专利名称：：使用高活性酮醇酸还原异构酶来发酵生产异丁醇的制作方法使用高活性酮醇酸还原异构酶来发酵生产异丁醇发明领域本发明涉及工业微生物和醇生产领域。更具体地讲，通过使用特殊的酮醇酸还原异构酶(KARI)以高转换数工业发酵重组;徵生物来生产异丁醇。本发明还涉及从自然微生物中发现高活性KARI酶的方法。
背景技术：
：丁醇是一种重要的工业化学品，其可用作燃料添加剂、塑料工业中的化学原料以及食品和香料工业中的食品级萃取剂。每年，通过石油化学手4殳生产100至120亿磅的丁醇，并且对该日用化学品的需求可能还会增加。用于化学合成异丁醇的方法是已知的，如羰基合成、一氧化碳催化氢化(Ullmann，sEncyclopediaofIndustrialChemistry,第6版,2003,Wiley-VCHVerlagGmbHandCo.,Weinheim,Germany,Vol.5,pp.716-719)和曱醇与正丁醇的格尔伯特缩合(Carlmi等人，J.Molec.Catal.A:Chem.220,215-220,2004)。这些工艺利用衍生自石油化学品的起始材料并通常昂贵，并且对环境不友好。用衍生自植物的原材料生产异丁醇将会使温室气体排放达到最低程度并将代表本领域的进步。异丁醇在生物学上作为酵母发酵的副产物产生。它是"杂醇油"的一种组分，杂醇油由这群真菌氨基酸的不完全代谢形成。异丁醇具体地讲由L-缬氨酸的分解代谢而产生。在L-缬氨酸的胺基作为氮源被利用后，所得的ot-酮酸被酶脱羧并还原成异丁醇，这就是所谓的Ehrlich途径(Dickinson等人，J.Biol.Chem.273,25752-25756,1998)。饮料发酵过程中获得的杂醇油和/或其组分的收率通常^L低。例如，据报道在啤酒发酵中产生的异丁醇的浓度小于16ppm(Garcia等人，ProcessBiochemistry29,303-309,1994)。发酵中加入外源L-缬氨酸可提高异丁醇的收率，如Dickinson等人所述，同上，其中据报道通过在发酵中提供浓度为20g/L的L-缬氨酸能获得3g/L的异丁醇收率。此外，海藻酸钙固定化的运动发酵单胞菌细胞已经显示能产生正丙醇、异丁醇和异戊醇。使用了补充有L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、a-酮异己酸(a-KCA)、a-酮丁酸(a-KBA)或a-酮异戊酸(a-KVA)的10%含葡萄糖培养基(Oaxaca,等人，ActaBiotechnol.;11,523-532,1991)。a-KCA提高了异丁醇含量。氨基酸提供了对应的醇，但其数量少于酮酸。当将亮氨酸、异亮氨酸和/或缬氨酸作为氮源加入培养基时，来自碳水化合物的C3-C5醇的收率显示增加(WO2005040392)。虽然上述方法显示了经由生物方法生产异丁醇的潜力，但是这些方法当用于工业规模的异丁醇生产时受到成本的制约。从糖直接生物合成异丁醇将是经济上可行的并将代表本领域的进步。然而，该生产受到低速酮醇酸还原异构酶(KARI)的严重阻碍，所述酶催化将乙酰乳酸转化为二羟基异戊酸的异丁醇途径中的第二步。因为所述酶已经是高水平表达的(S.Epelbaum等人J.Bacteriol.,180,4056-4067,1998)，需要在不增加蛋白质数量的情况下提高KARI酶的活性，即，提高酶比活。申请人已经通过发现一种具有高比活的KARI酶解决了所述问题，所述酶可被用于提高异丁醇的生物性生产。发明概述本发明涉及表达高活性KARI酶的重组生物体。工程化微生物具有高含量的短型KARI酶，所述酶具有显著更高的比活(大肠杆菌中的KARI酶的6-8倍)并可用于异丁醇的商业生产。因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于将乙酰乳酸转化为二羟基异戊酸的方法，该方法包括a)提供包含编码多肽的基因构建体的微生物宿主细胞，所述多肽具有大于大肠杆菌的酮醇酸还原异构酶比活的酮醇酸还原异构酶比活；以及b)使所述(a)的宿主细胞接触乙酰乳酸，其中产生2,3-二羟基异戊酸。在一个优选的实施方案中，基因构建体编码具有基于纯化蛋白大于1.1(imol/min/mg的酮醇酸还原异构酶比活的多肽，所述比活通过在以下条件下进4亍的NADPH消碑毛测定法来测量a)约7.5的pH值；b)约22.5。C的温度；和6c)大于约10mM的钾。在另一个实施方案中，本发明提供了生产异丁醇的方法，该方法包括a)提供包括下列基因构建体的重组微生物宿主细胞1)至少一种编码乙酰乳酸合酶的基因构建体，所述乙酰乳酸合酶将丙酮酸转化为乙酰乳酸(途径步骤a);2)至少一种编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体，所述酮醇酸还原异构酶的比活基于纯化蛋白大于l.lpmol/min/mg,所述比活通过在以下条件下进^亍的NADPH消4毛测定法来测量i)约7.5的pH值；ii)约22.5。C的温度；和iii)大于约10mM的钾，所述钾用于将(S)-乙酰乳酸转化为2,3-二羟基异戊酸，(途径步骤b);3)至少一种编码乙酰羟酸脱水酶的基因构建体，所述乙酰羟酸脱水酶用于将2,3-二羟基异戊酸转化为a-酮异戊酸，(途径步骤c);4)至少一种编码支链酮酸脱羧酶的基因构建体，所述支链酮酸脱羧酶用于将a-酮异戊酸转化为异丁醛，(途径步骤d);5)至少一种编码支链醇脱氢酶的基因构建体，所述支链醇脱氲酶用于将异丁醛转化为异丁醇(途径步骤e);以及b)使(a)的宿主细胞在产生异丁醇的条件下生长。在另一个实施方案中，本发明提供包括酮醇酸还原异构酶的重组宿主细胞，所述酶具有的比活大于大肠杆菌酮醇酸还原异构酶的比活。在另一个实施方案中，本发明提供用于鉴定和分离编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体的方法，所述酶具有基于纯化蛋白大于l.lpmol/min/mg的比活，所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消谇毛测定法来测量i)约7.5的pH值；ii)约22.5。C的温度；和iii)大于约10mM的4甲；该方法包括以下步骤a)筌定当在M9基本培养基中生长时倍增时间短于大肠杆菌的倍增时间的菌种；b)筛选(a)的菌种的酮醇酸还原异构酶活性以鉴定活性菌种；c)使用与已知编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体具有同源性的核酸序列来探测(b)活性菌种的基因组DNA,以从所述活性菌种中鉴定和分离编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体；以及d)从所述活性菌种中扩增并表达编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体；以及e)从步骤(d)的表达的基因构建体中筛选具有基于纯化蛋白大于l.lpmol/min/mg的比活的酮醇酸还原异构酶的基因构建体，所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消耗测定法来测量i)约7.5的pH值；ii)约22.5。C的温度；和iii)大于约10mM的4甲。和本发明的序列通过下面的具体实施方式、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明，这些详细描述、附图和序列描述形成了本专利申请的一部分。图1显示了四种不同的异丁醇生物合成途径。标记有"a"、"b"、"c"、"d"、"e"、"f，、"g"、"h"、'T，、"j"和"k"的步骤代表下述的底物到产物的转化。下面的序列遵照37C.F.R.1.821-1.825("RequirementsforPatentApplicationsContainingNucleotideSequencesand/orAminoAcidSequenceDisclosures-theSequenceRules"(，寸含有才亥酸序列禾口/或氨基酸序列公开的专利申请的要求一序列规则))，并且符合WorldIntellectualPropertyOrganization(世界知识产权组织，WIPO)ST.25标准(1998)以及EPO和PCT的序列清单要求(规则5.2和49.5(a-bis)以及AdministrativeInstructions(行政指令)的第208节和附录C)。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式均遵照37C.F.R.§1.822中列出的规则。表1优选的异丁醇途径的基因和蛋白质SEOIDNO:的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>SEQIDNO:11-22是用于生成实施例1中构建体的寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQIDNO:23-30是用于生成实施例2中构建体的寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQIDNO:11和12是实施例1中用于ilvC基因的PCR扩增的引物的DNA序列SEQIDNO:13是用于克隆大肠杆菌pBAD载体中的KARI基因的正向引物DNA序列SEQIDNO:14是用于克隆大肠杆菌pBAD载体中的KARI基因的反向引物DNA序列SEQIDNO:15是用于扩增KARI基因的ilvC-trc-SacI-F的正向DNA序列SEQIDNO:16是用于扩增KARI基因的ilvC-trc-HindIII-R的反向DNA序列SEQIDNO:17至22是用于通过SacI消化和DNA测序确认大肠杆菌ilvC插入序列存在的寡核苷酸引物的核苷酸序列。SE(5IDNO17-ilvC國trc-F3SEQIDNO18-ilvC-trc-F5SEQIDNO19-ilvC-trc-R2SEQIDNO20-ilvC-trc隱R4SEQIDNO21-pBAD-eFl9SEQIDNO:22-PALPK-R1SEQIDNO:23至26是用于通过PCR从铜绿假单胞菌(PAOl)和荧光假单胞菌(PF5)的基因组DNA中正向和反向扩增ilvC基因的寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQID#23-PA〇1-C-F1SEQIDNO:24-PA01-C-R1SEQIDNO:25-PF5-C-F1SEQIDNO:26-PF5-C-R1SEQIDNO:21、22、27和28是用于验证包含假单胞菌属ilvC基因的阳性克隆DNA序列的寡核苷酸引物的核苷酸序列。SEQIDNO:27-PF5-S-F2SEQIDNO:28-PF5-S-R2以下SEQIDNO对应于本发明中^f吏用的KARI基因的DNA序列SEQIDNO:29-大肠杆菌K12-ilvCSEQIDNO:30-经密码子最优化的KARI，来自弧菌，用于大肠杆菌表达SEQIDNO:31-铜绿假单胞菌-PAOl-ilvCSEQIDNO:32-荧光假单胞菌隱PF5-ilvC以下SEQIDNO是分别对应于SEQIDN029-32的氨基酸序列SEQIDNO:33-大肠杆菌K12-ilvC-[KARI来自大肠杆菌K12]34-KARI,来自霍乱弧菌35-PAOl國ilvC(laa-338aa)36-PF5-ilvC(laa-338aa)37是正向引物PAL-F1——38是反向引物(PAL-R1)39是正向引物(PAL-EcoRl-Fl)40是反向引物(PAL-EcoRl-Rl)SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:发明详述本发明涉及一种使用包含高活性KARI酶的微生物宿主细胞将乙酰乳酸转化为2,3-二羟基异戊酸的方法。由此形成的2,3-二羟基异戊酸经由图1显示的步骤被进一步转化为异丁醇。本发明还公开了用于在它们的天然宿主微生物中寻找快速KARI酶的方法和可用于进一步改善它们的催化活性的此类酶的分子进化。本发明满足多种商业需求和工业需求。丁醇是一种具有多种应用的重要工业日用化学品，其中其作为燃料或燃料添加剂的潜力尤为重要。尽管丁醇仅仅是一种四碳醇，但是其具有与汽油相似的能含量，并且可以与任何化石燃料共混。丁醇是优选的燃料或燃料添加剂，因为它在标准内燃机中燃烧时仅生成C02并且几乎不产生或根本不产生SOx或NOx。另夕卜，丁醇的腐蚀性不及乙醇，是目前为止最优选的燃料添加剂。丁醇除了可用作生物燃料或燃料添加剂之外，在新兴的燃料电池工业中还具有影响氢分配问题的潜力。如今，由于氢的运输和分配存在安全隐患，燃料电池饱受困扰。