免疫相关基因的多态性的检测用探针及其用途的制作方法

专利名称：免疫相关基因的多态性的检测用探针及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测免疫相关基因的多态性的探针及其用途。

背景技术：
作为在基因水平上分析所有疾病的原因、个体间的疾病易患病性(患病的容易程度)、个体间的药效的差异等的方法，点突变，即所谓的单核苷酸多态性(SNP)的检测被广泛进行。
作为多态性的一般的检测方法，可以例举(1)对于试样的目标DNA，通过PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增检测目标区域，分析其扩增产物的全序列的直接测序法，(2)与前述(1)同样进行PCR，对扩增产物进行限制性酶处理，通过DNA杂交(southern hybridization)对由于限制性片段长度多态性导致的变化进行分型的PCR-RFLP(限制性片段长度多态性，Restriction Fragment Length Polymorphism)法等。
然而，前述(1)的方法例如需要在PCR之后进行测序，再通过测序仪进行电泳等。因此，检测时极费时间和劳动力。而且，由于在PCR后需要处理所获得的扩增产物，在该处理时存在产生污染的危险。前述(2)的方法中，也需要在PCR后，对获得的扩增产物用各种限制性酶进行处理，并进行分析，也耗费时间和精力。而且，对获得的扩增产物的限制性酶处理，需要临时取出扩增产物再进行。因此，存在着第1次反应中获得的扩增产物飞散，并混入到第2次的其它反应中的危险。由于这样的问题，前述(1)和(2)的方法中，存在着难以实现点突变检测自动化的问题。
由于这些问题，近年来，作为SNP的检测方法，Tm(解链温度，Melting Temperature)分析受到关注。其首先使用与含有检测目标的SNP的区域互补的探针，使待测核酸和前述探针形成杂交体(双链核酸)。并且，对杂交产物实施加热处理，通过吸光度等信号测定检测伴随温度上升的杂交体向单链核酸的解离(熔解)。该方法为基于该检测结果来确定Tm值并判断SNP的方法。Tm值随杂交产物的同源性越高而越高，同源性越低而越低。因此，在检测对象位点的多态性为X或Y时，对于含有目标多态性(例如Y)的核酸和与其100％互补的探针形成的杂交产物，预先求出其Tm值(评价基准值)。接着，测定待测核酸和前述探针的Tm值(测定值)。并且，如果该测定值与前述评价基准值相同，则待测核酸与探针为完全匹配，即，可以判断待测核酸的检测对象位点为目标多态性(Y)。另一方面，如果前述测定值比前述评价基准值低，则待测核酸与探针错配，即，可以判断待测核酸的检测对象位点为其它的多态性(X)。如果为这种方法，例如，只对添加了前述探针的PCR反应液实施温度处理，进行信号测定，就可以检测SNP，因此也能实现检测装置的自动化。
然而，采用这种Tm分析的检测方法存在以下问题。基因的多态性中一般存在纯合体(例如，X/X或Y/Y)和杂合体(例如，X/Y)。多态性的检测中，为纯合体(X/X或Y/Y)，或为杂合体(X/Y)，以及为纯合体时为X/X的纯合体和Y/Y的纯合体中的哪一个，上述判断很重要。但是，为杂合体时，含有多态性为X的基因和多态性为Y的基因，二者的差异只不过是点突变即一个碱基的差异。这样的话，会发生这样的现象，即，与含有一种多态性(例如，Y)的序列完全杂交(完全匹配)的探针进而也会与含有其它多态性(X)的序列杂交(1个碱基的错配)。这种情况下，一旦通过Tm分析制成显示信号强度与温度之间的关系的熔解曲线，则存在着由于显示完全匹配序列的高温侧的峰的存在，而难以检测显示错配序列的低温侧的峰的问题。也就是说，即使在试样中存在错配序列的情况下，由于存在完全匹配序列，其判断有可能变得困难，检测灵敏度有可能降低。而且，即使就纯合体来说，在多态性X的纯合体(X/X)和多态性Y的纯合体(Y/Y)中，仍旧只是一个碱基序列的差异。因此，如前所述，如果难以判断完全匹配的峰和错配的峰，其结果为，难以判断是显示前者(X/X)的峰，还是显示后者(Y/Y)的峰。也就是说，即使可以判断是纯合体，但也存在难以确定多态性种类的情况。
近年来，利用人所具有的免疫机能的抗体药物在医药领域备受关注。作为前述抗体药物，可以例举例如，恶性淋巴瘤治疗药Rituxan(商品名；一般名Rituximab)，乳腺癌的治疗药Herceptin(商品名；一般名Trastuzumab)等。然而，人的免疫力存在个人差异，人们认为这对前述抗体药物的药效有影响。而且，有报道指出基因的变异(例如，SNP)是影响药效的因子。具体而言，报道了与免疫相关的基因FCGR3A基因(非专利文献1)的多态性。该基因编码IgG的片段C受体(FcRs)中的1种即FcγRIIIa。因此，在治疗中使用前述抗体药物时，例如，检测这种基因的多态性(SNP)，考虑其结果，再确定抗体药物的给药量和治疗药的变更等治疗方针被认为是有帮助的。
非专利文献1Buillaume Cartron et al.BLOOD，1FEBRUARY 2002，第99卷，第3期

发明内容
由于这样的理由，FCGR3A基因的多态性的检测例如在使用抗体药物的治疗中非常重要。而且，前述的问题，不仅对于FCGR3A基因，而且对于其它免疫相关基因，例如FCGR2A基因，IL-10基因，TNFα基因和TNFβ基因也可同样考虑。因此，本发明的目的在于提供一种多态性检测方法，其能简便且高可信性地对免疫相关基因的只有一个碱基不同的多态性进行判断。
为了实现前述目的，本发明的多态性检测用探针的特征在于，由选自于下述(A)～(H)构成的组中的至少一个寡核苷酸构成 (A)与以序列号1中第193位的鸟嘌呤为第一位碱基，向3’方向直到第13～21位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为3’末端 (B)与以序列号2中第191位的鸟嘌呤为第一位碱基，向3’方向直到第15～24位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为3’末端 (C)与以序列号3中第311位的鸟嘌呤为第一位碱基，向5’方向直到第16～21位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为5’末端 (D)与以序列号4中第391位的鸟嘌呤为第一位碱基，向3’方向直到第16～22位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为3’末端 (E)与以序列号5中第426位的鸟嘌呤为第一位碱基，向5’方向直到第15～24位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为5’末端 (F)与以序列号6中第165位的胞嘧啶为第一位碱基，向3’方向直到第16～27位碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶为5’末端 (G)与以序列号7中第394位的鸟嘌呤为第一位碱基，向3’方向直到第12～16位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为3’末端 (H)与以序列号300中第393位的鸟嘌呤作为第一位碱基，向3’方向直到第15～22位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为3’末端 本发明的多态性检测用试剂，其特征在于，其为一种用于检测免疫相关基因的多态性的试剂，含有本发明的多态性检测用探针。
本发明的多态性检测方法，其特征在于，其是一种免疫相关基因的多态性的检测方法，含有下述(1)～(3)工序 (1)准备反应体系的工序，所述反应体系含有检测前述多态性的待测核酸和本发明的多态性检测用探针 (2)改变前述反应体系的温度，测定显示前述待测核酸和前述探针的杂交产物的熔解状态的信号值的工序 (3)根据伴随温度变化的前述信号值的变动，决定前述待测核酸中的前述多态性的工序。
通过本发明的多态性检测用探针，利用Tm分析，可以简便且高可信度地判断免疫相关基因FCGR3A基因、FCGR2A基因、IL-10基因、TNFα基因和TNFβ基因的后述规定的多态性。具体而言，即使免疫相关基因的多态性是杂合体(X/Y)，也可以判断并检测多态性X和多态性Y。而且，即使免疫相关基因的多态性是纯合体(X/X或Y/Y)时，也可以判断是X/X还是Y/Y。如前所述，在通过Tm分析进行的杂合体(X/Y)的检测中，如前所述，以往的探针中，由于前述探针与含有一个多态性(X)的序列和含有只有1个碱基不同的其它多态性(Y)的序列这两者杂交，因此前述熔解曲线中二者的信号峰重叠，难以判断多态性。与之相对，通过本发明的探针，尽管与这两个序列杂交，但在前述熔解曲线中能充分分离二者的信号峰。因此，根据本发明，能简便地判断并检测只有一个碱基不同的多态性。而且，根据本发明，例如，在同一反应体系中添加两种以上的探针，也能在前述同一反应体系中判断各探针所对应的免疫相关基因的多态性。因此，例如，对于一个待测试样，使用一个反应体系，能检测多个多态性。这样一来，根据本发明能容易地且可信度高地判断免疫相关基因的多态性，因此例如，检测结果也可以反映到通过前述抗体药物的给药而进行的治疗上。因此，本发明可以说在医疗领域等中极为有用。



图1是表示本发明的实施例1中的Tm分析结果的图。
图2是表示本发明的实施例2中的Tm分析结果的图。
图3是表示本发明的实施例3中的Tm分析结果的图。

具体实施例方式 本发明中，以下，将发生检测目标的多态性的位点称为“检测对象位点”，将探针可以杂交的序列，即含有前述检测对象位点的前述序列称为“检测对象序列”。前述检测对象序列中，将与探针完全匹配的检测对象序列称为“完全匹配序列”，将与探针错配的检测对象序列称为“错配序列”。在本发明中，所谓完全匹配是指前述检测对象位点的碱基与前述探针中的对应碱基互补，优选是指前述检测对象序列和前述探针完全互补。本发明中，所谓错配是指前述检测对象位点的碱基与前述探针中的对应碱基非互补，优选是指前述检测对象位点与前述探针在前述检测对象位点以外完全互补。而且，将具有完全匹配序列的核酸、DNA或基因称为“完全匹配核酸、完全匹配DNA或完全匹配基因”，将具有错配序列的核酸、DNA或基因称为“错配核酸、错配DNA或错配基因”。而且，将进行多态性检测的核酸、DNA或基因称为“待测核酸、待测DNA或待测基因”。
<探针> 如前所述，本发明的多态性检测用探针，其特征在于，其是用于检测免疫相关基因的多态性的探针，由选自于下述(A)～(H)构成的组中的至少一个寡核苷酸构成。而且，如后所述，本发明的多态性检测探针例如除以下的各种寡核苷酸以外，还可以具有例如标记物质等。
FCGR3A探针 由下述(A)的寡核苷酸构成的探针是用于检测免疫相关基因FCGR3A基因的多态性的探针。以下，将该探针称为“FCGR3A探针” (A)与以序列号1中第193位的鸟嘌呤(g)为第一位碱基，向3’方向直到第13～21位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶(c)为3’末端。
本发明的FCGR3A探针是用于检测序列号1所示的FCGR3A基因的部分序列中的第201位碱基(k)的多态性(g/t；祖先型等位基因(ancestral allele)“g”)的探针。该多态性，例如，以登录号No.rs396991登录于NCBI。在本发明中，以下将该多态性称为“FCGR3A多态性”。
本发明的FCGR3A探针与FCGR3A基因的有义链(正向链)互补，通过与有义链的杂交，能检测有义链中的多态性。前述寡核苷酸(A)中，与序列号1的第201位碱基(k)对应的互补碱基用m表示，前述m是腺嘌呤或胞嘧啶。m为腺嘌呤时，探针与多态性(t)完全匹配，m为胞嘧啶时，探针与多态性(g)完全匹配。因此，根据是否完全匹配，能检测FCGR3A多态性。m优选为腺嘌呤。
FCGR3A探针的具体例子示于下表。序列号8～16表示的探针由与含有序列号1中的第201位(k)的区域互补的序列构成，碱基m为与序列号1中的第201位碱基(k)对应的互补碱基。以下所示的各序列中，碱基m可以是腺嘌呤(a)和胞嘧啶(c)中的任意一种，优选为腺嘌呤(a)。下表中“Tm(℃)”是下表的序列和与其完全互补的序列杂交时的Tm(℃)，通过MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)，将参数设为寡核苷酸浓度0.2μM、钠当量(Na eq.)50mM而计算出的值(以下，同样)。前述Tm值，例如，可以通过前述MELTCALC软件(http://www.meltcalc.com/)等计算，另外也可以通过毗邻法(Nearest Neighbor Method)确定。下述探针中，优选由序列号14的碱基序列构成的寡核苷酸(A1)。
[表1]
另外，本发明的FCGR3A探针也可以是由与前述(A)的寡核苷酸互补的寡核苷酸(A’)构成的探针。这样，通过与反义链(相反链)的杂交，能够检测反义链中的多态性。
FCGR2A探针 由下述(B)的寡核苷酸构成的探针是用于检测免疫相关基因FCGR2A基因的多态性的探针。以下，将该探针称为“FCGR2A探针”。
(B)与以序列号2中第191位的鸟嘌呤(g)为第一位碱基，向3’方向直到第15～24位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶(c)为3’末端 本发明的FCGR2A探针是用于检测序列号2所示的FCGR2A基因的部分序列中第201位的碱基(y)的多态性(t/c；祖先型等位基因“t”)的探针。该多态性，例如，以登录号No.rs1801274登录于NCBI。以下，将该多态性称为“FCGR2A多态性”。
