微生物检测方法和仪器的制作方法

专利名称：微生物检测方法和仪器的制作方法
技术领域：
本发明的实施方式涉及选择性的生物体检测，更具体地涉及重组噬菌体 以及使用此类重组噬菌体检测靶细菌并确定所述靶细菌耐受的药物。相关现有技术鉴别特定类型的细菌的能力对于全球的卫生保健人员、农民、甚至于患 者和消费者都至关重要。全球每年体外细菌诊断市场消费额为大约100亿美 元，这就是对上述事实的例证。另外，如以下所讨论，还有许多具体(但并非 穷尽)的例子可以突显对特异、敏感、精确并可重复的细菌诊断手段(产品、 ^^剂盒和方法)的需要。例如，牛乳腺炎(一种由细菌引起的感染)，可导致牛乳房发炎、产奶量 减少以及奶品质的降低。这种情况是由金黄色葡萄球菌CStop/^/ococcw 和无乳葡萄球菌0Sto; /^/ococcw aga/acft'ae)引起的。这种因产奶量与 奶品质的降低带来的经济损失单在西方国家每年就高达约37亿美元。牛结核病(牛分枝杆菌(M;;co6a"eWMW 6ov/力)是由细菌引起导致世界范 围内遭受巨大经济损失的另一个例子。例如，在2005年，密西根州一家小型 农场的共55头牛的牛群中就有12头经检测呈牛结核病阳性。该农场被迫销 毁了整群牛以及整个猪群。当时的家畜结核病检测需要2天，并且假阳性率 为5%。经常出现整个牧群被隔离或销毁的情况。全球每年经济损失约为30 亿美元。此外，牛分枝杆菌可以感染人类。细菌性食源性疾病造成了美国每年约7600万人生病，325,000人住院， 5,000人死亡，这是对人类健康的一个巨大威胁。在美国，由昆虫及微生物类 造成的经济损失估计在每年50亿-170亿之间。
例如，1996年，由果汁制造商Odwalla生产的果汁被大肠杆菌 (^yc/^/7'c&a co//)污染流入市场后造成1人死亡，66人生病。该公司交付了 150万美金的罚金，并且仅召回就花费了 650万美元。2006年，来自加利福 尼亚的Dole牌菠菜因被大肠杆菌0157:H7污染，导致205人生病，3人死 亡。
结核病是全球首位致死因素。全球人口有三分之一感染结核分枝杆菌 (岭co6ofcter/Mw ft^)ercw/ow'》，而后者正是导致结核病的罪魁祸首。每天有 25,000人被感染而5,000人死于此病。此外，主要由于诊断手段的缺乏，正 在出现结核分枝杆菌的多重耐药株，并且，在全球范围内再度流行结核病也 成为真正的威胁。全球每年用于结核病诊断的费用为18亿美元。
根据世界卫生组织(WHO)等各种主要国际卫生组织所述，人们迫切需求 更加快速、更加可靠的诊断手段，并且这些诊断方法应该在仅有少量基础设 施和低诊断费用支出的发展中国家也能切实可行。例如，印度是受结核病影 响最重的国家，每年有179万新增患病人口，但是由于细菌诊断手段的缺乏 导致实际检出率仅为总感染人数的46%。
耐甲氧西林金葡菌(MRSA)是普通金黄色葡萄球菌的一个耐药菌株，在 美国，有250万人携带此菌。携带者可以是健康的个体，但仍具有强传染 性，这归咎于耐甲氧西林金葡菌的特性。这种细菌具有强传染性，通过接触 传播。大约86%的感染发生在医院内，并且感染的死亡率为20%。在美国， 这种细菌每年导致治疗费用高出标准平均约21,000美元以及约19,000人死 亡。
如下靶区域有助于细菌的检测/诊断环境样品、植物样品、兽医样品、 食物样品、家畜样品以及医学样品。这些靶区域/样品可来自多种不同来源， 包括环境样品可来自例如水(如河、湖、池塘、海洋)、大气、土壤、矿物 质、以及天然和人工合成材料的表面；植物样品可来自例如活自然植被或死 自然植被、农作物；兽医样品可来自例如活的或死的家养动物、圈养动物和野生动物；食物样品可来自例如任何天然或人工合成食物(人用、动物用或植 物用)；家畜样品可来自例如供人类食用的动物；医学样品可来自例如人体组 织、血液、痰或其他体液。
噬菌体被定义为感染细菌的病毒。噬菌体对其相应的宿主细菌具有高度 的特异性。噬菌体通过与细菌表面的特异性受体结合感染细菌。这种结合决 定各种噬菌体的宿主范围，通常可以限制在细菌的某些属、种、或甚至亚 种。噬菌体的这种特异性使得临床医生、实验室技术人员、本领域技术人员 和消费者能够通过利用这种噬菌体特征鉴定(检测或诊断)具体细菌类型。
噬菌体经历2个类型的生活周期或者说是病毒复制途径，即裂解周期和 溶原性周期。在裂解周期中，在病毒体复制后，宿主细胞将破裂并死亡。与 之相反的是，溶原性周期并不直接导致宿主细胞的裂解及其后宿主细胞的死 亡；噬菌体的基因组与宿主DNA整合，或者作为质粒与生物体的基因组一 起进行复制。这种内源性噬菌体处于静止状态直到宿主暴露于某种特定条件 (如应激)，此时噬菌体可能会被激活，开始进入复制周期并导致宿主细胞的 裂解。
有很多常规的方法旨在利用噬菌体和细菌的相互作用，这些方法典型的 就是研究噬菌体的裂解周期。在少数情形中，这些常规方法研究的是溶原性 周期。如文献报道中所提到的， 一般来说，在发生最初的噬菌体-宿主相互作 用或将报道分子融入噬菌体中后，报道基因将被不加区分地整合入宿主，然 后在此重组噬菌体感染其宿主细菌后，便可检测出此噬菌体的增殖或者报道 分子的表达。在一些早期工作中，研究者们通过探讨细菌特异性启动子和/或 复制起点的使用以提高检测方法的特异性。此外，已知一些报道基因表达酶 (例如萤光素酶或(3-半乳糖苷酶)，这些酶需要通过加入其它报道细菌或底物 来间接探测。
如果不采取某些步骤用来准备用于检测的样品，从样品检测和分析细菌 将会很难。这种准备包括对样品的物理和化学操作以提高诊断的效率。通常 采用这些步骤以移除样品中对检测方法不利的因素。样品准备的另外一个明 显好处就是通过浓縮样品中的细菌以提高检测的可能性以及可从样品中细菌 收集到的数据强度。两个关于结核分枝杆菌临床诊断的样品准备问题的具体案例揭示如下。 在迄今为止关于通过显微镜涂片制备用于结核病检测的临床痰样的最为综合
性的综述中(见于Karen R Steingart， V.N.， Megan Heniy， Philip C Hopewell, Andrew Ramsay， Jane Cunningham, Richard Urbanczik^ Mark D Perkins,禾B M.P. Mohamed Abdel Aziz, 5]pwf腦proc咖/"g膨AoA to z'附pnwe f/ze sew础W0/ o/ s附ear淤/crcwco/^ ft/6ercw/o57s .. a 5^Wewa打.c rev/ew， Lancet Infectious Diseases, 2006. 6: P.664-674.以上文献的全部内容均以引用方式并入本文)，研 究结果显示通过离心以及任何常规化学方法处理痰样以浓縮细菌可以提高检 测的敏感性。在另外项关于处理痰液以便通过使用基于噬菌体的方法检测 结核的研究中(见于D. J. Park, F.A.D., A. Meyer， and S. M. Wilson, 0/a
S尸w&w， Journal of Clinical Microbiology, 2002. 41(2): P.680-688,以上文献的 全部内容均以引用方式并入本文)，确定了化学和物理处理方法通过化学方法 移除痰中抑制噬菌体感染的因子，并通过离心作用浓缩样品均可显著改进该 技术的检出率。
样品准备的常规技术要求操作者具有技术专长及实验室基础设施。此 外，样品准备还经常带来较高的污染风险，对样品而言将可能妨碍诊断，而 对临床人员而言则可能提高染上疾病的风险。
例如，诊断结核病的痰液样品准备需要进行多个化学处理和离心处理步 骤。处理过程中需要使用一些试管和实验室离心分离机。
样品准备试剂盒的实例包括由Salburis, Inc. (Woburn， MA)生产的 MYCOPROSAFE 样品准备试剂盒和由Biotec Laboratories, LTD (Suffolk, 英国)生产的FASTPlaque-Response 结核病诊断试剂盒。MYCOPROSAFE 样品准备试剂盒用于处理用于结核病诊断的痰样。虽然该试剂盒提供处理过 程中需要的试管和化学试剂，但它仍依赖于实验室设备(也就是离心分离机) 的使用。FASTPlaque-Response 结核病诊断试剂盒用于检测和确定结核菌及
其利福平耐药性。准备程序依然复杂并要求离心作用。