可以容易地对丁醇重整其氢含量，并且可以通过现有的加油站以燃料电池或汽车所需的纯度进行分配。以下定义和缩写用于权利要求和说明书的判读。如本文所用，术语"发明"或"本发明"一般应用于如权利要求中所述的本发明所有实施方案，或如说明书中提供的或后经修正或补充的所有实施方案。术语"异丁醇生物合成途径"是指用以生产异丁醇的酶途径。优选的异丁醇生物合成途径在图1中示出并如本文所述。术语"NADPH消耗测定法"是指用于确定KARI酶比活的酶测定法，涉及测量酶反应中KARI辅因子NADPH的消冲毛，如下文所述(Aulabaugh等人；Biochemistry,29，2824-2830，1990)。"KARI"是酮醇酸还原异构酶的缩写。术语"乙酰鞋酸还原异构酶"和"酮醇酸还原异构酶"可互换使用，是指EC编号为EC1丄1.86(EnzymeNomenclature1992,AcademicPress,SanDiego)的酶。酮醇酸还原异构酶催化(S)-乙酰乳酸转化为2,3-二羟基异戊酸的反应，这将在下文中详迷。这些酶可得自多个来源，包括但不限于大肠杆菌基因库保藏编号(GenBankAccessionNumber)NC_000913区域3955993..3957468、霍乱弧菌基因库保藏编号NC—002505区域157441..158925、铜绿假单胞菌基因库保藏编号NC—002516区域5272455..5273471和荧光假单胞菌基因库保藏编号NC—004129区域6017379..6018395。术语"乙酰乳酸合酶"是指催化丙酮酸转化为乙酰乳酸和C02的酶。乙酰乳酸具有(R)-和(S)-两种立体异构体，所述酶优选通过生物体系制备的(S)-异构体。优选的乙酰乳酸合酶已知其EC编号为EC2.2.1.69(EnzymeNomenclature1992,AcademicPress,SanDiego)。这些酶可得自多种来源，包括但不限于枯草芽孢杆菌(基因库编号(GenBankNo):CAB15618,Z99122,分别是NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)氨基酸序列、NCBI核苷酸序列)、肺炎克雷伯氏菌(基因库编号AAA25079(SEQIDNO:2)、M73842(SEQIDNO:1))和乳酸乳球菌(基因库编号AAA25161,L16975)。术语"乙酰羟酸脱水酶"是指催化2,3-二羟基异戊酸转化为a-酮异戊酸的酶。优选的乙酰羟酸脱水酶已知其EC编号为EC4.2丄9。这些酶可得自多种微生物，包括但不限于大肠杆菌(基因库编号YP—026248(SEQIDNO:6)、NC—000913(SEQIDNO:5))、啤酒糖酵母(基因库编号NP—012550,NC—001142)、海沼曱烷J求菌(基因库编号CAF29874,BX957219)和菌株枯草芽孢#干菌(基因库编号CAB14105,Z99115)。术语"支链a-酮酸脱羧酶"是指催化a-酮异戊酸转化为异丁醛和C02的酶。优选的支链a-酮酸脱羧酶已知其EC编号为EC4.1.1.72,并可得自多种来源，包括4旦不限于乳酸乳球菌(基因库编号AAS49166,AY548760;CAG34226(SEQIDNO:8),AJ746364、鼠伤寒沙门氏菌(基因库编号NP—461346,NC—003197)和丙酮丁醇梭菌(基因库编号NP—149189,NC—001988)。术语"支链醇脱氲酶"是指催化异丁醛转化为异丁醇的酶。优选的支链醇脱氳酶已知其EC编号为EC1.1.1.265,但也可以将其归类为其他醇脱氩酶(具体地讲，ECl丄l.l或1.1.1.2)。这些酶利用NADH(还原型烟酰胺腺噤呤二核苷酸)和/或NADPH作为电子供体并可得自多种来源，包括但不限于啤酒糖酵母(基因库编号NP—010656,NC_001136;NP—014051,NC—001145)、大肠杆菌(基因库编号NP—417484(SEQIDNO:10),NC—000913(SEQIDNO:9))和丙酮丁醇梭菌(基因库编号NP—349892,NC—003030)。术语"支链酮酸脱氲酶"是指催化a-酮异戊酸转化为异丁酰-CoA(异丁酰-辅酶A)的酶，-使用NAD+(烟酰胺腺噤呤二核苷酸)作为电子受体。优选的支链酮酸脱氬酶已知其EC编号为EC1.2.4.4。这些支链酮酸脱氲酶由四个亚基构成，并且来自所有亚基的序列可得自多种微生物，包括但不限于菌抹枯草芽孢杆菌(基因库编号CAB14336,Z99116;CAB14335,Z99116;CAB14334,Z99116;和CAB14337,Z99116)和恶臭假单胞菌(基因库编号AAA65614,M57613;AAA65615,M57613;AAA65617,M57613;和AAA65618,M57613)。术语"碳底物"或"可发酵碳底物"指能够被本发明的宿主生物体代谢的碳源，并且特别是选自由下列的碳源单糖、低聚糖、多糖和一石灰底物或它们的混合物。术语"keat"和"Km"是本领域的技术人员已知的，并被描述于EnzymeStructureandMechanism,第2版(Ferst;W丑Freeman:NY,1985;pp98-120)。术语"kcat"，也常称之为"转换数"，定义为每个活性位点每单位时间内将底物分子转化为产物的最大数目，或每单位时间内的酶转换次数。kcat=Vmax/[E]，其中[E]是酶浓度(Ferst,同上)。术语"总转换"和"总转换数"本文用于指KARI酶与底物反应形成的产物的量。术语"催化效率"定义为酶的keat/KM。"催化效率"用于测定酶对底物的特异性。术语"比活"是指酶单位/mg蛋白，其中酶单位定义为在特定温度、pH、[S]等条件下的形成的产物的摩尔数/分钟。术语"慢速"或"快速，，当用于指酶活性时涉及与标准品比较的酶转换数。术语"分离的核酸分子"、"分离的核酸片段"和"基因构建体"可以互换使用，并将指单链或双链的RNA或DNA聚合体，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。术语"基因"指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调节序列(5'非编码序列)和编码序列后的调节序列(3'非编码序列)。"天然基因"是指天然存在的具有其自己的调节序列的基因。"嵌合基因"是指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调节序列和编码序列。因此，嵌合基因可包括源于不同来源的调节序列和编码序列，或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。"内源性基因"指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。"外来基因"指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。"转基因"是通过转化方法导入基因组内的基因。如本文所用，术语"编码序列"是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。"合适的调节序列"指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性，或者翻译。调节序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。术语"启动子"指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可以整个源于甚至包括合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。导致基因在大部分时间内在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为"组成型启动子"。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。术语"可操作地连接"指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可^:作i也连接。编码序列可以以有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。如本文所用，术语"表达"指源于本发明核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。如本文所用，术语"转化"指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组内，导致在基因上稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为"转基因"或"重组"或"转化"生物体。术语"质粒，，、"载体，，和"盒，，指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列(线性或环状)，其中多个核苷酸序列已连接或重组进一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3'末端非翻译序列一起引入细胞中。"转化盒"指包含外来基因并且除该外来基因外还具有有利于特定宿主细胞转化的元件的特定载体。"表达盒"指包含外来基因并且除该外来基因以外还具有使得该基因在外来宿主中的表达增强的元件的特定载体。如本文所用，术语"密码子简并性"指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解在使用核苷酸密码子确定给定氨基酸时特定宿主细胞显示出的"密码子偏倚性，，。因此，在合成基因以改善其在宿主细胞中的表码子使用频率。术语"经密码子最优化的"在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体通常的密码子使用。本文所用的标准重组DNA和分子克隆:技术为本领域所熟知，并且描述于以下文献中Sambrook等人(Sambrook、Fritsch和Maniatis,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor,NY,1989)(在下文中"Maniatis");和Silhavy等人(Silhavy等人,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarbor,NY，1984);以及Ausubel,F.M.等人,(Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience,1987)。本发明从源自植物的碳源来生产异丁醇，避免了与丁醇生产的标准石油化学工艺相关的负面的环境影响。在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定具有高催化效率的KARI酶的方法，所述酶的高效率将使其不适的KARI酶以及使用本领域熟知的方法对它们进行诱变以提高酶的比活，这些过程将在下文中详述。酮酸还原异构酶(KARI)乙酰鞋酸还原异构酶或酮醇酸还原异构酶(KARI;EC1.1.1.86)催化支链氨基酸生物合成的2个步骤，是它们的生物合成中的关键酶。KARI存在于多种生物体中，跨物种的氨基酸序列比较已经揭示所述酶具有两种类型短型(I类)存在于真菌和大多数细菌中，长型(n类)一般存在于植物中。短型KARI通常具有330-340个氨基酸残基。长型KARI具有约490个氨基酸残基。然而，一些细菌如大肠杆菌具有长型酶，其中的氨基酸序列略微不同于存在于植物中的氨基酸序列。KARI由ilvC基因编码，是基本培养基中大肠杆菌和其他细菌生长的必需酶。KARI使用NADPH作为辅因子并且其活性需要二价阳离子如Mg++。除了在缬氨酸途径中利用乙酰乳酸之外，KARI还在异亮氨酸生产途径中将乙酰羟基丁酸转化为二羟基甲基戊酸。大肠杆菌KARI酶在2.6A分辨率下的晶体结构已经被解决(Tyagi等人，ProteinScience,14，3089-3100,2005)。所述酶由2个结构域组成，一个结构域具有混合a/p结构，它类似于存在于其他吡啶核苷酸依赖型脱氲酶中的结构域。第2个结构域主要是oc-螺旋状结构，并且有有力证据显示其具有内部重复。比较大肠杆菌、铜绿假单胞菌和菠菜的KARI活性位点显示酶活性位点的大多数残基占据保守位点。当把大肠杆菌KARI晶体化成四聚体时，该四聚体可能是合适的生物活性单位，铜绿假单胞菌KARI(Ahn等人，J.Mol.Biol.,328，505-515,2003)形成十二聚体，而来自菠菜的KARI酶形成二聚体。