本发明的FCGR2A探针与FCGR2A基因的有义链(正向链)互补，通过与有义链的杂交，能检测有义链中的多态性。前述寡核苷酸(B)中，与序列号2的第201位碱基(y)对应的互补碱基用r表示，前述r为腺嘌呤或鸟嘌呤。r为鸟嘌呤时，探针与多态性(c)完全匹配，r为腺嘌呤时，探针与多态性(t)完全匹配。因此，根据是否完全匹配，能检测FCGR2A多态性。r优选为腺嘌呤。
FCGR2A探针的具体例子示于下表。序列号17～26表示的探针由与含有序列号2中的第201位(y)的区域互补的序列构成，碱基r为与序列号2中的第201位碱基(y)对应的互补碱基。以下所示的各序列中，碱基r可以是腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)中的任意一种，优选为腺嘌呤(a)。下述探针中，优选由序列号23的碱基序列构成的寡核苷酸(B1)。
[表2]
另外，本发明的FCGR2A探针也可以是由与前述(B)的寡核苷酸互补的寡核苷酸(B’)构成的探针。这样，通过与反义链(相反链)的杂交，能检测反义链中的多态性。
IL-10(-592)探针 由下述(C)的寡核苷酸构成的探针是用于检测免疫相关基因IL-10基因的第592位的位点的多态性的探针。以下，将该探针称为“IL-10(-592)探针”。
(C)与以序列号3中第311位的鸟嘌呤(G)为第一位碱基，向5’方向直到第16～21位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶(C)为5’末端。
本发明的IL-10(-592)探针是用于检测序列号3所示的IL-10基因的部分序列中第301位的碱基(m)的多态性(a/c；祖先型等位基因“c”)的探针。该多态性，例如，以登录号No.rs1800872登录于NCBI。以下，将该多态性称为“IL-10(-592)多态性”。
本发明的IL-10(-592)探针与IL-10基因的有义链互补，通过与有义链的杂交，能检测有义链中的多态性。前述寡核苷酸(C)中，与序列号3的第301位碱基(m)对应的互补碱基用k表示，前述k为胸腺嘧啶或鸟嘌呤。k为胸腺嘧啶时，探针与多态性(a)完全匹配，k为鸟嘌呤时，探针与多态性(c)完全匹配。因此，根据是否完全匹配，能检测IL-10(-592)多态性。k优选为胸腺嘧啶。
本发明的IL-10(-592)探针的具体例子示于下表。序列号27～32表示的探针由与含有序列号3中的第301位(m)的区域互补的序列构成，碱基k为与序列号3中的第301位碱基(m)对应的互补碱基。以下所示的各序列中，碱基k可以是胸腺嘧啶(t)和鸟嘌呤(g)中的任意一种，优选为胸腺嘧啶(t)。下述探针中，优选由序列号30的碱基序列构成的寡核苷酸(C1)。
[表3]
另外，本发明的IL-10(-592)探针也可以是由与前述(C)的寡核苷酸互补的寡核苷酸(C’)构成的探针。这样，通过与反义链的杂交，能检测反义链中的多态性。
IL-10(-819)探针 由下述(D)的寡核苷酸构成的探针是用于检测免疫相关基因IL-10基因的第819位的位点的多态性的探针。以下，将该探针称为“IL-10(-819)探针”。
(D)与以序列号4中第391位的鸟嘌呤(G)为第一位碱基，向3’方向直到第16～22位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶(C)为3’末端。
本发明的IL-10(-819)探针是用于检测序列号4所示的IL-10基因的部分序列中第401位的碱基(y)的多态性(c/t；祖先型等位基因“c”)的探针。该多态性，例如，以登录号No.rs1800871登录于NCBI。以下，将该多态性称为“IL-10(-819)多态性”。
本发明的IL-10(-819)探针与IL-10基因的有义链互补，通过与有义链的杂交，能检测有义链中的多态性。前述寡核苷酸(D)中，与序列号4的第401位碱基(y)对应的互补碱基用r表示，前述r为鸟嘌呤或腺嘌呤。r为鸟嘌呤时，探针与多态性(c)完全匹配，r为腺嘌呤时，探针与多态性(t)完全匹配。因此，根据是否完全匹配，能检测多态性。r优选为鸟嘌呤。
本发明的IL-10(-819)探针的具体例子示于下表。序列号33～39所示探针由与含有序列号4中的第401位(y)的区域互补的序列构成，前述r是对应于序列号4中第401位的碱基(y)的互补碱基。以下所示的各序列中，碱基r可以是鸟嘌呤(g)和腺嘌呤(a)中的任意一种，优选为鸟嘌呤(g)。下述探针中，优选由序列号36的碱基序列构成的寡核苷酸(D1)。
[表4]
而且，本发明的IL-10(-819)探针也可以是由与前述(D)的寡核苷酸互补的寡核苷酸(D’)构成的探针。这样，通过与反义链的杂交，能检测反义链中的多态性。
IL-10(-1082)探针 由下述(E)的寡核苷酸构成的探针是用于检测免疫相关基因IL-10基因的第1082位的位点的多态性的探针。以下，将该探针称为“IL-10(-1082)探针”。
(E)与以序列号5中第426位的鸟嘌呤(G)为第一位碱基，向5’方向直到第15～24位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶(C)为5’末端。
本发明的IL-10(-1082)探针是用于检测序列号5所示的IL-10基因的部分序列中第414位的碱基(r)的多态性(a/g；祖先型等位基因“a”)的探针。该多态性，例如，以登录号No.rs1800896登录于NCBI。以下，将该多态性称为“IL-10(-1082)多态性”。
本发明的IL-10(-1082)探针与IL-10基因的有义链互补，通过与有义链的杂交，能检测有义链中的多态性。前述寡核苷酸(E)中，与序列号5的第414位的碱基(r)互补的碱基用y表示，前述y为胸腺嘧啶或胞嘧啶。y为胸腺嘧啶时，探针与多态性(a)完全匹配，y为胞嘧啶时，探针与多态性(g)完全匹配。因此，根据是否完全匹配，能检测多态性。y优选为胞嘧啶。
本发明的IL-10(-1082)探针的具体例子示于下表。序列号40～49所示的探针由与含有序列号5中的第414位(r)的区域互补的序列构成，碱基y是与序列号5中的第414位的碱基(r)互补的碱基。以下所示的各序列中，碱基y可以是胸腺嘧啶(t)和胞嘧啶(c)中的任意一种，优选为胞嘧啶(c)。下述探针中，优选为由序列号47的碱基序列构成的寡核苷酸(E1)。
[表5]
另外，本发明的IL-10(-1082)探针也可以是由与前述(E)的寡核苷酸互补的寡核苷酸(E’)构成的探针。这样，通过与反义链的杂交，能检测反义链中的多态性。
IL-10(-3575)探针 由下述(F)的寡核苷酸构成的探针是用于检测免疫相关基因IL-10基因的第3575位的位点的多态性的探针。以下，将该探针称为“IL-10(-3575)探针”。
(F)与以序列号6中第165位的胞嘧啶(C)为第一位碱基，向3’方向直到第16～27位碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶(C)为5’末端 本发明的IL-10(-3575)探针是用于检测序列号6所示的IL-10基因的部分序列中第179位的碱基(w)的多态性(a/t；祖先型等位基因“t”)的探针。该多态性，例如，以登录号No.rs1800890登录于NCBI。以下，将该多态性称为“IL-10(-3575)多态性”。
本发明的IL-10(-3575)探针与IL-10基因的反义链互补，通过与反义链的杂交，能检测反义链中的多态性。前述寡核苷酸(F)中，与序列号6中第179位的碱基(w)对应的碱基用w表示，前述w是胸腺嘧啶或腺嘌呤。w为胸腺嘧啶时，探针与反义链的多态性(a)完全匹配，w为腺嘌呤时，探针与反义链的多态性(t)完全匹配。因此，根据是否完全匹配，能检测多态性。w优选为胸腺嘧啶。
本发明的IL-10(-3575)探针的具体例子示于下表。序列号50～61所示的探针由与含有序列号6中的第179位(w)的区域相同的序列构成，碱基w是与序列号6中的第179位的碱基(w)对应的碱基。以下所示的序列中，碱基w是胸腺嘧啶(t)和腺嘌呤(a)中的任意一种，优选为胸腺嘧啶(t)。下述探针中优选由序列号57的碱基序列构成的寡核苷酸(F1)。
[表6]
另外，本发明的IL-10(-3575)探针也可以是由与前述(F)的寡核苷酸互补的寡核苷酸(F’)构成的探针。这样，通过与有义链的杂交，能检测有义链中的多态性。
TNFα(-308)探针 由下述(G)的寡核苷酸构成的探针是用于检测免疫相关基因TNFα基因的多态性的探针。以下，将该探针称为“TNFα(-308)探针或TNFα探针”。
(G)与以序列号7中的第394位的鸟嘌呤(G)为第一位碱基，向3’方向直到第12～16位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶(C)为3’末端。
本发明的TNFα探针是用于检测序列号7所示的TNFα基因的部分序列中第401位的碱基(r)的多态性(a/g；祖先型等位基因“g”)的探针。该多态性，例如，以登录号No.rs1800629登录于NCBI。以下，将该多态性称为“TNFα(-308)多态性或TNFα多态性”。
本发明的TNFα探针与TNFα基因的有义链互补，通过与有义链的杂交，能检测有义链中的多态性。前述寡核苷酸(G)中，与序列号7的第401位的碱基(r)互补的碱基用y表示，前述y为胸腺嘧啶或胞嘧啶。y为胸腺嘧啶时，探针与多态性(a)完全匹配，y为胞嘧啶时，探针与多态性(g)完全匹配。因此，根据是否完全匹配，能检测多态性。y优选为胞嘧啶。
本发明的TNFα探针的具体例子示于下表。序列号62～66所示的探针由与含有序列号7中的第401位(r)的区域互补的序列构成，碱基y是与序列号7中的第401位的碱基(r)互补的碱基。以下所示的各序列中，碱基y可以是胸腺嘧啶(t)和胞嘧啶(c)中的任意一种，优选为胞嘧啶(c)。下述探针中，优选为由序列号64的碱基序列构成的寡核苷酸(G1)。
[表7]
另外，本发明的TNFα探针可以是由与前述(G)的寡核苷酸互补的寡核苷酸(G’)构成的探针。这样，通过与反义链的杂交，能检测反义链中的多态性。
TNFβ探针 由下述(H)的寡核苷酸构成的探针是用于检测免疫相关基因TNFβ基因的多态性的探针。以下，将该探针称为“TNFβ(+252)探针或TNFβ探针”。
(H)与以序列号300中第393位的鸟嘌呤(G)作为第一位碱基，向3’方向直到第15～22位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶(C)为3’末端。
本发明的TNFβ探针是用于检测序列号300所示的TNFβ基因的部分序列中第401位的碱基(y)的多态性(t/c)的探针。该多态性，例如，以登录号No.rs909253登录于NCBI。以下，将该多态性称为“TNFβ(+252)多态性或TNFβ多态性”。
本发明的TNFβ探针与TNFβ基因的有义链互补，通过与有义链的杂交，能检测有义链的多态性。前述寡核苷酸(H)中，与序列号300的第401位的碱基(y)对应的互补碱基用r表示，前述r是腺嘌呤或鸟嘌呤。r为鸟嘌呤时，探针与多态性(c)完全匹配，r为腺嘌呤时，探针与多态性(t)完全匹配。因此，根据是否完全匹配，能检测多态性。r优选为鸟嘌呤。
TNFβ探针的具体例子示于下表。序列号301～308表示的探针由与含有序列号300中的第401位(y)的区域互补的序列构成，碱基r为与序列号300中的第401位的碱基(y)对应的互补碱基。以下所示的各序列中，碱基r可以是腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)中的任意一种，优选为鸟嘌呤(g)。下述探针中，优选由序列号306或序列号307的碱基序列构成的寡核苷酸(H1)。
[表8]
另外，本发明的TNFβ探针还可以是由与前述(H)的寡核苷酸互补的寡核苷酸(H’)构成的探针。这样，通过与反义链的杂交，能检测反义链中的多态性。
本发明的探针包括前述的各寡核苷酸中，除与检测对象位点对应的碱基位点以外，缺失、置换或添加了1个或多个碱基的碱基序列所构成的、能与检测对象序列杂交的寡核苷酸构成的探针。
本发明的探针优选在前述的寡核苷酸上结合了标记物质的标记探针。作为前述标记探针，例如，可以例举单独显示信号且由于形成杂交体而不显示信号的标记探针，或单独不显示信号但由于形成杂交体而显示信号的标记探针。如果为前者这样的探针，则在与检测对象序列形成杂交体(双链核酸)时不显示信号，而由于加热探针游离时显示信号。另外，如果为后者的探针，则由于与检测对象序列形成杂交体(双链核酸)时显示信号，由于加热探针游离时信号就减少(消失)。
前述标记物质没有限制，例如，可以例举萤光色素(萤光团)。作为前述标记探针的具体例子，例如，优选用萤光色素标记，单独显示萤光且由于形成杂交体萤光减少(例如，猝灭)的探针。利用这种萤光猝灭现象(Quenching phenomenon)的探针被称为萤光猝灭探针。前述标记探针优选寡核苷酸的3’末端或5’末端被萤光色素标记，更优选3’末端和5’末端中碱基为胞嘧啶的核苷酸末端被标记。此时，优选将前述标记探针的碱基序列设计成在前述标记探针杂交的检测对象序列中，与前述标记探针的末端碱基的胞嘧啶配对的碱基或距离前述配对碱基1～3碱基的碱基为鸟嘌呤。这种探针一般被称为鸟嘌呤猝灭探针，已知为所谓的QProbe(注册商标)。这种鸟嘌呤猝灭探针一旦与检测对象序列杂交，被萤光色素标记的末端胞嘧啶由于靠近前述检测对象序列中的鸟嘌呤，因此出现前述萤光色素的发光变弱(萤光强度减少)的现象。
前述萤光色素没有限制，例如，可以例举荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等，作为市售的萤光色素，例如，可以例举BODIPY FL(商标名，Molecular Probes公司制)、FluorePrime(商品名，Amersham Pharmacia公司制)、Fluoredite(商品名，Millipore公司制)、FAM(ABI公司制)、Cy3及Cy5(Amersham Pharmacia公司制)、TAMRA(Molecular Probes公司制)、Pacific Blue(B ecton，Dickinson公司制)等。探针的检测条件没有特别限定，可以根据所使用的萤光色素适当确定。例如，太平洋蓝(Pacific Blue)可以在检测波长450～480nm下检测，TAMRA可以在检测波长585～700nm下检测，BODIPY FL可以在检测波长515～555nm下检测。若使用这种探针，则可以根据信号的变动，容易地确认杂交与其的分离。
