专利名称：：乳清蛋白水解物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种使用微生物内肽酶来生成乳清蛋白水解物的方法。
背景技术：
：蛋白质补充物(诸如乳清蛋白粉末)普遍被健身者和其它运动员用于加速肌肉发育和帮助恢复。同样地，此类蛋白质补充物对于临床营养是有用的。一般而言，预先消化的、经过部分水解的乳清蛋白比未水解的蛋白质更容易吸收，这便是为何蛋白质水解物被认为具有营养益处。但是未水解的乳清蛋白在味道方面清淡略有奶味(mildandslightlymilky)，而经过水解的乳清蛋白趋于尝起来完全不同，通常在某种程度上是不受多数人欢迎的。因此，在此类水解物使用在例如饮料中时，该味道不得不通过例如添加人造香料来掩至ΓΤΠο使用特定内肽酶来水解蛋白质是本领域已知的，参见例如W097/43910。对β-乳球蛋白(其是乳清蛋白中所存在的蛋白质之一)的水解已经在Madsen等(1997)，Int.DairyJournal，7，399-409页中进行了研究。还有，用不同蛋白酶水解β-乳球蛋白的表位记载于FoodProteinsandTheirApplications;Ed.S.Damodaran禾口A.Paraf;MarcelDekker，NewYork,1997；443-472页。发明概述本发明人令人惊讶地发现了一种用于生成乳清蛋白水解物的方法，其中用针对精氨酸和赖氨酸具有特异性的微生物内肽酶对所述乳清蛋白进行处理，接着使所述内肽酶失活，这产生具有可口味道的水解物。所述水解物可能甚至具有比未水解的乳清蛋白更好的味道。此外，通过本发明方法所获得的乳清蛋白水解物是稳定的，而且与用其它内肽酶获得的水解物相比在热处理时具有降低的胶化趋势。因此，本发明涉及一种用于生成乳清蛋白水解物的方法，包括a)提供包含β-乳球蛋白和α_乳清蛋白的乳清蛋白的水性组合物；b)使所述组合物受到在精氨酸或赖氨酸的羧基端一侧进行特异性切割的微生物内肽酶的作用；并c)使所述内肽酶失活。本发明还涉及通过上文方法所获得的乳清蛋白水解物在临床营养或能量饮料(energydrink)或运云力饮料(sportsdrink)中的用途。发明详述如上文所提及的，本发明涉及一种用于生成乳清蛋白水解物的方法，包括a)提供包含β-乳球蛋白和α_乳清蛋白的乳清蛋白的水性组合物；b)使所述组合物受到在精氨酸或赖氨酸的羧基端一侧进行特异性切割的微生物内肽酶的作用；c)使所述内肽酶失活。要在本发明方法中使用的乳清蛋白要理解为可从乳清获得的蛋白质，诸如自乳清分离的蛋白质。乳清可定义为在乳因酸和/或粗制凝乳酶(rennet)凝结时分开的液体部分。如此，乳清可以是来自干酪生产或来自酪蛋白生产的副产物。在本发明语境中的乳可以源自任何哺乳动物，诸如牛(cow)、山羊、绵羊、驴、骆驼、camelid、牦牛、或水牛。在一个优选的方面，所述乳是牛奶。要在本发明方法中使用的乳清蛋白包含乳球蛋白和α-乳清蛋白。它还可以包含可从乳清获得的其它蛋白质，诸如血清清蛋白。步骤a)的水性组合物还可以包含不可从乳清获得的其它蛋白质。在一个优选的方面，步骤a)的水性组合物包含占总干物质至少15%，诸如至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%或至少60%的β-乳球蛋白。在另一个优选的方面，步骤a)的水性组合物包含占总干物质至少5%，诸如至少10%、至少15%或至少20%的α-乳清蛋白。另一方面，步骤a)的水性组合物包含占总干物质至少1%、诸如至少2%、至少3%、至少4%或至少5%的血清清蛋白。在另一个优选的方面，步骤a)的水性组合物包含占总蛋白质至少15%(w/w(重量/重量))，诸如至少20%(w/w)、至少25%(w/w)、至少30%(w/w)、至少35%(w/w)、至少40%(w/w)、至少45%(w/w)、至少50%(w/w)、至少55%(w/w)或至少60%(w/w)的β-乳球蛋白。