已知的KARI是慢速酶，报道的转换数为(kcat)2s"(Aulabaugh等人；Biochemistry,29,2824-2830,1990)或0.12s-1(Rane等人，Arch.Biochem.Biophys.338,83-89,1997)乙酰乳酸。已有研究证明大肠杆菌中的异亮氨酸-缬氨酸生物合成的基因操纵不同于铜绿假单胞菌的基因才喿纵(Marinus等人，Genetics,63,547-56,1969)。高活性KARI酶的鉴定和分离。回顾了具有比大肠杆菌更高的倍增速率的生物。鉴定了当在M9基本培养基中生长时倍增时间比大肠杆菌更快的三种微生物，它们是铜绿假单胞菌(PAOl)、荧光假单胞菌(PF5)和霍乱弧菌(N16961)。从这些微生物的每个中分离编码KARI酶的基因并且表达和部分纯化所编码的蛋白。将从高倍增速率生物中分离的酶的比活与大肠杆菌的酶比活进行了比较。KARI使用NADPH消耗测定法进行检测，该方法在340nm处测量辅因子NADPH在酶将乙酰乳酸转化为a,(3-二羟基异戊酸过程中的消耗。使用NADPH的6220M"cm^摩尔消光系数来计算活性并报告为细胞提取物中每mg总蛋白每分钟消耗的NADPH的pmole数(参见Aulabaugh和Schloss,Biochemistry,29,2824-2830,1990)。本发明的一个目标是提供具有比活大于l.l|Limol/min/mgKARI的KARI酶，该比活根据本文所述的NADPH消耗测定法使用纯化蛋白来测量。大肠杆菌KARI是一种慢速酶，它在支链氨基酸合成途径中是必需的。编码KARI(ilvC)的^f、因当细胞在丰富培养基中生长时不表达,但当在基本培养基中生长时以高水平(约10%的可溶性蛋白)表达(S.Epelbaum等人，同上)。选择合适KARI酶的方法涉及两个步骤。第一步是搜索在自然界中分离可用的酶的同源物。基于生物的倍增时间，通过4艮定某种生物最可能具有合适的KARI进行该搜索。第二步涉及通过构建强表达载体、诱变并进化KARI编码序列、并且最后选4奪具有改善KARI活性的变异体来制造并搜索人造差异酶。使用上述方法从荧光布i单胞菌属(SEQIDNO:35[PA01-ilvC]SEQIDNO:36[PF5-ilvC])和霍乱弧菌(SEQIDNO:34)中分离KARI酶，所述酶具有比分离自大肠杆菌(SEQIDNO:33[大肠杆菌K12-ilvC]的KARI酶更高的比活。本发明中优选的是比活大于约l.lpmol/min/mg的KARI酶。其中约5-40pmol/min/mg的比活是尤其合适的。优选使用纯化蛋白结合NADPH消耗测定法(Aulabaugh,同上)来测量KARI的比活，测量温度在2(TC和25。C之间，其中优选约22.5。C,测量在pH值介于7.0和8.0之间，其中优选约7.5的pH值，并且在具有约10mM钾的緩冲液中进4亍，其中至少约10mM至约50mM的钾是合适的。本发明中使用的一些具体酶在下表2中列出。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>本发明不限于本文所述的特定假单胞菌和弧菌酶。例如，这些多肽可用作寻找具有相似活性的同源物的基础，或作为诱变和蛋白进化的模板。KARI同源物分离本发明的核酸片段可用于分离编码来自相同或其他微生物物种的同源蛋白的基因。使用序列依赖性规程来分离同源KARI基因是本领域熟知的。序列依赖型规程的实例包括但不限于核酸杂交方法、DNA和RNA扩增方法例如核酸扩增技术的多种应用，例如聚合酶4连反应(PCR)(Mullis等人，美国专利公开4,683,202)、连接酶链反应(LCR)、(Tabor等人，Pro"Acad.Sci.USA82,1074,1985)或链置换扩增反应(SDA)(Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,89,392,1992)。例如，编码与本发明的那些蛋白或多肽相似的蛋白或多肽的基因可通过使用所有或部分本发明的核酸片段作为DNA杂交探针，使用本领域的技术人员熟知的方法来筛选来自任何所需细菌的文库而得以直接分离。基于本发明的核酸序列的特异性寡核苷酸探针可通过本领域已知的方法(Maniatis，同上)设计和合成。而且，整个序列可直4妻用于通过熟练技术人员已知的方法，例如随机引物DNA标记、切口平移或末端标记技术，来合成DNA探针，或使用可获得的体外转录体系来合成RNA探针。另外，可设计特异性引物并将其用于扩增部分或全长的本发明序列。所得的扩增产物可在扩增反应过程中直接标记或在扩增反应之后标记，并用作探针来在合适的严格条件下分离全长的DNA片段。通常，在PCR类型的扩增技术中，引物具有不同的序列而且彼此之间不互补。取决于所需的检测条件，应该设计引物序列以便提供既有效又可靠的靶核酸的复制。PCR引物设计方法是本领域常见且熟知的，例如Thein禾口Wallace等人，"TheuseofoligonucleotideasspecifichybridizationprobesintheDiagnosisofGeneticDisorders",inHumanGeneticDiseases:APracticalApproach,K.E.Davis编辑，1986,第33-50页，IRLPress,Herndon,Virginia);和Rychlik(Rychlik,1993，InWhite,B.A.(编辑),MethodsinMolecularBiology,Vol.15,第31-39页，PCRProtocols:CurrentMethodsandApplications.HumanaPress,Inc.,Totowa,NJ)。通常，可以将本发明序列的两个短片段在聚合酶链反应规程中用于从DNA或RNA扩增编码同源基因的更长的核酸片段。聚合酶链反应也可以用克隆的核酸片段的文库进行，其中一个引物的序列源自本发明的核酸片段，而另一个引物的序列利用编码微生物基因的mRNA前体的3'端的多腺苦酸片的存在。作为另外一种选择，第二个引物序列可以基于来源于克隆载体的序列。例如，技术人员可以按照RACE规程(Frohman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,8998,1988),通过用PCR扩增在转录物内单个位点与3'或5'端之间的区域的拷贝来生成cDNA。以3'和5'方向取向的引物可用本发明的序列i殳计。4吏用可商购获得的3'RACE或5'RACE体系(LifeTechnologies,Rockville,MD),可以分离特异性的3'或5'cDNA片段(Ohara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,5673,1989);和(Loh等人，Science,243,217-2201989)。作为另外一种选择，可使用本发明的序列作为杂交试剂用于鉴定同源物。核酸杂交试验的基本组成包括探针、怀疑含有目的基因或基因片段的样本及特定的杂交方法。本发明的探针通常是与待检测的核酸序列互补的单链核酸序列。探针与待检测的核酸序列是"可杂交的"。探针长度可从5个碱基至数万个碱基不等，这将取决于具体待完成的测试。通常约15个碱基至约30个碱基的探针长度是合适的。只需要探针分子的部分与待检测的核酸序列互补。另外，探针和靶序列之间不需要完全19的某些碱基没有与正确的互补碱基配对。杂交方法是非常确实的。通常探针和样本必须在允许核酸杂交的条针和样本接触。探针和样本核酸必须接触足够长的时间，使探针和样本核酸之间的任何可能的杂交都可发生。混合物中的探针或靶标的浓度将决定杂交发生所需的时间。探针或靶标的浓度越高，所需的杂交孵育时间就越短。<壬选地，可以加入离液剂。离液剂通过抑制核酸酶活性来稳定核酸。此外，离液剂允许短寡核苷酸探针在室温下的敏感和严格杂交(VanNess等人，Nucl.AcidsRes.19,5143-5151,1991)。合适的离液剂包括氯化胍、碌u氰酸胍、碌u氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾和三氟乙酸铯等。通常，离液剂的终浓度将为约3M。如果需要，人们可以加入甲酰胺至杂交混合物中，通常为30-50%(v/v)。可以采用多种杂交溶液。通常，这些杂交溶液包含约20%至60%体积，优选30%体积的极性有机溶剂。普通的杂交溶液使用约30-50%v/v甲酰胺、约0.15至l.OM氯化钠、约0.05至O.IM緩冲液(如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6画9))、约0.05至0.2%去污剂(如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mMEDTA,FICOLL(PharmaciaInc.)(约498-830zg(300-500千道尔顿))、聚乙烯吡咯烷酮(约41SS30zg(250-500千道尔顿))和血清白蛋白。典型的杂交溶液中还将包含约0.1至5mg/mL未经标记的载体核酸、片段化的核DNA例如小牛胸腺或鲑精DNA、或酵母RNA、以及任选地约0.5至2%w/v甘氨酸。还可以包含其他添加剂，例如包括多种极性水溶性或可膨胀试剂如聚乙二醇、阴离子聚合物如聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯和阴离子糖类聚合物如硫酸葡聚糖在内的体积排阻剂。核酸杂交可适用于多种测定形式。最合适的方法形式之一是夹心测定形式。夹心测定尤其适用于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要成分是固体支持体。固体支持体具有吸附或共价连接至其上的固定核酸探针，该探针未经标记并且与序列的一部分互补。异丁醇生物合成途径本发明的高活性KAR1酶的其中一个主要用途将是作为用于生成异丁醇的代谢途径中的元件。已经阐明并描述了多个这些途径。利用碳水化合物的微生物将糖酵解(EMP)途径、恩-杜二氏糖解途径和戊糖磷酸循环用作中心代谢途径以便为生长和维持提供能量和细胞前体。这些途径均有中间体3-磷酸甘油醛，而且最终会直接形成丙酮酸或与EMP途径结合形成丙酮酸。随后，经由多种方法将丙酮酸转化为乙酰-辅酶A(乙酰-CoA)。乙酰-CoA是关键中间体，例如在生成脂肪酸、氨基酸和次级代谢物的途径中它是关键中间产物。糖转化为丙酮酸的组合反应产生能量(如5，-三磷酸腺苷，ATP)和还原型等价物(如，还原型烟酰胺腺噤呤二核苦酸NADH,以及还原型烟酰胺A泉嘌p令二核苷酸磷酸盐NADPH)。NADH和NADPH必须一皮循环以形成其氧4b形式(分别为NAD+和NADP+)。在存在无才几电子受体(如，02、NCV和SOZ-)的情况下，所述还原型等价物可以用于增加能量池；作为另外一种选择，可能形成还原型碳副产物。如图l所示，用重组微生物有四种潜在的途径从碳水化合物生成异丁醇。在共有的美国专利申请11/586315中已经描述了从碳水化合物转化为异丁醇的所有潜在途径，该专利申请以引用方式并入本文。将丙酮酸转化为异丁醇的优选途径由酶催化步骤"a"、"b"、"c"、"d"和"e，，(图1)组成，并且包括以下底物到产物的转化a)丙酮酸到乙酰乳酸，由例如乙酰乳酸合酶催^>,b)(S)-乙酰乳酸到2,3-二羟基异戊酸，由例如乙酰羟酸还原异构酶催化，c)2,3-二羟基异戊酸到a-酮异戊酸，由例如乙酰羟酸脱水酶催化，d)ot-酮异戊酸到异丁醛，由例如支链酮酸脱羧酶催化，以及e)异丁醛到异丁醇，由例如支链醇脱氢酶催化。该途径结合了在详述的缬氨酸生物合成(丙酮酸到a-酮异戊酸)和缬氨酸分解代谢(a-酮异戊酸到异丁醇)途径中涉及的酶。因为许多缬氨酸生物合成酶还催化异亮氨酸生物合成途径中的类似反应，所以底物特异性是选择基因来源时的主要考虑因素。因此，乙酰乳酸合酶受关注的主要基因是那些来自芽孢杆菌属(alsS)和克雷白氏杆菌属(budB)的基因。已知这些特定乙酰乳酸合酶参与这些生物中的丁二醇发酵并显示出对比对酮丁酸更高的丙酮酸亲和力(Gollop等人，J.Bacteriol.172,3444-3449,1990);和(Holtzclaw等人，J.Bacteriol.121,917-922,1975)。途径的第二个和第三个步骤分别由乙酰羟酸还原异构酶和脱水酶催化。已知这些酶有多个来源，例如大肠杆菌(Chunduru等人，Biochemistry28,486-493,1989);和(Flint等人，J.Biol.Chem,268,14732-14742,1993)。优选的异丁醇途径的最后两步已知发生在酵母中，酵母能利用缬氨酸作为氮源并在该过程中分泌异丁醇。a-酮异戊酸能^皮多个酮酸脱羧酶如丙酮酸脱羧酶转化为异丁醛。