专利名称：：钩藤属植物的种的鉴别方法
技术领域：
：本发明涉及通过基因学方法鉴别钩藤属植物的种的方法。
背景技术：
：钓藤钩是收载在日本药典第14版第1增补本中的生药，据其记载，钩藤(UncariarhynchophyllaMiquel)、华钩藤(UncariasinensisHaviland)禾口大口十钩藤(UncariamacrophyllaWallich)3个种是其基原植物。然而，在中国分布着11种钩藤属植物(HsueH.&WuH.，1999.UncariainLoH.ed.FloraReipublicaePopularisSinicae71(1)SciencePress,Beijing)，还流通着源自上述3个种以外的种的生药。但是，鉴别这样的生药和含有上述3个种的钩藤属植物的真正的生药比较困难。因此，作为钓藤钩的中药制剂，其品质稳定性存在问题。关于此问题，有通过化学成分和解剖学特征对分布在中国的钩藤属植物进行鉴别的技术的报告(榊原等(1999)植物研究杂志74:42-52)，但人们需要以更高精度鉴别钩藤属植物的种的方法。近年来的分子遗传学的发展对生物分类学中的方法论产生了很大影响。S卩，除至今为止的形态学分类以外，也能够通过选择某特定的基因，比较生物种的碱基序列，从基因的类似性推断其进化过程，从而进行分类。由生物种产生的基因的差异的大小多种多样，在对承担基本生命活动的蛋白质进行编码的基因中，它被令人惊奇地保存，另一方面，在许多基因中，它随着各蛋白质功能的分散而变化，甚至连判断是否为同一起源也很困难。因此，根据作为分类对象的生物种的范围，选择适当的基因区域，能够进行例如从鲸和其它哺乳类的关系那样大范围的近缘关系到乌鸦的地域差那样的被高度限定的范围内的详细分类。作为一般最常用于这种进化上的相对距离的推定以及分类的基因，有大量关于核糖体RNA基因(BruceAlbertsetal.，EssentialCellBiology,GarlandPublishingInc.，439-440，1998)和线粒体基因(宝来聪、细胞工学、14巻、10311035、1995)等的报告。真核生物核糖体RNA中，由RNA聚合酶转录的RNA被加工，分成若干片段，组入构成核糖体的小亚单位(SS;SmallSubunit)和大亚单位(LS;LargeSubunit)中。如果组入小亚单位中的RNA被称为18SrRNA，由约1900(酵母)2000碱基(人)组成，如果组入大亚单位中的RNA为28SrRNA和5.8SrRNA两种，28SrRNA由约4700(酵母)至5000碱基组成，5.8SrRNA由约160碱基(酵母或人)组成。对这些进行编码的DNA，在rRNA基因上、即在编码核糖体RNA的核核糖体DNA上，按照18S、5.8S、28S的顺序纵向排列，18S和5.8S、5.8S和28S之间由被称为ITS(InternalTranscribedSpacer)的非编码区域分开。编码上述核糖体RNA的核糖体DNA内的ITS在植物中是普遍的，在许多植物中都发现了它的存在。但是，关于许多钩藤属植物的种，还没有通过确定其碱基序列进行分类，然后由此进行种的判别的例子。
发明内容本发明的课题在于提供高精度判别钩藤属植物的种的方法。本发明人的发明人为了解决上述课题进行研究，结果发现在钩藤属植物的核糖体DNA的ITS区域碱基序列上存在种特异的多态，并且，利用该多态，能够鉴别钩藤属植物的种，由此完成了本发明。SP，本发明包括以下的发明。(1)—种鉴别被检试样中含有的钩藤属植物的种的方法，包括将被检试样中含有的植物的核糖体DNA的ITS区域碱基序列与选自序列号111的碱基序列中的至少1个ITS区域的碱基序列进行比较的步骤。(2)如(1)记载的方法，被检试样为生药。(3)如(1)或(2)记载的方法，鉴别被检试样中含有的钩藤属植物是否为钩藤(Uncariarhynchophylla)、华钩藤(Uncariasinensis)、大口十钩藤(Uncariamacrophylla)、鹰爪风(Uncariawangii)、攀枝钩藤(Uncariascandens)、北越钩藤(Uncariahomomella)、毛钩藤(Uncariahirsuta)、披针口十钩藤(Uncarialancifolia)、白钩藤(Uncariasessilif潔tus)、平滑钩藤(Uncarialaebigate)禾口滇钩藤(Uncariayurmanensis)中的任意——禾中。(4)如(1)或(2)记载的方法，鉴别被检试样中含有的钩藤属植物是否为钩藤(Uncariarhynchophylla)、华钩藤(Uncariasinensis)禾口大口十钩藤(Uncariamacrophylla)中的任意一种或者除此之外其他的种。(5)如(4)记载的方法，对选自将序列号1的碱基序列作为参考序列时相当于12位、37位、43位、47位、78位、79位、84位、85位、86位、94位、104位、105位、169位、172位、177位、209位、210位、211位、215位、365位、395位、412位、413位、415位、433位、446位、447位、450位、451位、461位、514位、518位、526位、532位、537位、546位、554位、567位、570位、585位、588位、590位、592位、608位或609位的位置的碱中的至少1个碱基进行比对。