另外，本发明的探针例如可以在3’末端上添加磷酸基。如后所述，待测核酸可以通过PCR等核酸扩增法进行制备，此时，可以使本发明的探针共存于核酸扩增反应的反应体系中。此时，如果预先在前述探针的3’末端上添加磷酸基，例如则能充分防止探针自身通过核酸扩增反应而伸长。而且，即使通过在3’末端上添加如上前所述的标记物质，也可以获得同样效果。
本发明的探针可以分别用于各种免疫相关基因中的多态性的检测。而且，在多态性检测时，既可以使用本发明的探针中的一种，只检测一种多态性，也可以使用两种以上的探针，检测两种以上的多态性。使用两种以上的本发明的探针时，例如，可以使之共存于同一反应体系中，使用前述同一反应体系而检测两种以上的多态性。此时，优选用检测条件不同的萤光色素标记各探针。
此外，在采用本发明的探针的多态性的检测中，检测方法没有任何限制，只要是利用检测对象序列与探针的杂交的方法即可。作为使用本发明的探针的方法的一例，对于利用Tm分析的多态性的检测方法，说明如下。
<多态性检测方法> 本发明的多态性检测方法如前所述，其特征在于，其是免疫相关基因的多态性的检测方法，包括下述(1)～(3)工序。而且，本发明的多态性检测方法的特征在于，其使用本发明的探针，其它构成和条件等不受以下所述限制。
(1)准备反应体系的工序，所述反应体系含有检测前述多态性的待测核酸和本发明的多态性检测用探针 (2)改变前述反应体系的温度，测定显示前述待测核酸和前述探针的杂交产物的熔解状态的信号值的工序 (3)根据伴随温度变化的前述信号值的变动，决定前述待测核酸中的前述多态性的工序 本发明的多态性检测方法中使用的本发明的探针，如前所述，可以是一种，也可以是两种以上。为前者的情况下，在一个反应体系中能检测所希望的一种多态性，为后者的情况下，通过在反应体系中添加两种以上的本发明的探针，就能在一个反应体系中分别检测各探针对应的所希望的两种以上的多态性。在一个反应体系中检测两种以上的多态性时，本发明的探针的组合没有特别限定，但例如可以例举以下组合 (1)FCGR3A探针和IL-10(-819)探针的组合，优选含有序列号14的序列的探针和含有序列号36的序列的探针的组合 (2)FCGR2A探针、IL-10(-592)探针和TNFα(-308)探针的组合，优选含有序列号23的序列的探针、含有序列号30的序列的探针和含有序列号64的序列的探针 (3)IL-10(-1082)探针和IL-10(-3575)探针的组合，优选含有序列号47的序列的探针和含有序列号57的序列的探针的组合 (4)IL-10(-592)探针和IL-10(-1082)探针的组合，优选含有序列号30的序列的探针和含有序列号47的序列的探针的组合 在一个反应体系中添加两种以上的探针时，优选各探针分别被检测条件不同的标记物质标记。由此，只改变检测条件，即便使用同一个反应体系，也可以简便地检测两种以上的多态性。
本发明中，前述待测核酸既可为单链核酸，也可为双链核酸。前述待测核酸为双链核酸时，例如，如后所述，优选在前述(2)工序中包括加热前述反应体系而使双链的待测核酸解离的工序。通过将双链核酸解离成单链核酸，使得与本发明的探针的杂交成为可能。
本发明中，前述待测核酸，例如可以是生物体试样中原本含有的核酸，也可以是以前述核酸作为模板核酸，通过核酸扩增法扩增出的扩增产物，此时可以提高检测精度。前述扩增产物，例如可以是以生物体试样中的DNA作为模板的扩增产物，也可以是以由生物体试样中的总RNA、mRNA等RNA通过逆转录-PCR合成的cDNA作为模板的扩增产物。
前述待测核酸为前述扩增产物时，可以在前述(1)工序中，例如，使用预先制备的扩增产物，准备含有本发明的探针和前述扩增产物的反应体系，也可以在本发明的探针的存在下，由模板核酸通过核酸扩增法扩增目标扩增产物，准备含有前述探针和扩增产物的反应体系。
在后者的情况下，前述(1)工序优选包括下述(1a)工序。
(1a)在含有前述探针的反应体系中，通过核酸扩增法，由模板核酸生成作为前述待测核酸的扩增产物的工序。
前述核酸扩增法不受限制，例如，可以例举PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)法、NASBA(依赖核酸序列的扩增，Nucleic acid sequence based amplification)法、TMA(转录介导的扩增，Transcription-mediated amplification)法、SDA(链置换扩增，Strand Displacement Amplification)法等，其中优选PCR法。
在前述(1a)工序中优选使用用于扩增含有前述免疫相关基因中的检测目标的多态性的序列的引物。引物的序列没有特别限定，只要能扩增含有检测对象位点的检测对象序列即可，例如，可以根据检测对象序列和其周边序列等，通过以往公知的方法适当设定。引物的长度没有特别限定，可以设定为一般的长度，例如，可以例举10～30mer。如前所述，在检测两种以上的多态性时，可以分别并用用于扩增各多态性的检测对象序列的引物。另外，通过使这些引物共存于同一反应体系中，能同时扩增两种以上的检测对象序列。
作为前述引物，例如，可以使用扩增基因的有义链的正向引物(以下，也称为“F引物”)和扩增反义链的反向引物(以下，也称为“R引物”)中的任意一种，但优选将这两者作为一对引物对使用。以下，示出引物对的一个例子，但其仅为示例，本发明并不限于此。
FCGR3A引物对(a) FCGR3A多态性的检测中，作为引物对，例如，可以例举包括由下述(F1)的寡核苷酸构成的正向引物和由下述(R1)的寡核苷酸构成的反向引物的引物对(a)。
(F1)与以序列号1的碱基序列中的第173位的胞嘧啶(c)为第1位碱基，向5’方向直到第27～46位碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶(c)作为3’末端 (R1)与以序列号1的碱基序列中的第307位的腺嘌呤(a)为第1位碱基，向3’方向直到第23～29位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述第307位的腺嘌呤(a)互补的胸腺嘧啶(t)作为3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具体例子，但本发明并不限于此。而且，这些正向引物和反向引物的组合没有任何限制，但其中特别优选包括由序列号77的碱基序列构成的正向引物和由序列号97的碱基序列构成的反向引物的引物对。
[表9]
FCGR2A引物对(b) FCGR2A多态性的检测中，作为引物对，例如，可以例举包括由下述(F2)的寡核苷酸构成的正向引物和由下述(R2)的寡核苷酸构成的反向引物的引物对(b)。
包括由下述(F2)的寡核苷酸构成的正向引物和由下述(R2)的寡核苷酸构成的反向引物的引物对 (F2)与以序列号2的碱基序列中的第189位的鸟嘌呤(g)为第1位碱基，向5’方向直到第23～38位碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以前述鸟嘌呤(g)作为3’末端 (R2)与以序列号2的碱基序列中的第206位的鸟嘌呤(g)为第1位碱基，向3’方向直到第31～48位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述第206位的鸟嘌呤(g)互补的胞嘧啶(c)作为3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具体例子，但本发明并不限于此。而且，这些正向引物和反向引物的组合没有任何限制，但其中特别优选包括由序列号132的序列构成的F2引物和由序列号114的碱基序列构成的R2引物的引物对。
[表10]
IL-10(-592)引物对(c) IL-10(-592)多态性的检测中，作为引物对，例如，可以例举包括由下述(F3)的寡核苷酸构成的正向引物及由下述(R3)的寡核苷酸构成的反向引物的引物对(c)。
(F3)与以序列号3的碱基序列中的第291位的胞嘧啶(c)作为第1位碱基，向5’方向直到第23～41位碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶(c)作为3’末端 (R3)与以序列号3的碱基序列中的第311位的鸟嘌呤(g)作为第1位碱基，向3’方向直到第27～41位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述第311位的鸟嘌呤(g)互补的胞嘧啶(c)作为3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具体例子，但本发明并不限于此。而且，这些正向引物和反向引物的组合没有任何限制，但其中特别优选包括由序列号148的碱基序列构成的正向引物和由序列号167的碱基序列构成的反向引物的引物对。
[表11]
IL-10(-819)引物对(d) IL-10(-819)多态性的检测中，作为引物对，例如，可以例举包括由下述(F4)的寡核苷酸构成的正向引物及由下述(R4)的寡核苷酸构成的反向引物的引物对(d)。
(F4)与以序列号4的碱基序列中的第351位的鸟嘌呤(g)为第1位碱基，向5’方向直到第24～39位碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以前述鸟嘌呤(g)作为3’末端 (R4)与以序列号4的碱基序列中第420位的鸟嘌呤(g)为第1位碱基，向3’方向直到第29～46位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述第420位的鸟嘌呤(g)互补的胞嘧啶(c)作为3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具体例子，但本发明并不限于此。而且，这些正向引物和反向引物的组合没有任何限制，但其中特别优选包括由序列号182的碱基序列构成的正向引物和由序列号198的碱基序列构成的反向引物的引物对。
[表12]
IL-10(-1082)用引物对(e) IL-10(-1082)多态性的检测中，作为引物对，例如，可以例举包括由下述(F5)的寡核苷酸构成的正向引物及由下述(R5)的寡核苷酸构成的反向引物的引物对(e)。
(F5)与以序列号5的碱基序列中的第329位的胞嘧啶(c)为第1位碱基，向5’方向直到第22～32位碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶(c)作为3’末端 (R5)与以序列号5的碱基序列中第447位的鸟嘌呤(g)为第1位碱基，向3’方向直到第23～39位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述447位的鸟嘌呤(g)互补的胞嘧啶(c)作为3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具体例子，但本发明并不限于此。而且，这些正向引物和反向引物的组合没有任何限制，但其中特别优选包括由序列号213的碱基序列构成的正向引物和由序列号227的碱基序列构成的反向引物的引物对。
[表13]
IL-10(-3575)用引物对(f) IL-10(-3575)多态性的检测中，作为引物对，例如，可以例举包括由下述(F6)的寡核苷酸构成的正向引物及由下述(R6)的寡核苷酸构成的反向引物的引物对。
(F6)与以序列号6的碱基序列中的第139位的胞嘧啶(c)作为第1位碱基，向5’方向直到第25～42位碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶(c)作为3’末端 (R6)与以序列号6的碱基序列中第223位的鸟嘌呤(g)作为第1位碱基，向3’方向直到第19～33位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述第223位的鸟嘌呤(g)互补的胞嘧啶(c)作为3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具体例子，但本发明并不限于此。而且，这些正向引物和反向引物的组合没有任何限制，但其中特别优选包括由序列号244的碱基序列构成的正向引物和由序列号260的碱基序列构成的反向引物的引物对。
[表14]
TNFα引物对(g) TNFα多态性的检测中，作为引物对，例如，可以例举包括由下述(F7)的寡核苷酸构成的正向引物及由下述(R7)的寡核苷酸构成的反向引物的引物对。
(F7)与以序列号7的碱基序列中的第386位的鸟嘌呤(g)为第1位碱基，向5’方向直到第26～41位碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以前述鸟嘌呤(g)作为3’末端 (R7)与以序列号7的碱基序列中第418位的胞嘧啶(c)为第1位碱基，向3’方向直到第24～40位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述第418位的胞嘧啶(c)互补的鸟嘌呤(g)作为3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具体例子，但本发明并不限于此。而且，这些正向引物和反向引物的组合没有任何限制，但其中特别优选包括由序列号277的碱基序列构成的正向引物和由序列号293的碱基序列构成的反向引物的引物对。
[表15]