在另一个优选的方面，步骤a)的水性组合物包含占总蛋白质至少5%(w/w)，诸如至少10%(w/w)、至少15%(w/w)或至少20%(w/w)的α-乳清蛋白。另一方面，步骤a)的水性组合物包含占总蛋白质至少(w/w)，诸如至少2%(w/w)、至少3%(w/w),至少4%(w/w)或至少5%(w/w)的血清清蛋白。优选地，乳清蛋白已经从乳清中分离出来，且乳球蛋白和α-乳清蛋白之间的比率大体上与从中分离乳清蛋白的乳清中的相同。在一个优选的实施方案中，该方法中所使用的乳清蛋白可以是乳清蛋白浓缩物，其具有约29%至小于约90%(以无水物为基础)的蛋白质含量。乳清蛋白浓缩物含有低水平的脂肪和胆固醇，但是一般具有较高水平的乳糖形式的碳水化合物。在另一个实施方案中，乳清蛋白可以是乳清蛋白分离物。一般而言，乳清蛋白分离物具有至少约90%乳清蛋白(以无水物为基础)的蛋白质含量。一般而言，此类分离物已经进行了加工以除去脂肪和乳糖。要在本发明方法中使用的乳清蛋白可以是乳清蛋白浓缩物和乳清蛋白分离物的混合物。乳清蛋白可以包含完整的乳清蛋白或其可以包含经过部分水解的乳清蛋白。在本发明的方法中，乳清蛋白材料通常混合或分散在水中以形成包含约至约20%蛋白质(按重量计)的浆料。在一个实施方案中，所述浆料可以包含约至约5%蛋白质(按重量计)。在另一个实施方案中，所述浆料可以包含约6%至约10%蛋白质(按重量计)。在一个进一步的实施方案中，所述浆料可以包含约11%至约15%蛋白质(按重量计)。在又一个实施方案中，所述浆料可以包含约16%至约20%蛋白质(按重量计)。在蛋白质材料在水中分散后，可以对蛋白质浆料的ρΗ和温度进行调节以优化水解反应，具体地，以确保水解反应中所使用的内肽酶几乎以其最佳活性水平起作用。可以依照本领域普遍知道的方法对蛋白质浆料的PH进行调节和监测。可以对蛋白质浆料的PH进行调节，并维持在约5.0至约10.0。在一个实施方案中，可以对蛋白质浆料的ρΗ进行调节，并维持在约6.5至约8.0。在一个优选的实施方案中，可以对蛋白质浆料的ρΗ进行调节，并维持在约7.5。优选地，依照本领域中已知的方法在水解反应过程中对蛋白质浆料的温度进行调节，并维持在约40°C至约70°C。在一个优选的实施方案中，可以在水解反应过程中对蛋白质浆料的温度进行调节，并维持在约40°C至约60°C。一般而言，高于此范围的温度可能使内肽酶失活，而低于或高于此范围的温度趋于减缓内肽酶的活性。一般地，通过将内肽酶添加至蛋白质材料的浆料来启动水解反应。要在本发明方法中使用的内肽酶在精氨酸残基或赖氨酸残基中任一的羧基端一侧进行特异性切割。“特异性切割”意指内肽酶具有的在精氨酸或赖氨酸中任一的羧基端一侧进行切割的特异性高于在任何其它氨基酸的羧基端一侧进行切割的特异性。在一个实施方案中，所述内肽酶在精氨酸的羧基端一侧进行特异性切割，意味着所述内肽酶具有的在精氨酸的羧基端一侧进行切割的特异性高于在任何其它氨基酸的羧基端一侧进行切割的特异性。通常，内肽酶在pH约6.0至约11.0，优选地，pH约8至约10，且在约40°C至约70°C的温度，优选地，在约45°C至约60°C或约45°C至约55°C的温度具有最佳的蛋白水解活性。要在本发明方法中使用的内肽酶是微生物来源的。微生物酶(而不是动物或植物酶)的使用是有利的，有利之处在于微生物酶展现出广谱的特征(最适pH、温度等)，而且可以相对大量地一致地获得。优选地，所述内肽酶是微生物来源的胰蛋白酶样内肽酶。在本发明的语境中，胰蛋白酶样内肽酶是具有与胰蛋白酶的特异性类似的特异性的内肽酶，例如具有大于100的胰蛋白酶比率(Trypsinratio)的内肽酶，其中所述胰蛋白酶比率根据该酶在Arg或Lys后切割时的活性(取较大者)除以该酶在任何其它氨基酸之后切割时的活性来测定。