(6)如(5)记载的方法，对选自将序列号1的碱基序列作为参考序列时相当于12位、37位、43位、47位、79位、84位、85位、86位、94位、104位、105位、169位、172位、177位、209位、210位、211位、215位、365位、395位、412位、413位、415位、433位、446位、447位、450位、451位、461位、514位、518位、526位、532位、537位、546位、554位、567位、570位、585位、588位、590位、592位、608位或609位的位置的碱中的至少1个碱基进行比对。(7)如(6)记载的方法，对选自将序列号1的碱基序列作为参考序列时相当于12位、37位、43位、85位、94位、104位、169位、177位、209位、211位、215位、412位、413位、415位、450位、461位、532位、537位、585位、588位或608位的位置的碱中的至少1个碱基进行比对。根据本发明，提供一种高精度鉴别钩藤属植物的种的方法。图1表示在属于钩藤属的11个种中，分别关于多个样品确定的核糖体DNA的ITS区域碱基序列进行比对研究而发现的64个变异部位的详细情况。图2-1表示对由表3所示的42种样品得到的ITS区域的碱基序列进行比对的结4果。图2-2表示对由表3所示的42种样品得到的ITS区域的碱基序列进行比对的结果。图2-3表示对由表3所示的42种样品得到的ITS区域的碱基序列进行比对的结果。图2-4表示对由表3所示的42种样品得到的ITS区域的碱基序列进行比对的结果。图2-5表示对由表3所示的42种样品得到的ITS区域的碱基序列进行比对的结果。图2-6表示对由表3所示的42种样品得到的ITS区域的碱基序列进行比对的结果。图2-7表示对由表3所示的42种样品得到的ITS区域的碱基序列进行比对的结果。图2-8表示对由表3所示的42种样品得到的ITS区域的碱基序列进行比对的结果。图2-9表示对由表3所示的42种样品得到的ITS区域的碱基序列进行比对的结果。图2-10表示对由表3所示的42种样品得到的ITS区域的碱基序列进行比对的结果。图2-11表示对由表3所示的42种样品得到的ITS区域的碱基序列进行比对的结果。本说明书包括作为本申请优先权基础的特愿2007-194973号的说明书、附图和权利要求中记载的内容。具体实施例方式核糖体RNA与对所有生物的生命活动不可缺少的蛋白合成相关，众所周知对其进行编码的基因核糖体DNA(rDNA)在大部分生物的基因组内存在多个拷贝，在真核生物中存在数百到数万个拷贝。rDNA在真核生物中一般是对18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA进行编码的区域(分别称为18SrDNA、5.8SrDNA、28SrDNA)连续存在，重复形成重复序列。而且，在18S和5.8S之间、5.8S和28S之间分别存在ITS(IntenalTranscribedSpacer)1和ITS2。在本说明书中，将上述2个ITS和在其间的5.8S总称为ITS区域。核糖体DNA(rDNA)序列在生物分类中被广泛使用。其理由是，大范围保存了真核生物中从最简单的酵母到非常复杂的哺乳动物的信息，另一方面，如一部分ITS那样在加工过程中被舍弃的序列，可以期待某种程度的大变异。如本发明，为了找出杂交种的差异，需要序列间的某种程度的差异，但差异太大时，序列的确定和扩增引物有时会产生问题。在这一点上，在以核糖体DNA的ITS为中心的序列确定中，能够以保存性高的SS区域和LS区域为线索，探索分散度高的ITS。作为钩藤属植物，例如可以列举出钩藤(Uncariarhynchophy1la)、华钩藤(Uncariasinensis)、大口十钩藤(Uncariamacrophylla)、鹰爪风(Uncariawangii)、攀枝5钩藤(Uncariascandens)、北越钩藤(Uncariahomomella)、毛钩藤(Uncariahirsute)、披针叶钩藤(Uncarialancifolia)、白钩藤(Uncariasessilif潔tus)、平滑钩藤(Uncarialaevigata)、滇钩藤(Uncariayu皿anensis)、儿茶钩藤(Uncariagambir)、圭亚纟内钩藤(Uncariaguianensis)禾口绒毛钩藤(Uncariatomentosa)等。本发明的发明人发现，关于在日本药典中记载为生药的钓藤钩的基原植物的钩藤(UncariarhynchophyllaMiquel)、华钩藤(UncariasinensisHaviland)和大叶钩藤(UncariamacrophyllaWallich)3个种、以及分布在中国的其它8个种钩藤属植物，即鹰爪风(Uncariawangii)、攀枝钩藤(Uncariascandens)、北越钩藤(Uncariahomomella)、毛钩藤(Uncariahirsuta)、披针口十钩藤(Uncarialancifolia)、白钩藤(Uncariasessilif潔tus)、平滑钩藤(Uncarialaevigata)、滇钩藤(Uncariayunnanensis)合计11个种，分别使用多个样品，确定核糖体DNA的ITS区域(包括ITS1和ITS2及其之间5.8S的区域)的碱基序列(序列号分别是1253)，进行比对发现，在钩藤属植物的核糖体DNA的ITS区域的碱基序列上存在种特异的多态。