专利名称：突变型dna聚合酶及相关方法
技术领域：
本发明涉及DNA聚合酶领域及它们的各种应用，包括核酸的引物延伸与扩增。
背景技术：
DNA聚合酶负责基因组的复制和维护，这是在世代间精确传递遗传信息的中心职 责。DNA聚合酶在细胞中的功能是作为负责DNA合成的酶。它们在有金属活化剂诸如Mg2+ 存在的情况下，以被复制的DNA模板或多核苷酸模板支配的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷 酸。在体内，DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程，包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩 增。在每一 DNA合成过程期间，复制DNA模板一次或最多几次产生一致的复制品。与此相 反，在体外，DNA复制可以重复多次，例如在聚合酶链式反应期间(参见例如Mullis的美国 专利号 4，683，202)。在聚合酶链式反应(PCR)的最初研究中，DNA聚合酶是在DNA复制的每一循环开 始时添加(参见上述美国专利号4，683，20 。后来，确认了从在高温下生长的细菌中可获 得热稳定DNA聚合酶，这些酶只需要添加一次(参见Gelfand的美国专利号4，889，818和 Mullis的美国专利号4，965，188)。在PCR期间使用的高温下，这些酶没有不可逆失活。因 此，可以进行聚合酶链式反应的重复循环而不需要在每一合成加成过程开始时添加新鲜的 酶。DNA聚合酶特别是热稳定聚合酶，是重组DNA研究和疾病的医疗诊断中大量技术的关 键。特别是对于诊断应用，靶核酸序列可能仅仅是所考察(in question) DNA或RNA的一小 部分，因此不扩增的话可能难以检测到靶核酸序列的存在。聚合酶的总体折叠模式类似人的右手，包括手掌、手指和拇指三个独特的亚结 构域。(参见 Beese 等，Science 260 :352-355,1993) ；Patel 等，BioChemistry 34 5351-5363,1995)。尽管在大小和细胞功能不同的聚合酶之间手指和拇指亚结构域的结 构变化很大，但催化性的手掌亚结构域全部都是重叠的(superimposable)。例如，与引 入的dNTP相互作用并在化学催化作用期间稳定过渡态的基序A是重叠的，在哺乳动物 ρο α和原核生物的pol I家族DNA聚合酶之间的平均偏差大约为1人(Wang等，Cell 89 1087-1099,1997)。在结构上基序A以主要包括疏水性残基的反向平行β链起始，延续 到α-螺旋。DNA聚合酶活性位点的主要氨基酸序列是特别保守的。基序A的例子中，例 如，序列DYSQIELR(SEQ ID NO :30)保留在从数百万年进化的生物体包括例如水生栖热菌 (Thermus aquaticus)、沙目艮衣原体(Chlamydia trachomatis)禾口大肠杆菌(Escherichia coli)分离的聚合酶中。把这些观察结果联系在一起，它们指出聚合酶通过类似的催化机理 行使功能。除了高度保守之外，DNA聚合酶的活性位点也被证明是相对易变的，能够接受 特定的氨基酸取代而不显著降低DNA聚合酶活性。(参见例如I^atel等的美国专利号 6，602，695)。这样的突变型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反应的诊断和研究应用中 提供各种选择优势。本发明，如同在此阐述的，满足这些及其它需要。发明概述本发明提供了相对于相应的未经修饰的聚合酶具有改良的酶活性的DNA聚合酶，它可以用于多种核酸合成应用中。在一些实施方式中，聚合酶是分离的或纯化的。在一些 实施方式中，DNA 聚合酶包含氨基酸序列 A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9-Xltl-X11-L-X 12-X13-X14-X15(SEQ ID N0:1)，其中X2, X5, X6, X9,和 Xltl 是任何氨基酸，&是!^或0， 是N 或H，)(4是1^ 或 I，X7 是 D，K 或 T，)(8是1^ 或 V，X11 是 V，I 或 L，父12是？或Y，X13是0或E之外的氨基酸，)(14是1(或 E，并且X15 是 L 或 Q ；其中该聚合酶相对于)(13是D或E而其它方面相同的DNA聚合酶具有改良的核酸延 伸速率。X5, X6, X9和)(1(1可以是任何氨基酸优选，该突变型聚合酶在位点)(13具有G (SEQ ID N0:33)。在一些实施方式中，该突变型聚合酶在位点X13具有R或K。在进一步优选的 实施方式中，&选自P，A，E，T和VJ5选自N，R，G和SJ6选自R，P，S和T，X9选自E，G，Q， S 禾口 A，X1。选自 R，T，A，V, Y，S 禾Π N，和 / 或 X13 选自 Α，C，F，G，H，I，K，L，Μ，N，P，Q，R，S， T，V，W或Y，最优选)(13是6。在一些实施方式中，本发明的DNA聚合酶是未经修饰的聚合酶的修饰形式。