应当在如下pH值进行用以测定胰蛋白酶比率的此类活性测量，内肽酶在所述pH值的活性至少是内肽酶在其最适PH的活性的一半。可以如本申请的实施例3中所描述的那样测定胰蛋白酶比率。在一个实施方案中，所述内肽酶是细菌内肽酶。在另一个实施方案中，所述内肽酶是真菌内肽酶。在一个优选的实施方案中，所述内肽酶来自镰孢属(Fusarium)菌株，优选地，来自尖镰孢(Fusariumoxysporum)，例如具有如本申请的SEQIDNO:2所示的氨基酸序列(SWISSPROTNo.P35049)。先前已经描述了来自尖镰孢的胰蛋白酶样内肽酶，其具有如SEQIDNO:2的氨基酸25-248所示的氨基酸序列(US5,288，627；US5,693，520)。在一个实施方案中，所述内肽酶是来自水解无色杆菌(Achromobacterlyticus)的胰蛋白酶样内肽酶，例如具有如本申请的SEQIDN0:4所示的氨基酸序列(UNIPR0TP15636)。在另一个实施方案中，所述内肽酶是来自腐皮镰孢(Fusariumsolani)的胰蛋白酶样内肽酶，例如具有如本申请的SEQIDN0:6所示的氨基酸序列(GENESEQP:ADZ80577)的AP977S。在另一个实施方案中，所述内肽酶是来自腐皮镰孢相似种(Fusariumcf.solani)的胰蛋白酶样内肽酶，例如具有如本申请的SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的AP971。在本发明的一个实施方案中，所述内肽酶选自下组i)多肽，其具有与如下的(A)或(B)至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%相同的氨基酸序列(A)SEQIDNO:2、4、6或8中任一，或⑶这些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段；ii)多肽，其由与SEQIDNO1、3、5或7中任一至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%相同的多核苷酸编码；iii)多肽，其由如下多核苷酸编码，所述多核苷酸的补体在至少低严格性条件，优选至少中等严格性、至少高严格性或至少极高的严格性条件下，与SEQIDN0:l、3、5或7中任一杂交；和iv)多肽，其具有通过在如下的㈧或⑶中取代、缺失、和/或插入一个或几个氨基酸而修饰的氨基酸序列(A)SEQIDNO:2、4、6或8中任一，或(B)这些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段。氨基酸序列中具有蛋白酶活性的片段可以是活性酶的氨基酸序列，例如在加工后，诸如在切除任何信号肽和/或前肽后。优选的片段是SEQIDNO:2的氨基酸25-248、SEQIDNO4的氨基酸21-653、SEQIDNO6的氨基酸26-251、或SEQIDNO8的氨基酸18-250。在本发明的一个优选实施方案中，所述内肽酶具有这样的氨基酸序列，其与SEQIDNO2的氨基酸25-248至少60%、70%、80%、85%、90%、95%或98%相同。极低的至极高的严格性条件定义为于42°C在5XSSPE、0.S^SDSJOOyg/ml经过剪切的且变性的鲑精DNA、和或是用于极低的和低的严格性的25%甲酰胺、或是用于中等的和中_高的严格性的35%甲酰胺、或是用于高的和极高的严格性的50%甲酰胺中遵循标准的Southern印迹规程进行最佳12至24小时的预杂交和杂交。最后，使用2XSSC、0.2%SDS，优选至少在45°C(极低的严格性)、更优选至少在50°C(低的严格性)，更优选至少在550C(中等严格性)，更优选至少在60°C(中-高严格性)，甚至更优选至少在65°C(高严格性)，和最优选至少在70°C(极高的严格性)清洗载体材料3次，每次15分钟。