对于实验室设备及技术专长的要求对临床环境造成负担，并且，这些要 求和相关费用使得样品准备在很多资源有限的环境中难以实施。人们需要更加快捷、更可靠的细菌诊断手段(产品、试剂盒和方法)，所 述手段可以容易地实施并且不局限于噬菌体-宿主结合感染事件。这一需求需 要较常规细菌诊断手段更具特异性、敏感、准确、可重复的细菌诊断手段。 同时也需要进一步利用噬菌体对其相应宿主细菌所固有的高度特异性。
此外，人们也需要低成本、易使用并且不需要技术专长或任何附加实验 室设备的样品准备仪器。

发明内容
因此，本发明的目的和优势在于能够为选择性生物体(如细菌)检测提供 比目前现有技术成本更低、效率更高、特异性更高、速度更快、使用更方便 且适用性更强的操作方法和仪器。
与常规细菌诊断手段相比，本发明的目的和优势在于提供更加深入利用 噬菌体对其相应的宿主细菌所固有的高度特异性的细菌诊断手段(产品、试剂 盒、装置和方法)。
根据上述目的和优势，本发明的实施方式提供重组噬菌体、构建和制备 所述重组噬菌体的方法、以及所述重组噬菌体用于检测靶细菌和/或用于确定 靶细菌对其具有耐药性的药物/抗生素的用途。
根据本发明的一个实施方式提供例如通过探测靶活细菌中特定核酸序列 和/或基因(这是靶活细菌的特征)的存在(而不仅仅是通过噬菌体/宿主的结合/ 感染事件)而能够检测特定类型的细菌的产品、试剂盒和方法。这种产品/方 法的一般实例可以包括那些基于细菌培养、细菌染色和显微镜检查、酶联免
疫吸附测定(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)的产品/方法、以及其他基于噬菌 体的方法。
本发明更进一步的目的和优势在于提供探测其他特定核酸序列并确定其 特性如引起细菌耐药性的能力。因此，检测特定的细菌核酸序列可以通过所 使用的报道基因的表达和检测来实现。
根据本发明的一个实施方式，检测样品中的靶(如活细菌)的特定核酸序 列的方法包括如下步骤(根据具体情况，以下步骤可单独或组合进行)(a)将 样品中的细菌暴露于遗传工程化的噬菌体并被其感染，所述噬菌体的裂解周期已被抑制或缺失。报道基因被整合进噬菌体的基因组中。这(些)报道基因 置于启动子的下游，其侧翼为与细菌中待检测的靶核酸序列同源的核酸序 列。(b)只有在感染后的细菌中存在一或多个耙核酸序列或基因并发生伴随基 因置换的同源重组时，感染后的细菌方能表达报道基因；和(c)然后，直接 或间接检测报道基因。
根据本发明的一个实施方式，提供了用于检测靶细菌生物体的体外诊断 试剂盒和装置。
依据本发明的一个实施方式，提供了用于制备通过利用基于噬菌体的技 术进行检测和分析的样品的样品准备仪器，其具有成本低、易于使用并且不 要求专业技术或任何附加实验室设备的特点。


通过阅读以下详细描述及相应附图，可以更充分理解并领会本发明。
图1是本发明一个实施方式的重组噬菌体的结构的示意图，所述重组噬
菌体可用于检测样品中细菌细胞的存在及其对特定药物的耐药性。 图2是产生本发明一个实施方式的重组噬菌体的示意图。 图3是显示根据本发明的一个实施方式利用如图2所产生的噬菌体(可存
在于测试试剂盒中)来测试样品中是否含有耙细菌及测试所述靶细菌的药物敏
感性谱的图示。
图4是根据本发明的一个实施方式，以侧流装置作为具体实例来检测生 物学样品中的耙细菌和/或耐药性靶细菌的图示。
图5a显示的是本发明的包含初级报道基因(RG)的噬菌体探测构建体， 所述报道基因置于启动子(P)下游，其侧翼是与靶细菌中待检测的特定的靶 核酸序列(耙)同源的核酸序列(5'HT; 3'HT)。
图5b是显示根据本发明的一个实施方式，噬菌体中位于报道基因(RG) 侧翼的同源核酸序列(5' HT; 3' HT)(如图5a所示)与靶细菌基因组中特定靶 基因进行双重交换实现基因置换的图示。
图6显示的是本发明一个实施方式中的用基因工程化的噬菌体检测样品 中的耙细菌的细菌体外诊断试剂盒和相关诊断方法。图7是本发明一个实施方式中结合侧流装置一起使用的鼻拭子取样仪器的图示。
图8是本发明一个实例中"注射器内部实验室(lab w池in a syringe)"仪器
的侧面透视图。
图9是对根据本发明的一个实施方式使用基于噬菌体技术及如图8所示的样品准备仪器制备用于供检测和分析的样品的样品准备程序的简要图解。
图IO是对根据本发明的一个实施方式使用基于噬菌体技术及如图8所示的样品准备仪器制备用于检测和分析的样品的样品准备程序的更详细的图解。
图11是本发明一个实施方式中注射器内部实验室仪器的正面透视图。
图12是本发明一个实施方式中试管内部实验室仪器的侧面透视图。
图13是根据本发明一个实施方式，如图12所示的"试管内部实验室"仪
器的侧面透视图，其组件包括一个注射器和一个主腔室装置，其中所述注射
器组件插入主腔室装置组件中。
本发明实施方式的详细描述
通过阅读如下详细描述及附图(其中，同样的附图标记表示同样的部件)，可以更加全面理解并领会本发明的实施方式。
正如上文所述，构成本发明实施方式的技术是基于噬菌体(即，感染细菌的病毒)对其相应宿主细菌固有的高度特异性。
根据本发明的实施方式，利用能够通过与其融合的报道分子而被检测的噬菌体的方法受益于生成缺乏表达的报道分子但却包含报道分子DNA的噬菌体的生成策略。然后，在感染后，子代噬菌体中中掺入了表达的报道分子。小分子(即，小于40 KDa)如具有允许其被检测所需的特征(如高结合亲和力、免疫原性、化学反应性、传导性、电化学活性等)的小分子蛋白质、肽、表位和寡聚体可被用作报道分子，不过，如果需要也可以使用带有所需特征的较大分子。
与常规细菌检测方法及产品相比，本发明的实施方式有如下优势(i)通过允许检测靶细菌的基因组DNA中的特定序列，伴随基因置换的同源重组为本发明实施方式的检测系统添加了额外的特异性和功能性；(ii)能够产生如下的噬菌体，其不含检测系统中所使用的任何报道分子，但所述噬菌体内拥有由不同的条件性启动子控制的编码一个或多个报道分子的DNA序列。这些被分别控制的不同的条件性启动子的存在能为本发明的系统增加更多的灵敏性。在重组噬菌体感染靶细菌之前不存在报道分子，这能使假阳性结果最少。除了能增加本发明的方法的灵敏性外，使用由不同条件性启动子控制的报道分子能通过在检测过程的不同步骤中存在或不存在启动子的诱导物或阻抑物合理控制报道分子的表达。这种合理控制使得此系统能够检测感染后的靶细菌对不同条件和/或处理(例如存在药物(如抗生素或杀菌剂)和/或物理处理(如温度))的敏感性。
以下实施例用于举例说明本发明的优势。然而，在这些实施例中所述的具体的材料及其量和其他条件及细节应理解为可宽泛地用于本领域，而不是
为本发明添加任何不适当的限制。实施例l
本实施例描述了根据本发明的一个实施方式的重组噬菌体的构建。重组噬菌体的构建包括噬菌体基因组的修饰。噬菌体的基因组(如分枝杆菌属菌种噬菌体L5、 D29、 TM4、 Bxbl、 DS6A、 Barnyard、 Bxzl、 Bxz2、 Che8、Che9c、 Che9d、 Cjwl、 Corndog、 Omega、 Chel2、 Bethlehem禾口 U2;金黄色葡萄球菌噬菌体Pl、 P14、 CDC47、 42E、 CDC 52、 CDC 52A、 CDC 79、CDC 53和UC 18;粪肠球菌(五"ferococow /aeo fc)噬菌体VD13、 42、ph正F24C、 PlyV12禾t] phiFCl;艰难梭菌(C/os&Www fi 骄cz7e)噬菌体phiC2、 phiCD119、 PhiC5、 PhiC6、 PhiC8、 C2和CD630)被修饰，使得一种或多种噬菌体基因被条件性启动子控制(如热休克启动子，若限制性温度是42°C，那么许可温度就可以是室温至37°C)。条件性启动子可能也与生长期、感染阶段及生长条件有关，如营养的存在或缺乏。因存在化学物质(阻抑物)而被抑制的启动子的一个例子就是^汉P^M启动子系统，其中PxylA被金黄色葡萄球菌中的木糖抑制。与之相比，Pcad启动子系统被葡萄球菌中存在的镉诱导，并可与编码可检测报道分子(如肽、蛋白质、DNA和/或RNA)的基因融合。此外，这些分子可被设计成可生成可检测的电学、化学或光学信号和/或呈现出对可用于捕获报道分子的其他分子的特异性亲和力。而且，报道分子可以是天然存在的分子，如对蛋白质或核酶而言是荧光蛋白和抗体，