TNFβ引物对(h) TNFβ多态性的检测中，作为引物对，例如，可以例举包括由下述(F8)的寡核苷酸构成的正向引物及由下述(R8)的寡核苷酸构成的反向引物的引物对。
(F8)与以序列号300的碱基序列中的第350位的胞嘧啶(c)为第1位碱基，向5’方向直到第18～37位碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶(c)作为3’末端 (R8)与以序列号300的碱基序列中第443位的鸟嘌呤(g)为第1位碱基，向3’方向直到第17～37位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述第443位的鸟嘌呤(g)互补的胞嘧啶(c)作为3’末端 以下，示出正向引物和反向引物的具体例子，但本发明并不限于此。而且，这些正向引物和反向引物的组合没有任何限制，但其中特别优选包括由序列号337的碱基序列构成的正向引物和由序列号312的碱基序列构成的反向引物的引物对。
[表16]
在前述(1)工序中，本发明的探针相对于前述待测核酸的添加比例(摩尔比)没有特别限制，但为了能充分确保检测信号，优选为1倍以下，更优选为0.1倍以下。此时，前述待测核酸，例如，可以是具有完全匹配序列的完全匹配核酸和具有错配序列的错配核酸的总计，也可以是包括完全匹配序列的扩增产物和包括错配序列的扩增产物的总计。而且，待测核酸中完全匹配DNA的比例通常不明，但从结果看，前述探针的添加比例(摩尔比)优选为完全匹配核酸(含有完全匹配序列的扩增产物)的10倍以下，更优选为5倍以下，进一步优选为3倍以下。而且，其下限没有特别限定，例如，为0.001倍以上，优选为0.01倍以上，更优选为0.1倍以上。本发明的探针相对于前述待测核酸的添加比例，例如，可以为相对于双链核酸的摩尔比，也可以为相对于单链核酸的摩尔比。
作为使用本发明的多态性检测方法的试样，没有特别限定，但可以列举生物体试样。作为前述生物体试样的具体例子，例如，可以例举白细胞等血细胞、全血、口腔粘膜等口腔内细胞、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、吐出的痰、羊水、石蜡包埋组织、尿、胃液、胃清洗液等。本发明中，前述试样的采集方法和从前述试样制备待测核酸的方法等没有限制，可以采用以往公知的方法。
就Tm值进行说明。逐步加热含有双链核酸(例如，双链DNA)的溶液时，260nm处的吸光度上升。这是因为双链核酸中双链间的氢键因加热而解离，解离(DNA的熔解)成单链核酸(例如，单链DNA)。而且，所有的双链核酸均解离成单链核酸时，其吸光度呈现出加热开始时的吸光度(仅双链核酸的吸光度)的约1.5倍左右，由此可以判断熔解结束。基于这种现象，熔解温度Tm一般定义为吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。
本发明中，用于测定Tm值的伴随温度变化的信号变动，其测定也可以根据前述原理通过260nm处的吸光度测定而进行，但优选测定添加于探针上的标记物质的信号。因此，作为本发明的探针，优选使用前述标记探针。作为前述标记探针，例如，可以例举单独显示信号且由于形成杂交体而不显示信号的标记探针，或者单独不显示信号但由于形成杂交体而显示信号的标记探针。如果为前者的探针，则在与检测对象序列形成杂交体(双链核酸)时不显示信号，而由于加热探针游离则显示信号。此外，如果为后者探针，则由于与检测对象序列形成杂交体(双链核酸)而显示信号，而由于加热探针游离则信号减少(消失)。因此，通过在信号特有的条件(吸光度等)下检测由该标记物质产生的信号，可以与前述260nm处的吸光度测定同样，进行熔解的进行和Tm值的确定。标记探针中的标记物质，例如，如前所述。
以下，就本发明的多态性检测方法，以待测核酸为核酸扩增物，使用经萤光色素标记的标记探针作为本发明的探针为例进行说明。另外，本发明的多态性检测方法的特征在于使用本发明的探针本身，其它工序和条件没有任何限制。
首先，从全血中分离基因组DNA。从全血中分离基因组DNA可以通过以往公知的方法进行。作为具体例子，例如，可以使用市售的基因组DNA分离试剂盒(商品名GFX GenomicBlood DNA Purification kit；GE Healthcare Bio-Science公司制)等。
随后，在含有分离的基因组DNA的试样中添加标记探针，制备反应液。如前所述，添加的标记探针可以是一种，也可以为两种以上。作为前述标记探针，例如，优选QProbe。前述QProbe一般为用萤光色素标记探针末端的胞嘧啶的探针，其通过与检测对象序列杂交，前述萤光色素和检测对象序列的鸟嘌呤相互作用，其结果为萤光减少(或猝灭)。标记探针的碱基序列如前所述，可以根据检测目标的多态性而适当选择。
前述标记探针的添加时机没有特别限定，例如，可以在后述的核酸扩增反应后添加到PCR扩增产物中，也可以在核酸扩增反应之前添加。这样在PCR等核酸扩增反应前添加前述标记探针时，例如，如前所述，优选在探针的3’末端上添加萤光色素或添加磷酸基。
前述标记探针可以添加于含有分离的基因组DNA的试样，也可以在溶剂中与基因组DNA混合。作为前述溶剂，没有特别限定，例如，可以例举Tris-HCl等缓冲液，含有KCl、MgCl2、MgSO4、丙三醇等的溶剂，PCR用反应液等核酸扩增用反应液这些以往公知的溶剂。
接着，以分离的基因组DNA作为模板，在前述标记探针的存在下，通过PCR等核酸扩增法，对含有发生检测目标多态性的检测对象位点的序列进行扩增。以下，作为核酸扩增法，以PCR为例，对本发明进行说明，但不限于此。而且，PCR的条件没有特别限定，可以通过以往公知的方法进行。
具体而言，对含有前述基因组DNA和前述标记探针的前述反应液进行PCR。该反应液的组成没有特别限定，只要是本领域技术人员即可适当设定，例如，除了前述基因组DNA和前述标记探针外，还可以列举DNA聚合酶等聚合酶、dATP、dTTP、dCTP、dGTP及dUTP等dNTP、缓冲液、各种催化剂、引物等。
然后，进行获得的扩增产物(双链DNA)的解离以及使通过解离获得的单链DNA与前述标记探针杂交。例如，其可以根据前述反应液的温度变化而进行。
前述双链DNA的解离可以通过例如加热来进行。该解离工序中的加热温度只要为前述扩增产物可以解离的温度即可，没有特别限定，例如为85～95℃。加热时间也没有特别限定，通常是1秒～10分钟，优选为1秒～5分钟。
另外，解离的单链DNA与前述标记探针的杂交，例如，可以在前述解离工序后通过使前述解离工序中的加热温度下降而进行。该杂交工序中的温度条件没有特别限定，但优选比前述标记探针的Tm值更低的温度，例如为40～50℃。而且，前述温度下的处理时间没有特别限定，例如为1～600秒。
杂交工序中，前述反应液的各组成的体积和浓度没有特别限定。作为具体例子，前述反应液中的DNA的浓度是例如为0.01～1μmol/L，优选为0.1～0.5μmol/L，前述标记探针的浓度，例如，优选满足前述的DNA的添加比例的范围，例如为0.001～10μmol/L，优选为0.001～1μmol/L。
然后，改变前述反应液的温度，测定显示前述扩增产物(前述单链DNA)和前述标记探针的杂交产物的熔解状态的信号值。具体而言，例如，通过加热前述反应液而加热前述单链DNA和前述标记探针的杂交产物，测定伴随温度上升的信号值的变动。如前所述，例如，在使用末端的胞嘧啶被标记的探针(鸟嘌呤猝灭探针)时，在与单链DNA杂交的状态下萤光减少(或猝灭)，在解离的状态下发出萤光。因此，例如，可以缓慢加热萤光减少(或猝灭)的杂交产物，测定伴随温度上升的萤光强度的增加即可。
测定萤光强度的变动时的温度范围没有特别限定，例如，开始温度为室温～85℃，优选为25～70℃，例如，终止温度为40～105℃。而且，温度的上升速度没有特别限定，例如为0.1～20℃/秒，优选为0.3～5℃/秒。
使用两种以上的标记探针来检测两种以上的多态性时，只要在适应于各标记探针的标记物质的条件下，基于各标记探针测定信号变动即可。
然后，分析前述信号的变动，确定Tm值。具体而言，例如，根据获得的萤光强度计算各温度下每单位时间的萤光强度变化量。变化量为(-d萤光强度增加量/dt)时，例如，可以将显示最低值的温度确定为Tm值。而且，变化量为(d萤光强度增加量/dt)时，例如，可以将最高点确定为Tm值。此外，作为标记探针，不使用猝灭探针而使用单独不显示信号但由于形成杂交体而显示信号的探针时，相反地测定萤光强度的减少量即可。
并且，根据这些Tm值，确定目标检测对象位点的多态性(基因型)。在Tm分析中，例如可获得这样的结果完全互补的杂交体(匹配)与一个碱基不同的杂交体(错配)相比，表示解离的Tm值要高。因此，通过预先确定前述探针的完全互补的杂交体的Tm值和一个碱基不同的杂交体的Tm值，可以确定目标检测对象位点的多态性。例如，目标检测对象位点的多态性为X或Y时，使用与检测对象位点为X的检测对象序列完全互补的探针时，形成的杂交体的Tm值若与完全互补的杂交体的Tm值相同，则可以判断检测对象位点的碱基为X。另外，如果形成的杂交体的Tm值与一个碱基不同的杂交体的Tm值相同，或比完全互补的杂交体的Tm值低，则可以判断检测对象位点的碱基为Y。
另外，在本发明中，代替如前所述的使前述反应液的温度上升以加热杂交产物来测定伴随温度上升的信号变动的方法，例如，可以进行杂交体形成时的信号变动的测定。也就是说，可以在使含有前述探针的反应液的温度下降以形成杂交产物时，测定伴随前述温度下降的信号变动。
作为具体例子，就使用单独显示信号且由于形成杂交体而不显示信号的标记探针(例如、QProbe)的情况进行说明。在单链DNA与探针解离的状态下发出萤光，但随温度下降而形成杂交体时，前述萤光则减少(或猝灭)。因此，例如，可以使前述反应液的温度缓慢下降，测定伴随温度下降的萤光强度的减少即可。另一方面，使用单独不显示信号但由于形成杂交体而显示信号的标记探针时，在单链DNA与探针解离的状态下不发出萤光，但由于温度下降而形成杂交体时，则发出萤光。因此，例如，可以使前述反应液的温度缓慢下降，测定伴随温度下降的萤光强度的增加即可。
<多态性检测用试剂> 本发明的多态性检测用试剂，其特征在于，其是用于检测免疫相关基因的多态性的多态性检测用试剂，含有本发明的多态性检测用探针。本发明的特征在于含有前述的本发明的多态性检测用探针，其它构成和条件没有任何限制。而且，本发明的多态性检测用试剂，例如，也可以称为用于免疫相关基因的多态性的检测的探针试剂盒。
在本发明的多态性检测用试剂中，本发明的多态性检测用探针可以为一种也可以为两种以上。探针为两种以上时，其组合没有特别限定，例如可以例举前述那样的组合。另外，两种以上的探针例如可以分别收纳于容器中，而且如前所述，由于能够进行同一反应体系中的多态性的检测，因此也可以以混合状态收纳于同一容器中。而且，含有两种以上的探针时，各探针优选被不同标记物质标记。通过这样改变标记物质的种类，即使是同一反应体系，也可以进行各个探针的检测。作为前述标记物质，例如优选为检测波长不同的物质。
据报道，如前所述免疫相关基因FCGR3A基因、FCGR2A基因、IL-10基因、TNFα基因及TNFβ基因中，例如分别存在与商品名Rituxan等恶性淋巴瘤治疗药、商品名Herceptin等乳腺癌治疗药(例如，商品名Herceptin)等抗体药物的药效相关的多态性。而且，根据本发明的探针，可以分别检测这些多态性。另外，对于这些多态性，例如存在只检测到某一个种类的突变型的情况，但也存在检测到多种突变型的情况。本发明中作为检测目标的各多态性，分别显示了与前述抗体药物的药效之间的关系，可认为分别显示出特有的特征。因此，例如，检测多个多态性，通过综合判断这些结果，可以进行更好的诊断和治疗。因此，通过使本发明的多态性检测试剂或探针试剂盒中含有两种以上的本发明的探针，可以更简便地进行用于诊断和治疗等的多态性检测。
本发明的检测用试剂还可以进一步含有用于扩增含有免疫相关基因中的检测目标位点的区域的引物或引物对。作为引物对，例如，根据使用的本发明的探针的种类，可以例举如前所述的引物对。具体而言，优选分别含有FCGR3A探针和FCGR3A引物对、FCGR2A探针和FCGR2A引物对、IL-10(-592)探针和IL-10(-592)引物对、IL-10(-819)探针和IL-10(-819)引物对、IL-10(-1082)探针和IL-10(-1082)引物对、IL-10(-3575)探针和IL-10(-3575)引物对、TNFα探针和TNFα引物对、TNFβ探针和TNFβ引物对的组合。
本发明的探针的组合没有特别限定，例如可以例举如前所述的例子。而且，就引物或引物对的组合而言，也可以根据本发明的探针的组合来确定。
本发明的检测用试剂，除此之外例如还可以含有核酸扩增反应所必需的成分。作为具体例子，例如可以例举DNA聚合酶等聚合酶、dATP、dTTP、dCTP、dGTP及dUTP等dNTP、缓冲液、各种催化剂等。而且，本发明的检测用试剂可以是检测试剂试剂盒，还可以进一步含有使用说明书。
接着，就本发明的实施例进行说明。但是，本发明并不限于下述实施例。而且，％表示w/v％。
实施例 [实施例1] FCGR3A多态性及IL-10(-819)多态性的检测 使用本发明的探针，通过Tm分析，检测FCGR3A多态性和IL-10(-819)多态性。
从FCGR3A多态性和IL-10(-819)多态性为已知的3名健康者中，通过EDTA采血管采集血液(试样1～试样3)。各试样的FCGR3A多态性和IL-10(-819)多态性分别如下。FCGR3A多态性IL-10(-819)多态性 试样1T/T C/C 试样2G/T T/C 试样3T/T T/T 将前述各试样10μL与70μL下述试样稀释液1混合，将混合液10μL再与70μL下述试样稀释液2混合。将该混合液17μL于95℃加热10分钟后，添加到46μL下述PCR反应液中进行PCR。前述PCR，通过热循环仪于95℃处理60秒后，以95℃下1秒和62℃下15秒作为1个循环，重复进行50个循环，再进行95℃下1秒、40℃下60秒的处理。然后，继续将温度上升速度设为1℃/3秒，使前述PCR反应液由40℃逐渐加热到75℃，测定经时的萤光强度的变化(波长515～555nm、585～700nm)。