S卩，发现通过将被检试样中含有的植物的核糖体DNA的ITS区域的碱基序列，与选自序列号111的碱基序列中的至少1个ITS区域的碱基序列进行比较，可以识别钩藤属植物的种。序列号l表示钩藤(Uncariarhynchophylla)的ITS区域的碱基序列，序列号2表示华钩藤(Uncariasinensis)的ITS区域的碱基序列，序列号3表示鹰爪风(Uncariawangii)的ITS区域的碱基序列，序列号4表示攀枝钩藤(Uncariascandens)的ITS区域的碱基序列，序列号5表示北越钩藤(Uncariahomomella)的ITS区域的碱基序列，序列号6表示毛钩藤(Uncariahirsuta)的ITS区域的碱基序列，序列号7表示披针叶钩藤(Uncarialancifolia)的ITS区域的碱基序列，序列号8表示白钩藤(Uncariasessilifructus)的ITS区域的碱基序列，序列号9表示平滑钩藤(Uncarialaebigate)的ITS区域的碱基序列，序列号10表示大叶钩藤(Uncariamacrophylla)的ITS区域的碱基序列，序列号11表示滇钩藤(Uncariayunnanensis)的ITS区域的碱基序列。根据本发明的方法，可以鉴别至少上述11个种的钩藤属植物的种。本发明的方法对鉴别钩藤(Uncariarhynchophylla)、华钩藤(Uncariasinensis)禾口大叶钩藤(Uncariamacrophylla)3个种特别有用。在本发明中，对钩藤属植物的种的鉴别包括对特定种的鉴别、对非特定种的鉴别、对包括在特定种的群中的鉴别、以及对不包括在特定种的群中的鉴别。例如，在一个实施方式中，本发明的方法可以鉴别被检试样含有的钩藤属植物是否为在日本药典中记载为生药的钓藤钩的基原植物的钩藤(Uncariarhynchophylla)、华钩藤(Uncariasinensis)禾口大口十钩藤(Uncariamacrophylla)3个禾中中的任意1禾中、或其他的种。换言之，可以鉴别被检试样是否为日本药典中的钓藤钩，即真正的生药。作为将被检试样中含有的植物的核糖体DNA的ITS区域碱基序列，与选自序列号111的碱基序列中的至少1个ITS区域的碱基序列进行比较的识别方法，可以利用比较ITS区域的全部碱基序列的方法，比较1数个特定部位的碱基的方法，或组合多个1数个特定部位的碱基的不同、图形化进行比较的方法。作为比较ITS区域的全部碱基序列的方法，有以下方法。即，确定被检试样中含有的植物的核糖体DNA的ITS区域碱基序列，与上述序列号111的碱基序列比较，以其相同性的比例进行判定。一般来讲，生物种即使是接近的种，由于作为对进化过程的反映、其相同性也存在微妙的不同，所以由被检试样得到的碱基序列经常和上述序列号111的碱基序列不100%相同。在这样的情况下，通过求得相同性的比例，可以容易地推测相对的类缘关系。作为确定ITS区域的碱基序列的方法，比如可以从被检试样提取DNA，以此为模板扩增ITS区域，进行直接测序或克隆测序，确定碱基序列。ITS区域的扩增、直接测序、克隆测序以及碱基序列确定都可以通过常规的方法进行。例如在ITS区域的扩增中，除PCR以外，可以利用LAMP法(荣研化学)、ICAN法(宝酒造)等。因此，在一个实施方式中，本发明的方法包括l)从被检试样提取DNA的步骤，2)以该DNA为模板扩增ITS区域的步骤，3)确定ITS区域的碱基序列的步骤，和4)将得到的碱基序列和序列号111的碱基序列中的至少1个进行比较，确定具有最高相同性的钩藤属种的步骤。作为用于扩增ITS区域的引物，可以使用公知的通用引物(WhiteT.J.etal.，1990，AmplificationanddirectsequencingoffungalribosomalRNAgenesforphylogenetics，InPCRProtocols,AGuidetoMethodsandApplications(M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky，andT.J.White,Eds.)pp.315-322.AcademicPress,SanDiego)。用于扩增ITS区域的引物可以以钩藤属植物的核糖体DNA的ITS区域的碱基序列为基础进行设计。引物的设计条件没有特别限定。例如，可以是序列号111所示的任意一个或多个碱基序列或与这些碱基序列互补的碱基序列的一部分，并且设计由10个碱基以上的连续的碱基序列组成的核苷酸。如果不足10个碱基，因为在概率上可以预想在模板DNA上存在多个与该碱基序列互补的碱基序列，因此作为在扩增中使用的引物，其精度下降，所以优选10个碱基以上。另外，即使是用作引物的碱基序列的10%以下数目的碱基被取代、缺失、插入或加成后得到的碱基序列组成的核苷酸，因为能够与模板DNA杂交，所以可以作为引物使用。例如，引物可以使用市售的DNA合成装置等来合成。作为用于扩增钩藤属植物的核糖体DNA的ITS区域的引物的具体例子，可以列举以下的引物。