为了防止异丁醇生产中的丙酮酸错用，需要一种对丙酮酸亲和力4交〗氐的脱羧酶。迄今为止，本领域已知两种此类酶(Smit等人，Appl.Environ.Microbiol.71,303-311,2005);和(delaPlaza等人，FEMSMicrobiol.Lett.238,367-374,2004)。两种酶都来自乳酸乳球菌菌抹并优选酮异戊酸，对酮异戊酸的亲和力高于丙酮酸50至200倍。最后，已经鉴定了酵母中的多个醛还原酶，许多醛还原酶具有重叠的底物特异性。那些已知的相比乙醛更优选支链底物的酶包括但不限于醇脱氲酶VI(ADH6)和Yprlp(Larroy等人，Biochem.J.361,163-172，2002);和(Ford等人，Yeast19,1087-1096,2002),二者都使用NADPH作为电子供体。NADPH依赖型还原酶YqhD对支链底物有活性，它最近也在大肠杆菌中被鉴定(Sulzenbacher等人，J.Mol.Biol.342,489-502,2004)。其他两种潜在的异丁醇生产途径还包含最初的三步"a"、"b"和"c"。一种途径由酶催化步骤"a"、"b"、"c"、"f，、"g，，、"e"组成。步骤"f'包含"支链酮酸脱氬酶"，所述酶EC编号为EC1.2.4.4。步骤"g，，包含"酰化醛脱氢酶，，，所述酶EC编号为EC1.2.1.10和1.2.1.57,此外步骤"e"包含"支链醇脱氢酶"。另一种潜在途径由步骤"a"、"b，，、"c"、"h"、T、"j，，、"e"组成。术语"转氨酶"(步骤"h")EC编号为EC2.6.1.42和2.6.1.66。步骤"h"或由"缬氨酸脱氳酶"组成，EC编号为EC1.4.1.8和1.4.1.9,或由步骤"i，，"缬氨酸脱羧酶"组成，EC编号为EC4.1丄14。最终步骤"j"将利用EC编号为EC2.6丄18的"D转氨酶"生成异丁醛，步骤"e"将其还原生成异丁醇。所有将丙酮酸转化为异丁醇的潜在途径均在图1中进行了描述。此外，已知多个生物体经由丁酰-CoA中间体产生丁酸盐和/或丁醇(Diirre等人，FEMSMicrobiol.Rev.17,251-262,1995);和(Abbad-Andaloussi等人，Microbiology142，1149-1158，1996)。因此在这些生物体中利用图l所示的步骤"k"、"g"和"e"将生成异丁醇。步骤"k"将使用EC编号为EC5.4.99.13的"异丁酰-CoA变位酶"。嵌套步骤将涉及使用EC编号为EC1.2.1.10和1.2.1.57的"酰化醛脱氢酶"来制备异丁醛，随后由酶催化步骤"e"来制备异丁醇。在共有美国专利申请11/586315中详述了所有这些步骤，该专利申请全文以引用方式并入本文。用于异丁醇生产的微生物宿主用于生产异丁醇的微生物宿主可以选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。用于生产异丁醇的微生物宿主将是异丁醇耐受性的，以便收率不总亍两t志，w"aaim六文、:念命ik亚AASl亇跖t乂v;i+、>aa处i>t/1^St4XJt^j""igr'i工wvlP、rlJ'Jo^P"r口J/又/J、，"V7"lJIl、^0J,口>八wV'I外入J-TVy^一i、ZV本领域所熟知的。尽管已从产溶剂梭菌(solventogenicClostridia)中分离了丁醇耐受性突变体，但有关其他潜在可用的细菌菌抹的丁醇耐受性方面的信息几乎没有。关于细菌中醇耐受性的比较的大部分研究表明，丁醇的毒性大于乙醇(deCavalho等人，Microsc.Res.Tech.64,215-22,2004),并且(Kabelitz等人，FEMSMicrobiol.Lett.220,223-227,2003,Tomas等人J.Bacteriol.186,2006-2018,2004)报道了在丙酮丁醇梭菌发酵期间1-丁醇的收率可能受1-丁醇毒性的限制。l-丁醇对丙酮丁醇梭菌的主要影响是破坏膜功能(Hermann等人，Appl.Environ.Microbiol.50,1238-1243,1985)。选择用于生产异丁醇的微生物宿主应该是异丁醇耐受性的，并应能将碳水化合物转化为异丁醇。选择合适微生物宿主的标准包括如下对异丁醇的固有耐受性、对葡萄糖的高利用率、用于基因操纵的遗传工具的可用性、以及产生稳定的染色体变异的能力。具有异丁醇耐受性的合适宿主菌抹可以通过基于菌抹的固有耐受性进行筛选而鉴定。微生物对异丁醇的固有耐受性可以通过测定在基本培养基中培养时造成生长率50%抑制的异丁醇浓度(IC5。)来测量。IC50值可以利用本领域已知的方法来确定。例如，可让所关注的孩i生物在含有多种量的异丁醇的情况下生长，通过测量600纳米(OD6G。)下的光密度来监测生长率。倍增时间可以从生长曲线的对数部分计算并用作生比对异丁醇浓度的曲线图来测定。优选地，宿主菌抹将具有大于约0.5%的异丁醇IC50。23用于生产异丁醇的微生物宿主还应以高速率利用葡萄糖。大多数微生物都能够利用碳水化合物。然而，某些环境微生物不能高效利用碳水化合物，因此它们将不是合适的宿主。在遗传上修饰宿主的能力对任何重组微生物的产生来说十分关键。基因转移技术的模式可以是电穿孔、接合、转导或自然转化。可利用多种宿主接合性质粒和药物抗性标记。基于可在宿主中产生作用的抗生素抗性标记的性质，针对该宿主生物体来定制克隆载体。还必须操纵微生物宿主以便通过删除多种基因而使竟争碳流的途径失活。这就需要存在转座子或染色体整合载体用以引导失活。此外，生产宿主应能受到化学诱变以便得到改善的异丁醇固有耐受性的突变体。基于上述标准，用于生产异丁醇的合适微生物宿主包括但不限于梭菌属(C7o^n^ww)、发酵单胞菌属(Zymowo，s)、埃希氏菌属(￡^c/ze"'c/n'a)、沙、门氏菌属(iS"a/附owe〃a)、纟工；求菌属(W/zc^ococcw5)、假单胞菌属(尸化wt/cwomw)、芽孢杆菌属(S〃/m)、弧菌属()、乳酸菌属(丄a"oZ)"".〃wa)、肠3求菌属(i"/^rococcw《)、产石咸斥干菌属(j/ca/zge"^)、克雷伯氏菌属(A7eZwe〃a)、类芽i包杆菌属(Paem力"cz'〃w5)、节杆菌属(J/^/zn^acfer)、棒状杆菌属(Co/7"e6a"en'ww)、4豆斥干菌属(i^ew力(2c&rz'wm)、毕赤酵母属(Pichia)、々支丝酵母属(Qw^J")、汉逊酵母属(//a朋e"w/a)和#唐酵母属(Sacc/z"/w^c^)。4尤选的宿主包4舌大肠4干菌、真养产石咸杆菌(j/ca/,"e《e旨o//z船)、地衣芽孑包杆菌(Bacilluslicheniformis)、浸麻类芽孑包杆菌(尸aem力"cz'〃ws附acera朋)、红串红J求菌(i^ot/ococcwser_yf/zro/x>/&)、恶臭々￡单月包菌(T^ez^fowowos*/w〃da)、才直物等L4干菌(Z^/cfo6""'〃ws)、屎肠J求菌(iwfeAcoccws^2ec/w附)、享鸟，鸟肠球菌(i"fen9coccw^ga〃z力a〃.w附)、粪肠球菌(5Vferococcz^/^eca/^)、枯草芽孢軒菌(Sac/〃m)和啤酒糖酵母(Sacc/mromycesCg^W^S7'M)。生产宿主的构建可以采用本领域已知的技术来构建含有必需基因的重组生物体，所述必需基因将编码用于将可发酵碳底物转化为异丁醇的酶途径。如上所述，在本发明中，编码本发明其中一种异丁醇生物合成途径的酶的基因可从多个来源分离获得，所述酶例如乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸还原异构酶、乙酰羟酸脱水酶、支链a-酮酸脱羧酶和支4连的醇脱氪酶。从细菌基因组中获得所需基因的方法是分子生物学领域中常用并且为人所熟知的。例如，如果基因的序列已知，则可以通过限制性内切酶消化来产生合适的基因组文库并且可以用与所需基因序列互补的探针来筛选。分离了序列之后，即可以用标准的引物引导的扩增方法如聚合酶链反应(美国专利4,683,202)来扩增DNA,以获得适于使用合适载体转化的量的DNA。用于优化密码子以在异源宿主细胞内表达的工具很容易得到。一些密码子优化工具可基于宿主生物体的GC含量获得。鉴定并分离了相关途径的基因之后，即可将它们通过本领域中已知的方法转化到合适的表达宿主内。可用于转化多种宿主细胞的载体或试剂盒是常见的并且可以从一些公司商购获得，例如EPICENTRE(Madison,WI)、InvitrogenLtd.(Carlsbad,CA)、Stratagene(LaJolla,CA)和NewEnglandBiolabs,Inc.(Beverly,MA)。通常，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5'区域和控制转录终止的DNA片段3'区域。这两种控制区均可来源于与转化的宿主细胞同源的基因，但是应当理解，这种控制区也可能来源于对被选择作生产宿主的特定物种来说是非天然的基因。可用于驱动相关途径编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所熟悉。事实上，任何能够驱动这些遗传元件的启动子均适用于本发明，包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GALIO、ADH1、PGK、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母属中表达)；AOXl(用于在毕赤酵母属中表达)；和lac、ara、tet、trp、1PL、1PR、T7、tac、以及trc(用于在大肠杆菌属、产碱杆菌属和假单胞菌属中表达)以及amy、apr、npr启动子和多个噬菌体启动子，用于在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和浸麻类芽孢杆菌中表达。终止控制区也可以源于对优选宿主天然的多种基因。任选地，终止位点可能是不必要的，然而，如果含有终止位点则是最优选的。某些载体能够在广泛的宿主细菌中复制并可通过接合进行转移。可25利用完全并注解的序列pRK404和三个相关载体-pRK437、pRK442和pRK442(H)。这些衍生物已被证明是在革兰氏阴性菌中进行遗传操纵的有用工具(Scott等人，Plasmid50(1):74-79(2003)。广宿主范围的IncP4质粒RSF1010的几种衍生质粒也可获得，其具有在一系列革兰氏阴性菌中发挥功能的启动子。质粒pAYC36和pAYC37具有连同多个克隆位点一起的活性启动子，使得在革兰氏阴性菌中的异源基因能够表达。染色体基因置换工具也可广泛获得。例如，将广宿主范围的复制子pWV101的热敏性变体进行改良以构建可用于在一系列革兰氏阳性菌内实现基因置换的质粒pVE6002(Maguin等人，J.Bacterio1.174,5633-5638,1992)。此外，体外转座体可得自商业来源(例如EPICENTRE),用以在各种基因组中产生随机突变。异丁醇生物合成途径在多种优选的微生物宿主中的表达在下面进行了更详细的描述。异丁醇生物合成途径在大肠杆菌中的表达可用于转化大肠杆菌的载体或试剂盒是4艮普遍的并且可以从上述公司中商购获得。例如，异丁醇生物合成途径的基因可从多个来源分离、克隆到经修饰的pUC19载体中并转化进大肠杆菌NM522中。异丁醇生物合成途径在红串红球菌中的表达一系列大肠杆菌-红球菌穿梭载体可用于在红串红球菌中表达，所述穿梭载体包括但不限于pRhBR17和pDA71(Kostichka等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.62,61-68,2003)。此外，一系列启动子可用于异源基因在红串红球菌中表达(Nakashima等人，Appl.Environ.Microbiol.70,5557-5568,2004和Tao等人，Appl,Microbiol.Biotechnol.68,346-354,2005)。红平红球菌染色体基因中的靼向基因中断可以利用Tao等人(同上)和Brans等人(Appl.Environ.Microbiol.66,2029-2036,2000)描述的方法予以生成。最初可以将如上所述的产生异丁醇所需的异源基因克隆至pDA71或pRhBR71内，并转4b进大肠杆菌中。然后，可以通过电穿孔将载体转化进红串红球菌中，如Kostichka等人(同上)所述。重组体可在含有葡萄糖的合成培养基中生长，并随后可利用本领域已知的方法来产生异丁醇。异丁醇生物合成途径在枯草芽孢杆菌中的表达枯草芽孢杆菌中基因表达及突变产生的方法也是本领域所熟知的。例如，异丁醇生物合成途径的基因可从多个来源分离、克隆到经修饰的pUC19载体中并转化进枯草芽孢杆菌BE1010中。