对核苷酸而言是宿主或噬菌体DNA或RNA的拷贝。此外，报道分子可以被合成设计，如小分子肽或寡聚体被设计成可产生特异性电学、化学、或光学信号和/或被设计成呈现对其他分子以及抗体片段的亲和力。寡聚体衍生的报道分子可以被设计成赋予其它分子以特异性亲和力，这可仅基于对互补的核苷酸序列的亲和力和/或通过将寡聚体设计成能产生对各种分子和其他材料具有特异性亲和力的配体实现)。编码可检测的报道分子的外源DNA或RNA片段可被整合入噬菌体的DNA或RNA中并通过条件性启动子自主地控制。
如图1所示，根据本发明的一个实施方式，重组噬菌体的构建可分为3个部分(1、 II、 III)。在部分(I)中，附图显示的是噬菌体基因组图谱的实例(例如分枝杆菌属菌种噬菌体L5、 D29、 TM4、 Bxbl、 DS6A、 Barnyard、Bxzl、 Bxz2、 Che8、 Che9c、 Che9d、 Cjwl 、 Comdog、 Omega、 Chel2、Bethlehem禾Q U2;金黄色葡萄球菌噬菌体Pl、 P14、 CDC 47、 42E、 CDC52、 CDC52A、 CDC 79、 CDC 53禾H UC 18;粪肠球菌噬菌体VD13、 42、ph正F24C 、 PlyV12和phiFCl ;艰难梭菌噬菌体phiC2 、 phiCDl 19 、PhiC5、 PhiC6、 PhiC8、 C2和CD630)。图下的大写字母，从A到I，显示的是噬菌体基因组中可能可用的开放阅读框，由不同的箭头代表。基因组中不同的限制性位点的实例如图中所示，这些限制性位点用代码表示，该代码之后跟着大写字母。
部分(II)显示可使用的不同的可能构建体，每种构建体编码一种或多种可检测报道分子(DeRM)(例如MBP、 GST、 HP硫氧还蛋白、V5表位、GB1、聚-Pro-Phe-Tyr和6x组氨酸标签)，所述报道分子位于具有所需特性的自主启动子(P)下游。每种构建体的侧翼可以是与感兴趣的细菌中特定的靶基因同源的序列(如与万古霉素耐药性相关的粪肠球菌vanA和vanCl，与甲氧西林耐药性相关的金黄色葡萄球菌mecA，与异烟肼耐药性相关的结核分枝杆菌katG、 gyrA、 gyrB和inhA，以及pstB、 Rvl258c、 Rvl410c和其他可能与一种或多种如下抗生素相关的流出泵利 平、异烟肼、乙胺丁醇和链霉素；艰难梭菌gyrA、 gyrB以及与对该微生物上的氟喹诺酮的耐药性相关的流出泵基因)。当需要在细菌中进行基因特异性检测时，可将这些侧翼序列掺入噬菌体结构。在每种构建体的末端显示了不同的限制性位点。部分(II)所示实例以及(I)所示的将这些构建体的一种或多种插入噬菌体基因组的方法可以通过常规分子克隆技术和方法得到实现，如Sambrook et al.， 1989. J.Sambrook, E.F. Fritsch禾口 T. Maniatis, Molecular Cloning In: (2nd ed.), ^丄a6orato/^v Mawwa/, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY (1989)中所描述的那样，以上文献的全部内容均以引用方式并入本文。(III)显示的是最终产物，其具有整合到噬菌体基因组(I)中的各种可检测报道分子(II)构建体。
实施例2
本实施例描述了根据本发明的一个实施方式的重组噬菌体的制备。使用重组宿主细菌制备噬菌体。相对于实施例1中所述构建的重组噬菌体，所述重组宿主细菌含有编码野生型基因的外源DNA，但是没有任何所需的修饰和/或融合。在既不允许上述构建的重组噬菌体基因组中经修饰的基因表达，也不允许额外的条件性可检测报道分子表达的条件下，所述重组噬菌体可感染该重组宿主细菌。然后，利用存在于此重组噬菌体基因组及重组宿主细菌中未经修饰的野生型蛋白质制备功能性噬菌体，而不生成外源性报道分子。如下所讨论，图2进一步阐述了重组噬菌体的制备。
图2显示的是重组噬菌体的制备的示意图。所述重组噬菌体DNA含有可检测的报道分子(DeRMl)，该报道分子可与或不与其结构蛋白(SP)融合，并受外源启动子(PI)控制。其它可检测的报道分子(DeRM2、 DeRM/)也可存在于此重组噬菌体，并且每一个都可以由不同的外源启动子(P2、 P/)控制。
如图2中所示，所述重组噬菌体感染重组细菌，此重组噬菌体含有编码噬菌体野生型(WT)结构蛋白的质粒，以防任何可检测报道分子与重组噬菌体的结构蛋白融合。感染后，溶源体处于允许条件(如存在某种化合物(如抑制剂(I))下，其抑制与可检测报道分子融合并存在于重组噬菌体DNA中的结构蛋白(SP+DeRMl)的表达，以及任何其它与或不与其他结构蛋白融合的可检测报道分子(DeRM2、 DeRMz')的表达。
所有的DeRM表达均被抑制，万一有一些DeRM与重组噬菌体的任何结构蛋白融合，则重组细菌中的质粒表达不与DeRM相融合的野生型结构蛋白。然后，这种由细菌中存在的质粒表达且没有任何融合的结构蛋白与其它由噬菌体导入的基因表达的其他噬菌体蛋白质装配。结果显示子代噬菌体不含任何可检测报道分子。
所得的重组噬菌体可用于例如下面实施例3所描述的试剂盒中。所得的重组噬菌体在其基因组中含有生成不同DeRM的全部必要信息，却不含任何表达的可检测报道分子，并且DeRM不与任何表达的结构蛋白融合。
实施例3
本实施例描述了如何用实施例2中产生的重组噬菌体检测样品中耙细菌的存在。如实施例2中所述，通过可检测报道分子的表达实现对样品中靶细菌的检测。
可使用实施例2中所产生的重组噬菌体来感染样品中存在的靶细菌细胞。被感染的耙细菌细胞(即溶源体)被保持在使得外源性可检测报道分子(如实施例2中所述)表达的条件下(如存在诱导物或缺少阻抑物)，从而提供一种通过检测表达的可检测报道分子以鉴定靶细菌的方法。
图3中，实施例2中产生的噬菌体(可存在于测试试剂盒中)被用于测试样品(如血、尿、痰等)中是否含有任何靶细菌(如分枝杆菌属菌种、葡萄球菌属菌种、李斯特菌属菌种、梭状芽孢杆菌属菌种、肠球菌属菌种、链球菌属菌种、螺杆菌属菌种、立克次氏体属的物种、嗜血杆菌属菌种、致病杆菌属菌种、不动杆菌属菌种、支气管败血性博德特氏菌、铜绿假单胞菌、气单胞菌属菌种、放线杆菌属菌种、巴氏杆菌属菌种、弧菌属菌种、军团菌属菌种、芽孢杆菌属菌种、眉蓝细菌属菌种、产甲烷球菌属菌种、寡养单胞菌属菌种、不动杆菌属菌种、衣原体属的物种、奈瑟氏球菌属菌种、沙门氏菌属菌种、志贺菌属菌种、弯曲杆菌属菌种以及耶尔森氏菌属菌种)。如果待测试的样品中含有任何靶细菌，重组噬菌体会进入其裂解周期(A)或在感染后进入其溶原性周期(B)，而在两种情况下都可产生第一报道分子(DeRMl)(这是因为不存在实施例2所示的能够抑制与可检测报道分子融合的蛋白质(SP+DeRMl)的表达的抑制剂)。如果不存在靶细菌，那么就不会发生感染，且不会产生DeRMl(C)。
实施例4
本实施例描述的是确定特定靶细菌是否对特定药物存在耐药性的方法。简而言之，将通过使用重组噬菌体感染靶细菌形成的溶源体(如实施例3中所述)暴露于一种药物。在预先确定的一段时间后，可检测报道分子(如实施例2中所述)的表达被激活(例如通过加入诱导分子或灭活阻抑物)，从而生成可检测报道分子。可存在一个以上的可检测报道分子，并可由不同的启动子控制，从而可以检测细菌对一种以上药物的耐药性。通过这种方式，如果药物不影响靶细菌，可检测报道分子将被表达。因此，对这些可检测报道分子的检测可以确定耙细菌是否对特定药物有耐药性。
如图3所示，可使用在许可和/或可控条件(B)下方进入溶原性周期的温和噬菌体或重组噬菌体来利用被感染的靶细菌的溶原性周期。从而可以(通过将细菌暴露给药物)测试出细菌的药物敏感谱。
样品中存在的耙细菌被重组噬菌体感染及重组细菌噬菌体进入其溶原性周期后产生DeRMl之后(如实施例3 - (B)所述)，将靶细菌暴露给待测试的药物。如果所述细菌对药物敏感(没有耐药性)，它们将被药物杀死(其新陈代谢停止)(D)。如果所述细菌对测试药物有耐药性，它们将存活(具有代谢活性)。
经过药物处理步骤后的预定时间(时间长得足够药物杀死任何敏感细菌)，将一种分子(诱导物)加入培养基中(F)。此诱导物将会作用于控制DeRM2的启动子，诱导其在存活于药物中的细菌内增殖。通过检测DeRM2表明剩下的活靶细菌对测试药物具有耐药性。
实施例5
本实施例描述检测生物学样品中靶细菌和/或耐药性靶细菌的一个具体实例——侧流装置的使用。侧流装置应为本领域技术人员所了解，因此无需太过详细描述。简而言之，可设计用于在侧流装置中使用的报道分子，其中报 道分子将对染料颗粒呈现亲和力以便在侧流膜上显影，同时也将对固定在侧 流膜上的其他分子呈现亲和力以便定位于侧流膜上。然后，可将含有所述报 道分子的溶液施加于侧流装置，它们在侧流装置中可与染料颗粒结合，然后 通过固定分子定位于侧流膜上。可视信号由结合的染料颗粒定位蓄积产生。
