分离和培养来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞的方法

专利名称：：分离和培养来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞的方法
技术领域：
：本发明涉及高产量分离并培养来自人羊膜的成人干细胞的方法，具体涉及获得大量成人干细胞的方法，所述方法包括通过使用二硫苏糖醇(DTT)和低浓度胰蛋白酶处理从人羊膜组织高产量获得羊膜上皮细胞，并在含有Rho-相关激酶抑制剂(Rho-associatedkinaseinhibitor)的培养基中培养羊膜上皮细胞。
背景技术：
：二十一世纪生物技术提供了对食品、环境和健康问题的新的解决办法的可能性，其最终目标是促进人类繁荣。近些年来，使用干细胞的技术已经被认为治疗不治之症的新的途径。先前，器官移植、基因治疗等被用于治疗不可治愈的人类疾病，但是它们的有效使用由于免疫排斥、器官供应源的缺乏、载体发展的不足以及疾病基因的知识不足而没有实现。由于这种原因，随着干细胞研究兴趣的增加，已经认识到具有通过增殖和分化形成所有器官的能力的全能干细胞不仅能治疗大多数疾病，而且基本上能够治愈器官损伤。而且，许多科学家已经建议将干细胞临床应用于所有器官的再生和不治之症的治疗，包括帕金森病、各种癌症、糖尿病以及脊髓损伤。干细胞指的是不仅具有自我复制能力而且具有分化成至少两种细胞的能力的细胞，并可被分成全能干细胞、多能干细胞(pluripotentstemcells)和专能干细胞(multipotentstemcells)。全能干细胞是具有能够发育成完整个体的全能性质的细胞，并且这些性质直到在卵细胞和精子受精之后的8细胞期的细胞所具有。当这些细胞被分离并移植到子宫中时，它们可发育成一个完整个体。多能干细胞是能够发育成来自外胚层、中胚层和内胚层的多种细胞和组织的细胞，来自位于在受精4-5天之后产生的胚泡内部的细胞团。这些细胞被称为"胚胎干细胞"，并可分化成不同其他组织，但不能形成新的生物体。专能干细胞是仅仅分化成对含有这些细胞的组织和器官专一的细胞的干细胞，不仅在胎儿、新生儿和成人阶段中的各种组织和器官生长和发育中涉及，而且在成体组织的体内平衡的保持和在组织损伤时诱导再生功能中涉及。组织专一性专能干细胞统称为"成人干细胞"。成人干细胞通过从不同人体器官获取细胞并将细胞发育成干细胞得到，其特征在于它们仅仅分化成专一性组织。但是，近来，将成人干细胞分化成不同组织包括干细胞的实验获得成功，并因此引起注意。专能干细胞最早从成人骨髓中分离(Jiang等人，Nature,418:41，2002)，然后也在其他各种成人组织中发现(Verfaillie，TrendsCellBiol.，12:502，2002)。换言之，虽然骨髓是已知的最广泛的干细胞源，但专能干细胞也在皮肤、血管、肌肉和大脑中被发现(Tomas等人，Nat.CellBiol.，3:778,2001;Sampaolesi等人，Science,301:487,2003;3Jiang等人，E邓.Hematol.，30:896,2002)。但是，干细胞在成人组织诸如骨髓中几乎不存在，并且在不诱导分化时这些细胞难以培养，因此在缺少专一性筛选培养基时难以培养。即，在体外保存分离的干细胞非常困难。同时，对来自胎儿组织的间叶干细胞的分离研究结果表明，在胎儿组织中存在丰富的间叶干细胞。但是，胎儿组织作为细胞治疗剂来源的使用由于伦理上的关注而受到限制。间叶干细胞也从作为胎儿间叶干细胞(MSC)的脐带血(UCB)中被分离，但是它们的数量非常少，并且它们显示较差的增殖能力。另一方面，在近来由于极佳的分化潜能和安全性而引起广泛注意的胎盘干细胞的情况下，间叶干细胞以超过脐带血IOO倍以上的量被提取。此外，脐带血仅仅能够使用一次，并且在15岁之后另外需要供体脐带血，相反胎盘干细胞能够多次使用，因此也能够在成人中使用。另外，胎盘干细胞可被用于广泛的疾病范围。脐带血的造血干细胞主要用于血液病，而胎盘干细胞可有利地用于治疗细胞损伤，并可在将来用于治疗许多疾病，包括心力衰竭、中风、糖尿病、骨质疏松、变性关节炎等。但是，无论何时需要，在使用胎盘作为成人干细胞来源的情况下难以使用在分娩之后立即收集的胎盘组织，事实上，对于胎盘组织的工业应用(胎盘注射剂、胎盘化妆品等)来说，在分娩之后收集的胎盘组织被冷藏以便使用。以未分化状态存在的来自胎盘的干细胞仅仅从分娩之后立即收集的胎盘中可大量得到，并且从分娩数小时之后的胎盘组织或者尤其是从长时间冷藏的胎盘组织得到大量成人干细胞非常困难。由于这种原因，为了在工业应用中使用来自胎盘的成人干细胞，迫切需要开发从冷藏的胎盘组织或类似物中制备大量成人干细胞的工艺。在成人干细胞中，已知来自羊膜上皮细胞的成人干细胞具有与胚胎干细胞的性质最相似的性质，因此具有分化成各种细胞的能力，同时它们在临床上是安全的，因为它们在体内移植时不引起肿瘤，这与胚胎干细胞不同(Miki等人，StemCell,23:1549,2005)。与来自其他胎盘组织的成人干细胞不同，来自羊膜上皮细胞的成人干细胞最可能在单细胞培养和传代培养过程中发生凋亡。由于这种原因，使用常规培养方法大量诱导来自羊膜上皮细胞的未分化成人干细胞增殖很困难(http:〃www.cellapplications.com/HumanCells/HPlEpC.htm)。因此，本发明的发明人付出了许多努力来制备来自羊膜上皮细胞的大量未分化成人干细胞以便其实践应用，结果发现，通过使用DTT和ROCK抑制剂来分离并培养羊膜上皮细胞并改变培养基的组成从冷藏胎盘组织可得到大量来自羊膜上皮细胞的干细胞，由此完成了本发明。