此外，可将异丁醇生物合成途径的五个基因分裂成两个操纵子用于表达。可将该途径的三个基因(bubB、ilvD和kivD)整合进枯草芽孢杆菌BE1010的染色体中(Payne等人，J.Bacteriol.173,2278-2282,1991)。可将剩余的两个基因(ilvC和bdhB)克隆到表达载体中并转化进携带整合的异丁醇基因的芽孢杆菌菌抹中。异丁醇生物合成途径在地衣芽孢杆菌中的表达在枯草芽孢杆菌中复制的大多数质粒和穿梭载体可用于通过原生质体转化或电穿孔来转化地衣芽孢杆菌。可将异丁醇生产所需的基因克隆在质粒pBE20或pBE60衍生物中(Nagarajan等人，Gene114,121-126,1992)。转化地衣芽孢杆菌的方法是本领域已知的(Fleming等人，Appl.Environ.Microbiol.,61,3775-3780,1995)。所构建的用于在枯草芽孢杆菌中表达的质粒可以,皮转化进地衣芽孢杆菌内以产生可生产异丁醇的重组孩￡生物宿主。异丁醇生物合成途径在浸麻类芽孢杆菌中的表达可按照上面关于在枯草芽孢杆菌中表达的描述来构建质粒，并通过原生质体转化法将该质粒用于转化浸麻类芽孢杆菌，以产生可生产异丁醇的重组樣i生物宿主。异丁醇生物合成途径在真养产碱杆菌中的表达用于在真养产碱杆菌中进行基因表达和产生突变的方法是本领域内已知的(Taghavi等人，Appl.Environ.Microbiol.,60,3585-3591,1994)。可以将异丁醇生物合成途径的基因克隆进上述任何广宿主范围的载体中，并通过电穿孔以形成生产异丁醇的重组体。产碱杆菌属中的聚羟基丁酸酯途径已经有详细描述，多种改良真养产碱杆菌基因组的遗传技术是已知的，并且这些工具可以应用于工程化异丁醇生物合成途径。异丁醇生物合成途径在恶臭假单胞菌中的表达在恶臭假单胞菌中表达基因的方法是本领域内已知的(参见例如Ben-Bassat等人，美国专利6,586,229,该文献以引用方式并入本文)。可将丁醇途径基因插入pPCU18中，并且该连接DNA可通过电穿孔进入电穿孔感受态恶臭假单胞菌D0T-T1C5aARl细胞中以形成能生产异丁醇的重纟且体。异丁醇生物合成途径在啤酒糖酵母中的表达用于啤酒糖酵母中基因表达的方法是本领域已知的(例如，Enzymology,Volume194,GuidetoYeastGeneticsandMolecularandCellBiology,PartA,2004,ChristineGuthrie和GeraldR.Fink,编辑，ElsevierAcademicPress,SanDiego，CA中的方法)。酵母中的基因表达通常需要在受关注的基因前的启动子和转录终止子。可使用多个酵母启动子来构建编码异丁醇生物合成途径的基因的表达盒，包括但不限于组成型启动子FBA、GPD、ADH1和GPM,和i秀导型启动子GALl、GAL10和CUPl。合适的转录终止子包括但不限于FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、GALlt、CYC1和ADH1。例如，可将合适的启动子、转录终止子和异丁醇生物合成途径基因克隆到大肠杆菌-酵母穿梭载体中。异丁醇生物合成途径在植物乳杆菌中的表达乳杆菌属属于乳杆菌科(Lactobacillales),并且用于转化枯草芽孢杆菌和链球菌的许多质粒及载体可用于转化乳杆菌属。合适载体的非限制性实例包括pAMpi及其衍生物(Renault等人，Gene183,175-182,1996);和(O，Sullivan等人,Gene137,227-231,1993);pMBBl和pHW800,pMBBl的衍生物(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.62,1481-1486,1996);pMGl,接合质粒(Tanimoto等人，J.Bacteriol.184,5800-5804,2002);pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.63,4581-4584,1997);pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.67,1262-1267,2001);和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.AgentsChemother.38,1899-1903,1994)。也已经报道了几种来源于植物享'L斗干菌的质并立(vanKranenburg等人,Appl.Environ.Microbiol.71,1223-1230,2005)。异丁醇生物合成途径在多个肠球菌菌种中的表达(屎肠球菌、鹑鸡肠球菌和粪肠球菌)肠球菌属属于乳杆菌科，上述用于转化乳酸杆菌、杆菌和链球菌种的多种质粒和载体也可用于肠球菌种。合适载体的非限制性实例包括pAMpi及其衍生物(Renault等人，Gene183，175-182,1996);和(0，Sullivan等人，Gene137,227-231，1993);p應Bl和pHW800,pMBBl的衍生物(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.62,1481-1486,1996);pMGl，接合质粒(Tanimoto等人，J.Bacteriol.184,5800-5804,2002);pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.63,4581-4584，1997);pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.67,1262-1267,2001);和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.AgentsChemother.38,1899-1903,1994)。还可使用采用来自乳球菌属(Lactococcus)的msA基因的用于粪肠球菌的表达载体(Eichenbaum等人，Appl.Environ.Microbiol.64,2763-2769,1998)。另外，可使用用于在屎肠球菌染色体中进行基因置换的载体(薩aapareddy等人，Appl.Environ.Microbiol.72,334-345,2006))。发酵培养基本发明中的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的底物可包括但不限于单糖，例如葡萄糖和果糖；低聚糖，例如乳糖或蔗糖；多糖，例如淀粉、纤维素或它们的混合物；以及来自可再生原料的未纯化混合物，例如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖蜜及大麦麦芽。另外，碳底物也可以为已证明可以净皮代谢转化为关4建生化中间产物的诸如二氧4t碳之类的一碳底物或曱醇。除了一碳和二碳底物之外，甲基营养生物体也已知可以利用多种其他含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺及用于代谢活动的多种氨基酸。例如，曱基营养酵母已知可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.GrowthCICompd.,[Int.Symp.〗，7th(1993),415-32.(eds):Murrell,J.Collin;Kelly,DonP.Publisher:Intercept,Andover,UK)。类似地，^丝酵母属的多种物种将会^Ri射丙氨酸或油酸(Suiter等人，Arch.Microbiol.153,485-489,1990)。因此，预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并且将仅受限于生物体的选择。尽管预期所有上述碳底物及它们的混合物均适用于本发明，但优选的》灰底物为葡萄糖、果糖和蔗糖。除了合适的碳源外，发酵培养基还必须含有本领域技术人员已知的适于培养物生长并促进生产异丁醇所必需的酶途径的矿物质、盐、辅因子、緩冲剂及其他组分。培养条件通常，使细胞在约25。C至约40。C的温度范围下在合适的培养基中生长。本发明中合适的生长培养基是普通的商业制备的培养基，例如LuriaBertani(LB)肉汤、SabouraudDextrose(SD)肉汤或酵母培养基(YM)肉汤。也可以使用其他确定的或合成的生长培养基，微生物学或发酵科学领域的技术人员将知道用于具体微生物生长的合适培养基。已知可以直接或间接调节分解代谢物阻遏的试剂，如环腺苷酸2',3'-单磷酸(cAMP),也可以4参入发酵培养基中。适于发酵的pH范围在pH5.0到pH9.0之间，其中pH6.0至pH8.0优选作为起始条件。发酵可以在有氧或厌氧条件下进行，厌氧或微氧条件是优选的。工业分批发酵和连续发酵本发明的工艺采用分批发酵方法。经典的分批发酵是封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不进行人工改变。因此在发酵开始时，用所需生物体对培养基进行接种，在不向系统添加任何物质的情况下进行发酵。然而，通常来说，"分批"发酵是指碳源的添加是成批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批发酵系统中，代谢产物和生物质组成持续改变直至发酵结束时。在分批培养物内，细胞緩慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减緩或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，对数期中的细胞负责产生大部分终产物或中间产30物。标准分批式系统的一种变型是补料分批系统。补料分批发酵工艺也适用于本发明，并且包括典型的分批式系统，不同的是随着发酵进程递增地添加底物。在代谢产物往往抑制细胞的代谢作用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批式系统是有用的。补料分批式系统中的实际底物浓度难于测量并因而可根据一些可测量因素(例如pH、溶解的氧以及废气例如co2的分压)进行评估。分批发酵和补料分批发酵在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献ThomasD.Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版,(1989),SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA.或Deshpande,Mukund(Appl.Biochem.Biotechnol.,36,227,1992),该文献以引用方式并入本文。尽管本发明是以分批模式进行，但预期该方法将可适用于连续发酵方法。连续发酵是一种开放式系统，其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续发酵一般使培养物维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高密度。连续发酵允许调节一种因素或任意数目的因素，这些因素影响细胞生长或终产物浓度。例如，一种方法将以固定的速率维持限制性营养物质例如碳源或氮水平并且允许所有其他参数适度。在其他系统中，影响生长的许多因素可以连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统力求维持稳态的生长条件，并因而在发酵过程中由于培养基被取出而导致的细胞损失必须与细胞的生长率保持平衡。用于调节连续发酵工艺中的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成速率保持最高水平的方法是工业微生物领域众所周知的，并且多种方法已由Brock(同上)详细描述。预期可以或者采用分批发酵、补料分批发酵或者采用连续发酵工艺来实施本发明，并且任何已知的发酵模式均将适用。另外，预期可以将细胞固定在底物上而作为完整的细胞催化剂并让其经受发酵条件以生产异丁醇。用于从发酵培养基中分离异丁醇的方法可使用丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵领域已知的方法从发酵培养基中分离生物生产的异丁醇(参见例如Durre,Appl.Microbiol.Biotechnol.49,639-648,1998),和(Groot等人，Process.Biochem.27,61-75,1992以及本文参考)。