体转基因生物成像的制作方法

专利名称：体转基因生物成像的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过一种名为"体转基因生物成l象(somatotransgenic bioimaging)"的新技术在非人转基因动物中建立病变模型、筛选调控这些病 变的化合物以及评估药物代谢和毒性。
背景技术：
潜在治疗剂(Potential therapeutics )的鉴定通常始于使用高通量体外 技术。然后需要在体内例如在啮齿动物模型中验证成功的候选化合物，随 后进行全面的灵长类试验或者临床试验。
传统药物试验倚赖对外周的、分泌的或排泄的体液或者活检组织进行 测量，并经常倚赖终点分析(endpoint analyses )。对体液或组织进行测量 倚赖合适的实验变量，即它们只在当所述体液或组织中存在针对所述候选 化合物的给药而变化的物质时起作用。终点分析倚赖于动物的杀死，这扰 乱了实验的连续性，并使得必须进行大量实验以提供可靠的统计分析。转 基因小鼠的出现通过提供遗传工程疾病模型彻底改变了药物验证方法。转 基因疾病建模领域最近已经发展形成了转入有组织或表型特异性启动子控 制下的荧光素酶才艮告基因的小鼠(W. Zhang et al. 2001， Transgenic Research 10:423)。高精度生物成像使得研究者可以在动物的整个生命周期 中在体内定量追踪特异性药物目标的遗传激活(或抑制)。
由于自然特性，通过种系转基因获得的标准转基因动物在其体内的每 个细胞中都包含所插入的遗传物质。体内不同器官系统的大多数细胞内信 号传递过程是相同的，并且明显地可在不同组织中具有对照作用。这种整 体活性导致成像过程中有明显和复杂的背景千扰，这妨碍了这些用于有效、 连续生物成像的转基因生物的应用。在这些情况下，研究者会求助于对个 体死后的组织进行终点分析。本发明解决了这些问题。
絲/七 #絲辨
药物代谢是药物清除的主要决定因素，药物代谢细胞色素P450(CYP)的诱导性表达是最常见的导致药物代谢动力学变化的因素。这些包含血红 素的酶在多种化学性质不同的化合物(包括食物化合物、药剂、致癌物和
环境污染物)的代谢(主要是氧化)中都起到重要作用。
通常有两种方法可用于药物代谢语的体外研究用肝脏微粒体孵育和 用有代谢能力的细胞孵育。
测定药物在不同物种的肝脏微粒体中的代谢稳定性，以评估这种化合 物由于I期代谢形成不想要的潜在毒素或在药学上没有活性的代谢物的可 能性，或者由于缺少或可以忽略不计的代谢降解而在体内积聚的可能性。
因此对代T^I定性的测定是一种描述代谢归宿的量度。肝脏 ^立体中代谢
稳定性的测定总括了所有可能的反应。肝脏孩i粒体是包含多种药物代谢酶 (包括CYP)的亚细胞组分(主要是内质网)。因此，它们被广泛地用作 体外模型系统以研究外源物的代谢归宿。人类肝脏微粒体包含以下参与药 物代谢的CYP异构酶CYP1A2、 2A6、 2B6、 2C8、 2C9、 2C19、 2D6、 2E1和3A4。这些异构酶中，CYP3A4在外源物的代谢中起主务ft用，因 为其是人类肝脏中最丰富的CYP (约28%)，且其参与超过50%的在目
前的药疗中应用的药物的^a谢。
#*立体的主要局限是它们表现出I期的活性，但只表现出部分II期活 性，因而只能在短期孵育中^f吏用。
当使用完整细胞时，基因表达、代谢途径、辅助因子/酶和细胞质膜都 被广泛地保留，但需要使用完全分化的细胞如原代培养的肝细胞，因为肝 瘤细胞系只有非常低和部分的CYP表达。
对CYP的抑制对于候选药物是不想要的特征，并需要通过检测所述候 选药物是否抑制其他化合物的代谢或其他化合物是否抑制所述候选药物的 代谢来确定。这些实验既可用微粒体进行也可在细胞中进行。微粒体的主 要局限是抑制参数不能精确地反映体内情况，因为未考虑药物转运的影响。 药物-药物相互作用可能的最佳情况可在有代谢能力的肝细胞中获得。这需 要使用能够完全转录和翻译CYP基因、并可因为酶的mRNA或活性增加 而在体外监测的细胞系统。原代培养的人类肝细胞在最初的几天内对酶诱 导物应答良好；然后此能力消失。尽管几种异构酶的诱导已经^L才艮道，但 肝瘤细胞系对诱导物的应答很差。原代培养的肝细胞在体外模式下仍然是 独特的，并使得可对药物的CYP诱导可能性进行全面检测。
潜在治疗剂的鉴定通常始于使用高通量体外技术。然后需要在体内例
9如在啮齿动物模型中验证成功的候选化合物，随后进行全面的灵长类试验
或者临床试验。目前几乎没有可靠的用于分析因药物代谢的CYP激活的体 内试验系统。
CXR Biosciences建立的肝脏还原酶Null(HRN)小鼠是当前一种用于测 量CYP对候选药物代谢的影响的模型。为了发挥功能，CYP从电子供体 细胞色素P450还原酶接受电子。在所述HRN小鼠中，该还原酶活性^皮敲 除从而抑制任何CYP的活性。这提供了一个消除CYP活性的才莫型系统， 其可更清楚地分析替代代谢物或在无CYP代谢的情况下提供药效分析。所 述应用被限制在描述药物代谢中的特异CYP活性的范围之内。
其他体内方法包括生成具有"人源化"肝脏的小鼠。这避免了相关的人 类和啮齿类CPY活性之间对给药的应答不同。Tateno等人(2004) (Tateno C. et al. Am J Pathol; 165: 3 p901)描述了 一种方法，通过这种方法，uPA/SCID 小鼠可经历宿主肝细胞的部分消融，然后用人类肝细胞重构以建立人源化 小鼠。Katoh等人(2007) (Katoh， M. et al. J Pharm Sci; 96: 2， p428)最近已经 实际使用了这种方法，以检验在这些人源化小鼠中应答高或低水平的人类 白蛋白的CYP2D6特异性代谢物。尽管此工作显示了概念的精确证据，但 其倚赖在多态异构酶中非特异的CYP抑制物，并倚赖血清中可定量的代谢 产物的分泌。外周血液取样和生化分析要耗费时间并受到动物实验规范的 限制。
本发明通过使用当前文献中良好表征的遗传元件以对靶药物在体内的 代谢进行建模从而解决了这些问题。所述方法是快速和易适应的，因为具 体CYP450的体转基因生物可在几周内生成。读取是实时的，这使得在动 物个体中的测量可在给药前、给药时和给药后进行。此外，施药和读取可 在任何基因敲除模型、表型模型和疾病模型之上进行，而不需要进行耗时 的交配。我们的技术使得载体很容易定位到肝脏上并因此将任何生物成l象 读取结果都只限于所选的器官。

发明内容
我们已经建立了一项被称为"体转基因生物成像"的新技术。在此技术 中，载体带有一个由响应病变或治疗的遗传元件驱动的生物发光才艮告基因， 所述遗传元件可对所述病变和/或治疗介入的i^进行建模。所述载体通过 靶向给药到特定组织而被送递到非人动物胎儿或新生动物中，并使所述动
10物长到成年。所述生物发光报告基因的表达可在完整的活体动物中被测量。 因此可使用同一动物进行任何数量的测量而不需杀死所述动物。例如可对 疾病界定的分子事件进行测量。又例如，可在给药前进行测量以获得稳态 数据，然后从给药到所述药物被完全代谢期间进行测量，直到再次达到稳
态。 、 ， - 、、
达。因此它可用于候选药物化合物的验证。
此技术还可用于例如确定化合物是否调节控制药物代谢或因给药所致
毒性反应的基因的表达。所述药物代谢剂主要类型是细胞色素P450(CYP) 酶。细胞色素P450酶是很多化合物氧化代谢的主M化剂。CYP对药物 的代谢影响到药物清除、毒性、活化，并且可能的话，会影响到与其他药 物的不良相互作用。被P450酶很快转变并从体内快速清除或转化为毒性产 物的化合物是不好的候选药物。诱导或抑制P450酶表达的药物也对第二种 药物的效力或毒性具有不利作用。根据本发明，可将生物发光才艮告基因置 于一个控制代谢酶如细胞色素P450酶的表达的遗传元件的控制下，通过子 宫内基因转移将所述构建体靶向到动物肝脏，并通过4吏用整个动物生物成
响。因此本发明可用于确定可能的清除速度并因此可能确定候选药物的效 力、毒性，并且可能确定对其他共给药的药物的效力或毒性可能的影响。