发明内容本发明的目的在于提供从人羊膜组织高产量分离羊膜上皮细胞的方法，以及从来自分离的羊膜上皮细胞制备成人干细胞的方法。本发明的另一目的在于提供来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞以及用于伤口愈合的细胞治疗剂，其含有成人干细胞作为活性成分。为了实现上述目的，本发明提供了分离羊膜上皮细胞的方法，包括下列步骤使用二硫苏糖醇(DTT)处理人羊膜组织，并使用O.025-0.125X的胰蛋白酶处理DTT处理的羊膜组织。4本发明还提供了制备来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞的方法，该方法包括下列步骤在含有Rho-相关激酶(ROCK)抑制剂的培养基中培养根据上述方法分离的人羊膜上皮细胞，并从培养液中收集干细胞。本发明还提供了增殖并保存来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞的方法，该方法包括在含有Rho-相关激酶(ROCK)抑制剂的培养基中对根据上述方法制备的来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞进行传代。本发明还提供了通过所述方法制备的来自人羊膜上皮组织的成人干细胞，以及含有成人干细胞作为活性剂的用于伤口愈合的细胞治疗剂。通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加明显。图1显示了使用和不使用二硫苏糖醇(DTT)处理的羊膜上皮细胞的产量之间的比较[A:通过使用DTT和胰蛋白酶处理得到的羊膜上皮细胞；B:通过单独使用胰蛋白酶处理得到的单个细胞；C:通过培养"A"得到的成人干细胞；和D:通过培养"B"得到的成人干细胞];图2是显示在ROCK抑制剂存在下培养的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的增强的能力的照片；图3是显示以各种浓度的ROCK处理之后1天成人干细胞增强的增殖能力的比较的照片；图4是显示以各种浓度的ROCK处理之后4天成人干细胞增强的增殖能力的比较的照片；图5显示了使用/不使用ROCK抑制剂培养时比较干细胞的能力得到的结果；图6是显示根据ROCK抑制剂处理时间段比较来自羊膜上皮细胞的成人干细胞增殖能力进行比较得到的结果的照片(对照在不使用ROCK抑制剂处理时培养1天的细胞；A:仅仅在重新接种之前使用ROCK抑制剂处理并培养1天的细胞，以及B:甚至在重新接种后使用ROCK抑制剂处理并培养1天的细胞)；图7显示了通过比较来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的增殖能力得到的结果，该结果通过分别在DMEM培养基和K-SFM培养基中将它们培养3天、6天和8天得到；图8显示了通过更换DMEM培养基和K_SFM培养基的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的增强的增殖能力比较；图9和图10显示了来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的流式细胞分选计分析的结果；图11是显示来自羊膜上皮细胞的成人干细胞对SSEA4、0ct-4、细胞角蛋白(Cytokeratin)和E-钙粘着蛋白(E-cadherin)的应答的照片；图12是显示来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的形态学特征的光学显微镜照片；图13是显示来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的脂肪形成、骨生成和肌生成的照片；图14是显示来自羊膜上皮细胞的成人干细胞神经发生的照片。5图15是显示通过观察动物愈伤模型中伤口闭合率得到的结果的示意图；图16是在使用来自羊膜上皮细胞的成人干细胞给药的组中回收的伤口皮肤组织的H&E染色照片。具体实施例方式在一个方面，本发明涉及高产量分离并制备羊膜上皮细胞的方法，该方法包括下列步骤使用二硫苏糖醇(DTT)处理人羊膜组织，并使用低浓度胰蛋白酶处理DTT处理的羊膜组织。与从分离自胎盘的羊膜组织中提取各种细胞不同，本发明的特征在于，仅从羊膜组织中提取并分离羊膜上皮细胞。羊膜上皮细胞由受精后8天原肠胚形成之前的外胚层发育而来，它们保持了原肠胚形成前期胚胎细胞的可塑性。因此，发现羊膜上皮细胞表达与胚胎干细胞的表面标记物相同的表面标记物。免疫组化和基因分析结果表明，来自羊膜上皮细胞的成人干细胞具有分化成来自内胚层、中胚层和外胚层的细胞，并且不在体内引起肿瘤形成(Miki等人，StemCell,23:1549，2005)。但是，与来自其他胎盘组织的成人干细胞不同的是，来自羊膜上皮细胞的成人干细胞在单细胞培养和传代过程中很可能发生凋亡(即optosis)，由于这个原因，难以使用常规培养方法诱导未分化的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞大量增殖。换言之，以未分化状态存在的来自羊膜上皮细胞的干细胞仅仅可从分娩后立即收集的胎盘中大量获得，并且非常难以从分娩后数小时的胎盘组织或者尤其是从已经长期冷藏的胎盘组织中得到大量成人干细胞。由于这种问题的存在，需要从分娩之后立即收集的胎盘中得到大量羊膜上皮细胞或者在细胞培养过程中抑制成人干细胞凋亡。从胎盘分离的羊膜的表面常常覆盖有血液和粘液。在现有技术中这些粘液及类似物干扰了从羊膜中分离单个细胞，并起到降低胰蛋白酶处理的效果的作用。因此，需要在胰蛋白酶处理之前除去杂质诸如粘液，由此形成其中用于单细胞分离的胰蛋白酶的效果可被最大化的环境。