例如，可通过离心、过滤、滗析从发酵培养基中移除固体，可使用蒸馏、共沸蒸馏、液液萃取、吸附、汽提、膜蒸发、或全蒸发方法从发酵培养基中分离异丁醇。实施例本发明将在下面的实施例中进一步限定。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的实质性特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可对本发明进行各种变化和》务改以适应多种用途和条件。一般方法实施例中所用的标准重组DNA4支术和分子克隆技术在领域内是众所周知的，并且在下列文献中有所描述Sambrook等人(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.的MolecularCloning:ALaboratoryManual;ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,1989,本文称为Maniatis)矛口Maniatis(同上)以及Silhavy等人，(Silhavy等人，ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.1984)和Ausubel等人，(Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology,pub.GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience,1987)。适合细菌培养物维持及生长的材料和方法在领域内是众所周知的。以下实施例中适用的才支术描述可在下列文献中查到ManualofMethodsforGeneralBacteriology(Phillippetal,eds.,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.，1994)或ThomasD.Brockin(Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版,SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA(1989)。<吏用的用于细菌细月包生长和维持的所有试剂、限制性内切酶和材料均得自AldrichChemicals(Milwaukee,WI)、BDDiagnosticSystems(Sparks,MD)、LifeTechnologies(Rockville,MD)或SigmaChemicalCompany(St丄ouis,MO),除非另外指明。表3给出了以下实施例中使用的寡核苦酸引物。表3本发明中使用的寡核苷酸引物<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>缩写的含义如下"sec"是指秒，"min"是指分钟，"h"是指小时，"nm"是指纳米，>L"是指微升，"mL"是指毫升，"mg/mL"是指毫克每毫升，"L"是指升，"nm"是指纳米，"mM"是指毫摩尔，"M，，是指摩尔，"mmol"是指毫摩尔，'Vmole"是指微摩尔，"kg"是指千克，"g"是指克，>g"是指微克，"ng"是指纳克，"PCR"是指聚合酶链反应，"OD"是指光密度，"OD6o。"是指在600nm波长下测量的光密度，"kDa"是指千道尔顿，"g"是指引力常数，"bp"是指碱基对，"kbp"是指千碱基对，"kb"是指千碱基，"％"是指百分比，"％w/v"是指重量/体积百分比，"％v/v"是指体积/体积百分比，"HPLC"是指高效液相色谱，"g/L"是指克每升，>g/L"是指微克每升，"ngL"是指纳克每微升，"pmolL"是指皮摩尔每微升，"RPM"是指每分钟转数，、mol/min/mg"是指微摩尔每分钟每毫克，"w/v，，是指每单位体积重量，"v/v"是指每单位体积体积。实施例1(比4支)KARI酶活性分析该实施例描述制备ilvC基因过表达构建体以及使用乙酰乳酸依赖型KARI酶氧化NADPH来测量酶活性，KARI酶由大肠杆菌的ilvC基因编码。构建pBAD-ilvC表达质粒--,人大肠杆菌中分离ilvC基因ilvC基因编码区使用RCR从大肠杆菌菌抹FM5(ATCC53911)基因组DNA扩增得到。细胞在包含4mLLuriaBertani(LB)培养基(MediatechInc.,Herndon,VA)的50mL培养管中生长过夜(37°C,300RPM振荡培养)。然后通过在1000xg下离心3分钟来收获细胞，并<吏用GentraPuregenei式剂盒(GentraSystems,Inc.,Minneapolis,MN;目录号D-5000A)，按照制造商说明书来制备所述细胞的基因组DNA。使用大肠杆菌DNA作为模板及引物SEQIDNO:11和12,通过PCR来制备ilvC编码区DNA片段。使用FinnzymesPhusionHigh-FidelityPCRMasterMix(NewEnglandBiolabsInc.,Beverly,MA;目录号F-531),4姿照制造商*见程进行PCR。扩增在DNA热循环仪GeneAmp9700(PEAppliedBiosystems,Fostercity,CA)中进行。将未经进一步纯化的PCR产物(0.5pL)连接到pCR4BluntTOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA,目录号#45-0031)中，并转化进入到化学法感受态TOP10细胞(Invitrogen44-0301)中。将连接产物划线接种到包含加入100pg/mL氨千青霉素(TeknovaInc,Hollister,CA,目录号#L1004)的LB培养基的平板上。通过SacI/BamHI限制消化来确认包含ilvC插入序列的克隆。消化后4个质粒中的三个应具有预料的1.5kbp条带。将所得的克隆命名为pCR4BluntTOPO-ilvC。通过SacI/BamHI消化释方文出来自pCR4BluntTOPO-ilvC克隆载体的ilvC片段，并使用T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)将其连接到经SacI/BamHI消化的pTrc99A(Amann,等人，Gene,69,301-315,1988)中。将该构建体通过电穿孔转入电穿孔感受态大肠杆菌TOP10细胞(Invitrogen44-0035)中，并划线接种到如上所述的LB/氨节青霉素平板上。将包含1.5kb插入序列的载体命名为pTrc99A-ilvC。制备。BAD载体用于克隆使用Sacl/Hindlll限制位点，构建在基因5'末端包含Sacl位点的pBAD.HisA(Invitrogen)载体的衍生物，以用于将ilvC基因克隆到pBAD中。制造该构建体需要三个步骤。第一步，将来自粘红酵母的苯基丙氨酸氨裂合酶(PAL;EC4.3.1.5)编码区克隆到pBAD-HisA载体中以制备pBAD-PAL。第二步，将EcoRI位点添加到紧接着pBAD-PAL构建体的起始密码子之前的基因5'末端，以制备pBAD-PAL-EcoRI。第三步，用SacI位点置换EcoRI位点，并用Sacl/Hmdlll消化所得的载体以制备用于ilvC基因克隆的pBAD-SacI载体。首先从pKK223-PAL载体中PCR扩增PAL基因(USPatent#6521748)，使用的是正向引物(PAL-F1)(SEQIDNO:37)和反向引物(PAL-R1)(SEQIDNO:38)。在PerkinElmerPCR9700热循环仪(PEAppliedBiosystems,Fostercity,CA)中使用TaKaRaTaqDNA聚合酶预混物(TAKARABioUSA,Madison，WI，目录号jTTAK—R004A)按照制造商规程进行PCR。使用QIAQuikPCR纯化试剂盒(Qiagencat#28106)部分地纯化PCR产物，并用Bbsl和Hindlll消化产物。这生成了在5'末端包含Ncol突出的片段。然后将消化产物连接到pBAD.HisA(Invitrogen)载体中，该载体已经用Ncol/Hindlll消化过。使用T4DNA连接酶(Promega)按照制造商提供的标准规程进行连接反应。按照制造商说明书利用Bio-RADGenePulserII(Bio-RadLaboratoriesInc,Hercules,CA),使用两连接产物来转36化TOP10电穿孔感受态细胞(Invitrogen)。将转化过的细胞划线接种在包含加入100pg/mL氨千青霉素(TeknovaInc，Hollister,CA,目录号#L1004)的LB培养基的琼脂板上，在37。C下培养过夜。通过NcoI/Hindin限制消化来确认包含PAL插入序列的克隆。将此构建体命名为pBAD-PAL。然后使用QuikChangeIIXL定点诱变试剂盒(Stratagene,LaJollaCA,Catalogue#200524)将EcoRI位点添加到上述构建体中的PAL基因5'末端上。设计正向引物(PAL-EcoRI-Fl)(SEQIDNO:39)和反向引物(PAL-EcoRl-Rl)(SEQIDNO:40)并按照制造商的说明书来制备反应混合物。上文制备的pBAD-PAL构建体在下文反应中用作模板。50|iL反应混合物包含1.0|iL50ng/(iL的模板质粒、l.OjiL10pmolL的各种引物、5pL10x反应緩冲液、1.0)iLdNTP混合物和3pLQmk溶液，30pL水以及l.O(iLpfu-ultra高保真DNA聚合酶，置于200pL薄壁管中。在上文的QuikChangeIIXL试剂盒中提供该反应中使用的所有试剂和聚Fostercij,CA)中进行，使用的是以下条件。起始温度为96°C2分钟，随后进行18个加热/冷却循环。每个循环由96°C30秒，6CTC30秒，72。C160秒组成。在温度循环完成后，将样本保持在72。C下600秒或更长，然后在4。C下复性。反应完成后，加入l.O[iL限制性酶Dpnl(来自上述试剂盒)到反应中，然后在37。C下孵育3小时以消化反应中的模板质粒。然后用BioRADGenePulserII(Bio-RadLaboratoriesInc,Hercules,CA)按照制造商说明书将2.0^LDpnl消化反应产物转化到50^L大肠杆菌TOP10电穿孔感受态细胞(Invitrogen)中。将不同体积的(2攀,5.0pL和20pL)转化细胞划线接种在包含LB培养基和100(ig/mL氨节青霉素的10cm琼脂平板上，并将平板在37。C下孵育过夜。从包含分离良好的菌落的平板上采集三个克隆。使用Qiaprepspin小量制备试剂盒(Qiagen,ValenciaCA,目录号#27106),按照制造商的说明书来纯化来自三个克隆的质粒。使用限制性酶EcoRI和HindIII(Promega,Madison，WI)通过限制性消化分析来鉴定阳性克隆，酶消化通过将l.OpL10x反应緩沖液(Promega緩冲液)，l.OpL纯化质粒和l.OpL各种限制性酶置于6.0(aL去离子水中进行。将反应混合物在37。C下孵育60分钟。每个克隆的消化产物在0.8%琼脂糖E凝胶(Invitrogen,目录号#G5018-08)上分离。一个2.1kbp和一个4.0kbp的DNA片l更在凝月交上一皮发现存在于样本中，该样本在构建体中存在EcoRI和HindIII限制性位点。然后使用质粒才莫板pBAD-PAL-EcoRI和引物SEQIDNO:13按照上述相同规程用Sacl位点来置换该构建体中的EcoRI位点。使用限制性酶Sacl和HindIII(Promega,Madison,WI)进行限制性消化分析以确认阳性克隆。一旦鉴定了阳性克隆，就建立更大规模(50^L)的上述限制性消化反应。使用1%琼脂糖凝胶和QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,ValenciaCA,目录号#28704),按照制造商规程从混合物中纯化包含消化载体凝胶的4kbp片段。将该构建体命名为pBAD陽SacL用于过表达KARI的宿主菌抹4吏用宿主菌才朱大肠杆菌Bw25U3(AilvC)即ilvC基因敲除菌才朱来制备过表达KARI酶的构建体。在该菌抹中，大肠杆菌染色体中的完整ilvC基因被卡那霉素盒置换，该置换使用的是Lambdared同源重组技术(Datsenko和Wanner,Proc.Natl.AcadSci.USA.97,6640-6645,2000)。