用于一次性扩增ITS区域、即ITS1、5.8S和ITS2的引物，例如可以利用如下的引物组ITS5(5，-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3，)和ITS4(5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')(Whiteetal.1990、上述)。在这里，ITS5和ITS4表示引物的名称。作为分别扩增ITS1和ITS2的引物，例如可以利用如下的引物组ITS2(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')和ITS3(5，-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3')(Whiteetal.1990、上述)。在这里，ITS2和ITS3表示引物的名称。或者，作为在保存于钩藤属植物内的区域中设计的引物，通过使用以下的引物组，可以分别将ITS1和ITS2分成2份、合计分成4份，分别进行扩增。ITS1的扩增…ITS5&ITS-UncariaR2(5'-GAGTTTTCCTTGGCGCGTTCCG_3，)、ITS-UncariaF1(5，-CGCGCGGAAAACGTAACTCAA-3，)&ITS2ITS2的扩增…ITS3&ITS-UncariaRl(5，-ATTCAACCACCACTCGTCGTG-3，)、ITS-UncariaF2(5，-CTAAATGAGAGTCCTCGGCG-3')&ITS4。7本发明的发明人进一步对属于钩藤属的上述11个种，分别关于多个样品确定的核糖体DNA的ITS区域碱基序列进行比对研究，发现了64个变异部位。然后，还发现通过只比较ITS区域中的特定部位的碱基，也能够鉴别钩藤属植物的种。在图1中归纳了关于各个种和样品的上述64个变异部位中的碱基的详细情况。在本发明的碱基序列的比较中，在比较1数个特定部位碱基的不同的方法中，通过比较这64个变异部位的不同，可以鉴别钩藤属的种。S卩，在一个实施方式中，本发明对选自将序列号1的碱基序列作为参考序列时相当于12位、37位、43位、47位、78位、79位、84位、85位、86位、94位、104位、105位、169位、172位、177位、209位、210位、211位、215位、365位、395位、412位、413位、415位、433位、446位、447位、450位、451位、461位、514位、518位、526位、532位、537位、546位、554位、567位、570位、585位、588位、590位、592位、608位或609位的位置的碱基中的至少1个、至少2个或至少3个、优选110个、更优选15个、进一步优选13个碱基进行比对，以此鉴别钩藤属植物的种。其中，优选对选自将序列号1的碱基序列作为参考序列时相当于12位、37位、43位、47位、79位、84位、85位、86位、94位、104位、105位、169位、172位、177位、209位、210位、211位、215位、365位、395位、412位、413位、415位、433位、446位、447位、450位、451位、461位、514位、518位、526位、532位、537位、546位、554位、567位、570位、585位、588位、590位、592位、608位或609位的位置的碱基中的至少1个、至少2个或至少3个、优选110个、更优选15个、进一步优选13个碱基进行比对。在本说明书中，"将序列号1的碱基序列作为参考序列时相当于X位的位置的碱基"这样的表述，用于将序列号1的碱基序列作为参考序列时，指定任意的ITS区域碱基序列中的规定的碱基位置的情形。即，意指将来自被检试样的ITS区域的碱基序列(以下称为碱基序列Y)与序列号1的碱基序列进行比对时，与从序列号1的碱基序列的第1位碱基数起第X位碱基进行比对(即在比对中，排列于同一纵列)的碱基序列Y中的碱基。另外，"将序列号1的碱基序列作为参考序列时相当于v-w位的位置的碱基"这样的表述，意指将序列号1的碱基序列作为参考序列，在将来自被检试样的ITS区域的碱基序列(以下称为碱基序列Y)与序列号1的碱基序列比对时，与从序列号1的碱基序列的第l位碱基数起第V位和第W位碱基进行比对的碱基序列中的2个碱基之间所插入的碱基或者有无插入。将序列号1作为参考序列，如上述所述，表示碱基的位置时，序列号1的517位T的下一个518位缺失，以517位的C的下一个G为519位、以其下一个A为520位。另外，如上所述数起，569位(在序列号1中的第568位碱基)的T下一个570位也缺失，569位的T的下一个G(序列号1中的第569位碱基)成为571位、其下一个A(序列号1中的第570位碱基)成为572位。另外，在本发明中，上述碱基的位置特别是指，使用比对软件BioEdit(http:〃www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.htmt)进行比对时的碱基的位置。BioEdit可以从以下网址(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.zip)下载。序列号1的碱基序列是由ITS1、5.8S和ITS2组成的ITS区域，以ITS1的起始部位作为1位。另外，钩藤属植物的ITS1的起始部位的序列为5'-TCGAATCCTG。