本发明涉及通过在胰蛋白酶处理之前使用二硫苏糖醇(DTT)处理，从分娩之后立即收集的胎盘中得到大量羊膜上皮细胞，并通过抑制分离细胞的凋亡大量培养分离的细胞，从而解决了上述问题。DTT是由下列结构式1表示的化合物，一般用于从蛋白质中除去二硫键，抑制DNA中二聚体的形成，去除粘液、去除杂质或者连接组织的等，并且其为添加到许多生物检测组合物中的试剂，但在提取干细胞的过程中还未使用过。[结构式1]HOOH/CH-HC/\HS-CH2H2C-SH在本发明中，通过将作为分离单细胞的常规步骤的胰蛋白酶处理替换成DTT处理防止过度细胞裂解，并且通过除去干扰胰蛋白酶处理效果的粘液以增加单细胞的产量。这里，用于处理的DTT浓度优选为5-50mM，更优选8_15mM。在本发明的一种实施方式中，使用10mM的DTT。如果DTT以低于5mM的浓度使用，则难以高产量得到单细胞，如果DTT以超过50mM的浓度使用，则由于过量蛋白质降解而发生凋亡。在使用DTT处理人羊膜组织之后，使用低浓度胰蛋白酶对其进行处理以便分离羊膜上皮细胞。胰蛋白酶的浓度优选为0.025-0.125%，更优选0.05-0.10%。为了从羊膜组织中分离各种细胞，需要以与其对应的合适浓度的胰蛋白酶进行处理，特别是，通过使用低浓度胰蛋白酶进行处理得到羊膜上皮细胞。但是，在现有技术中，由于杂质诸如覆盖羊膜组织的粘液引起的干扰，上皮细胞不能使用低浓度胰蛋白酶有效分离，由于这种原因，通常使用可由高浓度胰蛋白酶或者胶原酶分离的间叶干细胞(MSC)。但是，本发明通过使用DTT处理人羊膜组织除去粘液等，甚至使用低浓度的胰蛋白酶也能够使羊膜上皮细胞有效地被分离。特别是，本发明提供了通过使用低浓度(0.025-0.125%)胰蛋白酶处理而不使用高浓度(0.25-0.5%)胰蛋白酶处理而高产量分离羊膜上皮细胞的方法。这里，通过在胰蛋白酶处理之后立即以2500-3000rpm涡旋30-60秒的另外的步骤，细胞的产量可通过施加物理剪切应力而增加。该另外的步骤具有的优点在于，其相对縮短了胰蛋白酶处理的时间，因此降低了由胰蛋白酶引起的细胞损伤。在羊膜组织经过胰蛋白酶处理和涡旋之后，将得到的物质过滤，由此得到所需羊膜上皮细胞。优选地，得到的物质经l-2mm筛初步过滤，结果，与从一开始就使用100-ym粗滤器的情况相比，细胞的体外暴露时间可被縮短，由此增加了细胞的活度，縮短了进行细胞分离的时间，并减少了100-m细胞粗滤器的使用，导致成本减少。当根据上述方法分离的羊膜上皮细胞在含有Rho-相关激酶(ROCK)抑制剂的培养基中培养时，可得到大量的成人干细胞。因此，在另一方面，本发明涉及制备来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞的方法，所述方法包括下列步骤在含有Rho-相关激酶(ROCK)抑制剂的培养基中培养根据上述方法分离的人羊膜上皮细胞，并从培养液中收集干细胞。此外，本发明还提供了增殖并保存来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞的方法，该方法包括在含有Rho-相关激酶(ROCK)抑制剂的培养基中对根据上述方法制备的来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞进行传代。在本发明中在来自羊膜上皮细胞的成人干细胞培养中使用的培养基可以是常用培养基，诸如DMEM(杜尔贝克改良伊格尔培养基，dulbeccomodifiedeaglemedium)或者K-SFM(无角化细胞血清培养基，keratinocyteserumfreemedium)。培养基可含有抗坏血酸、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、抗生素、FBS(胎牛血清)等。抗生素可以是本领域已知的常规抗生素，其例子可以是抗生素-抗真菌素(Gibco)。作为培养基，例如，含有FBS(胎牛血清)、抗坏血酸、表皮生长因子、非必需氨基酸和抗生素的匿EM(杜尔贝克改良伊格尔培养基，或者含有FBS、抗坏血酸、氢化可的松、NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸)、胰岛素和抗生素的K-SFM(无角化细胞血清培养基)可被用于培养羊膜上皮干细胞。这里，当在匿EM培养基中培养时比在K-SFM培养基中培养时显示成人干细胞的增殖稍高(图7)。特别是，关于培养基，本发明的发明人通过替换DMEM和K-SFM培养基进行实验检查了细胞增殖的能力，结果发现，当将DMEM培养基替换成K-SFM时，与当仅仅连续使用DMEM或者K-SFM培养基(无替换)时相比，成人干细胞增殖的能力进一步增加(图8)。在该过程中，DMEM培养基替换成K-SFM培养基优选在成人干细胞的初次传代中进行。但是，用于来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的培养基优选为由1:l的DMEM和F-12(营养混合物)构成的混合培养基(Gibco)。此时，混合培养基同样含有抗坏血酸、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、抗生素和FBS(胎牛血清)。在本发明的一种实施方式中，抗真菌抗生素(Gibco)被用作抗生素。在本发明中，分离的单个羊膜上皮细胞在含有ROCK(Rho-相关激酶)抑制剂的培养基中初步培养以获得成人干细胞，然后再ROCK抑制剂的存在下传代，使成人干细胞保持为未分化状态。起到抑制凋亡作用的物质ROCK(Rho-相关激酶)抑制剂已知用于抑制轴突再生的主动肌诱导的&2+敏感、肌球蛋白磷酸化和平滑肌收縮。