所有使用该技术制备基因敲除菌抹所需的菌株和载体均从Prof.BarryWanner(PurdueUniversity,WestLafayette,IN)处获得。制备用于克隆的ilvC编码区用高保真pfu-ultra聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA)来扩增ilvC编码区，将Sacl位点添加到正向引物ATG之前的5'末端,将HindIII位点添加到反向引物终止密码子之后的5，末端。该反应使用具有SEQIDNO:15(正向ilvc-trc-SacI-F)的引物和具有SEQIDNO:16(反向ilvc-trc-HindIII-R)的引物。PCR反应中使用的才莫板是上述ptrc99A-ilvC构建体。50pL反应混合物包含5.0pL10x反应緩冲液、pfu-ultra聚合酶(Stratagene)、l.O^iL50ng/(iL才莫板、l.OpL每个lOpmol/pL的正向和反向引物、1都L40mMdNTP混合物(Clonetech,MountainView,CA)、l.O^Lpfu-ultraDNA聚合酶(Stratagene)和39pL水。将该反应混合物置于薄壁200pL管中用于在DNAThermocyclerGeneAmp2400(PEAppliedBiosystems,Fostercity,CA)中的PCR反应。PCR反应条件如下起始温度为94°C2分钟。随后进行30个加热/冷却循环。每个循环由94°C30秒，58°C30秒，68°C1分钟40秒组成。在温度循环完成后，将样本保持在6(TC下IO分钟或更长，然后在fC下复性。用QIAquikPCR纯化试剂盒(Qiagen,cat#28106)部分地纯化PCR产物，并用HindIII和Sacl进行消化，然后通过如上所述的规程来纯化凝胶。将消化的PCR片段连接到用同样的酶消化的pBAD-SacI载体中。20pL连接反应包含l.O^LT4DNA连接酶(Promega),与T4DNA连接酶一起的2.0pL10x反应緩冲液，45ng载体和45ng插入序列以及去离子7jc。反应在Eppendorf热循环4义(EppendorfNorthAmerica,Westbury,NY)中在16。C下孵育过夜。使用Bio-RADGenePulserII(Bio-RadLaboratoriesInc,Hercules,CA)将两连接产物转化到大肠杆菌TOP10电穿孔感受态细胞(Invitrogen)中。在包含LB培养基和100貼/mL氨千青霉素的琼脂平4反上选4奪转化过的克隆。通过Sacl消化和DNA测序来确i人克隆中大肠杆菌ilvC基因插入序列的存在，DNA测序使用引物SEQIDNO:17至22。将具有ilvC基因插入序列的构建体命名为pBAD-K12-ilvC制备用于KARI表达分析的菌抹上文的pBAD-K12-ilvC构建体和pTrc99A-ilvC的质粒均在TOP10宿主菌柹、中，它们-使用Qiaprepspin小量制备试剂盒(Qiagen,ValenciaCA,catalogue#27106)按照制造商说明书，从在包含100jig/mL氨千青霉素的LB培养基中的3mL过夜培养物中制备。使用BioRADGenePulserII(Bio-RadLaboratoriesInc,Hercules,CA)4要照制造商说明书，将一pBAD-K12-ilvC和一|iLpTrc99A-ilvC分别转化到大肠杆菌Bw25113(AilvC)电穿孔感受态细胞中。将转化过的细胞划线接种在包含加入100(ig/mL氨千青霉素的LB培养基的琼脂板上，在37。C下培养过夜。使用来自这些平板的菌落来制备细胞游离提取物。制备细胞游离提取物使包含pBAD-K12-ilvC和pTrc99A-ilvC的细胞在3.0mLLB培养基中生长，该培养基包含100pg/mL氨卡青霉素以及诱导剂0.02%(w/v)39阿拉伯糖和lmM异丙基P-D-1—琉代半乳糖苦(IPTG),培养条件分别为37。C，在2S0卬m下振荡。通过在6000xg下离心5分钟来收获细胞，离心温度为22.5°C，将细胞沉淀物重悬于1.5mL微量离心管中的300(iL100mMHEPES緩冲液中(pH7.5),用40%水和60%水(按体积计)进行水浴，并超声处理2-3分钟(3.0秒脉沖，强度1.0档，随后是3.0秒停顿)，超声处理使用的是Misonix300超声波破碎仪(Misonix，FarmingdaleNY)。通过离心来移除细胞碎片(Eppendorf微型离心机，型号5415D,在9300xg下处理5分钟，温度为22.5°C)。作为另外一种选择，使用基于去污剂的蛋白提取试剂BugBuster主混合物(Novagen,目录号#71456)来制备细胞提取物。将来自3.0mL培养物的细胞沉淀物重悬在300pLBugBuster主混合物中并室温培养20分钟。通过离心移除细胞碎片(Eppendorff微型离心机，型号5415D),在9300xg,22.5。C下离心5分钟。蛋白质量化通过BradfordCoomassie观'J定〉去(BCAM吏用CoomassiePlus(Pierce#23238,Rockford，IL)来测量样本中的总蛋白浓度。按照制造商规程在96孔微板中制备样本和蛋白标准品(BovineSerumAlbumin,BSA)。蛋DevicesCorporation,Sunnyvale,CA)进4亍现'J量。KARI酶测定规程按照以下文献中所述的方法来合成测定底物(R,S)-乙酰乳酸Aulabaugh和Schloss(Aulabaugh和Schloss,Biochemistry,29，2824-2830,1990):将1.0g2-乙酰氧基-2-甲基-3-氧代丁酸乙酯(Aldrich,Milwaukee,WI)与10mL1.0MNaOH混合并在室温下搅拌。当溶液pH变为中性时，缓慢加入NaOH以维持约8.0的pH值。测定法中使用的所有其他化学药品均购自Sigma。用KARI将乙酰乳酸酶转化为2,3-二羟基异戊酸，然后使用分光光度计(AgilentTechnologies,SantaClara,CA)测量在340nm处辅因子NADPH在反应中的消耗。使用NADPH的GSZOM-Vm-1摩尔消光系数来计算活性。使用的原液是lOOmMHEPES-钾盐，用HC1/KOH调节至40pH7.5;1.0MMgCl2;20mMNADPH和90mM乙酰乳酸。40mL反应緩冲液混合原液包含lOOmMHEPES原液和400pLMgCl2原液。将反应缓冲液(194nL)与NADPH(2.0pL)原液和细胞提取物(2.0|iL)在一次性塑料管(EppendorfUVette,EppendorfAG,Hamburg,Germany)中混合，并且记录在340nm处22.5。C下的吸光度20秒。最初的A，通常为约0.9-1.0。然后将乙酰乳酸(2.0pL)加入管中开始反应。测定法中的成分终浓度为pH值为7.5的100mM钾HEPES、10mMMgCl2、200uMNADPH和900uM乙酰乳酸。完全混合该溶液，并且额外记录在340nm处的吸光度80秒。将该处报告的KARI活性定义为每mg细胞提取物中的总蛋白每分钟消耗的NADPHpmole数。表4显示了细胞提取物中的蛋白浓度和KARI活性的结果，该细胞提取物从用pBAD-K12-ilvC质粒和ptrc99A-ilvC质粒转化过的大肠杆菌Bw25113(AilvC)细胞中制备。制备两个细胞提取物样本用于pBAD-K12-ilvC构建体，一个通过超声波降解，另一个使用BugBuster。使用BugBuster制备用于pTrc99A-ilvC构建体的细胞提取物样本。这些分析显示KARI蛋白在包含pBAD-K12-ilvC质粒的细胞中的表达水平高于在那些包含pTrc99A-ilvC质粒的细胞中的表达水平，然而，通过两种不同方法制备的细胞提取物样本中的酶比活并无显著差异。使用由pBAD-HisB(Invitrogen)转化过的大肠杆菌菌抹Bw25113作阴性对照。阴性对照中的NADPH消耗速率是极低的(测得的消耗速率为那些包含pBAD-K12-ilvC基因的菌抹的约1%至2%)。表4KARI和在包含ilvC基因的克隆中的总蛋白浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>实施例2鉴定来自多种微生物的高比活KARI酶该实施例的目的是为了描述如何筌定包含具有高比活的KARI酶的微生物。那些包含KARI的生物当在基本培养基中生长时具有比大肠杆菌更快的倍增时间，假设它们包含高活性KARI酶。筌定了当在M9基本培养基中生长时具有比大肠杆菌更快的倍增时间的三种微生物，它们是铜绿假单胞菌(PAOl)、荧光假单胞菌(PF5)和霍乱弧菌(N16961)(参见下文)。这些生物的基因组DNA制备可商购获得。表5显示了这些生物当在M9基本培养基中生长时与大肠杆菌相比的倍增时间。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>参考1.Nddhardt,FC，等人，J,Bacteriol.119,736-747,1974。2.BrmkmanFSL,等人，J.Bacteno1.181,4746-4754,1999。3.SilvaAJ和BenitezJA,J.Bacteriol.188,794-800,2006。如上所述，已经将KARI酶分成不同类别。l叚单胞菌属PF5和PAOl酶属于I类KARI,它是家族中最大的一类，而大肠杆菌和霍乱弧菌酶属于II类细菌KARI。铜绿假单胞菌(PAOl,ATCC47085)和荧光々支单胞菌(PF5，ATCCBAA-477)的纯化基因组DNA购自ATCC(美国典型培养物保藏中心，10801UniversityBlvd,Manassas,VA)。来自每个生物的基因组DNA(每个10pg)在100pL10mMTris-HCl,pH8.5中进4亍再水合以用于PCR反应。以下引物对具有连接到正向引物(SEQIDNO:23和25)的Sacl位点和连结到反向引物(SEQIDNO:24和26)的HindIII位点，使用它们通过PCR利用高保真pfu-ultraDNA聚合酶(Stratagene)从PAOl和PF5的基因组DNA扩增ilvC基因编码区。基于这些生物的公用(GeneBank)序列PF5和PAOlilvC基因来设计引物。每个50pLPCR反应包含1.0pL基因组DNA和每个基因的l.OpL，每个10pmolL的正向和反向引物。PCR反应在Eppendorf主循环梯度(EppendorfNorthAmerica,Westbury,NY)下进行，使用以下反应条件。起始温度为95°C2分钟。随后进行5个加热/冷却循环。每个循环由95。C30秒，55。C30秒，72°C1分钟30秒组成。然后再进4亍25个加热/冷却循环。每个这些循环由95。C30秒，65。C30秒，72。C1.0分钟30秒组成。在这些温度循环完成后，将样本保持在72。C下10分钟或更长，然后在4。C下复性。使用实施例I中所述的规程将所得的PCR片段用HindIII和Sacl消化并克隆到pBAD-SacI表达载体中，然后转化进入ilvC敲除菌抹BW25113(AilvC)中。通过限制性酶消化来鉴定阳性克隆并通过全长DNA测序进行确^人，测序使用的是引物，SEQIDNO:21(pBAD-eFl)、SEQIDNO:22(PALPK-R1)、SEQIDNO:27(PF5-S-F2)和SEQIDNO:28(PF5-S-R2)。将所得的菌抹命名为BW25113(AilvC)-PAOl-ilvC和BW25113(AilvC)-PF5-ilvC。霍乱弧菌VC0162基因编码区经密码子最优化以用于大肠杆菌表达，该优化基于已知蛋白序列(AccessionNP一229819.1)并通过委托基因合成(DNA2.0,Inc.MenloPark,CA)来制备。它用粘附到基因末端的Sacl和HmdIII位点来制备。也使用Sacl和HindIII限制位点将该DNA片段克隆到pBAD-SacI表达载体中并转化进ilvC敲除菌抹BW25113(AilvC)中。将所得的菌才朱命名为BW25113(AilvC)-VCopt-VC0162。给予经密码子最优4匕的VC0162序列以SEQIDNO:30。来自K12、PA01、PF5和VC菌抹的蛋白质和KARI活性测定通过BugBuster如实施例1中所述来制备均表达KARI酶的菌才朱BW25113(AilvC)醫K12画ilvC、BW25113(AilvC)-PA01-ilvC.BW25113(AilvC)隱PF5画ilvC和BW25113(AilvC)-VCopt-VC0162的细胞游离提取物。通过使用188nL反应緩冲液、2.0pL20mM的NADPH原液、稀释在测定緩冲液中的5.0pL20%细胞提取物和5.0pL90mM乙酰乳酸来进行KARI测定。