图4中，试纸条(a)显示在(+)对照区域有一条粗线而在(-)DR (耐药菌) 或(-)靶细菌区域均没有任何线条。试纸条(a)表明虽然没有靶细菌、耐药性 或其它，但侧流测试有效。试纸条(b)显示(+)对照和(+)靶细菌区域各有一条 粗线，但(-)DR区域没有线条。试纸条(b)表明侧流测试有效，存在靶细菌， 但其不存在耐药性耙细菌。试纸条(c)显示在(+)对照、(+)靶细菌和(-)DR区 域各有一条粗线。试纸条(c)表明侧流测试有效，存在靶细菌，以及存在耐 药性耙细菌。
本发明的一种可选的实施方式将参照以下实例进行描述。这一可选的实 施方式提供了检测活细菌中特定核酸序列的方法。这一可选的实施方式也提 供了遗传修饰的噬菌体。
在该检测方法中，样品(例如，血液、痰、尿、食物、水、土壤等)中存 在的靶细菌被遗传修饰的噬菌体特异性地感染，所述噬菌体的裂解周期被抑 制或删除，并含有至少一个报道基因。初级报道基因被置于启动子(可为组成 型或条件性)的下游，且其侧翼是与存在于细菌中的特定靶核酸序列同源的核 酸序列，这样即构成了一个探测结构。另外，探针结构可能还含有不同的报 道基因，并能探测不同靶核酸序列。在靶核酸序列中，基因置换是通过噬菌 体中同源核酸序列与细菌中存在的靶序列的双重交换实现的。这种双重交换 使细菌中存在的靶核酸序列与报告结构中的报道基因发生置换。这可以激活 报道基因，使其被细菌表达，并使这些表达分子可被检测和鉴定。此外，所 述探测结构可被条件性启动子调节，所述启动子在有抑制剂或缺乏诱导物的 条件下能限制报道分子的表达。
根据本发明可选择的实施方式的的这一方法，特定的生物体(如特定的靶
细菌)的检测可通过探测其特有的核酸序列和/或基因来实现。例如，当检测 大肠杆菌时，在16SrDNA片段中的特征性核酸序列可用作侧翼序列。工程化噬菌体导入的报道基因将只会在特定的宿主细菌中存在特定的靶 核酸序列时方得到表达。通过这种方式，通过探测生物体特征性的和特异性 的核酸序列和/或基因可实现特定生物体的检测，而非简单地通过噬菌体-宿 主感染事件实现。因为很多噬菌体可能会对同一属中的几种不同类型的细菌 具有特异性，所以当需要识别此种属的一种特定细菌时，这种方法就变得非 常有用。换言之，本发明一个实施方式的这种噬菌体检测方法在另一个层面 上增加了关于识别样品中特定耙细菌的特异性。
此外，根据本发明另一实施方式的这一方法，其他一或多个特定核酸序 列和/或基因可以被探测以检测指示或导致细菌的耐药性的基因型(细菌特 征)，或能够产生其它可产生所需表型的酶或功能性蛋白质的能力(如在特定 条件下生长、代谢不同的底物或产生不同的代谢产物和/或蛋白质的能力)。
例如，可将多药流出泵的核酸序列用作侧翼序列以探测铜绿假单胞菌的 多重耐药性。因此，为了确定生物体的耐药性，这种技术不需要加入用于选 择目的的药物。在另一实例中，可将允许使用细胞的特定底物的特定酶的核 酸序列用作侧翼序列。在这种情形下，可以发生基因置换事件以简单地缺失 这一表型，对细胞不能代谢该特定底物进行分析可确定靶细胞的存在而无需 生成外源报道信号。在一些情形中，靶细胞产生酶的能力可以导致毒素化合 物的形成，从而，检测耙细胞中编码这种酶的基因就需要检测靶细胞产生这 种特定毒物的能力。在另一实例中，另一种感兴趣的表型就是直接编码生成
特定毒素(如金黄色葡萄球菌的肠毒素A、 B、或C)的核酸序列。在这种情 形下，当探测细菌种属产生特定毒素的能力时，毒素编码序列将构成侧翼序 列。
遗传修饰的噬菌体可含有提高宿主新陈代谢的基因，例如通过表达能够 增加细菌从培养基摄取营养的蛋白质。此外，遗传修饰的噬菌体可包含提高 报道基因表达的基因，所述提高例如通过抑制宿主细胞中与次级代谢相关的 基因或通过直接参与宿主细胞中蛋白质合成的蛋白质的表达实现。 一旦噬菌 体基因组材料自然进入宿主细菌基因组，这些"助手(helper)"基因将会被激 活并表达。遗传修饰的噬菌体也可含有例如通过RecA蛋白的表达增加宿主 细菌基因组中同源重组的频率的基因。遗传修饰的噬菌体在其基因组中可含有裂解周期，但通过条件性启动子的使用可以有条件地控制和/或抑制它。由 噬菌体导入的核酸分子可被多种宿主特异性的和/或源于噬菌体或其他来源的 启动子控制。例如，适当的启动子可以选自将使得由噬菌体导入的核酸过表 达的来源。
本发明的一个实施方式可提供众多遗传工程化噬菌体，它们中的每一种 都可特异性地感染来自不同属、种、或亚种的不同的靶细菌。众多遗传修饰 的噬菌体可具有可以一起使用的各种不同的报道基因，因此可以鉴定一种或 多种靶细菌和/或一种或多种核酸序列和/或基因的存在。
根据本发明的一个实施方式，报道基因可以通过产生荧光蛋白(例如绿色 荧光蛋白)而表达，所述荧光蛋白可通过其光学刺激造成可视的光发射或经由 光探测仪器检测。此外，报道基因可被宿主细菌表达或分泌，然后可与培养 基中或宿主细胞中的成分发生反应或者可催化培养基中的反应以产生可检测 信号。报道基因可由宿主细菌表达或分泌，然后可通过装置或装置表面感知 以通过该装置由电学方法检测。相同噬菌体上使用的报道基因可以是上述涉 及的多个报道基因，且用于相同噬菌体的报道基因的产物也可能不同(如不同 颜色的荧光蛋白)。
实施例6
本实施例描述的是一种通过使用遗传修饰的噬菌体检测靶(如活细菌)中 特定核酸序列的方法，所述噬菌体的裂解周期被抑制或删除，并且其DNA 序列含有至少一个报道基因(如前文所述)。
图5a显示的是包含初级报道基因(RG)的噬菌体探测结构，所述初级报 道基因位于启动子(P)下游，其侧翼是与靶细菌中待检测的特定的靶核酸序 列(耙(Target))同源的核酸序列(5' HT; 3' HT)。额外的报道基因可位于不同 启动子的下游并位于其他特定核酸序列的侧翼。
图5b显示的是由噬菌体中位于报道基因侧翼的同源核酸序列与靶细菌基 因组中特定靶基因之间的双重交换事件发生的基因置换事件。在存在靶核酸 序列(耙)的情况下，基因置换事件是通过噬菌体中同源核酸序列(5' HT; 3' HT)与细菌中的耙序列(耙)的双重交换事件实现的。这种双重交换事件使细菌中存在的靶核酸序列(靶)完全被移除，并将其置换为报道基因(RG)。这将 反过来激活报道基因(RG)使其表达，产生可用于检测和鉴定的报道分子。
因此，检测特定的生物体(如特定细菌)可通过探测该生物体特征性的特 定核酸序列和/或基因实现，而非简单地通过噬菌体-宿主感染事件。同样， 也可以通过检测其他特定核酸序列和/或基因以检测其特性如引起细菌耐药性 等。
依据本发明的另外一个实施方式，工程化(遗传修饰的)噬菌体的额外 应用涉及到检测仪器和装置。依据此实施方式，工程化噬菌体可被定位并固 定(如以微米尺度)在表面(或基材)上，这可被多路复用并通过使用多重靶细 菌检测分析装置定位报告信号。此实施方式提供了一种特异性高、检测限较 低并且反馈时间更短的装置，与传统和/或现有的技术相比，以上所有这些技 术可有利于获得更高的灵敏性和更出色的效力。
遗传工程化噬菌体可固定于基材/基质，并被定位在任意大小的区域内， 该噬菌体可以被遗传修饰以甚至在靶细菌感染后将其固定，这与抗体的功能 类似。所述基材/基质可包括特异性识别、结合并固定于靶细菌和/或其任意表 面成分的抗体和/或适体。此抗体可是多克隆抗体或单克隆抗体和/或其片段。
不同的遗传修饰的噬菌体可被固定于固体基材上不同的、预定的固定区 域。每种不同的噬菌体也可被修饰以甚至在靶细菌感染后将其固定在基材 上，这与抗体的功能类似。
上述遗传工程化噬菌体的开发可以经由常规的遗传工程、微生物方法、 和噬菌体展示技术、工具和试剂完成。遗传工程化方法可用于设计噬菌体基 因组，微生物学方法可用于产生及表征工程化噬菌体以及所使用抗体的活 性，噬菌体展示方法可用于控制并优化噬菌体-宿主相互作用及噬菌体-表面 相互作用以利于其固定。
遗传工程化噬菌体的设计可促进固定化噬菌体的开发，并且通过标准表 面化学和微制造技术可完成其开发。例如，通过将悬浮于液体培养基中的工 程化噬菌体的液滴沉降于被修饰为含具有伯氨反应性N-羟基琥珀酰亚胺酯 (NHS)的表面，该酯将与工程化噬菌体上的伯氨反应并在噬菌体和基材之间 形成共价酰胺键。使用商品化的BioForce Nanosciences NanoArrayer系统等工具可实现将其 控制并定位在微观层面。这也可以通过微制造技术实现，类似于下列文献所 述Bhatnagar, P; Strickland, AD; Kim， I, et al. /"fegrato^ reac"ve /ow e cAz,"g to