更具体地说，ROCK抑制剂已知会使引起高血压和哮喘的肌肉细胞的异常结构正常化，并具有增加到视盘(opticdisc)的血流以及持续降低眼内压的功能。关于生物学特性，已知ROCK抑制剂具有抑制凋亡并将细胞保持在未分化状态的功能。近来，进行了使用ROCK抑制剂增加分离的人胚胎干细胞的活度的研究(Watanabe等人，NatureBiotechnology,25:681,2007)。但是，对本领域技术人员来说显而易见的是，胚胎干细胞和成人干细胞彼此明显不同，因此它们的来源与分化能力彼此明显不同。尚没有报道确定通过使用ROCK抑制剂增加成人干细胞的增殖。但是，在本发明中，确定成人干细胞增殖的能力在其分离和培养中通过ROCK抑制剂而增加，并且增殖并保存羊膜上皮细胞来源的干细胞的效率也通过ROCK抑制剂进一步增加。在上面由Watanabe等人所进行的研究中，在将细胞重新接种到新鲜培养基中以便传代之前使用ROCK抑制剂处理羊膜干细胞的方法被使用。特别是，在使用ROCK抑制剂处理的羊膜干细胞被重新接种到新鲜培养基上之后，在不使用ROCK抑制剂的情况下对它们进行培养(Watanabe等人，NatureBiotechnology,25:681,2007)。另一方面，在本发明中，当重新接种到新鲜培养基上以便传代时使用ROCK抑制剂处理细胞，从而建立了ROCK抑制剂在来自人羊膜上皮细胞的干细胞的传代过程中持续存在的环境。可在本发明中使用的典型ROCK抑制剂包括Y-27632、HA_1077、Y_39983、Wf-536等，它们中，Y-27632(Calbiochem或者Sigma)在本发明的典型实施方式中使用。Y-27632具有下列结构式2:[结构式2]在根据本发明的处理中使用的ROCK抑制剂的浓度优选在从10nM到100yM的范8围内。如果ROCK抑制剂以低于10nM的浓度使用，将难以长期保存未分化状态的成人干细胞，如果ROCK抑制剂以超过100M的浓度使用，可发生细胞形态变化，并且细胞可进入分化过程中。在另一方面，本发明涉及通过上面描述的方法得到的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞。通过上面描述的方法得到的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的形态学和免疫学特征将在下面描述。(1)形态学特征从羊膜组织分离的单个羊膜上皮细胞具有典型的长方体或者方块状略圆的上皮细胞形态，在培养过程中细胞的尺寸大约为5-10ym。一般说来，羊膜上皮细胞基于培养条件而尺寸增大，同时胞液增加，引起滋养层变化，或者它们可能发生与上皮_间叶转变(印ithelio-mesenchymaltransition)相关的变形，上皮细胞通过这种突然的形态变化变成间叶干细胞(MSC)类型(图12)。但是，在本发明中，使用DTT处理并在含有ROCK抑制剂的培养基中培养的来自羊膜上皮细胞的成人干细持续保持简单的立方体形状(图12最下面的照片)。(2)免疫学特性使用流式细胞计分析根据本发明的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的免疫学性质，结果，细胞对于CD9、CD29、CD49f、CD73、CD90和CD105是阳性的，对于CD31、CD34、CD45和CD133是阴性的(图9和图10)。(3)干性(Sternness)在本发明的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞中，发现表示上皮细胞特性的细胞角蛋白(cytokeratin)和上皮(E)-f丐粘着蛋白(印ithelium(E)-cadherin)被表达，并且已知作为全能干细胞标记物的SSEA4、0ct-4、Tra-1-60和Tra_l_81也被表达(图11)。此外，关于干细胞的分化能力，羊膜上皮细胞具有与现有技术中已知的胚胎干细胞最相似的特性，因此本发明的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞也具有类似于胚胎干细胞的分化能力，即分化成内胚层、中胚层和外胚层细胞的能力。在本发明的实施例6中，本发明的成人干细胞分化成中胚层来源的成脂肪细胞、成骨细胞和成肌细胞以及外胚层来源的神经细胞的能力得到证实。在又一方面，本发明涉及用于治疗身体中和身体表面上的伤口的细胞治疗剂，其含有成人干细胞作为活性成分。本文中，术语"伤口"的意思是通过破坏结构的连续性的物理方式引起的身体伤害，并且指的是包括皮肤、粘膜或骨组织的破坏、切割或者破裂等。除静脉内或肌肉内注射形式的非肠道给药以外，本发明的含有成人干细胞作为活性成分的用于治疗伤口的细胞治疗剂可直接给药到患病部位。本发明的细胞治疗剂可通过各种途径给药，包括经皮、皮下、静脉内和肌肉内途径。用于非肠胃给药的制剂包括无菌水溶液或者非水溶液、悬液、乳液等。对于非水溶液和悬液来说，可使用丙二醇、聚乙二醇、菜油如橄榄油，可注射脂类诸如油酸己酯(ethyloleate)等。对人类来说，细胞治疗剂一般可以10M(T个细胞/个体的剂量给药，优选106_108个细胞/个体，每天一次或多次给药。9但是，应当理解活性成分的实际剂量应当通过各种相关因素诸如治疗疾病给药途径、患者年龄、性别和体重以及疾病的严重程度来确定。因此，上述活性成分的剂量范围不以任何方式限制本发明的范围。本发明的成人干细胞可有利地用于组织修复和伤口愈合。本发明的具有与胚胎干细胞类似性质的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞具有分化成内胚层、中胚层和外胚层的能力，因此可被用于伤口愈合和组织修复以及再生。