在一个具体的实施方案中，使用0.2X33(、0.2%303，优选至少在451(极低的严格性)、更优选至少在50°C(低的严格性)，更优选至少在55°C(中等严格性)，更优选至少在60°C(中-高严格性)，甚至更优选至少在65°C(高严格性)，和最优选至少在70°C(极高的严格性)进行清洗。在另一个具体的实施方案中，使用0.IX33(、0.2%303，优选至少在451(极低的严格性)、更优选至少在50°C(低的严格性)，更优选至少在55°C(中等严格性)，更优选至少在60°C(中-高严格性)，甚至更优选至少在65°C(高严格性)，和最优选至少在70°C(极高的严格性)进行清洗。就本发明而言，可以通过使用来自EMBOSS软件包(Rice，P.，Longden,I.andBleasby,Α.(2000)EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite.TrendsinGenetics16，(6)276-277页；http://emboss,org)第2.8.0版的Needle程序来确定两个氨基酸序列的比对。Needle程序执行Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453中所记载的全局比对算法。所使用的取代矩阵是BL0SUM62，缺口产生罚分是10，而缺口延伸罚分是0.5。两个氨基酸序列之间的同一性程度以两个序列比对中的精确匹配的数目除以两个序列中最短序列的长度来计算。结果以百分比同一性表示。精确匹配在两个序列在重叠的同一位置中具有相同氨基酸残基时发生。序列的长度是该序列中氨基酸残基的数目(例如SEQIDNO2的长度是248个氨基酸)。通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur禾口Lipman,1983,ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA80:726_730)使用LASERGENEMEGALIGN软件(DNASTAR，Inc.，Madison,WI)用同一性表和以下多重比对参数来测定两个核苷酸序列之间的同一性程度缺口罚分为10，且缺口长度罚分为10。成对比对参数是Ktuple=3、缺口罚分=3、和窗口=20。核苷酸序列之间的同一性程度以两个序列的比对中的精确匹配的数目除以两个序列中最短序列的长度来计算。结果以百分比同一性表示。精确匹配在两个序列在重叠的同一位置中具有相同核苷酸时发生。序列的长度是该序列中核苷酸的数目(例如SEQIDNO1的长度是744个核苷酸)。优选地，本发明的方法中所使用的微生物内肽酶量是每kg乳清蛋白约0.01至约500AU(如下文所定义的)，优选每kg乳清蛋白约0.1至约100AU，更优选每kg乳清蛋白约0.5至约50AU。一个安森单位(AnsonUnit,AU)定义为在标准条件(即25°C，pH7.5和10分钟反应时间)下以如下的起始速率消化血红蛋白的酶量，所述起始速率使得每分钟释放的TCA可溶性产物的量给出与一毫当量的酪氨酸相同的用酚试剂显现的颜色。根据蛋白质材料的来源、想要的水解程度、和水解反应的持续时间，向蛋白质材料所添加的内肽酶量可以且会有所变化。内肽酶量可以在每kg蛋白质材料约Img酶蛋白至约5000mg酶蛋白的范围。在另一个实施方案中，所述量可以在每kg蛋白质材料IOmg酶蛋白至约2000mg酶蛋白的范围。在又一个实施方案中，所述量可以在每kg蛋白质材料约50mg的酶蛋白至约IOOOmg的酶蛋白的范围。如技术人员可领会的，水解反应的持续时间可以且会有所变化。一般而言，水解反应的持续时间可以在少许几分钟至许多个小时的范围，诸如约30分钟至约48小时。优选地，用微生物内肽酶进行的处理导致这样乳清蛋白水解物，其具有约0.