在它 的未经修饰的形式中，聚合酶一般是功能性的，具有核苷酸掺入活性，并且在聚合酶结构域 中包括具有以下基序的氨基酸序列A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9-X10-X11-L-X12-X13-Xi4-Xi5 (SEQ ID NO 29)； 其中&，X5, X6, X9,和X10是任何氨基酸；&是H，E或Q成是N或H式是L或I ;X7是D，K 或T成是L或V ；X11是V，I或L ；X12是F或Y ；X13是D或E ；X14是K或E ；X15是L或Q。该突变型聚合酶(即，从SEQ ID NO 29修饰)的进一步特征在于相对于它的未经 修饰的形式，它至少在位点)(13包括氨基酸取代，并且相对于其未经修饰的形式具有改良的 核酸延伸速率。在一些实施方式中，该突变型聚合酶在位点X13具有D或E之外的氨基酸。 优选，该突变型聚合酶在位点)(13具有G。在一些实施方式中，该突变型聚合酶在位点)(13具 有R或K。多种DNA聚合酶适于根据本发明的突变。尤其适宜的是热稳定聚合酶，包括来 自各种嗜热菌(thermophilic bacteria)的野生型或天然存在的热稳定聚合酶，以及通 过氨基酸取代、插入或缺失或其它修饰来源于上述野生型或天然存在的酶的热稳定聚合 酶。示例性的聚合酶的未经修饰形式包括例如CS5或CS6 DNA聚合酶，或与其具有至少 80%、85%、90%或95%的序列同一性的功能性DNA聚合酶。其它未经修饰的聚合酶包括 例如来自于下列任何种类嗜热菌的DNA聚合酶(或与所述聚合酶具有至少90%的序列同 一性的功能性DNA聚合酶)海栖热袍菌(Thermotoga maritima)；水生栖热菌(Thermus aquaticus) ；口誉热栖热菌(Thermus thermophilus)；黄栖热菌(Thermus flavus)；丝状 热菌(Thermus filiformis)；栖热菌禾中 spsl7 (Thermus sp. spsl7)；栖热菌禾中 Z05 (Thermus sp.Z05)；那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeopolitana)；非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus) ；ThermuscaldophiIus S^^M^ifelf lif (Bacillus caldotengix)。
的 酶还包括那些具有逆转录酶(RT)活性和/或能够掺入非常规核苷酸诸如核糖核苷酸或其 它2'-修饰的核苷酸的聚合酶。在一些实施方式中，聚合酶未经修饰的形式包括嵌合聚合酶。在一个实施方式中， 例如，嵌合聚合酶未经修饰的形式是CS5 DNA聚合酶(SEQ ID N0:20)，CS6 DNA聚合酶(SEQ ID N0:21)或与CS5 DNA聚合酶或CS6 DNA聚合酶具有至少90%的序列同一性的聚合酶。 在一些特定的变型中，嵌合聚合酶未经修饰的形式包括相对于SEQ ID N0:20或SEQ ID NO: 21的选自G46E、L329A和E678G的一个或更多个氨基酸取代。例如，突变型聚合酶未经修饰 的形式可以是G46E CS5 ；G46EL329A CS5 ；G46E E678G CS5 ；或G46E L329A E678G CS5。在示 例性的实施方式中，这些未经修饰的形式被取代以提供具有E558G取代的突变型聚合酶。 例如，所述突变型DNA聚合酶可以是下列的任何一个G46E E558G CS5 ；G46E L329A E558G CS5 ；G46E E558G E678G CS5 ；G46E L329A E558G E678G CS5 ；等等。在一些实施方式中，未经 修饰的形式的嵌合聚合酶包括相对于SEQ ID N0:20或SEQ ID NO :21的一个或更多个氨基 酸取代，所述一个或更多个氨基酸取代选自S671F，D640G，Q601R，和I669F。例如，未经修饰 的形式的突变型聚合酶可以是 S671FCS5 ；D640G CS5 ；Q601R CS5 ；I669F CS5 ；S671F D640G CS5 ；S671FQ601R CS5 ；S671F I669F CS5 ；D640G Q601R CS5 ；D640G I669F CS5 ；Q601R I669F CS5 ；S671F D640G Q601R CS5 ；S671F D640G I669F CS5 ；S671F Q601R I669F CS5 ；D640G Q601R I669F CS5 ；或S671F D640GQ601R I669F CS5。在示例性的实施方式中，这些未经修 饰的形式被取代以提供具有E558G取代的突变型聚合酶。