(试样稀释液1) 10mmol/L Tris-HCl 0.1mmol/LEDTA 0.05％ NaN3 0.3％SDS (试样稀释液2) 10mmol/L Tris-HCl 0.1mmol/LEDTA 0.05％NaN3 [表17] (PCR反应液单位μL) 蒸馏水 28.02 10％NaN3 0.23 20％BSA 0.5 50％丙三醇 2.5 10×Gene Taq缓冲液* 5 2.5mmol/L dNTPs 4 5μmol/L FCGR3A探针 2 100μmol/L FCGR3A F引物 0.5 100μmol/L FCGR3A R引物 0.25 5μmol/L IL-10(-819)探针 2 100μmol/L IL-10(-819)F引物 0.5 100μmol/L IL-10(-819)R引物 0.25 5U/μL Gene Taq FP* 0.25总计46μL *商品名Gene Taq FPNIPPON GENE公司制 FCGR3A探针(序列号14) 5’-tcccaaAaagccccc-(BODIPY FL)-3’ FCGR3A F引物(序列号77) 5’-tctgacttctacattccaaaagccacactcaaagac-3’ FCGR3A R引物(序列号97) 5’-ctcctcccaactcaacttcccagtgtgat-3’ IL-10(-819)探针(序列号36) 5’-acagagatGttacatcacc-(TAMRA)-3’ IL-10(-819)F引物(序列号182) 5’-tgctggagatggtgtacagtagggtgagg-3’ IL-10(-819)R引物(序列号198) 5’-caccatgacccctaccgtctctattttatagtgagc-3’ 这些结果示于图1。图1为表示伴随温度上升的萤光强度变化的Tm分析图。在图1中，(A)为试样1的结果，(B)为试样2的结果，(C)为试样3的结果，上面部分表示FCGR3A多态性的结果，下面部分表示IL-10(-819)多态性的结果。
本实施例中，使用与有义链的FCGR3A多态性(t)完全匹配的探针作为FCGR3A探针，使用与有义链的IL-10(-819)多态性(c)完全匹配的探针作为IL-10(-819)探针。其结果是，在FCGR3A多态性的检测中，如图1的上部分所示，纯合体(T/T)的试样1和3仅在表示完全匹配的57.0℃处出现峰。另一方面，杂合体(G/T)的试样2在表示完全匹配的57.0℃和表示1个碱基错配的48.0℃处出现峰。而且，在IL-10(-819)多态性的检测中，如图1的下面部分所示，纯合体(C/C)的试样1仅在表示完全匹配的59.0℃处出现峰，纯合体(T/T)的试样3仅在表示错配的52.5℃出现峰。另一方面，杂合体(T/C)的试样2在表示完全匹配的59.0℃和表示1个碱基错配的52.5℃出现峰。根据此结果可知，通过本发明的探针可以充分判断与检测对象序列杂交的是完全匹配还是错配，而且可以在一个反应体系中判断两种多态性。
[实施例2] FCGR2A多态性、IL-10(-592)多态性和TNFα多态性的检测 使用本发明的探针，通过Tm分析，检测FCGR2A多态性、IL-10(-592)多态性和TNFα(-308)多态性。
从FCGR2A多态性、IL-10(-592)多态性及TNFα(-308)多态性为已知的1名健康者中，通过EDTA采血管采集血液(试样1)。并且，准备具有TNFα(-308)多态性为纯合体(A/A)的TNFα基因的质粒(试样2)。各试样的FCGR2A多态性、IL-10(-592)多态性及TNFα(-308)多态性如下。FCGR2A多态性 IL-10(-592)多态性 TNFα多态性 试样1C/T C/AG/G 试样2- - A/A 将10μL的试样1与70μL的前述试样稀释液1混合，将混合液10μL再与70μL前述试样稀释液2混合。将该混合液17μL于95℃加热10分钟后，添加到46μL下述PCR反应液中进行PCR。另一方面，将1μL的试样2(3.5pg)添加到46μL下述PCR反应液中进行PCR。前述PCR，通过热循环仪于95℃处理60秒后，以95℃下1秒和62℃下15秒作为1个循环，重复进行50个循环，再进行95℃下1秒、40℃下60秒的处理。而且，继续将温度上升速度设为1℃/3秒，将前述PCR反应液由40℃逐渐加热到75℃，测定经时的萤光强度的变化(波长450～480nm、515～555nm、585～700nm)。
[表18] (PCR反应液单位μL) 蒸馏水 17.77 10％NaN3 0.23 20％BSA 0.5 50％丙三醇 10 10×Gene Taq缓冲液* 5 2.5mmol/L dNTPs 4 5μmol/L IL-10(-592)探针 2 100μmol/L IL-10(-592)F引物 0.5 100μmol/L IL-10(-592)R引物 0.25 5μmol/L FCGR2A探针 2 100μmol/L FCGR2A F引物 0.25 100μmol/L FCGR2A R引物 0.5 5μmol/L TNFα(-308)探针 2 100μmol/L TNFα(-308)F引物 0.5 100μmol/L TNFα(-308)R引物 0.25 5U/μL Gene Taq FP* 0.25总计46μL *商品名Gene Taq FPNIPPON GENE公司制 IL-10(-592)探针(序列号30) 5’-(Pacific Blue)-cttcctacagTacaggcg-P-3’ IL-10(-592)F引物(序列号148) 5’-ggtaaaggagcctggaacacatcctgtgac-3’ IL-10(-592)R引物(序列号167) 5’-agcccttccattttactttccagagactggc-3’ FCGR2A探针(序列号23) 5’-ttctcccAtttggatccc-(BODIPY FL)-3’ FCGR2A F引物(序列号132) 5’-ctgtggtttgcttgtgggatggagaagg-3’ FCGR2A R引物(序列号38) 5’-aggtcacattcttccagaatggaaaatcccagaaattc-3’ TNFα(-308)探针(序列号64) 5’-ccgtccCcatgccc-(TAMRA)-3’ TNFα(-308)F引物(序列号277) 5’-cctggtccccaaaagaaatggaggcaatagg-3’ TNFα(-308)R引物(序列号293) 5’-ccactgactgatttgtgtgtaggaccctgg-3’ 这些结果示于图2。图2为表示伴随温度上升的萤光强度变化的Tm分析图。在图2中，(A)为试样1的结果，(B)为试样2的结果，上面部分表示IL-10(-592)多态性的结果，中间部分表示FCGR2A多态性的结果，下面部分表示TNFα(-308)多态性的结果。
本实施例中，使用与有义链IL-10(-592)多态性(a)完全匹配的探针作为IL-10(-592)探针，使用与有义链FCGR2A多态性(t)完全匹配的探针作为FCGR2A探针，使用与有义链TNFα(-308)多态性(g)完全匹配的探针作为TNFα(-308)探针。其结果是，在IL-10(-592)多态性的检测中，如图2的上面部分所示，杂合体(C/A)的试样1在表示完全匹配的58.0℃和表示1个碱基错配的50.0℃处出现峰。而且，在FCGR2A多态性的检测中，如图2的中间部分所示，杂合体(C/T)的试样1在表示完全匹配的57.0℃和表示1个碱基错配的48.0℃处出现峰。而且，在TNFα(-308)多态性的检测中，如图2的下面部分所示，纯合体(G/G)的试样1仅在表示完全匹配的61.0℃处出现峰，纯合体(A/A)的试样2仅在表示1个碱基错配的49.0℃处出现峰。根据此结果可知，通过本发明的探针可以充分判断与检测对象序列杂交的是完全匹配还是错配，而且可以在一个反应体系中判断三种多态性。
[实施例3] IL-10(-1082)多态性及IL-10(-3575)多态性的检测 使用本发明的探针，通过Tm分析，检测IL-10(-1082)多态性及IL-10(-3575)多态性。
从IL-10(-1082)多态性及IL-10(-3575)多态性为已知的1名健康者中，通过EDTA采血管采集血液(试样1)。并且，使用商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit(GEHealthcare Bio-Science社制)，纯化IL-10(-1082)多态性和IL-10(-3575)多态性为已知的基因组，将其稀释10倍作为试样2。而且，准备IL-10(-3575)多态性为纯合体(A/A)的合成DNA(试样3)。各试样的IL-10(-1082)多态性及IL-10(-3575)多态性分别如下。
IL-10(-1082)多态性 (-3575)多态性 试样1A/AT/T 试样2A/GT/T 试样3- A/A 将10μL的试样1与70μL的前述试样稀释液1混合，将混合液10μL再与70μL前述试样稀释液2混合。将该混合液17μL于95℃加热10分钟后，添加到46μL下述PCR反应液中进行PCR。另一方面，将1μL的试样2或1μL的试样3(3.5pg)分别添加到46μL下述PCR反应液中，进行PCR。前述PCR反应，通过热循环仪于95℃处理60秒后，以95℃下1秒及64℃下15秒作为1个循环，重复进行50个循环，再进行95℃下1秒、40℃下60秒的处理。而且，继续将温度上升速度设为1℃/3秒，将前述PCR反应液由40℃逐渐加热到75℃，测定经时的萤光强度的变化(波长515～555nm、585～700nm)。
[表19] (PCR反应液单位μL) 蒸馏水 20.27 10％NaN30.23 20％BSA 0.5 50％丙三醇 10 10×Gene Taq缓冲液* 5 2.5mmol/L dNTPs 4 100mmol/L MgCl2 0.25 5μmol/L IL-10(-1082)探针 2 100μmol/L IL-10(-1082)F引物 0.5 100μmol/L IL-10(-1082)R引物 0.25 5μmol/L IL-10(-3757)探针 2 100μmol/L IL-10(-3757)F引物 0.25 100μmol/L IL-10(-3757)R引物 0.5 5U/μLGene Taq FP*0.25 总计46μL *商品名Gene Taq FPNIPPON GENE公司制 IL-10(-1082)探针(序列号47) 5’-(BODIPY FL)-ccctacttccccCtccc-P-3’ IL-10(-1082)F引物(序列号213) 5’-ccgcaacccaactggctctccttac-3’ IL-10(-1082)R引物(序列号227) 5’-ggattccatggaggctggataggaggtcc-3’ IL-10(-3575)探针(序列号57) 5’-(TAMRA)-cccactggaaaaatTcattt-P-3’ IL-10(-3575)F引物(序列号244) 5’-ggatggaagaagagaggtattccccttcccac-3’ IL-10(-3575)R引物(序列号260) 5’-ccagtttgccctcaagcccagatgc-3’ 这些结果示于图3。图3为表示伴随温度上升的萤光强度变化的Tm分析图。在图3中，(A)为试样1的结果，(B)为试样2的结果，(C)为试样3的结果，上面部分表示IL-10(-1082)多态性的结果，下面部分表示IL-10(-3575)多态性的结果。
本实施例中，使用与有义链的IL-10(-1082)多态性(g)完全匹配的探针作为IL-10(-1082)探针。使用与反义链的IL-10(-3575)多态性(a)完全匹配的探针作为IL-10(-3575)探针。这和与有义链的IL-10(-3575)多态性(t)完全匹配的含义相同。其结果是，在IL-10(-1082)多态性的检测中，如图3的上面部分所示，纯合体(A/A)的试样1仅在表示错配的49.0℃处出现峰，另一方面，杂合体(A/G)的试样2在表示完全匹配的60.0℃和表示1个碱基错配的49.0℃处出现峰。而且，在IL-10(-3575)多态性的检测中，如图3的下面部分所示，纯合体(T/T)的试样1及2仅在表示完全匹配的56.0℃处出现峰，纯合体(A/A)的试样3仅在表示错配的49.0℃处出现峰。根据此结果可知，通过本发明的探针可以充分判断与检测对象序列杂交的是完全匹配还是错配，而且可以在一个反应体系中判断两种多态性。
根据以上结果可知，通过本发明的探针可以充分判断与检测对象序列杂交的是完全匹配还是错配。因此，根据本发明，例如，可以高精确度地判断检测目标位点是多态性(X)还是多态性(Y)。而且，由于这样可以判断完全匹配和错配，因此例如可以判断出检测目标的多态性是纯合体(X/X或Y/Y)还是杂合体(X/Y)，进而还可以判断是X/X的纯合体还是Y/Y的纯合体。另外，还可以在一个反应体系中判断两种以上的多态性。
产业上的可利用性 如上所述，根据本发明，就免疫相关基因FCGR3A基因、FCGR2A基因、IL-10基因、TNFα基因及TNFβ基因而言，即使为仅一个碱基不同的多态性也可以判断。因此，例如通过在Tm分析等中使用本发明的探针，可以简便地检测多态性。而且，根据本发明，即使使两种以上的探针共存于一个反应体系中，也可以判断其分别对应的基因的多态性。因此，可以使用一个反应体系进行多个多态性的检测。这样一来，根据本发明可以容易地判断免疫相关基因的多态性，例如，还可以将检测结果反映到前述那样的抗体药物的治疗给药中。因此，可以说本发明在医疗领域等方面极为有用。
序列表
<110>爱科来株式会社(ARKRAY Inc.)