至约20%，更优选约0.5%至约10%或约0.5%至约8%，甚至更优选约1%至约5%的水解程度(DH)。水解程度(DH)表示通过该方法所获得的蛋白质水解的程度。在本发明的语境中，水解程度(DH)定义如下DH=(所切割的肽键数/肽键总数)χ100%技术人员会知道如何测量DH。在本发明方法的步骤C)中，使内肽酶失活。可以通过本领域中已知的任何方法来实施这种失活，例如通过加热至至少70°C，诸如至至少75°C或至少80°C。通过本发明方法所获得的乳清蛋白水解物可以在食品中(例如在饮料中)使用。此类食品的非限制性例子包括运动饮料或能量饮料。通过本发明方法所获得的乳清蛋白水解物还可以在临床营养中使用，例如在医院中使用。实施例实施例1使用5种不同的蛋白水解酶来水解来自AriaFoods,Denmark的乳清蛋白浓缩物(Lacprodan80)(包含占总干物质约80%的蛋白质)。酶和剂量是来自尖镰孢的胰蛋白酶样蛋白酶，剂量为500mg酶蛋白/kg原料。PTN6.0(NovozymesA/S)，剂量为原料的0.5%0Alcalase2.4L(NovozymesA/S)，剂量为原料的0·2%。Neutrase0.8L(NovozymesA/S)，剂量为原料的1%。Protamex1.5MG(NovozymesA/S)，剂量为原料的0.5%。添加酶之前将乳清蛋白浓缩物与水(19)混合。水解在烧杯中于50°C发生，所述烧杯安装有碱(0.INNaOH)添加剂量系统以将pH保持在PH7.5不变，直至水解程度(DH)=4%。将样品加热至85°C以使酶失活，并在感觉小组中测试。使用三个一组测试(triangletest)来比较用微生物胰蛋白酶样蛋白酶所获得水解物与用其它4种酶所获得的每一种水解物。6位小组成员各接受3个编码的样品。他们被告知样品中的两个是相同的而一个是不同的。要求各位小组成员鉴别出单独的样品。下表中“正确答案”的数目指明能够鉴别出单独样品的小组成员数。各位小组成员还被要求选出每项三个一组测试中苦味最小的样品。用Alcalase、Neutrase和Protamex制备的样品在巴斯德消毒法过程中均具有明显的凝胶化趋势。用PTN和微生物胰蛋白酶样蛋白酶制备的样品保持同质。在味觉评估之前将样品稀释至3%蛋白质含量。下文显示了来自三个一组味觉评估的结果。MTP是来自尖镰孢的实验用微生物胰蛋白酶样蛋白酶。该评估中包括6位小组成员。如果给出至少5个正确答案(第2列)，那么认为样品之间的差异是显著的。第3列和第4列是(在第2列具有正确答案的小组成员中)发现任一样品具有较小苦味的小组成员的数目__正确答案__苦亨较小_试验1,PTN5__PTN__MTP______23.试验2,Alcalase4Alcalase__MTP_______2试验3,Neutrase2Neutrase__MTP--__1__试验4,Protamex3Protamex__MTP__2_1_该结果显示了MTP和PTN生成的样品之间有显著性差异，其中因为MTP生成的样品没有PTN生成的样品苦，所以选择MTP生成的样品。MTP生成的样品和用没有Lys和Arg特异性的酶(Alcalase，Neutrase,Protamex)生成的任何样品之间没有显示显著性差异。实施例2使用5种不同的蛋白水解酶来水解来自L印rinoFoodS，US的乳清蛋白浓缩物(包含占总干物质约80%的蛋白质)。酶和剂量是来自尖镰孢的胰蛋白酶样蛋白酶，剂量为500mg酶蛋白/kg原料。PTN6.0(NovozymesA/S)，剂量0.5%的原料。Alcalase2.4L(NovozymesA/S)，剂量为原料的0.2%。Neutrase0.8L(NovozymesA/S)，剂量为原料的1%。Protamex1.5MG(NovozymesA/S)，剂量为原料的0.5%。添加酶之前将乳清蛋白浓缩物与水(19)混合。