另外，成人干细胞可分化、增殖并再生成骨、软骨、肌肉、韧带和/或神经组织，因此作为细胞治疗剂来说是有用的。实施例此后，将参照实施例进一步对本发明进行描述。但是，应当理解的是，这些实施例仅仅用于解释的目的，而不解释为对本发明的范围的限制。在下列实施例中使用的各种培养基和试剂购自在下表1中显示的公司。表1商品商标目录号土昔养基DMEM/F-12Gibco11320EGFSigmaE9644Peprotech100-15Gibco13247-051)87]FBSGibco16000胰岛素SigmaI1882抗坏血酸SigmaA8960抗生素-抗真菌素Gibco15240ROCK抑制剂Y-27632CalbiochemCNB688000SigmaY0503胰蛋白酶溶液胰蛋白酶-EDTAGibco15400L/GDMEMGibco11885缓冲液HBSSGibco14175传代TrypLE-表达Gibco12604DTTDTTGibco15508-01310实施例1:通过使用DTT(二硫苏糖醇)和胰蛋白酶将羊膜上皮细胞从羊膜组织分离根据韩国大学的伦理审查委员会指南(InstitutionalReviewBoardGuidelines)在韩国大学Guro医院从正常出生和早产收集羊膜并将其用于研究目的。将在实验中所需的羊膜组织从胎盘中分离，将分离的组织储存在含抗生素的生理盐水或者DMEM培养基中。称取5g羊膜组织并使用HBSS洗涤。为了羊膜上皮细胞的稳定分离，洗涤步骤使用更类似于人体组分的HBSS缓冲液而不是使用一般的PBS来进行。将洗涤的羊膜组织转移到50-ml管中，并将10mMDTT加入到其中。在使用DTT处理30分钟之后，除去上清液，将羊膜组织精细切割，并在搅拌下使用O.05X胰蛋白酶-EDTA在37t:下将精细切割的羊膜组织处理42分钟，由此将组织化学降解。将化学降解的组织涡旋1分钟，然后通过1-mm筛初步过滤，并经lOO-ym筛进行次级过滤，由此除去没有降解的组织。将过滤的组织ISOOrpm离心10分钟。将底部的单细胞微团悬浮，由此获得羊膜上皮细胞。在显微镜下使用血细胞计数器根据台盼蓝染色法对活细胞视觉计数，结果，分离后立即计数的细胞数为3.72X107个细胞(图1(A))。另一方面，在羊膜细胞从羊膜组织通过单独使用胰蛋白酶处理而不添加DTT进行分离的情况下，分离后立即计数的细胞数为9.25X105个细胞(图1(B))。结果，如图1所示，通过使用DTT(A)和胰蛋白酶处理分离的羊膜上皮细胞的数目和在羊膜上皮细胞培养之后的细胞数(C)显著大于通过单独使用胰蛋白酶而不加入DTT处理(B)分离的羊膜上皮细胞的数目以及对其进行培养之后的数目(D)。通过这一结果发现，当使用DTT处理羊膜组织时，过量细胞裂解可被抑制，另外，干扰此后将要进行的胰蛋白酶处理效果的粘液可被除去，由此进一步增加了羊膜上皮细胞的产量。此外证明，当羊膜上皮细胞的初始产量增加时，通过培养羊膜上皮细胞可得到的成人干细胞的量也显著增加。实施例2:在ROCK抑制剂存在下培养羊膜上皮细胞2-1:羊膜上皮细胞培养将得到的羊膜上皮细胞在含有1:lDMEM(DulbeccomodifiedEaglemedium)和F-12(营养混合物)的混合物组成的培养基(Gibco)中培养，其中加入了下表2中显示的浓度的FBS、抗坏血酸、表皮生长因子、胰岛素，抗生素和10iiM的ROCK抑制剂Y_27632。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>培养3天后，使用HBSS缓冲液洗涤来自培养的羊膜上皮细胞的成人干细胞，然后37。C下使用TrypLE-表达(Gibco)或者0.25%胰蛋白酶-EDTA培养10分钟。将含有FBS的培养基加入到其中使胰蛋白酶失活，然后得到来自羊膜上皮细胞的5X10e个干细胞并将其接种到新鲜培养基中并进行传代。对于用于传代的每次重新接种，将10yMROCK抑制剂加入到新鲜培养基中。根据上述步骤进行的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的培养结果在图2中显示。从图2中可以看出，在加入ROCK抑制剂之前，成人干细胞的数目减少，但当羊膜上皮细胞分离4天之后加入R0CK抑制剂培养时，成人干细胞的数目迅速增加。2-2:干细胞在各种浓度ROCK抑制剂存在下增殖的能力比较为了检查来自羊膜上皮细胞的成人干细胞在各种浓度ROCK抑制剂下增殖的可能性，将在实施例1中得到的羊膜上皮细胞在含有FBS、抗坏血酸、表皮生长因子、胰岛素和抗生素的DMEM/F-12培养基中传代，其中已加入了各种浓度100iiM、10iiM、liiM、100nM和10nM的ROCK抑制剂Y_27632。在传代1天和4天之后，对于成人干细胞培养的最佳ROCK抑制剂Y-27632的浓度被检查。结果，如图3和图4所示，在使用10nMROCK抑制剂处理的组中，增殖程度与没有使用ROCK抑制剂处理的对照组中没有很大不同，并且在使用100iiMROCK抑制剂处理的组中，细胞的增殖显著增加，但细胞形态变化或者细胞分化出现。因此认为，ROCK抑制剂的优选浓度为10nM到100iiM的范围，并且最优选浓度大约为10iiM。比较实施例1:加入ROCK抑制剂对于促进干细胞增殖的影响为了检查ROCK抑制剂的效果，将在实施例1中得到的4X106个羊膜上皮细胞在含有FBS、抗坏血酸、表皮生长因子、胰岛素和抗生素的培养基中传代4天。然后，将细胞分别接种到含有10PMROCK抑制剂Y-27632的培养基中和不含ROCK抑制剂的培养基中，并在接种之后1天、2天和3天进行观察。