Applied Physics Letters, 90(14):144107， 2007,上述文献的全部内容均以引用方 式并入本文。
可使用荧光显微镜来表征使用如上文所述的荧光报道蛋白探测活菌生物 体中特定核酸序列的存在的装置。
接下来的实施例中描述的一个示例性检测装置可以用做例如结核病体外 诊断工具。此设计受益于所揭示技术的优势(即检测限低、反馈时间短和特异 性高)，此外，还具有成本低和使用简单的特点。
实施例7
本实施例描述的是本发明的用于检测活菌生物体中特定的核酸序列的存 在的装置和诊断方法的实施方式(依据例6所述的方法)。
图6所示是一种成本低、操作简单、通过使用遗传工程化噬菌体检测样 品中耙细菌的细菌体外诊断试剂盒。细菌体外诊断试剂盒也适用于很多情 况，如运用于发展中国家。与细菌体外诊断试剂盒相关的诊断方法除常规显 微镜玻片和常规显微镜外不需要任何额外的技术专长或设备。
图6描述的是TB诊断试剂盒。(A)显示的是有多个腔室的容器。具体而 言，(A)显示的是一个带有4个腔室的一次性试管。(B)显示的是此容器帽， 其具有一个试纸条Bl,其上附有处于微米尺寸的固定区域B2的固定化噬菌 体。如上文所述，噬菌体的这一位微观模式可通过将悬浮于液体培养基中的 工程化噬菌体的液滴沉降于被修饰为含具有胺反应活性的N-羟基琥珀酰亚胺 酯(NHS)表面，并可与工程化噬菌体上的胺反应。使用商品化的BioForce Nanosciences NanoArrayer系统等工具可实现将其控制在微观尺度上，这也在 上文中提到。
图6所示的细菌体外诊断程序如下(1)试剂盒的腔室1中附有干燥的试 纸条Bl。取自一位患者的样品和试纸条Bl被置入腔室2，其内含有可促进噬菌体-细菌相互作用的优化溶液。附有细菌的试纸条Bl被置入腔室3，其 内含有盐和/或表面活性物质的混合物作为洗涤溶液。然后，附有细菌的Bl 被置入腔室4，其内含可促进噬菌体转染及细菌表达荧光探测分子的溶液；(2) 将试纸条Bl从帽移出并置于常规显微镜的载玻片上；(3)将载有试纸条Bl 的玻片置入检测装置60，其含有二级发光管(LED)61，能发出适合波长的光 以刺激荧光分子以及用于检测探针的光发射的光学滤光片62。例如，此装置 可为塑料材质，包含一个发射波长在488nm左右的LED和一个只允许波长 为509nrn左右的光通过的滤光镜，以便激发和检测绿色荧光蛋白(GFP)分 子；以及(4)打开检测装置，刺激荧光探针，并且它被置于常规(非荧光)显 微镜下以检测附在微型化试纸条B1上的细菌所发出的荧光信号。
依据此诊断装置的一个选择性实例，主要检测平台(类似于图6所描述的 试纸条Bl)可由固定有噬菌体的基材组成，且噬菌体在其上的固定形式为噬 菌体(a)在基材上单一限制区域中的一种或多种噬菌体；或(b)在基材上具 有特定模式的多个限制区域中的一种或多种噬菌体，其中不同种类的噬菌体 可在同一个限制区域，或可在分开的限制区域。如上文所述，这种定位固定 可通过如下方式实现，将悬浮于液体培养基中的工程化噬菌体沉降至被修饰 为含具有胺反应活性的N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)的表面，NHS可与工程化 噬菌体上的胺反应。使用商品化的BioForce Nanosciences NanoArrayer系统等 工具可实现将其控制区域定于微观尺度上。此设计可通过分析识别噬菌体-宿 主相互作用产生发光探针分子的特定模式或位于同一或不同区域发光探针分 子的不同颜色以同时检测一个或多个生物体。
依据本发明的一个实施方式，还提供了其他检测平台的范例。例如，检 测平台可设计成使用改造后的预制装置(类似于图6所述的容器)而用于感兴 趣的样品，所述预制装置可使得感兴趣的样品中包含的任何研究细菌与检测 平台上的噬菌体相互作用。预制装置可以经过特定设计以用来处理检测结核 所需的痰液样品，并且可包含氢氧化钠溶液以使痰液中可抑制噬菌体感染结 核菌的成分失活。本实例另外包含一个拥有光学放大系统的检测装置，此装 置可以直接分析并观测而无需使用另一显微镜，本实例也可以设计成和外在 常规检测装置如荧光仪或荧光显微镜一起使用，以实现可视化或自动分析。本实例的检测平台可被设计成可置入一个单独的常规手持式检测装置(此装置 可进行自动分析)。检测平台也可设计成与一个独立的常规自动预制分析装置 一起使用，此装置可自动允许感兴趣的样品中的任何细菌(人工将其置入预制 检测装置或预制检测装置自动获得并置入)与检测平台上的噬菌体发生相互作 用，然后允许对检测平台进行分析。
依据本发明的一个实例，提供了用于准备样品以便通过基于噬菌体技术 来检测和分析的样品准备装置，所述装置具有成本低、易于使用并且不要求 任何专业技术或附加实验室设备的特点。
一个示例性的自动化细菌样品准备装置可能包括一个或多个腔室——所 述腔室由孔径从毫米至亚微米的滤网所分隔， 一种或多种化学药剂——这些 药剂会被物理上分开装入不同的隔室内，以及用于将液体在不同隔室内转移 的机械装置。此细菌样品准备装置还可另外包括一个可封口的排出口，该排 出口可带有一个亚微米孔径的过滤膜—这可保留细菌在装置内，却允许液
体溶液及小分子排出装置。
此细菌样品准备装置将具有如下能力
(a) 均质化样品
(b) 中和和/或分离所述样品中的污染物
(c) 可捕获所述样品中的细菌
(d) 浓縮所述细菌
此示例性细菌样品准备装置可被设计成可处理以下样品(但不限于以下样 品)环境样品、植物样品、兽医样品、食物样品、家畜样品及医疗样品。这 些样品还可另外包括土壤样品、水样品、蔬菜样品、肉样品、血样、尿样、 活检组织样品、粘液样品、排泄物样品以及痰液样品。
此样品准备装置可以在其内部使用内含的染色剂给靶细菌染色。从另一 个方面而言，此示例性细菌样品准备装置还可设计成在其内部加入对靶细菌 存在特异性的工程化噬菌体溶液，例如此处所述的工程化噬菌体，并且还可 设计成允许装置内的噬菌体感染细菌，并且当使用此处所述的重组噬菌体时 可以生成报道分子。
此范例装置在处理细菌之外还可以溶解、提取并分离细菌中的大分子(可
30能包括蛋白质、肽、寡聚体、DNA、 RNA和类脂)。
此范例装置还可整合一个侧流装置，以检测可源于装置内靶细菌被所述 的重组噬菌体感染所产生的报道分子和/或其他因靶细菌溶解所产生的大分 子。侧流装置可被整合入此样品准备装置，以便靶细菌所释放的分子可在此 样品准备装置的出口封印破裂后流入侧流装置。
此处描述了为进行检测分析(使用基于噬菌体的技术)而准备样品的装置 的3个额外范例。这些实例可以对痰液样品中的细菌进行化学处理和浓缩。
图7所示的是鼻拭子取样装置50和侧流装置55。鼻拭子取样装置50包 括一套鼻拭子51，后者连接在试管53的帽52上。此试管内可含有如上所述 的噬菌体溶液。此装置还有一个出口 54，其可含有一个< 0.2 pm的过滤膜。 图7还显示了这样一个装置的使用。在第1步，鼻拭子51被用来擦拭一位患 者的鼻腔，例如以测试MRSA。在第2步，将帽52从试管53移开，并放回 到试管53上，但此时试管53内多了鼻拭子51。试管53内的噬菌体将会感 染可能存在于鼻拭子51上的靶细菌。在第3步，当试管53内因噬菌体感染 靶细菌而产生报道分子后，可挤压试管53，目的是为了破坏连接试管53内 部和外部的出口 54上封印。试管53内的溶液包含报道分子，经由出口 54被 挤压到试管53外部，并进入设计用来可视化检测所生成的探针分子的侧流装 置中。
图8显示的是， 一个"注射器内部实验室"仪器100的侧面透视图。该仪 器100可包含(但不限于)入口 101 (可决定样品的最大体积)、腔室I 102 (1% w/v NaOH粉末)、宏观滤网103 (帮助均质化样品)、腔室II 104、 > 0.45 pm的单向孔膜105(允许细菌通过)、腔室III 106、孔径< 0.22 pm的孔膜107 (保留细菌)、腔室IV 108 (凝胶和中和粉末)、侧腔室109(培养基中含有噬菌 体)、侧腔室柱塞110、主柱塞lll、出口 112(包含0.22 pm孔膜)、指孔113 (用来拽出主柱塞)、主橡胶塞114，以及侧腔室橡胶塞115。