水解在烧杯中于50°C发生，所述烧杯安装有碱(0.INNaOH)添加剂量系统以将pH保持在PH7.5不变，直至水解程度(DH)=4%。将样品加热至85°C以使酶失活，并在感觉小组中测试。使用三个一组测试来比较用微生物胰蛋白酶样蛋白酶所获得水解物与用其它4种酶所获得的每一种水解物。7位小组成员各接受3个编码的样品。他们被告知样品中的两个是相同的而一个是不同的。要求各位小组成员鉴别出单独的样品。下表中“正确答案”的数目指明能够鉴别出单独的样品的小组成员数。各位小组成员还被要求选出每项三个一组测试中苦味最小的样品。所有样品在巴斯德消毒法期间/之后均保持同质。在味觉评估之前将样品稀释至3%蛋白质含量。下文显示了来自三个一组味觉评估的结果。MTP是来自尖镰孢的实验用微生物胰蛋白酶样蛋白酶。该评估中包括7位小组成员。如果给出至少5个正确答案(第2列)，那么认为样品之间的差异是显著的。第3列和第4列是(在第2列具有正确答案的小组成员中)发现任一样品具有较小的苦味的小组成员数<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>该结果显示了用MTP生成的样品和用Alcalase或PTN生成的样品之间有显著性差异，其中因为MTP生成的样品没有Alcalase和PTN生成的两种样品苦，所以选择MTP生成的样品。实施例3胰蛋白酶比率的定义、测量和计算Mfi为了进行可测量的测定法以测定胰蛋白酶样内肽酶活性，我们使用了10种具有通式Suc-AAPX-pNA的不同显色底物，在所述通式Suc-AAPX-pNA中X是20种天然氨基酸残基之一的单字母缩写。该内肽酶会在X的羧基端一侧进行切割，并释放可以被测量的黄色(对硝基苯胺)。我们使用了可从Bachem获得的这10种不同Suc-AAPX-pNA底物(X=A、R、D、E、I、L、K、M、F和V)以进行我们所称的胰蛋白酶比率的测量和计算。胰蛋白酶样内肽酶在本发明的语境中可定义为具有大于100的胰蛋白酶比率的内肽酶。胰蛋白酶比率以对Suc-AAPR-pNA或Suc_AAPK-pNA的最大活性除以对8种其它Suc-AAPX-pNA底物之任一种的最大活性来计算胰蛋白酶比率=对Suc-AAP(R/K)-pNA的最大活性/对Suc-AAP(非R/K)-pNA的最大活性应当在如下pH值进行活性测量，其中在所述PH值的活性至少是在最适pH的活性的一半。材料和方法Suc-AAPX-pNA测定法底物Suc-AAPA-pNA(BachemL-1775)Suc-AAPR-pNA(BachemL-1720)Suc-AAPD-pNA(BachemL-1835)Suc-AAPE-pNA(BachemL-1710)Suc-AAPI-pNA(BachemL—1790)Suc-AAPL-pNA(BachemL-1390)Suc-AAPK-pNA(BachemL-1725)Suc-AAPM-pNA(BachemL—1395)Suc-AAPF-pNA(BachemL-1400)Suc-AAPV-pNA(BachemL-1770)温度室温(25°C)测定缓冲液100mM琥珀酸、IOOmMHEPESUOOmMCHESUOOmMCABSUmMCaCl2,150mMKCUO.01%TritonX-100，pH9.0。测定法将20ul(微升)肽酶稀释物(在0.01%TritonX-100中稀释)置于微量滴定板的孔中。通过添加200ulpNA底物(50mg在1.0mlDMSO中溶解，并用测定缓冲液进一步稀释90x)来开始该测定法。监测OD4tl5的起始增加，作为对肽酶活性的测量。若在4分钟测量时间中没有实现线性(或接近线性)的曲线，则进一步稀释肽酶，并重复该测定法。肽酶Alcalase(NovozymesA/S,Denmark)水解无色杆菌赖氨酰_内肽酶(SEQIDNO4)来自尖镰孢的胰蛋白酶样蛋白酶猪胰蛋白酶(NovozymesA/S,Denmark)通过层析将所有的酶纯化至高纯度。