我们之前已经说明了经卯黄血管将慢病毒基因送递至啮齿动物胎儿的 有效基因送递和持续转基因表达(S. N. Waddington et al. 2003， Gene Therapy 10:1234)。在此论文中，将高剂量减毒的编码受控于CMV启动子 的P -半乳糖苷酶的VSV-G假型马传染性贫血病毒(EIAV)注射到有免疫能 力的MF1小鼠的胎儿循环中。有放基因送递和持续转基因表达i兌明了所述 技术用于基因治疗的可能性。子宫内基因送递这一技术被进一步研究以确 定其是否可能专门靶向患迪谢内肌营养不良的主JI/L^(Gregory et al. 2004， Gene Therapy 11(14):1117-25)。 P-半乳糖苷酶基因向这些主M^的高度有 效转移支持了子宫内基因送递用于肌营养不良的治疗和长期预防或矫正的 可能性。子宫内基因送递使得人类因子IX基因可转移到有免疫能力的血友 病小鼠的胎儿循环中，从而永久治疗性矫正B型血友病(Waddington et al. 2004， Blood 104:2714-2721)。这些研究表明了子宫内基因送递用于耙向基因 送递和基因治疗的可能性。根据本发明，体转基因生物成像是一种使组织可被特异性靶向的非侵 入式技术，其不需要杀死动物或者只是倚赖于外周的、分泌的或排泄的体 液或采取活检组织。慢病毒构建体用目标遗传元件控制下的生物发光报告 基因生成。所述基因构建体可被特异地靶向到动物胎儿或新生动物的目标 位点或组织。特异性靶向通过例如注射专门将所述载体送递到动物胎儿或 新生动物的目标位点或组织而实现。另一层面的特异性还可通过4吏用带有 可增加基因转移组织特异性的包膜进行假型化的慢病毒而提供。生物发光 报告基因特异性靶向到目标位点或组织减少了成像中明显的和复杂的背景 干扰，而这在使用标准种系转化转基因动物时由于报告基因在所有细胞中 表达而会出现。这是因为所述转基因只在其通过载体被送递到的组织中表 达，因此所观察到的生物发光只来自于那些组织而不是所有组织。换言之， 由于所述载体被送递到特定组织，因此可更精确和可靠地研究对那些特定 组织的病变或治疗作用。体转基因方法还会在给予药物或代谢物的整个过 程中提供连续的读出结果。
一旦目标遗传元件控制下的生物发光报告基因被耙向到动物胎儿中要 求的位点或组织，就使所述动物发育到出生和成年。在评估药物代谢或毒 性的研究中，主要靶向组织是肝脏。随后可监测所述动物中的所述生物发 光报告基因响应受控事件的表达情况。本发明使得可进行整个动物成像， 避免了杀死动物、复杂外科手术或对外周的、分泌的或排泄的体液的倚赖。 慢病毒的使用特别引起了在所述动物的整个生命周期中有效、 一体化的基 因转移和稳定的基因表达，这使得可在所述动物的任何生命阶段进行生物 成像。此外，出生前基因转移使得动物对转基因材料有免疫耐受性。
此外，本发明的技术比传统的体转基因技术更快，因为所需要的就是 制备栽体并将其送递到动物胎儿或新生动物中的合适位点，然后4吏所述动 物正常发育。在传统的转基因技术中，当然必须在早得多的阶段进行基因 转化。
另外，在传统的转基因技术中，所述转基因动物的所有细胞最终来自 于相同细胞中的相同转化事件，即所述转基因在每个细胞基因組中的位置 和方向均相同。在本发明中，所述转导在组织水平上进行(体转基因)， 因此在许多不同的各个细胞中存在许多不同的各个转化事件。这意味着位 置效应被避免。在传统的种系转基因中，如果所述栽体在一个不利的位置 整合，则在所述动物的所有细胞中都会存在该不利的结果，并可在任何分析中得到误导性的观点。在本发明的体转基因动物中，任何不利位置的插 入都会被其他有利位置的插入所补偿。
本发明的另 一优点是可使用任何合适的非整合载体，而传统转基因总 是需要一个整合事件，否则所述转基因就不能净皮复制到所得到动物的每个 细胞中。
体转基因术的另 一个优点是荧光素酶可被导入任何转基因或基因敲除 的小鼠模型或者背景品系中。相反，传统种系转基因必须对这些不同的品 系进行杂交，并通过最快的方法快速同源法达到遗传同质，但仍然需要至
少l(M义的时间。
本发明可使用体转基因生物成像技术监测模型动物中病变的逸艮。进 行子宫内基因送递的动物的背景可有所变动并用于确定对何种病变进行建 模。生物成像的非侵入性质的一个优点是所述报告基因的表达和所述病变 的发展可被连续监测。表达可在例如病变界定事件之前、之中、之后或全 程被检测。生物发光可在化合物的给药之前和之后净皮检测，以确定所述化 合物对所述报告基因表达的影响。因此本发明可用于确定候选治疗化合物 的效力。化合物对动物模型的作用可通过本发明技术提供连续生物发光读 数的能力进行详细分析。本发明技^艮有利，因为其可在已知和已证明模 型的环境中进行，从而可研究病变或治疗对具体组织的影响。
Becker等人提供了用于监测抗血管生成疗法效果的子宫内膜异位的非 ^^V模型(Am. J. Path.， 168:2074-2084)。用人类泛素C启动子控制下的荧 光素酶基因生成种系整合的表达荧光素酶的转基因小鼠。所述小鼠显示了 全身生物发光。通过外^"f术取出这些转基因小鼠的子宫内膜组织并移植 到不发光的受者上。所述模型提供了一种对子宫内膜的损伤成像、监测子 宫内膜的生长和子宫内膜异位治疗中抗血管生成疗法的效力的方法。此模 型与本发明有显著的不同。本发明能够分别靶向到多种组织并能够进行非 4h研究而无需外科手术。
因此本发明提供 一种用于确定报告基因的表达是否受到化合物调节 的方法，所述方法包括(a)将所述化合物给予非人转基因动物，所述非人 转基因动物通过在其尚未出生时或新生时用载体对其一个或多个特异组织 进行基因转导生成，所述栽体含有与响应病变或治疗的遗传元件有效连接 的生物发光报告基因；和(b)测定所述化合物对所述报告基因在所述一个或 多个特异组织中表达的效果一_假设如果存在这一效果，所述测定包括检
13测由于所述报告基因的基因产物的活性造成的动物生物发光。
告基因的表:的用途，所i非人转基因动物通过在其尚未出生时或新生时 用载体对其一个或多个特异组织进行基因转导生成，所述载体含有与响应
病变或治疗的遗传元件有效连接的所述报告基因，方式是测定所述化合物 对所述报告基因在所述一个或多个特异组织中表达的效果_一假i殳如果存 在这一效果，所述测定包括检测由于所述报告基因的基因产物的活性造成 的动物生物发光。
本发明可应用体转基因生物成像技术在野生型动物模型、外科手术或 化学诱导的疾病模型、转基因动物或人源化动物模型中监测药物代谢或毒 性。进行子宫内基因送递的动物的背景可变化，以在与稳定状态不同的疾 病变态下检测药物代谢。 一个实例是在患晚期肝细胞癌的动物中化疗药物 的代谢。生物成像的非侵入性质的一个优点是所述报告基因的表达可被连 续监测。 一个替代方案是使用宿主肝细胞部分或全部消融并且用人类肝细
胞重构的"人源化，，小鼠模型。这种方案分别被Katoh等人(2007) (Katoh， M. et al. J Pharm Sci; 96: 2， p428)、 Turrini等人(2006) (Turrini， P. Transplant Proc; 38: 4 pll81)和Mitchell等人(2002) (Mitchell, C. Am J Pathol; 160: 1
p31)使用不同的技术所描述。人类和小鼠CYP响应的不同表明这一人源化 小鼠模型对于在动物模型中检测人类CYP的相对表达是非常有价值的。我 们的方案是用病毒栽体在活体外遗传操作人类胎儿、新生儿或成人肝细胞 使其具有CYP特异性报告基因的构建体。然后用所述遗传修饰的肝细胞重 构鼠科动物肝脏环境(niche),并将得到的动物用于体转基因生物成4象试 验以评估药物代谢和/或作用。
本发明模型的可塑性是指具有确定启动子-增强子序列的任何CYP可 在人类或非人背景下，在疾病模型或毒性模型中被应用，且在所述实验的 全部时间都可生成凝:据，避免了物种和个体差异。
因此本发明提供了一种评估化合物代谢和/或毒性的方法，包括
(a) 将所述化合物给予非人转基因动物，所述非人转基因动物通过在其 尚未出生时或新生时用载体对其一个或多个特异组织进行基因转导生成， 所述载体含有与响应药物代谢和/或药物毒性的遗传元件有效连接的生物 发光报告基因；和
(b) 测定所述化合物对所述报告基因在所述一个或多个特异组织中表达的效果一 一若存在这一效果，所述测定包括检测由于所述报告基因的基 因产物的活性造成的动物生物发光。