因此该实施例中的测定的最终溶液由酶、100mM的钾誦HEPES、10mM的MgCl2、200uM的NADPH和2.25mM的乙酰乳酸组成。表6显示了四种不同生物的KARI比活，所述生物在存在0.02%(w/v)阿拉伯糖作诱导剂的情况下生长过夜。如上所述来测量细胞提取物中的总蛋白量和KARI活性。如表6所列出的那样，来自经筌定当在基本培养基(表5)中生长时具有更快倍增时间的生物的KARI酶均具有比来自大肠杆菌的KARI酶更高的比活。根据SDS-PAGE(未显示数据)的评估，每个提取物具有大约相等的KARI蛋白表达水平。这些结果支持这一假设可将在基本培养基中生长期间的倍增时间用作鉴定具有更高比活的KARI酶的方法。表6比较来自不同生物的KARI比活菌抹分子量(KDa)KARI类细月包提取物中的总蛋白ng/mLKARI比活拜ol/min/mg总蛋白BW25113(Az/VC)-K12-,7vC54II66930.72BW25113(Az/vC)54II67301.1BW25113(A"vC)-PAOl丢C36I49881.2BW25113(A"vC)-PF5-z/vC36I76711.8实施例3分冲斤纯化的K12-KARI和PF5-KARI的比活为了更好地确定观察到的实施例2中的粗细胞提取物KARI比活的提高，将K12-KARI和PF5-KARI纯化到同质以允许精确定量单个蛋白44的浓度并测定纯化的KARI酶的比活。纯化K12-KARI和PF5-KARIK12-KARI和PF5-KARI使用弱阴离子交换离心柱VivapureIEXD,miniH(VivasdenceAG,Hannover,Germany)进行纯化,然后在Microcon装置中4吏用100KDa分子量截止电压(YM100,Millpore,Bedford,MA)进行浓缩。纯化程序在室温(22.5°C)下进行。阴离子交换离心柱中使用的原液是pH7.0的lOOmM钾-HEPES、1.0MMgCl2、250mMEDTA、10%Brij35和2MKC1。洗涤緩冲液(BufferA)通过以下方法制备将5.0mLlOOmMHEPES原液加入到15mL水中，另外加入50pLMgCl2原液、20pLEDTA原液和10nL10%Brij35。洗脱缓冲液#1(緩冲液B)通过以下方法制备将5.0mLlOOmMHEPES、2.0mLKC1原液加入到13mL水中，另外加入50pLMgCh原液、20pLEDTA原液和lOpL10%Brij35。洗脱緩冲液#2(緩冲液C)通过以下方法制备将5mLlOOmMHEPES原液、5.0mLKC1原液加入到10mL水中，另外加入50MgCl2原液、20|iiLEDTA原液和10pL10%Brij35。緩冲液B中的KC1终浓度为约200mM,緩冲液C中为约500mM。菌抹BW25113(AilvC)-K12-ilvC和BW25113(AilvC)-PF5-ilvC的细胞游离提取物通过BugBuster如实施例1中所述进行制备。为了制备载入VivapureIEXD柱的稀释细胞提取物，将600pL双重去离子水加入到200|iL的提取物中。VivapureIEXD柱首先用400fiL緩冲液A洗涤，洗涤通过在2000xg下离心(Eppendorf微型离心机型号5415D)5分钟。在整个Vivapure正XD纯化程序中使用相同设备和方法。将稀释细胞提取物(如上所述)加载到柱上，分两批离心，每批400pL。然后用400pL緩冲液A洗涤(x2)。就PF5-KARI样本而言，将400pL緩冲液B上样以将所述酶从柱中洗脱到收集管中。就K12-KARI样本而言，改为使用400iliL緩冲液C。MicroconYM100装置首先用400pL去离子水洗涤，洗涤通过在13800xg下离心(Eppendorf微型离心机型号5415D)5分钟。然后将从VivapureIEXD纯化中收集的样本进样并在13800xg下离心4分钟。弃去流通液并将400pL緩冲液B加入到样本室中，在13800xg下离心4分钟。在加入200(iL緩冲液B到样本室前重复洗涤程序(x2)。将样本45室中的样本倒入洁净管中并在5000xg下离心2分钟以收集纯化的样本。通过毛细管电；永(Agilent2100Bioanalyzer,AgilentTechnology,SantaClara，CA)验证每个纯化KARI样本的纯度。使用Protein230试剂盒制备样本，并按照制造商说明书施用到ProteinLabchip(与试剂盒一起提供)，用Bioanalyzer进行分析。在电描记图上能观察到每个纯化样本极低背景的单峰。纯化的KARI样本的蛋白质量化使用分光光度计(AgilentTechnology,SantaClara,CA)和1cm-各径长度的一次性塑涉牛管(UVette,eppendorf,Hamburg,Germany)，于KARI纯化样本进4亍在280nm处的UV吸收测定，以定量纯化样本中的KARI。PF5-KARI(0.73,lmg/mL)和K12-KARI(0.98,lmg/mL)在280nm处的消光系数通过程序Protparam进4亍预测，该程序来自ExPASy网站(Pace,C.N.等人，ProteinSci.11,2411-2423,1995)。将纯化样本在緩冲液B中稀释成20%(v/v)用于UV吸收测定。稀释的PF5-KARI样本的A28Q为0.41,稀释的K12-KARI的A28o为0.36。纯化的KARI的活性测定该实施例中使用的测定条件与实施例2中相同，不同的是使用5[iL20%(v/v)纯化样本代替细胞提取物。纯化样本的蛋白浓度以及它们的比活在表7中示出。测得的最快生长生物的纯化PF5-KARI的比活是K12-KARI的两倍。这些结果与实施例2中使用这两种酶的粗制备物获得的数据一致，因此为以下假设提供了进一步支持在基本培养基中生长期间的倍增时间可用作鉴别具有比大肠杆菌酶更高比活的KARI酶的方法。表7大肠杆菌和假单胞菌属菌抹中的KARI浓度和比活<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>权利要求1.用于将乙酰乳酸转化为二羟基异戊酸的方法，所述方法包括a)提供包含编码多肽的基因构建体的微生物宿主细胞，所述多肽具有大于大肠杆菌酮醇酸还原异构酶比活的酮醇酸还原异构酶比活；以及b)使所述(a)的宿主细胞接触乙酰乳酸，其中产生2，3-二羟基异戊酸。2.根据权利要求1的方法，其中所述基因构建体编码具有基于纯化蛋白大于1.1pmol/min/mg的酮醇酸还原异构酶比活的多肽，所述比活通过在以下条件下进4亍的NADPH消4毛测定法来测量a)约7.5的pH值；b)约22.5。C的温度；和c)大于约10mM的钾。3.用于生产异丁醇的方法，所述方法包括a)提供包括下列基因构建体的重组微生物宿主细胞1)至少一种编码乙酰乳酸合酶的基因构建体，所述乙酰乳酸合酶将丙酮酸转化为乙酰乳酸(途径步骤a);2)至少一种编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体，所述酮醇酸还原异构酶的比活基于纯化蛋白大于l.lpmol/min/mg,所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消耗测定法来测量i)约7.5的pH值；ii)约22.5。C的温度；和iii)大于约10mM的钾，所述钾用于将(S)-乙酰乳酸转化为2,3-二鞋基异戊酸，(途径步骤b);3)至少一种编码乙酰羟酸脱水酶的基因构建体，所述乙酰羟酸脱水酶用于将2,3-二羟基异戊酸转化为a-酮异戊酸，(途径步骤c);4)至少一种编码支链酮酸脱羧酶的基因构建体，所述酮酸脱羧酶用于将a-酮异戊酸转化为异丁醛，(途径步骤d);5)至少一种编码支链醇脱氬酶的基因构建体，所述醇脱氬酶用于将异丁醛转化为异丁醇(途径步骤e);以及b)使(a)的宿主细胞在产生异丁醇的条件下生长。4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述至少一种编码具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽的基因构建体分离自假单胞菌属。5.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述宿主细胞选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。6.根据权利要求4的方法，其中所述宿主细胞是选自下组的属的成员梭菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱杆菌属、克雷伯氏菌属、类芽胞杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、弧菌属和糖酵母属。7.根据权利要求6的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。8.根据权利要求6的方法，其中所述细胞是植物乳杆菌。9.权利要求6的方法，其中所述细胞是啤酒糖酵母。10.根据权利要求3的方法，其中所述乙酰乳酸合酶具有如SEQIDNO:2所示出的氨基酸序列。11.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽具有选自SEQIDNO:34、SEQIDNO:35和SEQIDNO:36的氨基酸序列。12.根据权利要求3的方法，其中所述乙酰羟酸脱水酶活性具有如SEQIDNO:6所示出的氨基酸序列。13.根据权利要求3的方法，其中所述支链醇脱氬酶具有如SEQIDNO:IO所示出的氨基酸序列。14.根据权利要求3的方法，其中所述支链a-酮酸脱羧酶具有如SEQIDNO:8所示出的氨基酸序列。15.包含酮醇酸还原异构酶的重组宿主细l包，所述酮醇酸还原异构酶具有的比活大于大肠杆菌酮醇酸还原异构酶的比活。16.权利要求15的重组宿主细胞，其中所述酮醇酸还原异构酶具有基于纯化蛋白大于1.1jimol/min/mg的比活，所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消耗测定法来测量a)约7.5的pH值；b)约22.5。C的温度；和c)大于约10mM的《甲。17.用于鉴定和分离编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体的方法，所述酮醇酸还原异构酶具有基于纯化蛋白大于1.1pmol/min/mg的比活，所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消耗测定法来测量i)约7.5的pH值；ii)约22.5。C的温度；和iii)大于约10mM的钾；所述方法包括以下步骤a)鉴定当在M9基本培养基中生长时倍增时间短于大肠杆菌倍增时间的菌种；b)筛选(a)的菌种的酮醇酸还原异构酶活性以筌定活性菌种；c)使用与已知编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体具有同源性的核酸序列来探测(b)的活性菌种的基因组DNA,以从所述活性菌种中鉴定和分离编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体；以及d)从所述活性菌种中扩增并表达编码酮醇酸还原异构酶的基因构建体；以及e)从步骤(d)的表达的基因构建体中筛选具有基于纯化蛋白大于1.1nmol/min/mg的比活的基因构建体，所述比活通过在以下条件下进行的NADPH消库毛测定法来测量i)约7.5的pH值；ii)约22.5。C的温度；和iii)大于约10mM的《甲。18.根据权利要求17的方法，其中所述活性菌种选自梭菌属、发酵单胞菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、红球菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、弧菌属、乳杆菌属、肠球菌属、产碱杆菌属、克雷伯氏菌属、类芽胞杆菌属、节杆菌属、棒状杆菌属和短杆菌属。19.根据权利要求17的方法，其中当在M9基本培养基中生长时步骤(a)的倍增时间等于或小于大肠杆菌的倍增时间的80%。全文摘要本发明提供发酵生产异丁醇的方法，所述方法是通过发酵法培养除了用于将葡萄糖转化为异丁醇所需的其他酶之外还表达高活性酮醇酸还原异构酶的重组微生物。文档编号C12P7/16GK101680007SQ200880012258公开日2010年3月24日申请日期2008年4月16日优先权日2007年4月18日发明者M·G·布拉穆奇,M·J·奈尔逊,廖德瑛申请人:纳幕尔杜邦公司