在经考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上针对每种肽酶仅看到一条条带。肽酶的特征Alcalase对Suc—AAPF—pNA的pH最佳=pH9。水解无色杆菌蛋白酶对Suc-AAPK-pNA的pH最佳=pH10。镰孢属胰蛋白酶样蛋白酶对Boc-VLGR-pNA的pH最佳=pH10。猪胰蛋白酶对Boc-VLGR-pNA的pH最佳=pH10。MM肽酶在pH9对Suc-AAPX-pNA底物的特异性和胰蛋白酶比率的计算在pH9实施特异性实验。如在材料和方法段落中所看到的，3种测试的肽酶具有ρΗΛβ>pH9。然而，对于这3种肽酶，在pH9的活性大于在活性的一半。在下表中显示了该结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>可以看出，依照我们的定义，水解无色杆菌蛋白酶、镰孢属胰蛋白酶样蛋白酶和猪胰蛋白酶是胰蛋白酶样内肽酶。而Alcalase不是胰蛋白酶样内肽酶。权利要求一种用于生成乳清蛋白水解物的方法，包括a)提供包含β-乳球蛋白和α-乳清蛋白的乳清蛋白的水性组合物；b)使所述组合物受到在精氨酸或赖氨酸的羧基端一侧进行特异性切割的微生物内肽酶的作用；c)使所述内肽酶失活。2.权利要求1的方法，其中所述微生物内肽酶是真菌内肽酶。3.权利要求2的方法，其中所述真菌内肽酶源自镰孢属菌株。4.权利要求3的方法，其中所述真菌内肽酶源自尖镰孢菌株。5.上述权利要求任一项的方法，其中所述内肽酶在PH约8至约10具有最佳的蛋白水解活性。6.上述权利要求任一项的方法，其中所述内肽酶在约45°C至约60°C的温度具有最佳的蛋白水解活性。7.上述权利要求任一项的方法，其中所述内肽酶选自下组i)多肽，其具有与(A)SEQIDNO:2、4、6或8中任一，或⑶这些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段至少60%相同的氨基酸序列；ii)多肽，其由与SEQIDNO:1、3、5或7中任一至少60%相同的多核苷酸编码；iii)多肽，其由如下多核苷酸编码，所述多核苷酸的补体在低严格性条件下与SEQIDNO:1、3、5或7中任一杂交；和iv)多肽，其具有通过在(A)SEQIDN0:2、4、6或8中任一，或⑶这些序列中任一的具有蛋白酶活性的片段中取代、缺失、和/或插入一个或几个氨基酸而修饰的氨基酸序列。8.上述权利要求任一项的方法，其中所述内肽酶具有与SEQIDNO:2的氨基酸25-248至少60%相同的氨基酸序列。9.上述权利要求任一项的方法，其中所述乳清蛋白是乳清蛋白浓缩物或乳清蛋白分离物。10.上述权利要求任一项的方法，其中所述乳清蛋白的水溶液包含占总干物质至少5%的α-乳清蛋白。11.上述权利要求任一项的方法，其中所述乳清蛋白水解物具有约0.至约20%的水解程度。12.权利要求11的方法，其中所述乳清蛋白水解物具有约0.5%至约8%的水解程度。13.上述权利要求任一项的方法，其中步骤c)包括加热至至少70°C。14.上述权利要求任一项的方法，其中所述内肽酶以每kg乳清蛋白0.Ol-IOg酶蛋白的浓度添加。15.通过上述权利要求任一项的方法所获得的乳清蛋白水解物在临床营养中的用途。16.通过权利要求1-14任一项的方法所获得的乳清蛋白水解物在运动饮料中的用途。全文摘要本发明涉及一种使用在精氨酸或赖氨酸的羧基端一侧特异性切割的微生物内肽酶来生成乳清蛋白水解物的方法。本发明还涉及此乳清蛋白水解物在运动饮料或临床营养中的用途。文档编号A23J3/34GK101801209SQ200880012256公开日2010年8月11日申请日期2008年4月16日优先权日2007年4月16日发明者吉特·B·林雷夫,珀·M·尼尔森申请人:诺维信公司