序列号1的碱基序列与其它碱基序列的比对也可以以手工作业进行，但是，例如，也可以以默认设定使用多重比对程序(Thompson,J.D.etal，(1994)NucleicAcidsRes.22，p.4673-4680)完成。该程序例如可以从欧洲生物信息学研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute:EBI、http://www.ebi.ac.uk/index,html)禾口国立遗传学石开究所运营的日本DNA数据库(DDBJ、http:〃www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html)的网址上使用。本领域技术人员可以根据需要，将得到的比对结果进一步调整成最适当的比对结果。这样的最适当的比对结果优选考虑碱基序列的类似性和被插入的间隙的频率等来确定。更具体地讲，可以如下进行识别。80位为T(胸腺嘧啶)、和/或215位为T或K(T和G(甘氨酸)的混合碱基序列)时，可以鉴别为钩藤(Uncariarhynchophylla)。215位为A(腺嘌呤)、或415位为T、和/或416位为T时，可以鉴别为华钩藤(Uncariasinensis)。43位为C(胞嘧啶)、或177位为C、和/或532位为C时，可以鉴别为大叶钩藤(Uncariamacrophylla)。只要有1个碱基属于上述情形的话，这些碱基就可以鉴别为特定的种。例如，只要知道序列号1的碱基序列作为参考序列时的85位为T，不用看其它碱基，也可以鉴别为被检试样中含有钩藤(Uncariarhynchophylla)。其它碱基也是同样。537位为T、和/或585位为T时，可以鉴别为钩藤(Uncariarhynchophylla)或华钩藤(Uncariasinensis)中的任意一种。只要有1个碱基属于上述情形的话，这些碱基就可以鉴别为钩藤(Uncariarhynchophylla)或华钩藤(Uncariasinensis)中的任意一种。412位为T，并且37位为A、或94位为A、或413位为A、或450位为A、和/或608位为C时，可以鉴别为钩藤(Uncariarhynchophylla)或华钩藤(Uncariasinensis)中的任意一个。只要有2个碱基属于上述情形的话，即，只要412位为T、并且37位、94位、413位、450位和608位中的任意一个属于上述情形的话，这些碱基就可以鉴别为钩藤(Uncariarhynchophylla)或华钩藤(Uncariasinensis)的任意——禾中。169位为T、或209位为C、和/或211位为C、并且12位为G、或104位为T、或588位为T、和/或590位为T时，可以鉴别为大叶钩藤(Uncariamacrophylla)。只要有2个碱基属于上述情形的话，即只要169位、209位或211位中的任意一个属于上述情形的话，并且12位、104位、588位或590位中的任意一个属于上述情形的话，就能够确认，这些碱基可以鉴别为大叶钩藤(Uncariamacrophylla)。因此，对于被检试样中含有的钩藤属植物为钩藤(Uncariarhynchophylla)、华钩藤(Uncariasinensis)和大叶钩藤(Uncariamacrophylla)中的任意一种或其他的种的识别，可以对选自将序列号1的碱基序列作为参考序列时相当于12位、37位、43位、85位、94位、104位、169位、177位、209位、211位、215位、412位、413位、415位、450位、461位、532位、537位、585位、588位或608位的位置的碱基中的至少1个，例如至少2个、至少3个、优选110个、更优选15个、进一步优选13个，例如1个或2个碱基进行比较来实施。另夕卜，关于钩藤(Uncariarhynchophylla)、华钩藤(Uncariasinensis)和大叶钩藤(Uncariamacrophylla)以外的种，可以通过比较以下部位进行识别。12位为A、或104位为C、或在570位中有T插入、或588位为C、和/或590位为A时，可以鉴别为滇钩藤(Uncariayunnanensis)。即，只要有1个碱基属于上述情形的话，这些碱基就可以鉴别为滇钩藤(Uncariayunnanensis)。47位为T、或210位为A、或365位为A、和/或433位为C时，可以鉴别为毛钩藤(Uncariahirsute)。即，只要有1个碱基属于上述情形的话，这些碱基就可以鉴别为毛钩9藤(Uncariahirsute)。86位为T、或105位为T、和/或450位为C时，可以鉴别为披针叶钩藤(Uncarialancifolia)。S卩，只要有1个碱基属于上述情形的话，这些碱基就可以鉴别为披针叶钩藤(Uncarialancifolia)。84位为C、或395位为T、或451位为C或M(A禾PC的混合碱基序列)、或在518位有碱基插入、或526位为T或W(A和T的混合碱基序列)、或554位为A、和/或609位为A时，可以鉴别为白钩藤(Uncariasessilifructus)。即，只要有1个碱基属于上述情形的话，这些碱基就可以鉴别为白钩藤(Uncariasessilifructus)。