图9是对使用如图8所示的样品准备仪器来制备用于通过基于噬菌体的 技术进行检测和分析的样品的样品准备程序的简要图解。操作程序的步骤分 为(但不限于)如下l-5步(l)将样品塞入入口 101， (2)拉出主柱塞111， (3) 推入侧腔室柱塞110， (4)推入出口 112 (它连接腔室m 106至出口 112)， (5)推入主柱塞111。
图IO是对使用如图8所示的样品准备仪器来制备用于通过基于噬菌体的 技术进行检测和分析的样品的样品准备程序的更加详细的图解。可按照(但不
限于)如下步骤执行(1)将痰液样品置入入口 101，(2)拉出主柱塞111, (A)
原始的痰液进入入口 101， (B) NaOH在腔室I 102化学处理痰液，(C)宏观 滤网103通过物理方法混匀痰液，(D) > 0.45 nm的单向孔膜105将细菌从痰 液中大体积成分中分离出来并将其传入腔室III 106，问孔径< 0.22 pm的孔 膜107将细菌保留在腔室III 106内并移除样品溶液，和(F)凝胶粉末凝胶化 并中和腔室IV 108中样品溶液的pH然后空气被抽至腔室IV 108， (3)推入 侧柱塞110， (G)噬菌体悬液和培养基被推入腔室III106; (H)噬菌体感染细 菌并生成探针分子，(4)推入出口 112以连接腔室III 106至出口 112， (5)推 入主柱塞111， (I)来自腔室IV 108的空气被推入腔室III 106， (J)探针分子 离开出口 112。
图11显示的是带附加侧腔室的注射器内部实验室装置100的正面透视 图。此装置可包含至少一个附加侧腔室(如图11所示的116-120)。此外，还 可通过添加这些附加侧腔室对处理后的细菌另行进行各种最终处理。例如， 可通过加入药物或其它要求的成分以确定药物耐药性，从而评估药物敏感 度。可加入多种药物以确定细菌的多重耐药性。此外，最后一步可以是加入 一种成分以杀死细菌，并凝胶化残留在腔室in 106中的溶液。这最后一步能 够净化试剂盒，使得弃置试剂盒时不会引起任何危险。
图12显示的是试管内部实验室仪器200的侧面透视图。仪器200包括 (但不限于)(1)一个主腔室装置225，其包括中央腔室201、腔室I202(装 有l。/。w/vNaOH粉末)、腔室I宏观网203、腔室I/腔室II连接部204、腔室 11 205、腔室11孔径>0.45 ^m的孔膜206、腔室11/中央腔室连接部207、腔室 III孔径<0.2 pm的孔膜208、腔室III 209、腔室IV 210 (培养基中含噬菌 体)、腔室IV/中央腔室连接部211、中央腔室出口 212 (包含孔径<0.22 pm的 孔膜)、中央腔室入口 213，以及(2)—个注射器250，其包括一个中央腔室/ 侧腔室连接部214、橡胶塞215、 一个柱塞216、指孔217 (用来拽出主柱 塞)。图13所示的是试管内部实验室仪器200的侧面透视图，其中注射器250 被塞入主腔室装置225，注射器250正在做旋转运动。
使用如图12所示的样品准备仪器来制备用于通过基于噬菌体的技术进行 检测和分析的样品的样品准备程序显示如下。可按照(但不限于)如下步骤执 行最初步骤为将仪器200注射器250 (处于不与任何腔室相连位置)塞入中 央腔室201;旋转注射器，从而使中央腔室/侧腔室连接部214通过腔室1/中 央腔室连接部219将中央腔室201和腔室I 202连通；推下活塞216——样品 经过腔室I宏观网203，被强行推入腔室I 202，在此处它与NaOH粉末混合 形成1% w/vNaOH样品溶液(样品被均质化并被化学处理)；旋转注射器 250，使中央腔室/侧腔室连接部214将中央腔室201与腔室II 205通过腔室 11/中央腔室连接部207连通；拉起活塞216——样品通过腔室I/腔室II连接 部204从腔室I 202转移入腔室II 205，然后再通过腔室II孔径>0.45 pm的孔 膜206回到中央腔室201 (只有细菌和小样品成分可以通过并进入中央腔 室)；旋转注射器250，使中央腔室/侧腔室连接处214将中央腔室201与腔室 III 208通过腔室III /中央腔室连接部218连通；推下活塞216——样品经过腔 室III孔径<0.22 |im的孔膜208从中央腔室201转移入腔室III 208 (细菌存留 于中央腔室201);旋转注射器250，使中央腔室/侧腔室连接部214将中央腔 室201与腔室IV 210通过腔室IV/中央腔室连接部211相连通；拉起活塞 216——噬菌体和培养基经过腔室IV/中央腔室连接部211，从腔室IV 210转 入中央腔室201 (噬菌体感染细菌并产生报道分子)；旋转注射器250，使它不 和任何腔室相连；推下活塞216—探针分子通过中央腔室出口 212排出。 通过添加附加腔室，附加操作可以整合入此仪器200，类似于关于注射器内 部实验室仪器100的描述。
本发明可以有各种修改和可选形式，而附图给出的是这些修改和可选形 式的一些具体实例，且本文对这些具体实例做出了详细说明。不过，应该理 解，本发明并不仅限于在此所阐述的具体形式或方法，恰恰相反，本发明包 括落入所附权利要求书的实质和范围内的所有改进、等同和替代形式。
权利要求
1.一种特异于至少一种靶细菌的重组噬菌体，包括第一条件性启动子；编码第一报道分子的外源核酸序列，其中所述的第一报道分子适合于生成可检测信号，该可检测信号是从由电信号、化学信号、光学信号和对第二种分子的可检测亲和力组成的群组中选择出来的，此外，其中所述编码第一报道分子的外源核酸序列与所述第一条件性启动子可操纵地连接。
2. 根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述的条件性启动子是 从由热休克启动子、生长期启动子、感染阶段启动子和生长条件启动子组成 的群组中选择的。
3. 根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述的条件性启动子可 被阻抑物抑制。
4. 根据权利要求3所述的重组噬菌体，其中所述的启动子为^汉Pw"系统，其中PwM被木糖抑制。
5. 根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述的启动子可被诱导 物诱导。
6. 根据权利要求5所述的重组噬菌体，其中所述的启动子为Pcad， 所述的诱导物为镉。
7. 根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中，噬菌体源于感染以下 细菌中的至少一种细菌的噬菌体群组分枝杆菌属菌种、葡萄球菌属菌种、 李斯特菌属菌种、梭状芽孢杆菌属菌种、肠球菌属菌种、埃希氏菌属菌种、 链球菌属菌种、螺杆菌属菌种、立克次氏体属的物种、嗜血杆菌属菌种、致 病杆菌属菌种、不动杆菌属菌种、支气管败血性博德特氏杆菌(5oWefeZ/a 6ro"c/7/se; to)、铜纟录假单胞菌(尸"wcfo附o"os oen/gz> wa)、气单胞菌属菌种、 放线杆菌属菌种、巴氏杆菌属菌种、弧菌属菌种、军团菌属菌种、芽孢杆菌 属菌种、眉蓝细菌属菌种、产甲烷球菌属菌种、寡养单胞菌属菌种、不动杆 菌属菌种、衣原体属的物种、奈瑟氏球菌属菌种、沙门氏菌属菌种、志贺菌 属菌种、弯曲杆菌属菌种和耶尔森氏菌属菌种。
8. 根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述的第一报道分子是 对至少一种其他分子或材料呈现特异性亲和力的肽、蛋白质如抗体或其片 段、能够生成可检测信号的酶、以及荧光蛋白质。
9. 根据权利要求8所述的重组噬菌体，其中所述的第一报道分子包 含下列中的至少一种MBP、 GST、 HP硫氧还蛋白、V5表位、GB1、聚-Pro-Phe-Tyr和聚组氮酸标签。
10. 根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述的报道分子与所述 重组噬菌体子代的内源蛋白融合。
11. 根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述的报道分子与所述 至少一种靶细菌的内源蛋白融合。
12. 根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述的第一报道分子包 含DNA和RNA中的至少一种，如特定序列的寡聚体、核酶和适体。
13. 根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述的重组噬菌体显示 出天然溶原性周期和天然裂解周期中的至少一种。
