的处理时间范围为5到60分钟,优选范围为10到30分钟。22.采用权利要求1-21任一项所述方法处理的溶液的用途,其特征在于在权利要求1-8任一项中所述的有机还原剂存在的条件下,将所述溶液与含有拟进行扩增的耙核酸、以及所述靶核酸特异性的扩增引物和检测探针的生物学样品混合,从而产生终止所述片段化分子活性的过量有机还原剂。23.权利要求22所述的用途,其特征在于权利要求1-8任一项中所述的有机还原剂与权利要求11或12中所述的其他有机还原剂相同。24.权利要求22所述的用途,其特征在于权利要求1-8任一项中所述的有机还原剂不同于权利要求11或12中所述的其他有机还原剂。全文摘要本发明涉及去除溶液中含有的任意核酸的污染的方法,包括以下步骤将所述溶液与具有通过片段化降解核酸即片段化分子的性质的至少一类分子相作用充分的时间,直到所述核酸完全降解,即产生污染核酸,并终止所述片段化分子的活性。本发明还涉及以这种方法处理的此类溶液的用途。本发明优选用于诊断领域。文档编号C12Q1/68GK101646785SQ200880010629公开日2010年2月10日申请日期2008年3月28日优先权日2007年3月30日发明者A·劳伦特,A·拉尤,G·帕拉尼奥斯-巴卡拉申请人:生物梅里埃公司