结果，从图5中可以看出，当得到的羊膜上皮细胞在不存在ROCK抑制剂的情况下进行培养时，成人干细胞的增殖由于凋亡而非常缓慢。但是，当将羊膜上皮细胞在ROCK抑制剂存在的情况下进行培养时，羊膜上皮细胞的凋亡被抑制，成人干细胞的增殖显著增加。在传代中已经常规使用的胰蛋白酶处理存在的问题在于，培养效率由于胰蛋白酶的毒性而降低，但能够看出加入ROCK抑制剂通过防止由胰蛋白酶处理而引起的凋亡并抑制细胞分化而活化了成人干细胞的增殖，同时其帮助未分化成人干细胞的稳定增殖。实施例3:根据ROCK抑制剂处理阶段的干细胞增殖能力的比较为了进一步提高在实施例1中得到的羊膜上皮细胞的增殖能力，对在胚胎干细胞研究(Watanabe等人，NatureBiotechnology,25:681，2007)中使用的方法以及在培养过程中加入ROCK抑制剂的方法进行比较。换言之，将在重新接种之前仅仅加入lOiiMROCK抑制剂的培养物与甚至在重新接种之后加入ROCK抑制剂的培养物进行比较。结果，如从图6中看到的那样，在重新接种之前仅仅使用ROCK抑制剂处理的情况(A)下，来自羊膜干细胞的成人干细胞的增殖能力与没有使用ROCK抑制剂处理的对照组相比明显增加。同时，在重新接种和培养过程中连续加入ROCK的情况(B)下，成人干细胞的增殖能力与仅仅在重新接种之前加入ROCK抑制剂的情况(A)下相比更好。换言之，在甚至在重新接种之后培养过程中练习加入ROCK抑制剂的情况(B)下，来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的增殖能力更显著地增加。实施例4:在羊膜上皮细胞培养过程中通过培养基更换的干细胞增殖能力的增加12在实施例1中得到的羊膜上皮细胞在DMEM培养基和K-SFM培养基中分别培养3天、6天和8天。将DMEM培养基添加有FBS、表皮生长因子、抗坏血酸、非必需氨基酸和抗生素，将K-SFM培养基添加FBS、表皮生长因子、抗坏血酸、氢化可的松、NAC、胰岛素和抗生素。结果，如图7所示，观察到来自羊膜上皮细胞的成人干细胞在DMEM培养基中的增殖能力高于在K-SFM培养基中的增殖能力。同时，为大量生产来自羊膜上皮细胞的成人干细胞进行多种实验。结果，如从图8中看到的那样，在初次传代中将匿EM培养基替换成K-SFM培养基增加了来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的增殖。另外，将成人干细胞在DMEM培养基中培养4天并观察时，干细胞几乎以相同的速度增殖。此外，当在初次传代4天后将匿EM培养基替换成K-SFM培养基，并且细胞在更换的培养基中培养2天之后，与单独在匿EM培养基中培养而不更换培养基的成人干细胞相比，在更换的K-SFM培养基中培养的成人干细胞显示了更高的增殖能力。实施例5:来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的特性5-1:表面抗原表达的流式细胞计数分析在实施例2中培养的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的特征在于表面CD系列抗原标记物。CD9(表皮细胞，粘着)、CD29(单核细胞标记物)、CD31(内皮细胞和干细胞标记物)、CD34(造血干细胞标记物)、CD45(PTPR、ASV、白细胞标记物)、CD49f(整合素a6标记物，integrina6marker)、CD73、CD90(单核干细胞标记物)、CD105(TGFP1标记物)和CD133(造血干细胞标记物)被应用于FACS分析。将在实施例2中得到的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞使用PBS洗涤并使用胰蛋白酶处理。然后，收集细胞并1500rpm离心5分钟。除去上清液之后，将细胞加入到封闭缓冲液(5%血清(正常羊血清+正常马血清)中并在fC下培养60分钟，接着1500rpm离心5分钟。在除去上清液之后，将细胞悬浮在PBS中并以与阴性对照以及CD抗原标记物密度相同的1X105个细胞的细胞密度分散到每孔中。将R-藻红蛋白(PE)/FITC(荧光异氰酸酯)_结合的鼠抗人类单克隆抗体加入到每个孔中，并且将细胞在fC培养40分钟。在培养后，将细胞1500rpm离心3分钟。除去上清液之后，使用PBS洗涤细胞并1500rpm离心3分钟。然后，在除去上清液之后，使用PBS洗涤细胞并1500rpm离心3分钟。在除去上清液之后，使用流式细胞计数器对细胞进行分析。将细胞使用FITC(荧光异氰酸酯)_结合的抗人CD9(Becton-Dickinson)、CD34(Becton-Dicki固n)、CD45(Becton-Dicki固n)、CD105(Becton-Dicki固n)禾口PE(藻红蛋白)_结合的抗人CD29(Becton-Dickinson)、CD31(Becton-Dickinson)、CD49f(Becton-Dickinson)、CD73(Becton-Dickinson)、CD90(Becton-Dickinson)禾口CD133(Miltenyibiotec)染色。副本样品被用作无染色对照组以保证专一性。结果，如图9和图10所示，关于免疫学特性，来羊膜上皮细胞的成人干细胞对CD9、CD29、CD49f、CD73、CD90和CD105呈阳性、对CD31、CD34、CD45和CD133呈阴性。5-2:来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的干性将在实施例2中得到的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞使用PBS洗涤三次并在室温下使用含有PBS的多聚甲醛固定30分钟。