本发明还提供了一种评估化合物代谢和/或毒性的方法，包括
(a) 将所述化合物给予非人转基因动物，所述非人转基因动物通it^其 尚未出生时或新生时引入转基因细胞生成，所述转基因细胞含有与响应药 物代谢和/或药物毒性的遗传元件有效连接的生物发光报告基因；和
(b) 测定所述化合物对所述引入细胞或其所来源的细胞中的所述报告 基因表达的效果一一若存在这一效果，所述测定包括检测由于所述报告基 因的基因产物的活性造成的动物生物发光。
光报告基因"表^的用途r所述非人转基因动物通过在其尚未出生时或新
生时用载体对其一个或多个特异组织进行基因转导生成，所述载体含有与 响应药物代谢和/或药物毒性的遗传元件有效连接的生物发光报告基因，方 式是测定所述化合物对于所述报告基因在所述一个或多个特异组织中表达 的效果一一若存在这一效果，所述测定包括检测由于所述报告基因的基因 产物的活性造成的动物生物发光。
本发明还提供一种非人转基因动物用于确定某种化合物是否会调节所 述报告基因的表达的用途，所述非人转基因动物通#其尚未出生时或新 生时引入转基因细胞生成，所述转基因细胞含有与响应药物代i射和/或药物 毒性的遗传元件有效连接的生物发光报告基因，方式是测定所述化合物对 所述报告基因在所述一个或多个特异组织中表达的效果一一假设如果存在 这一效果，所述测定包括检测由于所述报告基因的基因产物的活性造成的 动物生物发光。


图1:说明了传统分析、传统转基因生物成像和本发明的体转基因生 物成像之间的不同。在全部三种分析中，上部阴影区示出了疾病诱导发生 的时间点，下部阴影区示出了治疗分子或候选治疗分子净皮引入的时间。
左边示出了传统的非成像分析进行了血浆试验，并最终杀死动物以 收集其組织用于分子分析。
右边示出了传统(种系)转基因生物成像。顶部示出了一个启动子荧 光素酶构建体的克隆，其下示出了转基因生物的形成，持续4个月以上。
15然后进行生物成像。
中间示出了本发明的体转基因生物成像的一个示例实施方案。与传统
转基因生物成像相比，持续4个月以上的转基因动物形成步骤为制备f曼病 毒载体和该载体的子宫内注射所代替代。这需要大约三周。
图2:对新生小鼠进行慢病毒载体的肌内注射后的肌肉生物发光，其 中荧光素酶被一个组成型启动子驱动。上图是正常图像，下图B肉生物 发光。
图3:对新生小鼠进行慢病毒载体的呼吸道灌注后的呼吸道生物发光， 其中荧光素酶被一个组成型启动子驱动。上图是正常图像，下图是呼吸道 生物发光。
图4:对新生小鼠进行慢病毒栽体的颅内注射后的颅部生物发光，其 中荧光素酶^皮一个组成型启动子驱动。上图是正常图# ，下图是颅部生物 发光。
图5:对新生小鼠进行慢病毒载体的血管内注射后的肝部生物发光， 其中荧光素酶被TGF-p感觉启动子驱动。上图是正常图像，下图是肝部生 物发光。
图6:阐释了对新生小鼠进行慢病毒载体的呼吸道灌注后在肺(呼吸 道)内的长期转基因表达，其中荧光素酶被一个组成型启动子驱动。对第 1日龄的新生小鼠(11=5)进行单剂量的gp64/HIV-荧光素酶( 3x107 iu)羊膜内 给药。这些动物与未注射对照(11=2)在鼻内给予50 jil的15 mg/ml荧光素后 进行成像。(A)显示了去掉背景(对照)值后肺内的荧光素酶表达，这在本 研究期间(390天)均是可检测的。(B)图示了荧光素酶在上述小鼠肺内和 鼻内的表达。(B)的图像是在第384日龄采集的。比例尺代表100nm。
图7:用含有驱动荧光素酶表达的TGF-p应答元件的质粒转染 NIH-3T3细胞。然后用表达TGF-P3的逆转录病毒载体转导这些细胞。所 述SBE4应答元件对通过smad2/3介导的转录活化的TGF-P活化是特异的。 此Smad活化可进一步描绘为使用ARE应答元件连同爪蟾Fast-l反式作 用子(单ARE只对Samd2/3特异)的Smad2特异的转录活化。所述BMP 特异的应答元件通过Smad1/5/8的活化激活并且不应响应TGF+3的活化。 最后，Samd7是一种抑制子Smad,已知其在一个TGF-|53活化的负反馈 环路中上调。转基因TGF-P3的活化将SBE4元件上调至对照的大约1000 倍，并且ARE、 ARE/Fast-l应答元件和Smad7启动子都显示了明显高于对照的响应。阴性对照BMP应答元件BRE在TGF-P3过表达时未显示出 明显高于对照的响应。我们的结论是这些应答元件在体外对TGF-p活化是 有活性的。
图8:从原代小鼠真皮成纤维细胞生成驱动萤火虫荧光素酶基因的合 成TGF-p应答元件的转基因细胞系。CAGA(12) Smad结合元件(SBE)被置 于最小启动子的上游，并将会对Smad2/3特异性转录激活响应。用含有所 述CAGA(12)-Luc元件的慢病毒栽体转导原代鼠真皮成纤维细胞(MDF)。 然后在用表达TGF-p3或GFP的慢病毒载体转导的MDF的M培养基中 培养这些细胞。所述MDF-CAGA(12)-Luc细胞显示了与对照相比荧光素 酶对TGF-P3 it^达细胞的条件培养基的明显响应。这些数据证实我们能 够从原代鼠细胞中形成响应TGF-p活性的转基因细胞，
图9:用Lenti/CAGA(12)-Luc载体转导稳定表达人类avp3整合素的 人类胚肾293T细胞和对照293T细胞以形成两个转基因系。再将这些细胞 置于it^达TGF-P3的细胞或对照细胞的条件培养基中。与对照293T细胞 相比，avp3表达细胞系中的荧光素酶产量明显加强。我们可以得出结论， avp3整合素的表达加强了 TGF-p3在293T细胞中的响应度。
图10:对新生小鼠进行慢病毒载体的血管内注射后的肝部生物发光， 其中荧光素酶被TGF-p感觉启动子驱动。上图是对生物发光的定量。下图 是标准化的生物发光图像。用VSV-G-假型HIV荧光素酶栽体经血管内途 径对小鼠胎儿(E17)进行注射。所述荧光素酶转基因被所述TGF-pi激活的 Smad特异的应答元件CAGA(12)驱动。得到的体转基因后代在60天中检 测4次，然后进行胆道结扎，这是一种诱导肝脏损伤和纤维化的^H人方法。 当肝脏纤维化进行时，持续对小鼠进行检领，J。 J3M内注射荧光素后5分钟， 用CCD照相机对麻醉小鼠所摄取的影像构成了荧光素酶表达试验。
具体实施方式
舰
本发明的优选栽体是病毒栽体。本发明可应用的病毒载体包括腺病毒 栽体、慢病毒载体、腺伴随病毒(AAV)和逆转录病毒载体或单纯疱療病毒 栽体。在许多情况下优选慢病毒栽体。
对于许多组织尤其是肝脏和肺，优选整合载体尤其是整合匱病毒载体。 在合适的情况下，也可使用非整合栽体(包括整合缺陷型慢病毒栽体)。非整合栽体例如AAV载体也可专门用于未分化组织如肌肉和脑中。
本发明的载体包括与 一个或多个响应病变或治疗的遗传元件有效连接的一个或多个生物发光才艮告基因。
在一个替代实施方案中，所述载体包括与响应药物代谢和/或药物毒性的遗传元件有效连接的生物发光报告基因。
优选的生物发光才艮告基因是荧光素酶基因。众所周知，荧光素酶作用于其底物荧光素导致生物发光。本发明可^"吏用的荧光素酶基因的实例为萤火虫荧光素酶基因，其基因产物作用于荧光素导致发出可穿透身体组织的红色(600nm波长)光并因此可^L检测；海肾(w/w7/fl^mybrw/s)荧光素基因，其基因产物作用于海肾荧光素(腔肠荧光素)导致发出可检测的蓝色(466 nm波长)光。
通常，所述载体表达盒含有一个体内优化的带有上游多克隆位点的荧光素酶基因，其中调控元件可克隆到所述多克隆位点中。这些调控元件包括因病变进程或药物代谢而被激活或抑制的基因的增强子和启动子元件。可使用非启动子遗传元件如小RNA限制表达。
通常，为研究药物代谢或毒性，所述启动子是细胞色素P450(CYP450)启动子或与细胞色素P450活性有关的基因的启动子。可4吏用参与药物^谢的任何CYP450基因的启动子，例如人类CYP450或与对其进行所述试验的转基因动物同一物种的CYP450的启动子。因此，在转基因小鼠中，优选使用鼠源或人源启动子。例如，可使用来自CYP1A2、 2A6、 2B6、 2C8、2C9、 2C19、 2D6、 2E1或3A4中的任一个启动子。优选CYP3A4启动子，尤其是人源或鼠源CYP3A4启动子。
逸欢