14. 根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述的重组噬菌体显示 出条件性溶原性周期和条件性裂解周期中的至少一种。
15. 根据权利要求10所述的重组噬菌体，其中融合的报道分子的表 达受条件性启动子控制。
16. —种特异于至少一种靶细菌的重组噬菌体，包括 编码第一报道分子的外源核酸序列，该核酸序列的侧翼为第一侧翼核酸序列，所述第一侧翼核酸序列包括与所述至少一种靶细菌中的第一靶核酸序 列同源的核酸序列。
17. 根据权利要求16所述的重组噬菌体，其中所述编码所述第一报 道分子的外源核酸序列可操纵地连接于启动子的下游。
18. 根据权利要求17所述的重组噬菌体，还包括第二侧翼核酸序 列，所述第二侧翼核酸序列包括与所述至少一种靶细菌中的第二靶核酸序列 同源的核酸序列。
19. 根据权利要求18所述的重组噬菌体，其中至少所述的第一侧翼 核酸序列包括与所述细菌中与流出泵相关的靶基因的核酸序列同源的核酸序列。
20. 根据权利要求18所述的重组噬菌体，其中至少所述的第一侧翼核酸序列包括与所述细菌中的靶基因的核酸序列同源的核酸序列，此靶基因 编码靶表型和)菌株特异性特征序列中的至少一种，包括耐药性和毒素产生中 的至少一种。
21. 根据权利要求20所述的重组噬菌体，其中所述的靶基因选自包 括下述中的至少一种的群组vanA、 vanCl、 mecA、 katG、 gyrA、 gyrB、 inhA、 pstB、 Rvl258c禾口 Rvl410c。
22. 根据权利要求17所述的重组噬菌体，其中所述的启动子为条件 性启动子并选自包括下述中的至少一种的群组热休克启动子、生长期启动 子、感染阶段启动子和生长条件启动子。
23. 根据权利要求17所述的重组噬菌体，其中所述的条件性启动子 可被阻抑物抑制。
24. 根据权利要求23所述的重组噬菌体，其中所述的启动子为^汉PwM系统，其中P;^被木糖抑制。
25. 根据权利要求17所述的重组噬菌体，其中所述的启动子是组成 型启动子。
26. 根据权利要求25所述的重组噬菌体，其中所述的组成型启动子^￡ Pspc。
27. 根据权利要求16所述的重组噬菌体，其中所述的第一报道分子 可生成可检测信号，其中，此可检测信号是从包含下述中的至少一种的群组 中选择电信号、化学信号、光学信号和对第二种分子的可检测亲和力。
28. 根据权利要求1所述的重组噬菌体，其中所述的第一报道分子是 对至少一种其他分子或材料呈现特异性亲和力的肽、蛋白质如抗体或其片 段、能够生成可检测信号的酶、以及荧光蛋白质。
29. 根据权利要求28所述的重组噬菌体，其中所述的第一报道分子 包含下列中的至少一种MBP、 GST、 HP硫氧还蛋白、V5表位、GB1、聚-Pro-Phe-Tyr和聚组氨酸标签。
30. 根据权利要求16所述的重组噬菌体，其中所述的报道分子与所述重组噬菌体子代的内源蛋白融合。
31. 根据权利要求16所述的重组噬菌体，其中所述的报道分子与所 述至少一种靶细菌的内源蛋白融合。
32. 根据权利要求16所述的重组噬菌体，其中所述的第一报道分子 包含DNA和RNA中的至少一种，如特定序列的寡聚体、核酶和适体。
33. 根据权利要求16所述的重组噬菌体，其中所述的重组噬菌体显 示出天然溶原性周期和天然裂解周期中的至少一种。
34. 根据权利要求16所述的重组噬菌体，其中所述的重组噬菌体显 示出条件性溶原性周期和条件性裂解周期中的至少一种。
35. 根据权利要求30所述的重组噬菌体，其中融合的报道分子的表 达受条件性启动子控制。
36. 根据权利要求16所述的重组噬菌体，其中，噬菌体源于感染以 下细菌中的至少一种细菌的噬菌体群组分枝杆菌属菌种、葡萄球菌属菌 种、李斯特菌属菌种、梭状芽孢杆菌属菌种、肠球菌属菌种、埃希氏菌属菌 种、链球菌属菌种、螺杆菌属菌种、立克次氏体属的物种、嗜血杆菌属菌 种、致病杆菌属菌种、不动杆菌属菌种、支气管败血性博德特氏杆菌、铜绿 假单胞菌、气单胞菌属菌种、放线杆菌属菌种、巴氏杆菌属菌种、弧菌属菌 种、军团菌属菌种、芽孢杆菌属菌种、眉蓝细菌属菌种、产甲烷球菌属菌 种、寡养单胞菌属菌种、不动杆菌属菌种、衣原体属的物种、奈瑟氏球菌属 菌种、沙门氏菌属菌种、志贺菌属菌种、弯曲杆菌属菌种和耶尔森氏菌属菌 种。
37. —种生成至少一种子代重组噬菌体的方法，包括如下步骤 用重组噬菌体接触重组宿主细菌，所述重组宿主细菌包括编码所述重组噬菌体的至少一种野生型内源蛋白质的外源核酸分子，其中所述的重组噬菌体包括第一条件性启动子和编码第一报道分子的外源核酸序列，其中所述第一报道分子可生成可检测信号，所述可检测信号选自由电信号、化学信号、 光学信号及对第二种分子的可检测亲和力组成的群组，此外，其中所述编码第一报道分子的外源核酸序列与所述第一条件性启动子可操纵地连接，由此 使得所述第一条件性启动子和所述编码第一报道分子的外源核酸序列被引入到所述重组宿主细菌中；抑制所述重组宿主细菌中的所述重组噬菌体中的第一报道分子的表达；允许所述第一条件性启动子和所述编码第一报道分子的外源核酸序列与 编码所述重组噬菌体中的至少一种野生型结构蛋白的外源核酸分子重组；表达所述至少一种野生型内源蛋白而不表达所述第一报道分子；生成至少一种子代重组细菌噬菌体，其包括所表达的至少一种野生型内源蛋白；所述第一条件性动子；禾口所述编码第一报道分子的外源核酸序列，而不表达所述第一报道分子。
38. 根据权利要求37所述的方法，其中抑制步骤另外还包括，通过 添加一种抑制剂，在许可的条件下将所述重组噬菌体放置在所述重组宿主细 菌中，其中所述抑制剂抑制所述第一报道分子的表达。
39. —种检测样品中靶细菌的存在的方法，包括如下步骤.-用特异于所述靶细菌的重组噬菌体接触所述样品，所述重组噬菌体包括第一条件性启动子和编码第一报道分子的外源核酸序列，其中所述的第一报 道分子适合于生成可检测信号，该可检测信号是选自由电信号、化学信号、 光学信号和对第二种分子的可检测亲和力组成的群组，此外，其中所述编码第一报道分子的外源核酸序列与所述第一条件性启动子可操纵地连接；分析所述样品中所述第一报道分子的表达，其中，所述第一报道分子的 表达表明样品中可能存在所述靶细菌。
40. 根据权利要求39所述的方法，其中，所述样品选自由环境样 品、植物样品、兽医样品、食物样品、家畜样品和医学样品组成的群组。
41. 根据权利要求39所述的方法，其中，所述样品选自由土壤样 品、水样品、蔬菜样品、肉样、血样、尿样、活组织样品、粘液样品、粪便 样品及痰液样品组成的群组。
42. 根据权利要求39所述的方法，还包括在可表达所述第一报道分 子的条件下，提供所述靶细菌的步骤。
43. 根据权利要求42所述的方法，其中在所述条件下提供所述靶细 菌的步骤还包括提供可诱导所述第一报道分子的表达的诱导物。
44. 根据权利要求42所述的方法，其中在所述条件下提供所述靶细 菌的步骤还包括在没有阻抑物的条件下提供所述靶细菌。
45. 根据权利要求39所述的方法，还包括检测所述第一报道分子的 表达的步骤，其中所表达的第一报道分子可生成可检测信号。
46. 根据权利要求42所述的方法，其中所述可检测信号选自由电信 号、化学信号、光学信号及对第二种分子的可检测亲和力组成的群组。
47. 根据权利要求39所述的方法，其中接触的步骤还包括用所述重 组噬菌体接触所述靶细菌，从而使所述第一条件性启动子和所述编码第一报 道分子的外源核酸序列被引入所述靶细菌中。
48. 根据权利要求47所述的方法，还包括生成至少一个包含所表达 的第一报道分子的子代重组噬菌体的步骤。
49. 根据权利要求48所述的方法，其中所述至少一个子代重组噬菌 体可经历裂解周期。
50. 根据权利要求48所述的方法，其中所述至少一个子代重组噬菌 体可经历溶原性周期。
51. 根据权利要求39所述的方法，其中，所述靶细菌包括选自以下 一组的细菌菌种分枝杆菌属菌种、葡萄球菌属菌种、李斯特菌属菌种、梭 状芽孢杆菌属菌种、肠球菌属菌种、埃希氏菌属菌种、链球菌属菌种、螺杆 菌属菌种、立克次氏体属的物种、嗜血杆菌属菌种、致病杆菌属菌种、不动 杆菌属菌种、支气管败血性博德特氏杆菌、铜绿假单胞菌、气单胞菌属菌 种、放线杆菌属菌种、巴氏杆菌属菌种、弧菌属菌种、军团菌属菌种、芽孢 杆菌属菌种、眉蓝细菌属菌种、产甲垸球菌属菌种、寡养单胞菌属菌种、不 动杆菌属菌种、衣原体属的物种、奈瑟氏球菌属菌种、沙门氏菌属菌种、志 贺菌属菌种、弯曲杆菌属菌种和耶尔森氏菌属菌种。