<120>免疫相关基因的多态性的检测用探针及其用途
<130>TF08021-01
<150>JP 2007-263713
<151>2007-10-09
<160>349
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>401
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
tgttgctcca ggcccctcgg tgggtgttca aggaggaaga ccctattcac ctgaggtgtc 60
acagctggaa gaacactgct ctgcataagg tcacatattt acagaatggc aaaggcagga 120
agtattttca tcataattct gacttctaca ttccaaaagc cacactcaaa gacagcggct 180
cctacttctg cagggggctt kttgggagta aaaatgtgtc ttcagagact gtgaacatca 240
ccatcactca aggtgagaca tgtgccaccc tggaatgccc agggacgcct gtgtgtggaa 300
cctgcaatca cactgggaag ttgagttggg aggagattcc tgattcttac acgcacttct 360
tcatatgtgg ttccctcctg gtgatcacca ggaggtcccc a 401
<210>2
<211>501
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
acctccatgt aggcccatgt gacctcagcc cttgtccatc ccctcttctc ccctccctac 60
atcttggcag actccccata ccttggacag tgatggtcac aggcttggat gagaacagcg 120
tgtagcctat gtttcctgtg cagtggtaat caccactgtg actgtggttt gcttgtggga 180
tggagaaggt gggatccaaa ygggagaatt tctgggattt tccattctgg aagaatgtga 240
ccttgaccag aggcttgtcc ttccagctgt ggcacctcag catgatggtt tctccctcct 300
ggaactccag gtgaggggtc tggagcacca gccattctga aagacacaaa tatgataaga 360
aaaagttgta aggatagatt ccaagggttt ttcagtctca gaggtacgtt actcacagaa 420
cttgacatga tgtctggcag acagaaatga agatgcttca tgacagatgt gagcattctc 480
ttataggcaa tatatggtat t501
<210>3
<211>601
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
gagatggtgt acagtagggt gaggaaacca aattctcagt tggcactggt gtacccttgt 60
acaggtgatg taacatctct gtgcctcagt ttgctcacta taaaatagag acggtagggg 120
tcatggtgag cactacctga ctagcatata agaagctttc agcaagtgca gactactctt 180
acccacttcc cccaagcaca gttggggtgg gggacagctg aagaggtgga aacatgtgcc 240
tgagaatcct aatgaaatcg gggtaaagga gcctggaaca catcctgtga ccccgcctgt 300
mctgtaggaa gccagtctct ggaaagtaaa atggaagggc tgcttgggaa ctttgaggat 360
atttagccca ccccctcatt tttacttggg gaaactaagg cccagagacc taaggtgact 420
gcctaagtta gcaaggagaa gtcttgggta ttcatcccag gttgggggga cccaattatt 480
tctcaatccc attgtattct ggaatgggca atttgtccac gtcactgtga cctaggaaca 540
cgcgaatgag aacccacagc tgagggcctc tgcgcacaga acagctgttc tccccaggaa 600
a 601
<210>4
<211>801
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
ccttccccag gtagagcaac actcctcgcc gcaacccaac tggctcccct taccttctac 60
acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acaaatccaa gacaacacta 120
ctaaggcttc tttgggaagg ggaagtaggg ataggtaaga ggaaagtaag ggacctccta 180
tccagcctcc atggaatcct gacttctttt ccttgttatt tcaacttctt ccaccccatc 240
ttttaaactt tagactccag ccacagaagc ttacaactaa aagaaactct aaggccaatt 300
taatccaagg tttcattcta tgtgctggag atggtgtaca gtagggtgag gaaaccaaat 360
tctcagttgg cactggtgta cccttgtaca ggtgatgtaa yatctctgtg cctcagtttg 420
ctcactataa aatagagacg gtaggggtca tggtgagcac tacctgacta gcatataaga 480
agctttcagc aagtgcagac tactcttacc cacttccccc aagcacagtt ggggtggggg 540
acagctgaag aggtggaaac atgtgcctga gaatcctaat gaaatcgggg taaaggagcc 600
tggaacacat cctgtgaccc cgcctgtact gtaggaagcc agtctctgga aagtaaaatg 660
gaagggctgc ttgggaactt tgaggatatt tagcccaccc cctcattttt acttggggaa 720
actaaggccc agagacctaa ggtgactgcc taagttagca aggagaagtc ttgggtattc 780
atcccaggtt ggggggaccc a801
<210>5
<211>913
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>misc_feature
<222>(800)..(899)
<223>n表示任意碱基
<220>
<221>misc_feature
<222>(226)..(227)
<223>n表示任意碱基
<400>5
tcaatgctcc ctggcaggca ggaggacagg tgctattgcc ctgttgggac agatgaaaaa 60
cagacacagg gaggatgagt gatttgccct gactatagag tggcagggcc aaggcagagc 120
ccaggcctcc tgcacctagg tcagtgttcc tcccagttac agtctaaact ggaatggcag 180
gcaaagcccc tgtggaaggg gaaggtgaag ctcaaatcaa agctcnncca gagactttcc 240
agatatctga agaagtcctg atgtcactgc cccggtcctt ccccaggtag agcaacactc 300
ctcgccgcaa cccaactggc tctccttact ttctacacac acacacacac acacacacac 360
acacacacac acacacacaa atccaagaca acactactaa ggcttctttg ggarggggaa 420
gtagggatag gtaagaggaa agtaagggac ctcctatcca gcctccatgg aatcctgact 480
tcttttcctt gttatttcaa cttcttccac cccatctttt aaactttaga ctccagccac 540
agaagcttac aactaaaaga aactctaagg ccaatttaat ccaaggtttc attctatgtg 600
ctggagatgg tgtacagtag ggtgaggaaa ccaaattctc agttggcact ggtgtaccct 660
tgtacaggtg atgtaatatc tctgtgcctc agtttgctca ctataaaata gagacggtag 720
gggtcatggt gagcactacc tgactagcat ataagaagtt tcagcaagtg ggggatcctc 780
tagagtcgcg acctcagcan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 840
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnng 900
gattttggat tca 913
<210>6
<211>465
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
gagtgagaca gaaaataaaa tacaaccccc tcttttaawa gccatgctta ctcaggtttt 60
ccttcatttg cagctaaata cagaaatgag agaatatttt ggagcaggga tggaagaaga 120
gaggtattcc ccttcccaca awcttctgat ttcccagtac atcccccact ggaaaaatwc 180
atttaaaatc agtataataa gcattgattr gatgcctact atgcatctgg gcttgagggc 240
aaactggact caggcctttt ggcctcaaga agctcacagt gtgagagtgg catttgtgtc 300
ctcttgaaat tcacaggact aaattgtgcc caggctgaca ttctatccat ccataggtgc 360
ctgccttctc acttccctct cttcatgggc tcttgccttg taccaaaatc caaacccaaa 420
tctcctcaca tgtgagtgtt ggcattcatg tctcagacat gacct 465
<210>7
<211>801
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
ttccttggaa gccaagactg aaaccagcat tatgagtctc cgggtcagaa tgaaagaaga 60
aggcctgccc cagtggggtc tgtgaattcc cgggggtgat ttcactcccc ggggctgtcc 120
caggcttgtc cctgctaccc ccacccagcc tttcctgagg cctcaagcct gccaccaagc 180
ccccagctcc ttctccccgc agggacccaa acacaggcct caggactcaa cacagctttt 240
ccctccaacc ccgttttctc tccctcaagg actcagcttt ctgaagcccc tcccagttct 300
agttctatct ttttcctgca tcctgtctgg aagttagaag gaaacagacc acagacctgg 360
tccccaaaag aaatggaggc aataggtttt gaggggcatg rggacggggt tcagcctcca 420
gggtcctaca cacaaatcag tcagtggccc agaagacccc cctcggaatc ggagcaggga 480
ggatggggag tgtgaggggt atccttgatg cttgtgtgtc cccaactttc caaatccccg 540
cccccgcgat ggagaagaaa ccgagacaga aggtgcaggg cccactaccg cttcctccag 600
atgagctcat gggtttctcc accaaggaag ttttccgctg gttgaatgat tctttccccg 660
ccctcctctc gccccaggga catataaagg cagttgttgg cacacccagc cagcagacgc 720
tccctcagca aggacagcag aggaccagct aagagggaga gaagcaacta cagacccccc 780
ctgaaaacaa ccctcagacg c801
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>8
ttttactccc aaaaagcccc c 21
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>9
tttactccca aaaagccccc 20
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>10
ttactcccaa aaagccccc19
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>11
tactcccaaa aagccccc 18
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>12
actcccaaaa agccccc 17
<210>13
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>13
ctcccaaaaa gccccc 16
<210>14
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>14
tcccaaaaag ccccc15
<210>15
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>15
cccaaaaagc cccc 14
<210>16
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>16
ccaaaaagcc ccc 13
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>17
cagaaattct cccatttgga tccc 24
<210>18
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>18
agaaattctc ccatttggat ccc23
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>19
gaaattctcc catttggatc cc 22
<210>20
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>20
aaattctccc atttggatcc c 21
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>21
aattctccca tttggatccc 20
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>22
attctcccat ttggatccc 19
<210>23
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>23
ttctcccatt tggatccc 18
<210>24
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>24
tctcccattt ggatccc17
<210>25
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>25
ctcccatttg gatccc 16
<210>26
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>26
tcccatttgg atccc15
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>27
cttcctacag tacaggcggg g 21
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>28
cttcctacag tacaggcggg 20
<210>29
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>29
cttcctacag tacaggcgg 19
<210>30
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>30
cttcctacag tacaggcg 18
<210>31
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>31
cttcctacag tacaggc17
<210>32
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>32
cttcctacag tacagg 16
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>33
ggcacagaga tgttacatca cc 22
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>34
gcacagagat gttacatcac c21
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>35
cacagagatg ttacatcacc 20
<210>36
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>36
acagagatgt tacatcacc19
<210>37
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>37
cagagatgtt acatcacc 18
<210>38
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>38
agagatgtta catcacc 17
<210>39
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>39
gagatgttac atcacc 16
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>40
ccctacttcc ccctcccaaa gaag 24
<210>41
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>41
ccctacttcc ccctcccaaa gaa 23
<210>42
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>42
ccctacttcc ccctcccaaa ga 22
<210>43
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>43
ccctacttcc ccctcccaaa g21
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>44
ccctacttcc ccctcccaaa 20
<210>45
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>45
ccctacttcc ccctcccaa 19
<210>46
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>46
ccctacttcc ccctccca18
<210>47
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>47
ccctacttcc ccctccc17
<210>48
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>48
ccctacttcc ccctcc 16
<210>49
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>49
ccctacttcc ccctc 15
<210>50
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>50
cccactggaa aaattcattt aaaatca 27
<210>51
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>51
cccactggaa aaattcattt aaaatc 26
<210>52
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>52
cccactggaa aaattcattt aaaat 25
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>53
cccactggaa aaattcattt aaaa24
<210>54
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>54
cccactggaa aaattcattt aaa 23
<210>55
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>55
cccactggaa aaattcattt aa22
<210>56
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>56
cccactggaa aaattcattt a 21
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>57
cccactggaa aaattcattt 20
<210>58
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>58
cccactggaa aaattcatt19
<210>59
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>59
cccactggaa aaattcat 18
<210>60
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>60
cccactggaa aaattca 17
<210>61
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>61
cccactggaa aaattc 16
<210>62
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>62
ccccgtcccc atgccc 16
<210>63
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>63
cccgtcccca tgccc 15
<210>64
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>64
ccgtccccat gccc14
<210>65
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>65
cgtccccatg ccc13
<210>66
<211>12
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>66
gtccccatgc cc 12
<210>67
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>67
tcatcataat tctgacttct acattccaaa agccacactc aaagac46
<210>68
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>68
catcataatt ctgacttcta cattccaaaa gccacactca aagac 45
<210>69
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>69
atcataattc tgacttctac attccaaaag ccacactcaa agac 44
<210>70
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>70
tcataattct gacttctaca ttccaaaagc cacactcaaa gac43
<210>71
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>71
cataattctg acttctacat tccaaaagcc acactcaaag ac 42
<210>72
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>72
ataattctga cttctacatt ccaaaagcca cactcaaaga c 41
<210>73
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>73
taattctgac ttctacattc caaaagccac actcaaagac40
<210>74
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>74
aattctgact tctacattcc aaaagccaca ctcaaagac 39
<210>75
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>75
attctgactt ctacattcca aaagccacac tcaaagac 38
<210>76
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>76
ttctgacttc tacattccaa aagccacact caaagac 37
<210>77
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>77
tctgacttct acattccaaa agccacactc aaagac36
<210>78
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>78
ctgacttcta cattccaaaa gccacactca aagac 35
<210>79
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>79
tgacttctac attccaaaag ccacactcaa agac 34
<210>80
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>80
gacttctaca ttccaaaagc cacactcaaa gac 33
<210>81
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>81
acttctacat tccaaaagcc acactcaaag ac32
<210>82
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>82
cttctacatt ccaaaagcca cactcaaaga c 31
<210>83
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>83
ttctacattc caaaagccac actcaaagac 30
<210>84
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>84
tctacattcc aaaagccaca ctcaaagac29
<210>85
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>85
ctacattcca aaagccacac tcaaagac 28
<210>86
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>86
tacattccaa aagccacact caaagac 27
<210>87
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>87
aatcaggaat ctcctcccaa ctcaacttcc cagtgtgat 39
<210>88
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>88
atcaggaatc tcctcccaac tcaacttccc agtgtgat 38
<210>89
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>89
tcaggaatct cctcccaact caacttccca gtgtgat 37
<210>90
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>90
caggaatctc ctcccaactc aacttcccag tgtgat36
<210>91
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>91
aggaatctcc tcccaactca acttcccagt gtgat35
<210>92
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>92
ggaatctcct cccaactcaa cttcccagtg tgat 34
<210>93
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>93
gaatctcctc ccaactcaac ttcccagtgt gat 33
<210>94
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>94
aatctcctcc caactcaact tcccagtgtg at 32
<210>95
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>95
atctcctccc aactcaactt cccagtgtga t 31
<210>96
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>96
tctcctccca actcaacttc ccagtgtgat 30
<210>97
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>97
ctcctcccaa ctcaacttcc cagtgtgat29
<210>98
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>98
tcctcccaac tcaacttccc agtgtgat 28
<210>99
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>99
cctcccaact caacttccca gtgtgat 27
<210>100
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>100
ctcccaactc aacttcccag tgtgat 26
<210>101
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>101
tcccaactca acttcccagt gtgat25
<210>102
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>102
cccaactcaa cttcccagtg tgat24
<210>103
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>103
ccaactcaac ttcccagtgt gat 23
<210>104
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>104
cctctggtca aggtcacatt cttccagaat ggaaaatccc agaaattc 48
<210>105
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>105
ctctggtcaa ggtcacattc ttccagaatg gaaaatccca gaaattc 47
<210>106
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>106
tctggtcaag gtcacattct tccagaatgg aaaatcccag aaattc 46
<210>107
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>107
ctggtcaagg tcacattctt ccagaatgga aaatcccaga aattc 45
<210>108
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>108
tggtcaaggt cacattcttc cagaatggaa aatcccagaa attc 44
<210>109
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>109
ggtcaaggtc acattcttcc agaatggaaa atcccagaaa ttc43
<210>110
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>110
gtcaaggtca cattcttcca gaatggaaaa tcccagaaat tc 42
<210>111
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>111
tcaaggtcac attcttccag aatggaaaat cccagaaatt c 41
<210>112
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>112
caaggtcaca ttcttccaga atggaaaatc ccagaaattc40
<210>113
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>113
aaggtcacat tcttccagaa tggaaaatcc cagaaattc 39
<210>114
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>114