根据本发明，将所述栽体引入一个或多个特异组织，而使其他组织不受影响(或至少受到的影响很小以至于可在实际上认为未被转基因)。这与传统生物成^f象中的位置不同，传统生物成#>的转基因动物是一种在所有组织的所有细胞中都包含转基因的种系转基因动物。如本文所述，将所述载体引入到一个或多个特异组织中具有极大的优点。
将本发明的载体特异地引入的优选组织包括肝脏、心脏、肾脏、肌肉、脑、曱状腺、肺、胰腺、血液、脾脏、胸腺、睾丸、消化道(如食管)、气管、血管系统、周围神经系统和眼部组织。尤其优选肺和肝。
18如本文所述，可使用多种机制已将所述载体特异地耙向到特定组织上。动參
本发明的技术优选地用于(非人)哺乳动物。优选啮齿动物如大鼠、
小鼠和兔；以及灵长类如猴。特别优选小鼠，因为有大量关于转基因小鼠的知识，包括全基因组序列的可得性和已有的小鼠疾病模型的广泛可得性，并且实验方便。还存在若干具有人源化肝脏的小鼠模型从而使得在体内环境中使用人类组织。也可使用小型猪或较小的灵长类。通常，较小的动物要优于较大的动物，因为在较小动物中易于检测组织的生物发光。需要利用不同的技术将载体最佳地送递到不同动物中。
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通常，将载体送递到动物胎儿或新生动物通过注射到相关组织或全身。
在小鼠中，全身注射已经证明可将慢病毒特异地定位到脾脏、肝脏、肺和心脏。这种耙向可通过血管内注射到胎儿卵黄嚢的血管中或注射到新生动物的浅颞静脉中实现。另一水平的靶向通过利用用来将慢病毒载体假型化的多种组织向性病毒包膜糖蛋白实现。
慢病毒栽体的一个吸引力一一某些其他载体也有一一在于可使用不同的表面受体以改变所述载体的组织和细胞向性( 一种被称为假型化的方法)的可能性。尽管可将慢病毒栽体合成来含有其他病毒表面糖蛋白(下面做更详细的解释)，然而腺伴随病毒载体和腺病毒栽体可用同属其他血清型的包膜蛋白获得以赋予不同的向性。例如，AAV血清型9与AAV血清型8相比可赋予心脏细胞更强的向性，而AAV血清型8可赋予肝脏细胞更强的向性。因此可使用不同的腺病毒血清型。还可使用具有其他血清型纤维的不同腺病毒血清型。
慢病毒载体用含有三或四个含有不同DNA组分的质粒转染细胞制备，以产生病毒样载体颗粒。三质粒系统包括由必要病毒组分组成的包装质粒，所述必要病毒组分包括用于病毒颗粒合成的gag和pol基因。第二质粒含有"有效载荷"，例如由侧翼为末端重复序列的选定启动子驱动的荧光素酶cDNA。这还包括一段确保所述有效载荷被整合到所述病毒颗粒中的包M列。第三质粒编码包覆所述包膜并赋予所述载体对特异细胞类型的向性的述(慢病毒载体是逆转录家族的一个属；HIV是一个亚属)。这些假型包括水疱性口炎病毒的G蛋白(VSV-G)，以及来自流感病毒、副流感病毒、埃博拉病毒、长臂猿白血病病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)和杆状病毒(gp64)等的糖蛋白。
本发明人和其他人已经观察到对某些组织或器官的特异性依赖包被所述病毒的假型并依赖向幼小生物体的给药途径。例如，VSV-G在静脉内注射后赋予对动物肝脏和脾脏的向性。gp64在羊膜内或鼻内给药后赋予对呼吸道上皮细胞的向性，而鼻内VSV-G给药具有对肺泡细胞的向性。狂犬病
病毒包膜糖蛋白在静脉内载体给药后提供了对周围神经系统和背才Mt经节强的向性。对肝细胞的靶向可利用合适的假型如Ebola、 gp64、 VSV-G和HA/HN来实现。
靶向也可通过在身体水平上控制送递位点即通过将所述载体特异地送递到有需要的组织中来实现。这可代替基于假型的方法，或与其同时使用。至少在小鼠中，肌内注射会导致基因在后肢中表达，但并不;U/L肉特异的。胸内注射靶向于呼吸肌，特别是重要隔膜。肋外注射也耙向于呼吸肌。腹膜内注射可得到在皿间皮或者在，和横隔的表达。羊膜内注射可用于肺部和鼻部靶向。脊推内和颅内注射靶向周围或中枢神经系统。肝内注射靶向肝脏。
对于某些可根据本发明使用的组织特异性送递方法的实例，参见S. N.Waddington et al. 2003， Gene Therapy 10:1234; Gregory et al. 2004， GeneTherapy ll(14):1117-25 (注射到胎儿后肢的骨骼肌中，通过胎儿卵黄嚢血管的全身注射、腹膜内注射)；和Waddington et al. 2004， Blood104:2714-2721。对于一个可根据本发明使用的肝脏组织特异性送递方法的实例，参见Waddington et al. 2004， Blood 104:2714-2721。
#絲忠
通常，用含有本发明的栽体(通常为病毒栽体)的溶液通过若干指定途径在指定的发育时间点注射动物胎儿或新生动物，优选小鼠，以完成空间和时间上的组织靶向。所述注射提供一个整合的基因组或游离持续的转基因，其是免疫耐受的并可作为任何刚出生的实验动物的目标组织类型的遗传效应器。此方法使研究者可以选择读出结果和背景。例如，可在一个疾病模型的基础上建立一个加入了手术或化学诱导的疾病状态以及药物应
20用的转基因或基因敲除小鼠，并提供一个清楚明确的对治疗剂的指定下游标记的实时读出结果。
在小鼠胎儿中，才艮据所需送递/耙向的精确类型，在20天，期内注射的优选时间通常是从怀孕后10天(dpc)到出生，如在11、 12、 13、 14、 15、16、 17、 18、 19dpc。对于送递到肝脏，优选12-17 dpc，特别优选16dpc。在新生小鼠中，优选的时间也倚赖送递/耙向的精确类型，但通常^1从出生到出生后20天，如出生后1-10天，或出生后1到5天，尤其是出生后l、2或3天。对于其他动物，可4^据其发育来确定相应的时间。
根据本发明，可研究针对多种病变的候选药物的活性。全部所需是现有的动物模型，通常是小鼠模型；和响应所述病变和/或响应对所述病变的治疗的遗传元件，通常是启动子或增强子。许多情况下，这两种所需的因素都是可得到的。使用本发明的病变应答元件与生物发光报告基因有效连接的载体，通过本文讨论的技术对动物模型的胎儿或新生个体进行体转基因处理。选择用于转化的组织以使所述栽体靶向到一个或多个患有待研究病变的组织上。例如，如果需要te针对肝病的候选药物，则通常耙向到肝脏。
所述体转基因动物成年时，它们不但保持模型特征而且在一个或多个在诱导时将会患病的组织中具有病变应答元件/生物发光报告转基因组合。可在此时进行生物成像以作为对照。然后，如果必要，以合适的方法如通过化学和/或手术诱导所述病变。然后通常进行生物成4象，以测量由所述病变/治疗应答元件的活性和所述活性在疾病状态下引起的报告基因的表达所导致的生物发光。然后将所述候选化合物给予所述动物，通常再次进行生物成像并比较结果。如果所述候选化合物对所述病变具有效果，则可从所述比较中得出。通常，在所述候选化合物的给药前和给药后都会进行生物成#^。在某些情况下，如当能够充分了解疾病状态下的情况时，则在给药前可不需进行生物成像，而只在给药后进行。
可定性或定量地测定所述候选化合物对所述病变的效果一一如果存在这一效果。在某些情况下，只需测定是否有效果，在其他情况下，可测量所述效果的程度。
如此可测定候选化合物对病变的效果。也可研究病变对已知疗法的反应。
4妙微
可如此研究的病变包括肝脏、心脏、肾脏、肌肉、脑、曱状腺、肺、 胰腺、血液、脾脏、胸腺、睾丸、消化道、气管、血管系统、周围或中枢 神经系统和眼睛的病变。任何病变途径都可被研究。优选肺或肝的病变， 或者肌肉和/或神经系统的病变。
优选地，肺部病变选自呼吸道感染、哞喘和慢性阻塞性肺部疾病
(COPD)。所述呼吸道感染可由例如呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒 (PIV)或流感病毒(IV)引起。优选地，肝部病变选自肝纤维化、肝硬化和丙 型肝炎感染。优选地，肌肉和/或神经系统病变是一种退化性疾病，如选自 迪谢内肌营养不良(DMD)、强直性肌营养不良(MD)、运动神经元病 (MND)、阿尔茨海默氏病(AD)和亨廷顿氏病(HD)的疾病。