在使用PBS将细胞洗涤三次每次三分钟之后，使用含有PBS的Triton-X100在室温下将细胞透化10分钟。在使用PBS将细胞洗涤三次每次三分钟之后，在封闭缓冲液(2.5%血清溶液，NSG+NHS)中在室温下将细胞培养30分钟，并使用含有PBS的初级抗体在室温下培养1小时。使用PBS将细胞洗涤三次每次五分钟，并使用次级抗体在室温黑暗条件下温育30分钟。使用PBS洗涤细胞3次，然后固定。检查由此得到的细胞的SSEA4，0ct-4，Tra-l-60，Tra-l-81，细胞角蛋白和E-钙粘着蛋白专一性。结果，如图11所示，根据本发明的成人干细胞对于可被认为是未分化细胞标记物即干细胞标记物的SSEA4、0ct-4、Tra-l-60和Tra_l_81呈阳性。而且，成人干细胞对于可被认为是上皮细胞标记物的细胞角蛋白和E-钙粘着蛋白呈阳性。5-3:来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的形态学特性将在实施例2中得到的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞从培养箱中取出并在ZeissAxiovert200荧光显微镜下在100X放大倍数下观察。而且，使用安装在显微镜上的AxioCamMRmCCD对细胞进行拍照。使用提供的AxioVisionver.4.5软件对细胞直径进行测量，细胞核的尺寸以及细胞质的大小通过照片进行检查，从而测定羊膜上皮细胞来源的干细胞的形态。结果，如图12所示，根据本发明的成人干细胞保持长方体或立方体略圆上皮细胞的典型形态，并且在培养过程中细胞的尺寸(直径)大约为5-10ym。实施例6:来自羊膜上皮细胞的成人干细胞的分化6-1:分化成脂肪细胞将在实施例2中得到的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞在脂肪形成诱导培养基(NonhematopoieticAdipoDiff培养基；MiltenyiBiotec)中培养3周(37°C;5%C02;培养基更换周期3-4天)以诱导多能干细胞分化成脂肪细胞。培养开始之后21天(3周)，使用油红O染色法对细胞进行分析。结果，可以观察到根据本发明的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞分化成脂肪细胞(图13)。6-2:分化成成骨细胞将在实施例2中得到的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞在成骨诱导培养基(nonhematopoieticosteoDiff培养基，MiltenyiBiotec)中培养两周(37°C;5%C02;培养基更换周期3-4天)以诱导多能干细胞分化成成骨细胞。培养开始之后14天(2周)，使用茜素红S染色法对细胞进行分析。结果可以观察到，来自羊膜上皮细胞的成人干细胞分化成成骨细胞(图13)。6-3:分化成成肌细胞将在实施例2中得到的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞在成肌诱导培养基(SkeletalMuscleCell培养基，L0NZA)中培养三周(37°C;5%C02;培养基更换周期3-4天)。培养开始之后21天(3周)，对细胞进行免疫染色。结果，根据本发明的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞显示对于作为骨骼肌细胞专一性抗原的肌球蛋白成阳性染色。这表明根据本发明的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞分化成肌细胞(图13)。6-4:分化成神经细胞将在实施例2中得到的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞在神经发生诱导培养基(NeuralProgenitorMediaSystems,L0NZA)中培养2周(37°C;5%C02;培养基更换周期3-4天)以诱导分化成神经细胞。培养开始之后14天(2周)，对细胞进行免疫染色。结果，如图14所示，根据本发明的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞显示对于在神经系统中对星状细胞专一的抗原GFAP(glialfibrillaryacidicprotein)、01(oligodendrocytemarker)禾口MAP2(microtubuleassociatedprotein)的阳性染色。这表明根据本发明的来自羊膜上皮细胞的成人干细胞分化成神经细胞。实施例7:伤口愈合效果的评估将来自羊膜上皮细胞的成人干细胞通过皮内途径给药到无胸腺裸鼠伤口模型，然后将其伤口愈合能力与使用生理盐水的对照组进行比较。作为受试动物，使用4-5周龄Bald/c-皿Sic无胸腺裸鼠(中心实验动物公司，韩国)并将其分成两组，如下表3所示。表3组剂量体积(ul)动物编号给药途径对照050(生理盐水)6皮内AEpSC2X1()5细胞50(生理盐水)3皮内在将动物分成如表3中所示的2组之后，将个体识别卡附着在饲养笼上，并且将每个动物分别在每个饲养笼中单独喂养以便识别每个动物个体。作为测试材料，在测试开始30分钟之前，在净化操作台上在29G胰岛素注射器中制备50ii1生理盐水和50ill2X105个细胞的AEpSC的每种。外科手术前1小时，测定每个动物的体重，以抗生素和麻醉剂给药。然后，将每个受试动物的背部中央部分使用酒精棉消毒，并在中央背部使用5mm直径活检冲头形成全厚度伤口。