例如，突变型DNA聚合酶可以是 下列中的任一 :E558G S671F CS5 ；E558G D640G CS5 ；E558GQ601R CS5 ；E558G I669F CS5 ； E558G S671F D640G CS5 ；E558G S671FQ601R CS5 ；E558G S671F I669F CS5 ；E558G D640G Q601R CS5 ；E558GD640G I669F CS5 ；E558G Q601R I669F CS5 ；E558G S671F D640GQ601R CS5 ；E558G S671F D640G I669F CS5 ；E558G S671F Q601R I669FCS5 ；E558G D640G Q601R I669F CS5 ；E558G S671F D640G Q601RI669F CS5 ；等等。在一些实施方式中，未经修饰的 形式的嵌合聚合酶包括相对于SEQ ID N0:20或SEQ ID NO :21的一个或更多个选自G46E， L3^A，和E678G的氨基酸取代，并且进一步包括相对于SEQ ID NO 20或SEQ ID NO 21的 一个或更多个选自S671F，D640G，Q601R，和I669F的氨基酸取代。例如，未经修饰的形式的 突变型聚合酶可以是G46EL3^A S671F E678G CS5 ；等等。在示例性的实施方式中，这些未 经修饰的形式被取代以提供具有E558G取代的突变型聚合酶。例如，突变型聚合酶可以是 E558G G46E L329A S671F E678G CS5 等等。DNA聚合酶酶活性可以利用其它非取代修饰被进一步改良。一种这样的修饰是热 可逆的共价修饰，它使酶失活，但是在高温，诸如通常用于引物延伸的温度下孵育其被逆转 而激活酶。在一个实施方式中，包括热可逆的共价修饰的DNA聚合酶由热稳定DNA聚合酶 和具有下列式I或II之一的二羧酸酐的混合物在碱性PH和低于约25°C的温度下进行的反 应产生
权利要求
1.DNA 聚合酶，其包括 A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9-Xltl-X11-L-X12-X13-X14-X15 ( SEQ ID NO :33)，其中X2，X5, X6, X9，和X10是任何氨基酸，X3是N或H， X4是L或I， 乂7是0，1(或1\ &是L或V， X11 是乂，I 或 L， 父12是？或Y， X13 是 G, X14 是K 或EjP X15是L或Q ；其中所述聚合酶相对于)(13为D或E而其它方面相同的DNA聚合酶具有改良的核酸延 伸速率。
2.权利要求1的DNA聚合酶，其中 & 选自 P，A，E，T，和 V ；&选自N，R，G，和S; & 选自 R，P，SJPT; X9 选自 E，G，Q，SdPAdP X1。选自 R，T，A，V，Y，S，和 N。
3.权利要求1的DNA聚合酶，其中所述聚合酶包括嵌合聚合酶。
4.权利要求3的DNA聚合酶，其中所述嵌合聚合酶与CS5DNA聚合酶(SEQ ID NO 20) 或CS6DNA聚合酶(SEQ ID NO 21)具有至少90%的序列同一性。
5.权利要求3的DNA聚合酶，其中所述嵌合聚合酶包含 SEQ ID NO 20 或 SEQ ID NO :21，或相对于 SEQ ID NO 20 或 SEQ ID NO 21 包含 一个或更多个选自G46E、L3^A、和E678G的氨基酸取代；并且 相对于 SEQ ID NO 20 或 SEQ ID NO 21 包括 E558G 改变。
6.权利要求1的DNA聚合酶，其进一步包含热可逆共价修饰。
7.重组核酸，其编码根据权利要求1的DNA聚合酶。
8.表达载体，其包含权利要求7的重组核酸。
9.宿主细胞，其包含权利要求8的表达载体。
10.生产DNA聚合酶的方法，所述方法包括在适合编码突变型DNA聚合酶的核酸表达的条件下，培养权利要求9的宿主细胞。
11.实施引物延伸的方法，其包括在适合引物延伸的条件下，使权利要求1的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板和游离核 苷酸相接触，从而产生延伸的引物。
12.权利要求11的方法，其中所述多核苷酸模板是RNA或DNA。
13.根据权利要求11的方法，其中所述游离核苷酸包括非常规核苷酸，所述非常规核苷酸包括核糖核苷酸或标记的核苷酸。
14.权利要求11的方法，其包括在适合多核苷酸扩增的条件下，使DNA聚合酶与引物 对、多核苷酸模板和游离核苷酸相接触。
15.生产延伸的引物的试剂盒，包括至少一个提供根据权利要求1的DNA聚合酶的容器， 选自下列的一个或更多个另外的容器(a)提供在引物延伸条件下能够与预定的多核苷酸模板杂交的引物的容器；(b)提供游离核苷酸的容器；和(c)提供适合引物延伸的缓冲剂的容器。
全文摘要
公开了相对于相应的未经修饰的聚合酶具有改良的延伸速率的突变型DNA聚合酶。突变型聚合酶能够用于公开的多种引物延伸方法。还公开了相关的组合物，包括能够用于，例如，突变型DNA聚合酶生产的重组核酸、载体以及宿主细胞。
文档编号C12N9/12GK102099464SQ200880024461
公开日2011年6月15日 申请日期2008年7月12日 优先权日2007年7月13日
发明者D·H·格尔范德, K·A·鲍尔 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司