可根据本发明进行研究的疾病模型的一个实例是肝纤维化。肝纤维化 小鼠模型可通过向胎儿血管内注射慢病毒制剂形成。所述慢病毒制剂包括 在荧光素酶报告基因上游的参与肝纤维化的一个或多个遗传效应器，如 ColI2a启动子、Smad7启动子或BRE增强元件。在通过渐进性纤维化刺 激如胆道结扎或慢性纤维化刺激如给予CCLt来诱导疾病之前和之后可进 行连续生物成寸象。可才艮据生物发光读出结果来确定试验化合物对所iiJt脏 纤维化模型的效果。
使用在遗传元件如调控5-HT转运蛋白和/或受体表达的遗传元件的控 制下表达荧光素酶报告基因的慢病毒载体，可研究候选抗忧郁药物如氟西 汀(Prozac)对小鼠模型的效果。所述慢病毒制剂可通过胎儿颅内注射来施 用。可通过在给予所述候选抗忧郁药物之前、之中和之后进行连续生物成 像来测定候选化合物的效果。
本发明还可用于病变为炎症或病变包括或会导致炎症的情况，例如在 肝部、肺部或关节处，但也可能在别处。为评估候选化合物对炎症的效果 —一如果存在这一效果，可在动物模型动物中用含有响应炎症和/或炎症减 轻的遗传元件(例如一个因炎症上调的特异性启动子)的载体如本文讨论 进行体转基因处理，所述动物模型在例如肝脏、肺、关节、肌肉、心脏、 脑或其他器官具有炎症或可使其具有炎症。所述载体可被送递到合适的组 织中，在此来自炎症的信号会导致所述应答元件被激活并表达所述生物发光基因，从而可进行生物成像。然后可通过进行生物成像来定性和/或定量 地评估所述候选化合物的效果，生物成〗象通常在给予所述化合物前后均进 行，但是(参见上文)在一些情况下也可以仅在给予所述化合物之后进行。
根据本发明，可使用在NFkB增强元件和鼠科最小启动子的控制下表 达荧光素酶报告基因的慢病毒载体形成炎症小鼠模型。所述慢病毒制剂可 通过胎儿羊膜内注射来施用。可通过在成熟小鼠中，在给予抗炎药物之前、 之中和之后进行连续生物成像来对所述抗炎药物的效果进行建模。
秀抛'絲#財估
使用本发明的响应药物代谢和/或药物毒性的遗传元件与生物发光报 告基因有效连接的载体，通过本文讨论的技术对动物胎儿或新生动物进行 体转基因处理。选择组织以使所述载体靶向到 一个或多个受药物代谢和/或 毒性影响的组织上。因此最感兴趣的组织通常是肝脏，因为其是药物代谢 和解毒的主要场所，还是从中得到本发明优选启动子的CYP450基因表达 的主要场所。
所述体转基因动物成年时，它们在一个或多个相关组织内具有应答元 件/生物发光报告转基因组合。可在此时进行生物成像以作为对照。然后， 给予候选化合物。然后通常进行生物成像，以测量由所述应答元件的活性
光r如果;i候选化合物已4代谢或已表现出4性,、则会观察到所述应答
元件的活性变化。通常，在所述候选化合物的给药前和给药后都会进行生 物成像。在某些情况下，如当能够充分了解给药前的情况时，则可不在给 药前进行生物成像，而只在给药后进行。
可定性或定量地测定所述候选化合物的效果——如果存在这一效果。 在某些情况下，只需测定是否有效果，在其他情况下，可测量所述效果的 程度。
在优选的实施方案中，可以体转基因术的方式通过全身注射将载体引 入小鼠胎儿或新生小鼠的肝脏内，所述载体包含与生物发光报道基因如荧 光素酶基因有效连接的CYP450启动子或与CYP450活性有关的基因的启 动子，并在给予候选化合物之前和之后进行生物成像；然后对这样获得的 测量进行比较，用于确定所述启动子是否和/或以何种程度被所述候选化合 物激活，即候选化合物是否和/或以何种程度在肝脏中被代谢和/或表现出毒性。
在某些实施方案中，本发明的应答元件/报告基因组合不直接通过载体
引入到所述动物中；而是在所述动物中引入包含所述组合的转基因细胞。 在这些实施方案中，细胞例如动物胎儿、新生动物或成年动物的细胞^L转 导，并通常通过上面讨论的注射引入所述动物中。通常，这会用本发明的 病毒载体尤其是慢病毒栽体来完成，如上所述，但是可使用任何合适的载 体。
通常，将所述细胞引入它们自身起源的组织或器官。
在某些实施方案中，所述细胞是与它们将被引入的动物同一物种的动 物的细胞，例如小鼠细胞通常会被引入小鼠。
或者，所述细胞可为人源(胎儿、新生儿或成人)细胞并被引入相容 的非人动物中，如一种"人源化，，动物(见上)。此时对于肝细胞来说，这 意味着它们可被引入(通常通过注射)到野生型实验动物(通常为小鼠) 或免疫抑制实验动物的正常或部分组织消融的肝脏中。通过宿主细胞的化 学或生物消融，或者通过使人类细胞在有利条件下重构，可促进用人类肝 实质细胞重构宿主肝脏。
在优选实施方案中，所述细胞是肝脏细胞，特别是肝细胞。通常，这 些细胞会通过注射被引入所述动物的肝脏。
为评估上述过程如给予候选化合物的结果，根据已知技术进行生物成 像。例如，Contag， C.H.和Bachma叫M.H.的综述(Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Ann. Rev. Biomed. Eng. 4:235-260; 2002);以及同作者的^Ui论文中描述了整体成像的方法。
利用荧光素酶，除了注射与荧光素酶作用产生生物发光的底物荧光素 以外，这种生物成像是非4^v性的。然而，也可通过喝水非^地而给予 荧光素，从而可在动物清醒时进行成像。
生物发光可用任何合适的方法检测，如用电荷偶合元件(CCD)相机。
通常， 一旦进行完所有需要的测量，就会杀死所述动物。
本发明通过以下实施例进行阐释。
24实施例 实施例1
进行实验以确定在小鼠中实现长期组织特异性转基因表达的可能性。
按照Seppen等人(Seppen J， Rijnberg M, Cooreman MP， Oude Elferink RP. Lentiviral vectors for efficient transduction of isolated primary quiescent hepatocytes. J Hepatol 2002; 36: 459-465)描述的方法命
备用于长期分析的gp64-假型化荧光素酶载体和vsvg-假型化荧光素酶载 体。
慢病毒的制备如下在每个T-150烧瓶中接种2xl07个293T生产细胞。 第二天，在每个T-150烧瓶中将以下量的质粒DNA在OptiMEM (Invitrogen， Paisley, UK)中进行混合并使最终体积为5 ml:栽体构建体 (pHR.SINcpptSEW) 40將、pMDG.2/pHCMVwhvGP64 10照、pCMVA8.74 30照。将聚乙烯亚胺(PEI， 25 kDa) (Sigma, Poole, UK)加入5 ml OptiMEM 中，使终浓度为2fiM,并通过0.22 jrni的过滤器过滤。将所述DNA逐滴 加入到PEI溶液在并在室温下温育20分钟。将所述DNA/PEI溶液加入到 所述293T细胞中，并在37°C、 5% C02下温育4小时，然后用完全DMEM (Invitrogen)替换。再过48小时后收集上清液，如果必要，更换生长培养基 以在72小时后进行第二次收集。
首先将病毒上清液用桌上型离心机(MSE， Germany)以2500 rpm离心 10分钟，再通过0.22 的过滤器过滤，然后以23,000 rpm(约100,000 xg) 在4。C下超速离心2小时。小心地倾出培养基并在300 jil PBS培养基中重 悬浮病毒沉淀。最后，将病毒悬浮液用桌上型微量离心机以4000 rpm离心 10分钟以除去任何残留的碎片。所有病毒制剂都新鲜使用并通过前人 (Logan AC， Nightingale SJ， Haas DL， Cho GJ， Pepper KA， Kohn DB. Factors influencing the titer and infectivity of lentiviral vectors. Hum Gene Ther 2004; 15: 976-988)所述的逆转录酶qPCR和p24 ELISA试验进行滴 定。
絲鄉
使用雄性和雌性MF1小鼠(Harlan，UK)。对于子宫内给药，通过吸入
25异氟醚(Abbott Laboratories, UK)将时间上匹配的怀孕小鼠麻醉。进行中线 剖腹术并使怀孕子宫的两个角都显露出来。所有注射都通过经子宫注射进 行。