在形成伤口之后立即将制备的50ia测试材料全部注射到靠近伤口的三个皮内部位。注射部位与伤口周边间隔大约1cm以便使测试材料经过伤口表面的损失最小化。为了检查伤口愈合效果，每天检查一次或多次动物的状况，并在外科手术之后3天、6天、7天、9天和14天立即对伤口部分进行拍照。分析结果在图15中显示。图15通过将与伤口尺寸相同圆形滤纸置于伤口上将伤口与作为参考像素区的圆形滤纸一起拍照得到。结果，如图15所示，可以观察到来自羊膜上皮细胞的干细胞给药组的伤口愈合速度高于生理盐水给药组的伤口愈合速度。另外，在诱导的伤口完全康复的外科手术之后21天，将受试动物进行解剖并进行皮肤活检。在诱导伤口康复之后在每组中组织活检的结果在图16中显示。如图16所示，在对照组的皮肤中，仅仅存在纤维组织团，相反，在使用羊膜上皮干细胞给药的组中，在康复的皮肤组织中观察到大量的皮肤附属物诸如毛囊和汗腺。通过这些结果可以发现，根据本发明的羊膜上皮干细胞起到促进皮肤组织表皮再植的作用，并促进了皮肤附属物的再生。工业实用性如上面详细描述的那样，与现存治疗性干细胞诸如脐带血干细胞和骨髓干细胞相15比，根据本发明的来自人羊膜上皮细胞的干细胞很容易被提取，其最初的产量通过DTT处理而增加，并且通过在含有ROCK抑制剂的培养基中培养它们显著增加了其增殖率。因此，本发明的方法可用于有效制备作为细胞治疗剂有用的成人干细胞。虽然已经参照特性特征对本发明进行了详细描述，但对本领域技术人员来说显而易见的是，该描述仅仅用于优选实施方式，而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由所附的权利要求书及其等同物来限定。权利要求一种分离羊膜上皮细胞的方法，包括下列步骤使用二硫苏糖醇处理人羊膜组织；并使用0.025-0.125％的胰蛋白酶处理经二硫苏糖醇处理的羊膜组织。2.根据权利要求1所述的分离羊膜上皮细胞的方法，其特征在于，进一步包括对经胰蛋白酶处理的人羊膜组织进行涡旋的步骤。3.根据权利要求1所述的分离羊膜上皮细胞的方法，其特征在于，所述二硫苏糖醇的浓度为5-50mM。4.一种制备来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞的方法，该方法包括下列步骤在含有Rho-相关激酶抑制剂的培养基中培养根据权利要求1所述的方法分离的上皮细胞；并从培养液中收集干细胞。5.—种增殖并保存来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞的方法，该方法包括在含有Rho-相关激酶抑制剂的培养基中对根据权利要求4所述的方法制备的来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞进行传代。6.根据权利要求4或5中任一项所述的方法，其特征在于，所述Rho-相关激酶抑制剂的浓度为10nM到100iiM。7.根据权利要求4或5中任一项所述的方法，其特征在于，所述Rho-相关激酶抑制剂为由下列结构式表示的化合物8.根据权利要求4或5中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基是杜尔贝克改良伊格尔培养基或者无角化细胞血清培养基。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养基在成人干细胞初次传代中由杜尔贝克改良伊格尔培养基更换成无角化细胞血清培养基。10.根据权利要求4或5中任一项所述的的方法，其特征在于，所述培养基为由1:1的杜尔贝克改良伊格尔培养基和营养混合物F-12构成的Gibco混合培养基。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述培养基另外含有抗坏血酸、表皮生长因子、胰岛素、抗生素和胎牛血清。12.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述传代过程中将来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞重新接种在培养基上时加入Rho-相关激酶抑制剂。13.—种来自人羊膜上皮细胞的成人干细胞，其通过根据权利要求4所述的方法制备，其特征在于(a)具有圆的简单立方体形态学特征；(b)具有免疫学特征，对CD9、CD29、CD49f、CD73、CD90和CD105呈阳性，对CD31、CD34、CD45和CD133呈阴性;(c)对SSEA4、0ct-4、Tra-l-60和Tra-1-81表达；并且(d)对细胞角蛋白(cytokeratin)和上皮-钙粘着蛋白表达。14.一种用于伤口愈合的细胞治病U，其含有丰離权利要求13戶腿的j^A干细胞作为活性成分。全文摘要本发明涉及高产量分离并培养来自人羊膜的成人干细胞的方法，具体涉及获得大量成人干细胞的方法，所述方法包括通过使用二硫苏糖醇(DTT)和低浓度胰蛋白酶处理从人羊膜组织以高产量获得羊膜上皮细胞，并在含有Rho-相关激酶抑制剂(Rho-associatedkinaseinhibitor)的培养基中培养所述羊膜上皮细胞。与现有治疗性干细胞诸如脐带血干细胞以及骨髓干细胞相比，来自人羊膜上皮细胞的干细胞容易提取，其生产和增殖通过DTT处理、加入ROCK抑制剂或者更换培养基而显著增加。因此，该方法可被用于有效制备成人干细胞。文档编号C12N5/00GK101765657SQ200880024259公开日2010年6月30日申请日期2008年1月10日优先权日2007年11月9日发明者于相奎,江成根,申一燮,罗正灿申请人:Rnl生物技术株式会社