84位为G、或451位为G、和/或514位为A时，可以鉴别为平滑钩藤(Uncarialaebigate)。S卩，只要有1个碱基属于上述情形的话，这些碱基就可以鉴别为平滑钩藤(Uncarialaebigate)。446位为T、和/或567位为T时，可以鉴别为北越钩藤(Uncariahomomella)。即，只要有1个碱基属于上述情形的话，这些碱基就可以鉴别为北越钩藤(Uncariahomomella)。换言之，如果将序列号1的碱基序列作为参考碱基时的12位、47位、84位、86位、104位、105位、210位、365位、395位、433位、446位、450位、451位、514位、518位、526位、554位、567位、570位、588位、590位或609位的碱基中的任意一个属于上述情形的话，就可以鉴别被检试样中含有的钩藤属植物为钩藤(Uncariarhynchophylla)、华钩藤(Uncariasinensis)禾口大叶钩藤(Uncariamacrophylla)以夕卜的禾中。另外，79位为C、或172位为A、或395位为T、或447位为T、或546位为G、和/或592位为C时，不能鉴别是哪一个种，但可以鉴别为钩藤(Uncariarhynchophylla)、华钩藤(Uncariasinensis)和大叶钩藤(Uncariamacrophylla)以外的种。即，只要有1个碱基属于上述情形的话，这些碱基就可以鉴别为钩藤(Uncariarhynchophylla)、华钩藤(Uncariasinensis)禾口大叶钩藤(Uncariamacrophylla)以夕卜的禾中。因此，对于被检试样中含有的钩藤属植物为钩藤(Uncariarhynchophylla)、华钩藤(Uncariasinensis)和大叶钩藤(Uncariamacrophylla)中的任意一种或其它的种的识别，可以对选自将序列号1的碱基序列作为参考序列时相当于12位、37位、43位、47位、79位、84位、85位、86位、94位、104位、105位、169位、172位、177位、209位、210位、211位、215位、365位、395位、412位、413位、415位、433位、446位、447位、450位、451位、461位、514位、518位、526位、532位、537位、546位、554位、567位、570位、585位、588位、590位、592位、608位或609位的位置的碱基中的至少1个，例如至少2个、至少3个、优选110个、更优选15个、进一步优选13个，例如1个或2个碱基进行比对来实施。关于在钩藤属植物的核糖体DNA的ITS区域碱基序列中可用来对种进行识别的部位，以序列号1为参考序列，列于以下的表1(药用种)和表2(非药用种)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>12位为A104位为C在570位中有T的插入588位为C590位为A滇钩藤(U.yunnanensis)47位为T210位为A365位为A433位为C毛钩藤(U.hirsuta)86位为T105位为T450位为C披针叶钩藤(U.lancifolia)84位为C395位为T451位为C或M在518位中有碱基的插入526位为T或W554位为A609位为A白钩藤(U.sessilif潔tus)84位为G451位为G514位为A平滑钩藤(U.laebigate)446位为T567位为T北越钩藤(U.homomella)另外，如果78位为A，就可以鉴别为大叶钩藤(Uncariamacrophy1la)、滇钩藤(Uncariayurmanensis)禾口白钩藤(Uncariasessilifructus)中的任意——禾中。上述特定部位的碱基的比较，是通过确定被检试样中含有的植物的核糖体DNA的ITS区域碱基序列，比较得到的ITS区域碱基序列中的上述特定部位的碱基来实施的。关于确定ITS区域的碱基序列的方法如上所述。即，从被检试样提取DNA，以其为模板，扩增ITS区域，进行直接测序或克隆测序，可以确定碱基序列。关于引物也与上述相同。因此，在一个实施方式中，本发明的方法包括l)从被检试样提取DNA的步骤，2)以该DNA为模板扩增ITS区域的步骤，3)确定ITS区域的碱基序列的步骤，和4)对选自将序列号1的碱基序列作为参考序列时相当于上述位置的碱基中的至少1个碱基与序列号111的碱基序列的至少1个进行比较的步骤。作为比较1数个特定部位的碱基的方法，可以利用使用PCR引物的方法。这是一种比较碱基序列，在有不同的区域设定PCR引物，通过由某个引物扩增来进行判别的方法。该情况下，最好是不仅在不同的区域、而且在相同的区域也设定引物，以形成内部控制。看不到扩增的原因不是反应失败，而是因为要确认其是由核糖体DNA的ITS区域的序列而引起的。判别通过上述特定的引物，核糖体DNA的ITS区域是否扩增，也可以采用PCR以外的扩增方法。例如，也能够用LAMP法(荣研化学)、ICAN(宝酒造)等。分类也可以不是由核酸的扩增引起的。例如，使1条链的核酸彼此杂交然后对其进行电检测的方法，因为检测灵敏度非常高，即使没有核酸的扩增也能够检测。与上述扩增法相同，将1条链的探针设定在不同的区域，由此可以以是否杂交来确认序列。