对于胎儿呼吸道给药，用33号Hamilton Microliter SyringeT"注射器通 过穿透子宫壁、卵黄嚢和羊膜对每个羊膜腔都进行注射(体积为50 pl)。对 于新生儿呼吸道给药，将20 jil载体施加到鼻孔中(剂量为2x10 nl)从而 使所述新生儿吸入所述载体(结果示于图3，上图为正常图像，下图为呼 吸道生物发光；以及图6,长期肺部生物发光，组成型和泛素启动子)。 对于胎儿血管内注射，使用34号针头(Hamilton， UK)将20 jil溶液经子宫 注射到周围卵黄嚢血管中。对于新生儿血管内注射，对新生儿进行低温麻 醉并将40jil溶液注射到颞上静脉中(结果示于图5，上图是正常图像，下 图是肝部生物发光；以及图10，胆管结扎前后的生物成像，TGF-p感觉启 动子)。对于新生儿肌内注射，将5 nl溶液直接注射到腿部肌肉中(结果 示于图2，上图是正常图像，下图^L肉生物发光)。对于胎儿颅内注射， 将5 pl溶液直接注射到胎儿小鼠的左半球中(结果示于图4，上图是正常 图像，下图是颅部生物发光)。
对于所有胎儿注射，对每只孕鼠最多注射6个胎儿。注射后，将子宫 放回腹腔内并用5/0 Mersilk缝线(E也icon， Brussels, Belgium)分两层缝合腹 部。将动物置于温暖无干扰的笼中直到苏醒和活动。新生儿给药后，使小 鼠在加热垫上恢复然后回到它们的母亲身边。所有动物工作都依照英国内 政部条例进行,并符合Imperial College London ethical review committee 的准则。
体内荧光素酶生物成4象
用异氟醚(Abbott Laboratories, IL， USA)将小鼠麻醉，通过鼻内途径给 予50 pi的15 mg/ml的D-荧光素(GoId Bio， MO， USA),并在5分钟后用 CCD相机(IVIS, Xenogen， MA， USA)成像。获得灰阶图像后，用12 cm视 场、分辨率8、光圈1/f并打开滤光镜得到5分钟生物发光影像。手动定义 目标区域(ROI)(在各种情况下都4吏用标准区域)，用Living Image软件 (Xenogen)计算信号强度并以每秒光子数表达。从未给予载体的对照小鼠的 ROI制图中确定背景光子通量。实施例2
为评估长期转基因表达，对第l日龄的新生小鼠(11=5)羊膜内给予单剂 gp64/HIV荧光素酶(约3xl07 iu)。对小鼠进行一年及以上的生物成像，并 将荧光素酶生物发光与对照比较(11=2)。如实施例l所述进行体内荧光素酶 生物成像。荧光素酶表达在整个分析中都显著高于对照并在整个研究中持 续(图6)。所述结果说明给药后可在最长达一年内检测到明显表达。
实施例3
在体外试验可用于动物模型的遗传生物效应器(实施例3-5)。 用含有驱动荧光素酶表达的TGF-P应答元件的质粒转染NIH-3T3细 胞。然后用表达TGF-P3的逆转录病毒载体转导这些细胞。所述SBE4应 答元件对通过smad2/3介导的转录活化的TGF-p活化是特异的。此Smad 活化可进一步描绘为使用ARE应答元件连同爪蟾Fast-l反式作用子(单 ARE只对Samd2/3特异)的Smad2特异的转录活化。所述BMP特异的 应答元件通过Smadl/5/8的活化激活并且不应应答TGF+3的活化。最后， Samd7是一种抑制子Smad，已知其在一个TGF-卩3活化的负反馈环路中 被上调。实验进行如下
按lx106细胞/孔预置NIH-3T3细胞并通过标准磷酸钾沉淀法用10照 才艮告质粒转染。48小时后用rKat.TGF-p3或者对照rKat.cmvGFP逆转录 病毒转导细胞。基于MLV的逆转录病毒载体pKat/rKat系统已经为前人 所描述(Finer, M. H.， T. J. Dull, L. Qin， D. Farson， and M. R. Roberts. 1994. kat: a high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes. Blood 83:43-50)。逆转录病毒制备如下在每个T-150烧瓶中 接种2xl(f个293T生产细胞。在每个T-150烧瓶中将以下量的质粒DNA 在OptiMEM (Invitrogen， Paisley, UK)中进行混合并使最终体积为5 ml:栽 体构建体40照、pKat 10照、rKat。将聚乙烯亚胺(PEI) (Sigma-Aldrich， Poole， UK)加入5 ml OptiMEM中使终浓度为2 nM并通过0.2 jim的过滤 器过滤。将所述DNA逐滴加入到PEI溶液在并在室温下温育20分钟。将 所述DNA/PEI溶^i口入到所述293T细胞中并在37°C、 5% C02下温育4 小时，然后用完全DMEM(Invitrogen)替换。24小时后更换生长培养基， 再过24小时后收集上清液，如果必要，再次更换生长培养基以进行第二次 收集。将病毒上清液以5000 xg离心10分钟以除去细J!W片然后通过0.22jim过滤器过滤。所有病毒制剂都新鲜使用并通过有限稀释和GFP的FACS 分析来对293T细胞进行滴定从而确定其生物滴度。用所述rKat逆转录病 毒转导NIH-3T3细胞，48小时后除去条件培养基，在通过0.45 ^rni的尼龙 滤膜过滤，然后加入含质粒的NIH-3T3细胞中。48小时后，在细胞裂解液 中测量荧光素酶表达。用Promega荧光素酶检验试剂盒和Berthold Flash，n，Glow LB955光度计(Berthold， Herts, UK)检验细胞裂解液中荧光 素酶的表达。按照厂商说明(BioRad， Herts, UK)，通过标准Bradford试验 测量总蛋白；相对总蛋白的相对荧光素酶活性可以任意单位表达。
结果示于图7。转基因TGF-P3的活化将SBE4元件上调至对照的大约 1000倍，并且ARE、 ARE/Fast-l应答元件和Smad7启动子都显示了明显 高于对照的响应度。阴性对照BMP应答元件BRE在TGF-P3 it^达时未 显示出明显高于对照的响应度。我们得出，这些应答元件在体外对TGF-p 活化是有活性的。
实施例4
从原代小鼠真皮成纤维细胞生成驱动萤火虫荧光素酶基因的合成 TGF-p应答元件的转基因细胞系。CAGA(12) Smad结合元件(SBE)被置于 最小启动子的上游，并将会响应Smad2/3特异性转录激活。用含有所述 CAGA(12)-Luc元件的慢病毒载体转导原代鼠真皮成纤维细胞(MDF)。然 后用表达TGF-P3或GFP的慢病毒栽体转导的MDF的条件培养基中培养 这些细胞。实验进行如下
按DiPersio等人所述(DiPersio， C. M.， S. Shah， and R. O. Hynes. 1995. alpha 3A beta 1 integrin localizes to focal contacts in response to diverse extracellular matrix proteins. J Cell Sci 108 (Pt 6):2321画36)分离鼠真皮成纤 维细胞(MDF),使其扩展至约60%融合，再用在smad 2/3特异性CAGA(12) 启动子控制下表达荧光素酶报告基因的慢病毒栽体转导。如实施例1所述 制备慢病毒制剂。48小时后将细胞重置于无血清条件下并加入 rKat-TGF-p3逆转录病毒栽体或对照cmvGFP载体，再过48小时后裂解。 用Promega荧光素酶检验试剂盒和Berthold Flash，n，Glow LB955 (Berthold, Herts, UK)光度计(Berthold， Herts, UK)检验细胞裂解液中 荧光素酶的表达。按照厂商说明(BioRad， Herts, UK)，通过标准Bradford 试验测量总蛋白；相对总蛋白的相对荧光素酶活性可以任意单位表达。
28结果示于图8。所述MDF-CAGA(12)-Luc细胞与对照相比显示了荧光 素酶对TGF-P3 it^达细胞的条件培养基的明显响应。这些lt据证实本发 明人能够从原代鼠细胞中形成响应TGF-P活性的转基因细胞。
实施例5
用Lenti/CAGA(12)-Luc栽体转导稳定表i^A类avp3整合素的人类胚 肾293T细胞和对照293T细胞以形成两个转基因系。然后，将这些细胞置 于it^达TGF-p3的细胞或对照细胞的条件培养基中。更多细节