aggtcacatt cttccagaat ggaaaatccc agaaattc 38
<210>115
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>115
ggtcacattc ttccagaatg gaaaatccca gaaattc 37
<210>116
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>116
gtcacattct tccagaatgg aaaatcccag aaattc36
<210>117
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>117
tcacattctt ccagaatgga aaatcccaga aattc 35
<210>118
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>118
cacattcttc cagaatggaa aatcccagaa attc 34
<210>119
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>119
acattcttcc agaatggaaa atcccagaaa ttc 33
<210>120
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>120
cattcttcca gaatggaaaa tcccagaaat tc 32
<210>121
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>121
attcttccag aatggaaaat cccagaaatt c31
<210>122
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>122
accactgtga ctgtggtttg cttgtgggat ggagaagg 38
<210>123
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>123
ccactgtgac tgtggtttgc ttgtgggatg gagaagg 37
<210>124
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>124
cactgtgact gtggtttgct tgtgggatgg agaagg36
<210>125
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>125
actgtgactg tggtttgctt gtgggatgga gaagg 35
<210>126
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>126
ctgtgactgt ggtttgcttg tgggatggag aagg 34
<210>127
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>127
tgtgactgtg gtttgcttgt gggatggaga agg 33
<210>128
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>128
gtgactgtgg tttgcttgtg ggatggagaa gg32
<210>129
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>129
tgactgtggt ttgcttgtgg gatggagaag g 31
<210>130
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>130
gactgtggtt tgcttgtggg atggagaagg 30
<210>131
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>131
actgtggttt gcttgtggga tggagaagg29
<210>132
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>132
ctgtggtttg cttgtgggat ggagaagg 28
<210>133
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>133
tgtggtttgc ttgtgggatg gagaagg 27
<210>134
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>134
gtggtttgct tgtgggatgg agaagg 26
<210>135
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>135
tggtttgctt gtgggatgga gaagg25
<210>136
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>136
ggtttgcttg tgggatggag aagg 24
<210>137
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>137
gtttgcttgt gggatggaga agg 23
<210>138
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>138
atgaaatcgg ggtaaaggag cctggaacac atcctgtgac40
<210>139
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>139
tgaaatcggg gtaaaggagc ctggaacaca tcctgtgac 39
<210>140
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>140
gaaatcgggg taaaggagcc tggaacacat cctgtgac 38
<210>141
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>141
aaatcggggt aaaggagcct ggaacacatc ctgtgac 37
<210>142
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>142
aatcggggta aaggagcctg gaacacatcc tgtgac36
<210>143
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>143
atcggggtaa aggagcctgg aacacatcct gtgac 35
<210>144
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>144
tcggggtaaa ggagcctgga acacatcctg tgac 34
<210>145
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>145
cggggtaaag gagcctggaa cacatcctgt gac 33
<210>146
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>146
ggggtaaagg agcctggaac acatcctgtg ac32
<210>147
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>147
gggtaaagga gcctggaaca catcctgtga c 31
<210>148
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>148
ggtaaaggag cctggaacac atcctgtgac 30
<210>149
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>149
gtaaaggagc ctggaacaca tcctgtgac29
<210>150
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>150
taaaggagcc tggaacacat cctgtgac 28
<210>151
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>151
aaaggagcct ggaacacatc ctgtgac 27
<210>152
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>152
aaggagcctg gaacacatcc tgtgac26
<210>153
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>153
aggagcctgg aacacatcct gtgac25
<210>154
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>154
aggagcctgg aacacatcct gtgac25
<210>155
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>155
ggagcctgga acacatcctg tgac 24
<210>156
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>156
gagcctggaa cacatcctgt gac 23
<210>157
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>157
gttcccaagc agcccttcca ttttactttc cagagactgg c 41
<210>158
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>158
ttcccaagca gcccttccat tttactttcc agagactggc40
<210>159
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>159
tcccaagcag cccttccatt ttactttcca gagactggc 39
<210>160
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>160
cccaagcagc ccttccattt tactttccag agactggc 38
<210>161
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>161
ccaagcagcc cttccatttt actttccaga gactggc 37
<210>162
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>162
caagcagccc ttccatttta ctttccagag actggc36
<210>163
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>163
aagcagccct tccattttac tttccagaga ctggc 35
<210>164
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>164
agcagccctt ccattttact ttccagagac tggc 34
<210>165
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>165
gcagcccttc cattttactt tccagagact ggc 33
<210>166
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>166
cagcccttcc attttacttt ccagagactg gc 32
<210>167
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>167
agcccttcca ttttactttc cagagactgg c31
<210>168
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>168
gcccttccat tttactttcc agagactggc 30
<210>169
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>169
cccttccatt ttactttcca gagactggc29
<210>170
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>170
ccttccattt tactttccag agactggc 28
<210>171
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>171
cttccatttt actttccaga gactggc 27
<210>172
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>172
tcattctatg tgctggagat ggtgtacagt agggtgagg 39
<210>173
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>173
cattctatgt gctggagatg gtgtacagta gggtgagg 38
<210>174
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>174
attctatgtg ctggagatgg tgtacagtag ggtgagg 37
<210>175
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>175
ttctatgtgc tggagatggt gtacagtagg gtgagg36
<210>176
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>176
tctatgtgct ggagatggtg tacagtaggg tgagg 35
<210>177
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>177
ctatgtgctg gagatggtgt acagtagggt gagg 34
<210>178
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>178
tatgtgctgg agatggtgta cagtagggtg agg 33
<210>179
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>179
atgtgctgga gatggtgtac agtagggtga gg32
<210>180
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>180
tgtgctggag atggtgtaca gtagggtgag g 31
<210>181
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>181
gtgctggaga tggtgtacag tagggtgagg 30
<210>182
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>182
tgctggagat ggtgtacagt agggtgagg29
<210>183
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>183
gctggagatg gtgtacagta gggtgagg 28
<210>184
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>184
ctggagatgg tgtacagtag ggtgagg 27
<210>185
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>185
tggagatggt gtacagtagg gtgagg 26
<210>186
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>186
ggagatggtg tacagtaggg tgagg25
<210>187
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>187
gagatggtgt acagtagggt gagg 24
<210>188
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>188
aggtagtgct caccatgacc cctaccgtct ctattttata gtgagc 46
<210>189
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>189
ggtagtgctc accatgaccc ctaccgtctc tattttatag tgagc 45
<210>190
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>190
gtagtgctca ccatgacccc taccgtctct attttatagt gagc 44
<210>191
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>191
tagtgctcac catgacccct accgtctcta ttttatagtg agc 43
<210>192
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>192
agtgctcacc atgaccccta ccgtctctat tttatagtga gc42
<210>193
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>193
gtgctcacca tgacccctac cgtctctatt ttatagtgag c 41
<210>194
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>194
tgctcaccat gacccctacc gtctctattt tatagtgagc40
<210>195
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>195
gctcaccatg acccctaccg tctctatttt atagtgagc 39
<210>196
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>196
ctcaccatga cccctaccgt ctctatttta tagtgagc 38
<210>197
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>197
tcaccatgac ccctaccgtc tctattttat agtgagc 37
<210>198
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>198
caccatgacc cctaccgtct ctattttata gtgagc36
<210>199
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>199
accatgaccc ctaccgtctc tattttatag tgagc 35
<210>200
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>200
ccatgacccc taccgtctct attttatagt gagc 34
<210>201
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>201
catgacccct accgtctcta ttttatagtg agc 33
<210>202
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>202
atgaccccta ccgtctctat tttatagtga gc32
<210>203
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>203
tgacccctac cgtctctatt ttatagtgag c 31
<210>204
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>204
gacccctacc gtctctattt tatagtgagc 30
<210>205
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>205
acccctaccg tctctatttt atagtgagc29
<210>206
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>206
ctcctcgccg caacccaact ggctctcctt ac32
<210>207
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>207
tcctcgccgc aacccaactg gctctcctta c 31
<210>208
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>208
cctcgccgca acccaactgg ctctccttac 30
<210>209
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>209
ctcgccgcaa cccaactggc tctccttac29
<210>210
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>210
tcgccgcaac ccaactggct ctccttac 28
<210>211
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>211
cgccgcaacc caactggctc tccttac 27
<210>212
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>212
gccgcaaccc aactggctct ccttac 26
<210>213
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>213
ccgcaaccca actggctctc cttac 25
<210>214
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>214
cgcaacccaa ctggctctcc ttac24
<210>215
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>215
gcaacccaac tggctctcct tac 23
<210>216
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>216
caacccaact ggctctcctt ac 22
<210>217
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>217
aaagaagtca ggattccatg gaggctggat aggaggtcc 39
<210>218
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>218
aagaagtcag gattccatgg aggctggata ggaggtcc 38
<210>219
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>219
agaagtcagg attccatgga ggctggatag gaggtcc 37
<210>220
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>220
gaagtcagga ttccatggag gctggatagg aggtcc 36
<210>221
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>221
aagtcaggat tccatggagg ctggatagga ggtcc35
<210>222
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>222
agtcaggatt ccatggaggc tggataggag gtcc 34
<210>223
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>223
gtcaggattc catggaggct ggataggagg tcc 33
<210>224
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>224
tcaggattcc atggaggctg gataggaggt cc32
<210>225
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>225
caggattcca tggaggctgg ataggaggtc c 31
<210>226
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>226
aggattccat ggaggctgga taggaggtcc 30
<210>227
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>227
ggattccatg gaggctggat aggaggtcc29
<210>228
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>228
gattccatgg aggctggata ggaggtcc 28
<210>229
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>229
attccatgga ggctggatag gaggtcc 27
<210>230
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>230
ttccatggag gctggatagg aggtcc 26
<210>231
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>231
tccatggagg ctggatagga ggtcc25
<210>232
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>232
ccatggaggc tggataggag gtcc 24
<210>233
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>233
catggaggct ggataggagg tcc 23
<210>234
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>234
agaggagcag ggatggaaga agagaggtat tccccttccc ac 42
<210>235
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>235
gaggagcagg gatggaagaa gagaggtatt ccccttccca c 41
<210>236
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>236
aggagcaggg atggaagaag agaggtattc cccttcccac40
<210>237
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>237
ggagcaggga tggaagaaga gaggtattcc ccttcccac 39
<210>238
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>238
gagcagggat ggaagaagag aggtattccc cttcccac 38
<210>239
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>239
agcagggatg gaagaagaga ggtattcccc ttcccac 37
<210>240
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>240
gcagggatgg aagaagagag gtattcccct tcccac36
<210>241
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>241
cagggatgga agaagagagg tattcccctt cccac 35
<210>242
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>242
agggatggaa gaagagaggt attccccttc ccac 34
<210>243
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>243
gggatggaag aagagaggta ttccccttcc cac 33
<210>244
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>244
ggatggaaga agagaggtat tccccttccc ac32
<210>245
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>245
gatggaagaa gagaggtatt ccccttccca c 31
<210>246
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>246
atggaagaag agaggtattc cccttcccac 30
<210>247
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>247
tggaagaaga gaggtattcc ccttcccac29
<210>248
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>248
ggaagaagag aggtattccc cttcccac 28
<210>249
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>249
gaagaagaga ggtattcccc ttcccac 27
<210>250
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>250
aagaagagag gtattcccct tcccac 26
<210>251
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>251
agaagagagg tattcccctt cccac 25
<210>252
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>252
gcctgagtcc agtttgccct caagcccaga tgc 33
<210>253
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>253
cctgagtcca gtttgccctc aagcccagat gc32
<210>254
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>254
ctgagtccag tttgccctca agcccagatg c 31
<210>255
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>255
tgagtccagt ttgccctcaa gcccagatgc 30
<210>256
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>256
gagtccagtt tgccctcaag cccagatgc29
<210>257
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>257
agtccagttt gccctcaagc ccagatgc 28
<210>258
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>258
gtccagtttg ccctcaagcc cagatgc 27
<210>259
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>259
tccagtttgc cctcaagccc agatgc 26
<210>260
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>260
ccagtttgcc ctcaagccca gatgc25
<210>261
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>261
cagtttgccc tcaagcccag atgc 24
<210>262
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>262
agtttgccct caagcccaga tgc 23
<210>263
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>263
gtttgccctc aagcccagat gc22
<210>264
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>264
tttgccctca agcccagatg c 21
<210>265
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>265
ttgccctcaa gcccagatgc 20
<210>266
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>266
tgccctcaag cccagatgc19
<210>267
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>267
agaccacaga cctggtcccc aaaagaaatg gaggcaatag g 41
<210>268
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>268