另夕卜，通过比较1至数个特定部位的碱基而进行识别时，可以利用RELP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)法。比较作为识别对象的若干禾中类的碱基序列，找出由限制酶产生的切断中不同的部分，设定引物，使得在被扩增的DNA断片中包括该部分。根据扩增的DNA断片是否被该限制酶切断，可以判断序列的不同。有无切断可以由通常的电泳法等容易判定。还有组合多个上述特定部位中的碱基的不同、图形化并进行比较的方法。例如，在上述引物法中，使用若干引物对的方法，或者在上述RFLP法中，扩增比较大的区域，用多个限制酶切断，根据各自的切断图形也能够判别。作为被检试样，只要是有可能含有钩藤属植物的试样，对其就没有特别限制。例如可以采用钩藤属植物的破碎物、粉碎物、干燥物和提取物、包括以上组分的生药或中药、以及含有该生药或中药的医药品、食品、饮料和化妆品等。另外，在本发明中使用的ITS区域的扩增、PCR、克隆、碱基序列的确定、核酸化学合成等的实验可以按通常的实验书中记载的方法进行。作为这样的实验书，例如可以参考Sambrook等的MolecularCloning,Alaboratorymanual,(2001)3rdEd.，Sambrook,J.&Russell，DW.ColdSpringHarborLaboratoryPress。以下，通过实施例详细说明本发明，但本发明的范围不被实施例限定。实施例(实施例1)材料使用根据形态能够鉴别的腊叶标本，研究有利于鉴别的变异部位。在表3中表示用于研究的样品。除了北越钩藤(Uncariahomomella)以外，针对每1个种，就多个样品确定ITS区域的碱基序列，研究种特异的部位。表3地点DNANo.地点DNANo.从样品采取约200mg的叶或果皮，使用DNeasy(注册商标)PlantMiniKit(Qiagen)提取全部DNA。关于ITS区域的PCR扩增，因为根据样品的状态、可扩增的长度不同，所以按照以下的步骤实施扩增。另外，对于扩增困难的样品，尝试使用PlasmidMiniKit(Qiagen)精制全部DNA。(1)使用引物组(ITS5&ITS4)，将ITS1、5.8S、ITS2—次扩增(WhiteT.J.etal.，1990，AmplificationanddirectsequencingoffungalribosomalRNAgenesforphylogenetics.InPCRRrotocols，AGuidetoMethodsandApplicationspp.315-322.AcademicPress,SanDiego)。ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG_3，)(序列号54)ITS4(5，-TCCTCCGCTTATTGATATGC_3，)(序列号55)(2)使用引物组(ITS5&ITS2、ITS3&ITS4)(Whiteetal.1990、上述)，分别扩增ITSl和ITS2。ITS2(5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3')(序列号56)ITS3(5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3')(序列号57)(3)以按照上述(1)、(2)扩增、以序列确定后的碱基序列为基础，在保存于钩藤属植物内的区域中设计引物，将ITSl和ITS2分别分成2份，合计分成4份分别扩增。使用的14引物组如下。ITS1的扩增…ITS5&ITS-UncariaR2(5'-GAGTTTTCCTTGGCGCGTTCCG_3，)(序列号58)、ITS-UncariaFl(5'-CGCGCGGAAAACGTAACTCAA-3')(序列号59)&ITS2ITS2的扩增…ITS3&ITS-UncariaRl(5'-ATTCAACCACCACTCGTCGTG-3')(序列号60)、ITS-UncariaF2(5'-CTAAATGAGAGTCCTCGGCG-3')(序列号61)&ITS4。反应液均如下所述10XGeneTaq-Buffer(NipponGene)5u1、d證mix(NipponGene)4iU、正向引物(ITS5:10pmo1/yl)1yl、反向引物(ITS4:10pmo1/yl)1yl、模板DNA1.25ii1、Gene-Taq(NipponGene)0.25ii1、DMSO5ii1、D.D.W.32.5ii1(TaKaRa)。反应循环中，步骤(1)为(94t:、l分钟；48t:、2分钟；72t:、3分钟)X30循环，(72。C、7分钟)Xl循环；步骤(2)和(3)为(94。C、l分钟；45。C、1分钟；72。C、2分钟)X45循环、(72t:、7分钟)Xl循环。使用2.0%琼脂糖凝胶作为PCR反应液实施电泳，将DNA按尺寸分离，切出目标尺寸的DNA片段，使用GFXTMPCRDNAandGelBandPurificationKit(Amershambiotech)进行精制。关于精制产物，使用BigDyeTerminatorCycleSequencingKitver.1.1禾口Model3100automatedsequencer(AppliedBioSytems)进行测序。测序时，使用扩增中使用的引物，由5'末端和3'末端双方进行序列确定，比较两者，确定碱基序列。