稳定转染有(iv和P3整合素的人类293T细胞(293Tab)以及293T对照 都是美国UNC的John Olsen博士友好赠送的。用Lenti-CAGA(12)-Luc 转导293T细胞和293Tab细胞，用表达人类TGF-p3iresGFP、突变 TGF+3iresGFP或GFP对照的慢病毒转导人类DF细胞。将细胞再培养 48小时，然后用胰蛋白酶消化，再以1: 1的比例混合293细胞和转导的 DF细胞。将细胞在含血清的培养基中再培育24小时，然后在添加有ITS+1 (Sigma-Aldrich)的不含血清的培养基中培育48小时。随后将细胞进行 FACS分析以评估293T细胞和DF细胞的比例，或者裂解以定量测定其荧 光素酶的表达。
结果示于表9。与对照293T细胞相比，avp3表达细胞系中的荧光素 酶产量明显加强。我们可以得出结论，avp3整合素的表达加强了 TGF-p3 在293T细胞中的响应度。
实施例6
已经使用肝脏纤维化的小鼠模型对新的体转基因生物成像技术对体内 病变进行建模的应用进行了初步确认。TGF-p特异性促纤维化信号传递是 通过Smad信号传递介导的。我们选择了文献已确定并对这些通路特异的 最小增强子/启动子元件来模仿因胆总管永久闭合而导致的门肝脏纤维化 的分子结果进行建模。此纤维化模型与如在胆道疾病和嚢性纤维化(CF) 肝病中观察到的肝脏病变相当。
参考图10，用VSV-G-假型HIV荧光素酶载体经血管内途径对小鼠胎 儿(E17)进行注射。所述荧光素酶转基因被所述TGF-pi激活的Smad特异 的应答元件CAGA(12)驱动。得到的体转基因后代在60天中检测4次，然 后进行胆道结扎，这是一种诱导肝脏损伤和纤维化的公认方法。当肝脏纤
29维化进行时，持续对小鼠进行检测。劇溪内注射荧光素后5分钟，用CCD 照相机对麻醉小鼠所摄取的影像构成了荧光素酶表达试验。所述新技术第 一次在体内显示了 Smad2/3信号传递以一种脉冲的方式响应。此前无法连 续监测动物个体时，此结果很可能被错过了。此外，即使对两个动物做同 样的处理，它们也不是同步的。当取平均时，这会消除任何不同的效果(图 10)。
实施例7
可为肝硬化和丙型肝炎感染以及肺纤维化(PF)建立类似的疾病模型。 对人类和小鼠基因组的测序使得可表征和获得可整合入报告基因表达盒的 高度特异的DNA效应器和阻遏元件的价值。同样可行的还包括使用增强子 /启动子元件以检测肌肉或神经再生/退化或神经元脱髓鞘从而对神经或肌 肉退化疾病进行建模，所述神经或肌肉退化疾病如多发性硬化症(MS)、 强直性肌营养不良(MD)、肌营养不良症(DMD/BMD)、运动神经元病 (MND)、阿尔茨海默氏病(AD)和亨廷顿氏病(HD)。此外，本发明 人能够使用假型慢病毒来靶向血管内皮，促i^血管再生的体内分析。
实施例8
最近嚢性纤维化(CF)的肺部病变已经通过使用小分子药物敲除ENaC ( 一种肺上皮钠通道蛋白)的p亚基的表达或降低其活性而被解决。CF肺 病的精确模型已经通#转基因小鼠中^±^达离子转运蛋白P-ENaC而被 建立，从而验证其与疾病病理的相关性。此模型除了测量小分子疗法的效 果以外还具有重大治疗意义，因为之前需要对实验动物做终点分析。 P-ENaC基因转移的肺部病变已被充分地研究，其中若干次级炎性反应广 泛地参与了早期疾病(特别是IL上调)。利用这一现有知识，可利用本发 明的教导来选择一个因局部炎症而上调的特异性启动子，将其设计到本发 明的慢病毒表达盒中并进行P-ENaC/启动子-生物成像体基因转移术。随后 这些动物可利用下游活性作为药物發逸的枱r验系统，用作病变发展的定量 检验。
实施例9
作为另一个实施例，PIV/RSV和流感病毒(IV)引起的病理性肺部感染导致早期杯状细胞增生/转化和私液素基因如Muc5AC的过表达。这一病毒 引起的肺病的早期表现可用于追踪疾病发展或治疗性减退。使用体转基因 生物成像，本发明人能够跟踪各种类型肺细胞和潜在的肺干细胞。因此， 可在疾病模型如p-ENaC转基因模型中追踪响应疾病状态或药物治疗或者 病毒和细菌感染组合的体内Muc5AC表达。
实施例10
在疾病如肺纤维化、(肺)副流感病毒和丙型肝炎(肝)感染中的进 行性肝/肺纤维化的治疗性减退会从体转基因生物成像中受益。在由TGF-p 信号传递或下游标记激活的早期效应器如胶原蛋白la2启动子控制下的遗 传调控生物成像报告基因的产量会对疾病进展/減退提供宝贵的数据。 TGF-p信号传递在包括肝和肺的许多器官中是早期纤维化所必需的。信号 传递通过下游Samd信号传递调节，所述下游Samd信号传递除了控制纤 维化及其他病变中的上皮间叶细胞转化(EMT)，还控制促纤维化和抗纤维 化反应。受体Smad(R-Smad)保持来自受刺激受体的信号传递，然后共激 活移至核内并发起转录激活的效应器Smad4。已知抑制子Smad既通过结 合R-Smad复合物又在转录水平上阻断这一通路。可使用包括此通路各阶 段的启动子/增强子元件的体转基因生物来追踪这一完整过程。此夕卜，EMT 被不同的R-Smad及可随时间在体内再次模仿和追踪的下游效应所控制。 EMT涉及不同病变如纤维化和癌症。^^、蛋白la2沉积的特征在于肝脏纤 维化，并且是一个极好的预后标记物。因此可通过化学(CCl4)或手术(胆管 结扎)方式使体转基因生物的肝脏受到伤害，并在此环境下检测治疗剂， 用荧光素酶生物成〗象作为输出结果。损伤前后以及处理前后的成〗象能力突 显了此方法的连续性。
权利要求
1.一种用于确定报告基因的表达是否受到化合物调节的方法，所述方法包括(a)将所述化合物给予非人转基因动物，所述非人转基因动物通过在其尚未出生时或新生时用载体对其一个或多个特异组织进行基因转导生成，所述载体含有与响应病变或治疗的遗传元件有效连接的生物发光报告基因；和(b)测定所述化合物对所述报告基因在所述一个或多个特异组织中表达的效果——若存在这一效果，所述测定包括检测由于所述报告基因的基因产物的活性造成的动物生物发光。
2. 根据权利要求l的方法，其中所述载体是病毒载体。
3. 根据权利要求2的方法，其中所述病毒载体A^病毒载体、慢病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体或单纯疱渗病毒载体。
4. 根据前述权利要求任一项的方法，其中用所述栽体对所述尚未出生时或新生时的动物进行的基因转导包括(a) 获得含有与响应疾病或治疗的遗传元件有效连接的生物发光报告基因的载体；并(b) 将所述载体送递到动物胎儿或新生动物的一个或多个选定组织中。
5. 根据权利要求4的方法，其中送递所述载体通过将所述栽体靶向到所述动物的 一个或多个特异组织的注射。
6. 根据权利要求5的方法，其中所述注射是全身性的，但所述载体被送递到一个或多个特异组织中；或者其中所述注射B内注射、胸内注射、肋外注射、 内注射或颅内注射。
7. 根据权利要求5或6的方法，其中所述注射是血管内注射，且当所述动物是动物胎儿时，注射是全身注射且所述载体经卵黄嚢血管靶向；或者，当所述动物是新生动物时，所述注射经浅颞静脉。
8. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述病毒载体包括组织靶向的 糖蛋白外壳。
9. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述一个或多个特异组织是肝 脏、心脏、肾脏、肌肉、脑、曱状腺、肺、胰腺、血液、脾脏、胸腺、 睾丸、消化道、气管、血管系统、周围神经系统或眼组织。
10. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述转基因动物是疾病和/或包 含基因敲除的模型；或其中所述动物在肺、肝、关节、肌肉、心脏、 脑或其他器官中具有炎症或可使其具有炎症。
11. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述转基因动物是哺乳动物。
12. 根据权利要求ll的方法，其中所述哺乳动物体是啮齿动物或灵长类。