52. —种检测样品中靶细菌对第一种感兴趣的药物的耐药性的方法， 包括如下步骤用特异于靶细菌的重组噬菌体接触所述靶细菌，所述重组噬菌体包括第 一条件性启动子和编码第一报道分子的外源核酸序列，其中所述的第一报道 分子适合于生成可检测信号，该可检测信号选自由电信号、化学信号、光学信号以及对第二种分子的可检测亲和力组成的群组，此外，其中所述编码第 一报道分子的外源核酸序列与所述第一条件性启动子可操纵地连接，从而使 所述第一条件性启动子和所述编码第一报道分子的外源核酸序列被引入所述 靶细菌中；将所述靶细菌暴露给所述第一种感兴趣的药物； 诱导所述第一报道分子的表达；分析所述样品中所述第一报道分子的表达，其中所述第一报道分子的表 达表明所述靶细菌对所述第一种感兴趣的药物有耐药性。
53. 根据权利要求52所述的方法，其中所述样品选自由环境样品、 植物样品、兽医样品、食物样品、家畜样品和医学样品组成的群组。
54. 根据权利要求54所述的方法，其中所述样品选自由土壤样品、 水样品、蔬菜样品、肉样、血样、尿样、活组织样品、粘液样品、粪便样品 及痰液样品组成的群组。
55. 根据权利要求52所述的方法，其中诱导步骤还包括加入诱导分 子的步骤。
56. 根据权利要求52所述的方法，其中诱导步骤还包括移除阻抑分 子的步骤。
57. 根据权利要求52所述的方法，还包括检测所述第一报道分子的 表达的步骤，其中所表达的第一报道分子可生成可检测信号。
58. 根据权利要求57所述的方法，其中所述可检测信号选自由电信 号、化学信号、光学信号及对第二种分子的可检测亲和力组成的群组。
59. 根据权利要求52所述的方法，还包括生成至少一个包含所表达 的第一报道分子的子代重组噬菌体的步骤。
60. 根据权利要求59所述的方法，其中所述至少一个子代重组噬菌 体可经历裂解周期。
61. 根据权利要求59所述的方法，其中所述至少一个子代重组噬菌 体可经历溶原性周期。
62. 根据权利要求52所述的方法，其中所述靶细菌包括选自以下一 组的细菌菌种分枝杆菌属菌种、葡萄球菌属菌种、李斯特菌属菌种、梭状芽孢杆菌属菌种、肠球菌属菌种、埃希氏菌属菌种、链球菌属菌种、螺杆菌 属菌种、立克次氏体属的物种、嗜血杆菌属菌种、致病杆菌属菌种、不动杆 菌属菌种、支气管败血性博德特氏杆菌、铜绿假单胞菌、气单胞菌属菌种、 放线杆菌属菌种、巴氏杆菌属菌种、弧菌属菌种、军团菌属菌种、芽孢杆菌 属菌种、眉蓝细菌属菌种、产甲烷球菌属菌种、寡养单胞菌属菌种、不动杆 菌属菌种、衣原体属的物种、奈瑟氏球菌属菌种、沙门氏菌属菌种、志贺菌 属菌种、弯曲杆菌属菌种和耶尔森氏菌属菌种。
63. —种检测样品中耙细菌的存在的方法，包括如下步骤 用特异于所述靶细菌的重组噬菌体接触所述样品，，所述重组噬菌体包括编码第一报道分子的外源核酸序列，其中此外源核酸序列的侧翼是第一侧 翼核酸序列，所述第一侧翼核酸序列包括与存在于所述至少一种靶细菌中的 第一靶核酸序列同源的核酸序列；以及分析所述样品中所述第一报道分子的表达，其中所述第一报道分子的表 达表明样品中可能存在所述靶细菌。
64. 根据权利要求63所述的方法，其中所述第一侧翼核酸序列在所 述第一侧翼核酸序列被引入到靶细菌中后可发生交换事件，其中所述第一侧 翼核酸序列与存在于所述至少一种靶细菌中的所述第一靶核酸序列发生置 换。
65. 根据权利要求64所述的方法，其中所述重组噬菌体还包括第二 侧翼核酸序列，此核酸序列包括与所述至少一种靶细菌中的第二靶核酸序列 同源的核酸序列。
66. 根据权利要求65所述的方法，其中所述的第二侧翼核酸序列在 所述第二侧翼核酸序列被引入到靶细菌中后可发生交换事件，其中所述第二 侧翼核酸序列与存在于所述至少一种靶细菌中的所述第二靶核酸序列发生置 换。
67. 根据权利要求66所述的方法，其中编码第一报道分子的外源生 核酸序列可置换位于所述第一和第二靶核酸序列之间的所述靶细菌的第三核 酸序列，其中所述第三核酸序列的置换可触发第一报道分子的表达。
68. 根据权利要求64所述的方法，还包括灭活重组噬菌体的裂解周期的步骤。
69. 根据权利要求64所述的方法，其中所述启动子是条件性启动子。
70. 根据权利要求69所述的方法，其中在存在抑制剂的条件下，所 述条件性启动子可限制报道分子的表达。
71. 根据权利要求69所述的方法，其中在缺乏诱导物的条件下，所 述条件性启动子可限制报道分子的表达。
72. 根据权利要求63所述的方法，其中所述靶细菌包括选自以下一 组的细菌菌种分枝杆菌属菌种、葡萄球菌属菌种、李斯特菌属菌种、梭状 芽孢杆菌属菌种、肠球菌属菌种、埃希氏菌属菌种、链球菌属菌种、螺杆菌 属菌种、立克次氏体属的物种、嗜血杆菌属菌种、致病杆菌属菌种、不动杆 菌属菌种、支气管败血性博德特氏杆菌、铜绿假单胞菌、气单胞菌属菌种、 放线杆菌属菌种、巴氏杆菌属菌种、弧菌属菌种、军团菌属菌种、芽孢杆菌 属菌种、眉蓝细菌属菌种、产甲烷球菌属菌种、寡养单胞菌属菌种、不动杆 菌属菌种、衣原体属的物种、奈瑟氏球菌属菌种、沙门氏菌属菌种、志贺菌 属菌种、弯曲杆菌属菌种和耶尔森氏菌属菌种。
73. 根据权利要求72所述的方法，其中所述靶细菌为大肠杆菌
74. 根据权利要求72所述的方法，其中所述靶细菌为链球菌属菌种。
75. 根据权利要求72所述的方法，其中所述靶细菌为分枝杆菌属菌种。
76. 根据权利要求63所述的方法，其中所述样品选自由环境样品、 植物样品、兽医样品、食物样品、家畜样品和医学样品组成的群组。
77. 根据权利要求76所述的方法，其中所述样品选自由土壤样品、 水样品、蔬菜样品、肉样、血样、尿样、活组织样品、粘液样品、粪便样品 及痰液样品组成的群组。
78. 根据权利要求63所述的方法，还包括在可表达所述第一报道分 子的条件下，提供所述耙细菌的步骤。
79. 根据权利要求78所述的方法，其中在所述条件下提供所述靶细菌的步骤还包括提供可诱导所述第一报道分子表达的诱导物。
80. 根据权利要求79所述的方法，其中在所述条件下提供所述耙细菌的步骤还包括在没有阻抑物的条件下提供所述耙细菌。
81. 根据权利要求63所述的方法，还包括检测所述第一报道分子的表达的步骤，其中所表达的第一报道分子可生成可检测信号。
82. 根据权利要求81所述的方法，其中所述可检测信号选自由电信号、化学信号、光学信号及对第二种分子的可检测亲和力组成的群组。
83. 根据权利要求63所述的方法，其中接触的步骤还包括用所述重组噬菌体接触所述靶细菌，从而使所述编码第一报道分子的外源核酸序列和第一侧翼核酸序列被引入至靶细菌中。
84. —种检测样品中靶细菌对感兴趣的药物的耐药性的方法，包括如下步骤用特异于所述靶细菌的重组噬菌体接触所述样品，所述重组噬菌体包括编码第一报道分子的外源核酸序列，此外源核酸序列的侧翼是第一侧翼核酸序列，所述第一侧翼核酸序列包括与至少一种靶细菌中的第一耙核酸序列同源的核酸序列，其中所述第一侧翼核酸序列与编码耙细菌对所述感兴趣的药物的耐药性表型的核酸序列的一部分同源；分析所述样品中的所述第一报道分子的表达，其中所述第一报道分子的表达表明靶细菌对所述感兴趣的药物有耐药性。
85. 根据权利要求84所述的方法，其中所述样品选自由环境样品、植物样品、兽医样品、食物样品、家畜样品和医学样品组成的群组。
86. 根据权利要求84所述的方法，其中所述样品选自由土壤样品、水样品、蔬菜样品、肉样、血样、尿样、活组织样品、粘液样品、粪便样品及痰液样品组成的群组。
87. 根据权利要求84所述的方法，还包括检测所述第一报道分子的表达的步骤，其中所表达的第一报道分子可生成可检测信号。
88. 根据权利要求87所述的方法，其中所述可检测信号选自由电信号、化学信号、光学信号及对第二种分子的可检测亲和力组成的群组。
全文摘要
本发明的实例涉及到选择性生物体检测，尤其是重组细菌噬菌体及使用其检测靶细菌以及检测此靶细菌中的特定核酸序列，从而可以检测此细菌表性的特性，如确定靶细菌对何种药物具有耐药性。此外，本发明还可涉及基于细菌噬菌体技术以用来检测和分析准备样品的样品准备装置。此装置成本低，易于使用并且不要求任何专业技术或附加的实验室设备。
文档编号C12Q1/04GK101680041SQ200880019718
公开日2010年3月24日 申请日期2008年4月18日 优先权日2007年4月18日
发明者C·巴特, D·雷伊, L·M·特谢拉 申请人:康奈尔大学