gaccacagac ctggtcccca aaagaaatgg aggcaatagg40
<210>269
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>269
accacagacc tggtccccaa aagaaatgga ggcaatagg 39
<210>270
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>270
ccacagacct ggtccccaaa agaaatggag gcaatagg 38
<210>271
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>271
cacagacctg gtccccaaaa gaaatggagg caatagg 37
<210>272
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>272
acagacctgg tccccaaaag aaatggaggc aatagg36
<210>273
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>273
cagacctggt ccccaaaaga aatggaggca atagg 35
<210>274
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>274
agacctggtc cccaaaagaa atggaggcaa tagg 34
<210>275
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>275
gacctggtcc ccaaaagaaa tggaggcaat agg 33
<210>276
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>276
acctggtccc caaaagaaat ggaggcaata gg 32
<210>277
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>277
cctggtcccc aaaagaaatg gaggcaatag g31
<210>278
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>278
ctggtcccca aaagaaatgg aggcaatagg 30
<210>279
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>279
tggtccccaa aagaaatgga ggcaatagg29
<210>280
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>280
ggtccccaaa agaaatggag gcaatagg 28
<210>281
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>281
gtccccaaaa gaaatggagg caatagg 27
<210>282
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>282
tccccaaaag aaatggaggc aatagg 26
<210>283
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>283
gtcttctggg ccactgactg atttgtgtgt aggaccctgg40
<210>284
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>284
tcttctgggc cactgactga tttgtgtgta ggaccctgg 39
<210>285
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>285
cttctgggcc actgactgat ttgtgtgtag gaccctgg 38
<210>286
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>286
ttctgggcca ctgactgatt tgtgtgtagg accctgg 37
<210>287
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>287
tctgggccac tgactgattt gtgtgtagga ccctgg36
<210>288
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>288
ctgggccact gactgatttg tgtgtaggac cctgg 35
<210>289
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>289
tgggccactg actgatttgt gtgtaggacc ctgg 34
<210>290
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>290
gggccactga ctgatttgtg tgtaggaccc tgg 33
<210>291
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>291
ggccactgac tgatttgtgt gtaggaccct gg32
<210>292
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>292
gccactgact gatttgtgtg taggaccctg g 31
<210>293
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>293
ccactgactg atttgtgtgt aggaccctgg 30
<210>294
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>294
cactgactga tttgtgtgta ggaccctgg29
<210>295
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>295
actgactgat ttgtgtgtag gaccctgg 28
<210>296
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>296
ctgactgatt tgtgtgtagg accctgg 27
<210>297
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>297
tgactgattt gtgtgtagga ccctgg 26
<210>298
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>298
gactgatttg tgtgtaggac cctgg25
<210>299
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>299
actgatttgt gtgtaggacc ctgg 24
<210>300
<211>801
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>300
agggagcccc taggggagaa cagagttgag gggggctcta gggctcaagg tttggctgag 60
ccaccccagc agcccccatt ctcctgctgc ctcacctggg ccccaggcag cagaaccagc 120
agcagcccca gaaggaggag gtgtagggtg gtgccacaca cccttgggag gaagagacgt 180
tcaggtggtg tcatggggag aacctgcaga gaaagagaga gagagagaga gacagtgagc 240
ggggcggggc acgcggcgga agacagacct cccgccctgg gagacagcac cccccgaccc 300
ccgagagaga gatcgacaga gaaggggaca agatgcagtc agagaaaccc caaggtgagc 360
agagggagac agagagagac aggaagggaa cagagaggaa ycatggcaga aacagagaat 420
gtgtgacaga gacaatgaga ctgacagatg gagagtcaga gacagagaag gaaaccaaaa 480
ccaaacccac caaggcccag gcccaggcag gccggggatc caggcagcag gtgcaggagg 540
gaccgaggcc caggcagagg gcaggacact gcggggcggt agtccaaagc acgaagcacg 600
ggcagcccaa ggagatgggg caggagagcc tcacctgctg tgtggagccc ctgggcccgg 660
acgctcaggt ccctttatag aggaagcggc agtggcagcg tggcaggcag cgggcgggtt 720
ctaggtcggg gctggggccc ggggaagccc ccagggctta gaagatactg ctgtttcagt 780
caaaggcagg aaaggctgag g801
<210>301
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>301
tgtttctgcc atggttcctc tc22
<210>302
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>302
gtttctgcca tggttcctct c 21
<210>303
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>303
tttctgccat ggttcctctc 20
<210>304
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>304
ttctgccatg gttcctctc19
<210>305
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>305
tctgccatgg ttcctctc18
<210>306
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>306
ctgccatggt tcctctc 17
<210>307
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>307
tgccatggtt cctctc 16
<210>308
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>探针
<400>308
gccatggttc ctctc 15
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<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>309
tttggtttcc ttctctgtct ctgactctcc atctgtc 37
<210>310
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>310
ttggtttcct tctctgtctc tgactctcca tctgtc36
<210>311
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>311
tggtttcctt ctctgtctct gactctccat ctgtc 35
<210>312
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>312
ggtttccttc tctgtctctg actctccatc tgtc 34
<210>313
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>313
gtttccttct ctgtctctga ctctccatct gtc 33
<210>314
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>314
tttccttctc tgtctctgac tctccatctg tc32
<210>315
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>315
ttccttctct gtctctgact ctccatctgt c 31
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<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>316
tccttctctg tctctgactc tccatctgtc 30
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<211>29
<212>DNA
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<220>
<223>引物
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ccttctctgt ctctgactct ccatctgtc29
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<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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cttctctgtc tctgactctc catctgtc 28
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<211>27
<212>DNA
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<220>
<223>引物
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ttctctgtct ctgactctcc atctgtc 27
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<211>26
<212>DNA
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<220>
<223>引物
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tctctgtctc tgactctcca tctgtc 26
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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ctctgtctct gactctccat ctgtc25
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<211>24
<212>DNA
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<223>引物
<400>322
tctgtctctg actctccatc tgtc 24
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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ctgtctctga ctctccatct gtc 23
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
<400>324
tgtctctgac tctccatctg tc22
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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gtctctgact ctccatctgt c 21
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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tctctgactc tccatctgtc 20
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<212>DNA
<213>人工序列
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ctctgactct ccatctgtc 19
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<211>18
<212>DNA
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<220>
<223>引物
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tctgactctc catctgtc 18
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<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
<400>329
ctgactctcc atctgtc17
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<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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cgacagagaa ggggacaaga tgcagtcaga gaaaccc 37
<210>331
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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gacagagaag gggacaagat gcagtcagag aaaccc36
<210>332
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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acagagaagg ggacaagatg cagtcagaga aaccc 35
<210>333
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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cagagaaggg gacaagatgc agtcagagaa accc 34
<210>334
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>334
agagaagggg acaagatgca gtcagagaaa ccc 33
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<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>335
gagaagggga caagatgcag tcagagaaac cc32
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<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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agaaggggac aagatgcagt cagagaaacc c 31
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<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>337
gaaggggaca agatgcagtc agagaaaccc 30
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<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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aaggggacaa gatgcagtca gagaaaccc29
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>339
aggggacaag atgcagtcag agaaaccc 28
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>340
ggggacaaga tgcagtcaga gaaaccc 27
<210>341
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>341
gggacaagat gcagtcagag aaaccc 26
<210>342
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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ggacaagatg cagtcagaga aaccc25
<210>343
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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gacaagatgc agtcagagaa accc 24
<210>344
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>引物
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acaagatgca gtcagagaaa ccc 23
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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caagatgcag tcagagaaac cc 22
<210>346
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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aagatgcagt cagagaaacc c 21
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<211>20
<212>DNA
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<220>
<223>引物
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agatgcagtc agagaaaccc 20
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<213>人工序列
<220>
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<400>348
gatgcagtca gagaaaccc19
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>349
atgcagtcag agaaaccc18
权利要求
1.一种多态性检测用探针，其特征在于，其为用于检测免疫相关基因的多态性的探针，由选自于下述(A)～(H)构成的组中的至少一个寡核苷酸构成
(A)与以序列号1中第193位的鸟嘌呤为第一位碱基，向3’方向直到第13～21位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为3’末端，
(B)与以序列号2中第191位的鸟嘌呤为第一位碱基，向3’方向直到第15～24位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为3’末端，
(C)与以序列号3中第311位的鸟嘌呤为第一位碱基，向5’方向直到第16～21位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为5’末端，
(D)与以序列号4中第391位的鸟嘌呤为第一位碱基，向3’方向直到第16～22位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为3’末端，
(E)与以序列号5中第426位的鸟嘌呤为第一位碱基，向5’方向直到第15～24位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为5’末端，
(F)与以序列号6中第165位的胞嘧啶为第一位碱基，向3’方向直到第16～27位碱基的区域序列相同的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以前述胞嘧啶为5’末端，
(G)与以序列号7中的第394位的鸟嘌呤为第一位碱基，向3，方向直到第12～16位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为3’末端，
(H)与以序列号300中第393位的鸟嘌呤作为第一位碱基，向3，方向直到第15～22位碱基的区域互补的至少一个寡核苷酸，该寡核苷酸以与前述鸟嘌呤互补的胞嘧啶为3’末端。
2.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，其中前述(A)～(H)的寡核苷酸分别为下述(A1)～(H1)的寡核苷酸
(A1)序列号14的碱基序列构成的寡核苷酸，
(B1)序列号23的碱基序列构成的寡核苷酸，
(C1)序列号30的碱基序列构成的寡核苷酸，
(D1)序列号36的碱基序列构成的寡核苷酸，
(E1)序列号47的碱基序列构成的寡核苷酸，
(F1)序列号57的碱基序列构成的寡核苷酸，
(G1)序列号64的碱基序列构成的寡核苷酸，
(H1)序列号306或序列号307的碱基序列构成的寡核苷酸。
3.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，前述探针是用于检测免疫相关基因FCGR3A基因的多态性的、由前述(A)的寡核苷酸构成的探针。
4.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，前述探针是用于检测免疫相关基因FCGR2A基因的多态性的、由前述(B)的寡核苷酸构成的探针。
5.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，前述探针是用于检测免疫相关基因IL-10基因的多态性的、由选自于前述(C)、(D)、(E)和(F)构成的组中的至少一个寡核苷酸构成的探针。
6.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，前述探针是用于检测免疫相关基因TNFα基因的多态性的、由前述(G)的寡核苷酸构成的探针。
7.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，前述探针是用于检测免疫相关基因TNFβ基因的多态性的、由前述(H)的寡核苷酸构成的探针。
8.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，前述探针是在前述寡核苷酸上结合了标记物质的标记探针。
9.根据权利要求8所述的多态性检测用探针，前述探针是单独显示信号且由于形成杂交体而不显示信号的标记探针，或单独不显示信号但由于形成杂交体而显示信号的标记探针。
10.根据权利要求8所述的多态性检测用探针，前述探针为在前述寡核苷酸上结合了作为前述标记物质的萤光色素的标记探针，其单独显示萤光且由于形成杂交体而萤光减少。
11.根据权利要求8所述的多态性检测用探针，前述探针是在前述寡核苷酸中具有胞嘧啶的末端核苷酸残基上结合了前述标记物质的标记探针。
12.根据权利要求1所述的多态性检测用探针，前述探针是Tm分析用的探针。
13.一种多态性检测用试剂，其特征在于，其为用于检测免疫相关基因的多态性的多态性检测用试剂，含有权利要求1所述的多态性检测用探针。
14.根据权利要求13所述的多态性检测用试剂，其含有两种以上的权利要求1所述的前述探针。
15.根据权利要求14所述的多态性检测用试剂，其含有用于检测FCGR3A基因的多态性的、由前述(A)的寡核苷酸构成的探针，和用于检测IL-10基因的多态性的、由前述(D)的寡核苷酸构成的探针。
16.根据权利要求14所述的多态性检测用试剂，其含有用于检测FCGR2A基因的多态性的、由前述(B)的寡核苷酸构成的探针，用于检测IL-10基因的多态性的、由前述(C)的寡核苷酸构成的探针，和用于检测TNFα基因的多态性的、由前述(G)的寡核苷酸构成的探针。
17.根据权利要求14所述的多态性检测用试剂，其含有用于检测IL-10基因的多态性的、由前述(E)的寡核苷酸构成的探针和由前述(F)的寡核苷酸构成的探针。
18.根据权利要求13所述的多态性检测用试剂，其还含有用于扩增前述免疫相关基因中含有检测目标的多态性的序列的引物。
19.根据权利要求18所述的多态性检测用试剂，前述探针和引物的组合为选自于以下组合构成的组中的至少一个组合由前述寡核苷酸(A)构成的探针及下述引物对(a)的组合，由前述寡核苷酸(B)构成的探针和下述引物对(b)的组合，由前述寡核苷酸(C)构成的探针和下述引物对(c)的组合，由前述寡核苷酸(D)构成的探针和下述引物对(d)的组合，由前述寡核苷酸(E)构成的探针和下述引物对(e)的组合，由前述寡核苷酸(F)构成的探针和下述引物对(f)的组合，由前述寡核苷酸(G)构成的探针和引物对(g)的组合，以及由前述寡核苷酸(H)构成的探针和下述引物对(h)的组合，
引物对(a)
含有由选自于序列号67～序列号86构成的组中的至少一个碱基序列构成的正向引物、和由选自于序列号87～序列号103构成的组中的至少一个碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(b)
含有由选自于序列号122～序列号137构成的组中的至少一个碱基序列构成的正向引物、和由选自于序列号104～序列号121构成的组中的至少一个碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(c)
含有由选自于序列号138～序列号156构成的组中的至少一个碱基序列构成的正向引物、和由选自于序列号157～序列号171构成的组中的至少一个碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(d)
含有由选自于序列号172～序列号187构成的组中的至少一个碱基序列构成的正向引物、和由选自于序列号188～序列号205构成的组中的至少一个碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(e)
含有由选自于序列号206～序列号216构成的组中的至少一个碱基序列构成的正向引物、和由选自于序列号217～序列号233构成的组中的至少一个碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(f)
含有由选自于序列号234～序列号251构成的组中的至少一个碱基序列构成的正向引物、和由选自于序列号252～序列号266构成的组中的至少一个碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(g)
含有由选自于序列号267～序列号282构成的组中的至少一个碱基序列构成的正向引物、和由选自于序列号283～序列号299构成的组中的至少一个碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(h)
含有由选自于序列号330～序列号349构成的组中的至少一个碱基序列构成的正向引物、和由选自于序列号309～序列号329构成的组中的至少一个碱基序列构成的反向引物的引物对。
20.根据权利要求19所述的多态性检测用试剂，前述引物对(a)～(h)分别为下述引物对(a1)～(h1)
引物对(a1)
含有由序列号77的碱基序列构成的正向引物和由序列号97的碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(b1)
含有由序列号132的碱基序列构成的正向引物和由序列号114的碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(c1)
含有由序列号148的碱基序列构成的正向引物和由序列号167的碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(d1)
含有由序列号182的碱基序列构成的正向引物和由序列号198的碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(e1)
含有由序列号213的碱基序列构成的正向引物和由序列号227的碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(f1)
含有由序列号244的碱基序列构成的正向引物和由序列号260的碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(g1)
含有由序列号277的碱基序列构成的正向引物和由序列号293的碱基序列构成的反向引物的引物对，
引物对(h1)
含有由序列号337的碱基序列构成的正向引物和由序列号312的碱基序列构成的反向引物的引物对。
21.一种多态性检测方法，其特征在于，其为免疫相关基因的多态性的检测方法，包括下述(1)～(3)工序
(1)准备反应体系的工序，所述反应体系含有检测前述多态性的待测核酸和权利要求1所述的多态性检测用探针，
(2)改变前述反应体系的温度，测定显示前述待测核酸和前述探针的杂交产物的熔解状态的信号值的工序，
(3)根据伴随温度变化的前述信号值的变动，决定前述待测核酸中的前述多态性的工序。
22.根据权利要求21所述的多态性检测方法，其中，前述(1)工序包括下述(1a)工序
(1a)在含有前述探针的反应体系中，通过核酸扩增法，由模板核酸生成作为前述待测核酸的扩增产物的工序。
23.根据权利要求22所述的多态性检测方法，其中，前述(1a)工序中使用用于扩增前述免疫相关基因中的含有检测目标的多态性的序列的引物。
全文摘要
本发明提供一种多态性检测用探针，其能够判断只有一个碱基不同的多态性。将选自于由序列号4、23、30、47、57和64组成的组中的至少一个寡核苷酸作为Tm分析中的探针使用。通过使用这些探针的Tm分析，能简便地检测影响抗体药物等的药效的FCGR3A基因、FCGR2A基因、IL-10基因、TNFα基因和TNFβ基因的特定的多态性。而且，根据这些探针，通过使两种以上的前述探针共存于反应体系中，能在同一反应体系中检测两种以上的多态性。
文档编号C12N15/09GK101652478SQ20088001163
公开日2010年2月17日 申请日期2008年10月3日 优先权日2007年10月9日
发明者平井光春, 间岛智史 申请人:爱科来株式会社