13. 根据权利要求11的方法，其中所述哺乳动物体是小鼠、大鼠、兔或小 型猪。
14. 根据前述权利要求任一项的方法，其中在给予所述化合物之前诱导所 述病变。
15. 根据权利要求14的方法，其中所述病变通过化学方式和/或手术诱导。
16. 根据权利要求14或15的方法，其中在诱导所述病变之前和/或之后检测所述报告基因的表达。
17. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述报告基因是荧光素酶基因。
18. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述响应病变或治疗的遗传元 件是启动子或增强子。
19. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述对病变是肺部或肝部病变， 或者肌肉和/或周围或中枢神经系统病变。
20. 根据权利要求19的方法，其中所述肺部病变选自呼吸道感染、肺纤维 化(PF)、哮喘和慢性阻塞性肺部疾病(COPD);或所述肝部病变选自 肝纤维化、肝硬化和丙型肝炎感染；或者所述肌肉和/或所述神经系统 疾病为选自迪谢内肌营养不良(DMD)、强直性肌营养不良(MD)、 运动神经元病(MND)、阿尔茨海默氏病(AD)和亨廷顿氏病(HD) 的疾病。
21. 根据权利要求20的方法，其中所述呼吸道感染可由呼吸道合胞病毒 (RSV)、副流感病毒(PIV)或流感病毒(IV)引起。
22. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述病变包括炎症，且所述生 物发光测定测定所述炎症对给予所述化合物的应答一一若存在这一应 答。
23. 根据权利要求22的方法，其中所述炎症包括肺、肝、关节、肌肉、心脏、脑或其他器官中的炎症。
24. 非人转基因动物用于确定化合物是否会调节生物发光报告基因的表达 的用途，所述非人转基因动物通过在其尚未出生时或新生时用栽体对 其一个或多个特异组织进行基因转导生成，所述栽体含有与响应病变 或治疗的遗传元件有效连接的所述报告基因，方式是测定所述化合物 对所述报告基因在所述特异组织中的表达的效果_一若存在这一效 果，所述测定包括检测由于所述报告基因的基因产物的活性造成的动 物生物发光。
25. —种评估化合物的代谢和/或毒性的方法，包括(a)将所述化合物给予非人转基因动物，所述非人转基因动物通过在其 尚未出生时或新生时用载体对其一个或多个特异组织进行基因转 导生成，所述载体含有与响应药物代谢和/或药物毒性的遗传元件有效连接的生物发光报告基因；和 (b)测定所述化合物对所述报告基因在所述特异组织中表达的效果一 一若存在这一效果，所述测定包括检测由于所述报告基因的基因 产物的活性造成的动物生物发光。
26. 根据权利要求25的方法，其中所述载体是病毒载体。
27. 根据权利要求26的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病 毒载体。
28. 根据前述权利要求25-27的方法，其中用所述载体对所述尚未出生时或 新生时的动物进行的基因转导包括(a) 获得含有与响应药物代谢和/或毒性的遗传元件有效连接的生物发光净艮告基因的载体；并(b) 将所述载体送递到动物胎儿或新生动物的一个或多个选定组织中。
29. 根据权利要求28的方法，其中送递所述栽体通过将所述载体靶向到所 述动物的 一个或多个特异性组织的注射。
30. 根据权利要求29的方法，其中所述注射是全身性的，但所述载体被送 递到 一个或多个特异组织。
31. 根据权利要求29或30的方法，其中所述注射是血管内注射，且当所 述动物是动物胎儿时，注射是全身注射且所述载体经卵黄嚢血管靶向； 或者，当所述动物是新生动物时，所述注射经浅颞静脉。
32. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述一个或多个特异组织是肝 脏组织。
33. —种评估化合物的代谢和/或毒性的方法，包括(a)将所述化合物给予非人转基因动物，所述非人转基因动物通过在其 尚未出生时或新生时引入转基因细胞生成，所述转基因细胞含有与响应药物代谢和/或药物毒性的遗传元件有效连接的生物发光报告基因；和基因表达的效果^"一若存在这一i二，所》i测定包括检测由于所述报告基因的基因产物的活性造成的动物生物发光。
34. 根据权利要求33的方法，其中所述细胞通过以下方法获得(a) 获得含有与响应药物代谢和/或毒性的遗传元件有效连接的生物发光报告基因的栽体；并(b) 将所述载体送递到所述细胞。
35. 根据权利要求33或34的方法，其中所述细胞来自动物胎儿、新生动 物或者成年动物。
36. 根据权利要求33-35任一项的方法，其中所述细胞是与它们将被引入的 动物同一物种的动物的细胞，或者所述细胞被引入与它们自身起源的 组织和器官相同的组织和器官；或者所述细胞是人源的并^皮引入相容 的非人动物中。
37. 根据权利要求33-36任一项的方法，其中所述细胞是肝细胞。
38. 根据权利要求37的方法，其中所述肝细胞被引入所述动物的肝脏中。
39. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述转基因动物是哺乳动物。
40. 根据权利要求39的方法，其中所述哺乳动物体是啮齿动物或灵长类。
41. 根据权利要求39的方法，其中所述哺乳动物体是小鼠、大鼠、兔或小 型猪。
42. 根据前述权利要求任一项的方法，其中在给予所述化合物之前和之后 检测所述报告基因的表达。
43. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述报告基因是荧光素酶基因。
44. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述响应药物代谢和/或药物毒 性的遗传元件是启动子或增强子。
45. 根据权利要求44的方法，其中所述启动子是细胞色素P450 (CYP450) 启动子或与细胞色素P450活性有关的基因的启动子。
46. 根据前述权利要求任一项的方法，其中所述转基因动物是人源化模型 和/或疾病模型和/或包括基因敲除的模型。
47.的用途^所述非人转基因动物通过在其尚未出生时或新生^用载体对 其一个或多个特异组织进行基因转导生成，所述载体^^有与响应药物 代谢和/或药物毒性的遗传元件有效连接的所述报告基因的载体进行 的，方式是测定所述化合物对所述报告基因在所述特异组织中的表达 的效果一一若存在这一效果，所述测定包括检测由于所述才艮告基因的 基因产物的活性造成的动物生物发光。
48.非人转基因动物用于确定化合物是否会调节生物发光报告基因的表达 的用途，所述非人转基因动物通过在其尚未出生时或新生时引入转基 因细胞生成，所述转基因细胞含有与响应药物代谢和/或药物毒性的遗 传元件有效连接的生物发光报告基因，方式是测定所述化合物对所述 报告基因在所述特异组织中的表达的效果一_若存在这一效果，所述
全文摘要
本发明涉及通过一种由发明人建立的名为“体转基因生物成像”的新技术在非人转基因动物中建立病变模型、筛选调控这些疾病的化合物以及检验药物代谢和毒性。因此本发明提供一种用于确定报告基因的表达是否受到化合物调节的方法或者一种评估化合物的代谢和/或毒性的方法，所述方法包括(a)将所述化合物给予非人转基因动物，所述非人转基因动物通过在其尚未出生时或新生时用载体对其一个或多个特异组织进行基因转导生成，所述载体含有与响应病变或治疗的遗传元件或响应药物代谢和/或毒性的遗传元件有效连接的生物发光报告基因；和(b)测定所述化合物是否对所述报告基因在所述一个或多个特异组织中的表达有效果，和/或测定任何这种效果的程度，所述测定包括检测因所述报告基因的基因产物活性导致的动物生物发光。在某些实施方案中，用本发明载体预转导的细胞也可被引入所述动物中，而不直接进行所述载体的送递。
文档编号C12Q1/68GK101680032SQ200880015112
公开日2010年3月24日 申请日期2008年3月13日 优先权日2007年3月13日
发明者S·N·沃丁顿, T·R·麦凯 申请人:Ucl商业有限公司