题在关于难以扩增的样品所进行的步骤(3)中，使用的4引物组中，ITS-UncariaFl&ITS2的扩增成功率最高，ITS5&ITS-UncariaR2的扩增成功率最低。调查的钩藤属植物中ITS1为227-228bp、5.8S为162-163bp、ITS2为219_220bp。在ITS1中，在白钩藤(Uncariasessilifructus)的2个样品中，观察到基于1个碱基的缺失的有无的基因组内多态，在直接测序中观察到波形紊乱；在5.8S中，大叶钩藤(Uncariamacrophylla)、滇钩藤(Uncariayunnanensis)都观察到1个碱基的缺失；在ITS2中，白钩藤(Uncariasessilifructus)中，观察到基于1个碱基的插入、乃至相同部位中插入的有无的基因组内多态，在滇钩藤(Uncariayunnanensis)中观察到1个碱基的插入。在白钩藤(Uncariasessilifructus)中，即使利用ITS5&ITS4的引物组成功进行全部区域的扩增，在全部碱基序列的解读中，也必须使用ITS2&ITS3的引物组确定序列。在研究区域中发现64个变异部位(图1)。在图2-111中表示对由表3所示的42种样品得到的ITS区域碱基序列进行比对的结果(从上依次分别表示序列号1253)。其中45位是在样品间观察到完全的碱基的不同的部位(12位、37位、43位、47位、78位、79位、84位、85位、86位、94位、104位、105位、169位、172位、177位、209位、210位、211位、215位、365位、395位、412位、413位、415位、433位、446位、447位、450位、451位、461位、514位、518位、526位、532位、537位、546位、554位、567位、570位、585位、588位、590位、592位、608位、609位)。其余的19位是只观察到不完全的碱取代的部位，观察到这样的取代的样品在各自的部位只有1个或极少数。除若干例外，各个种具有固有且稳定的变异图形，很明显ITS区域对钓钩藤基原植物及其近缘种的鉴别是有效的。从以上结果可知，钓钩藤基原植物和近缘的钩藤属植物是能够通过ITS区域碱基15序列判别的。(实施例2)通过解析由四川省古蔺县黄荆乡得到的钓藤钩(生药)和由四川省产地公司得到的钓藤钩(生药)的ITS区域碱基序列，鉴别了包括哪种钩藤属植物。MM作为样品，使用由四川省古蔺县黄荆乡得到的钓藤钩2个样品和由成都龙泉天然药品开发有限公司得到的钓藤钩2批8个样品。述使用DNeasy(注册商标)PlantMiniKit(Qiagen)，由约200iig样品提取全部DNA。在ITS区域的PCR扩增中，使用引物组(ITS5&ITS3)。反应液的组成如下10XBuffer5ii1、dNTPmix(2.5mM)4ii1、引物(10pmol/ii1)2.5ii1X2、10%DMSO30.75ii1、模板DNA5iU、Gene-Taq0.25iU。反应循环为(94°C、4分钟)X1循环，(95°C、30秒；70。C、15秒；72。C、15秒)X3循环，(95。C、30秒；66。C、15秒；72。C、15秒)X3循环，(95。C、30秒；62。C、15秒；72。C、15秒)X3循环，(95°C、30秒；58。C、15秒；72。C、15秒)X3循环，(95°C、30秒；54°C、15秒；72。C、15秒)X3循环、(95°C、30秒；48°C、1分钟30秒；72。C、2分钟30秒)X20循环和(72t:、7分钟)Xl循环。使用2.0%琼脂糖凝胶作为PCR反应液实施电泳，将DNA按尺寸分离，切出目标尺寸的DNA片段，使用GFXTMPCRDNAandGelBandPurificationKit(Amershambiotech)进行精制。关于精制产物，使用BigDyeTerminatorCycleSequencingKitver.3.1禾口Model3130xLGeneticAnalyzer(AppliedBiosytems)进行测序。在测序时，使用扩增中使用的引物，由5'末端和3'末端双方进行序列确定，比较两者，确定碱基序列。题关于各生药样品，解析得到的ITS区域碱基序列，由四川省得到的钓藤钩基原植物认定为钩藤(Uncariarhynchophylla)和华钩藤(Uncariasinensis)，因此得以确认在四川省古蔺县也生长华钩藤(Uncariasinensis)。从以上可知，在将生药作为样品使用时，也能够由ITS区域碱基序列判别钩藤属植物的种。本说明书中引用的全部刊物、专利和专利申请直接作为参考，引入本说明书中。1权利要求一种鉴别被检试样中含有的钩藤属植物的种的方法，其特征在于包括将被检试样中含有的植物的核糖体DNA的ITS区域碱基序列与选自序列号1～11的碱基序列中的至少1个ITS区域碱基序列进行比较的步骤。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于被检试样为生药。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于鉴别被检试样中含有的钩藤属植物是否为钩藤、华钩藤、大叶钩藤、鹰爪风、攀枝钩藤、北越钩藤、毛钩藤、披针叶钩藤、白钩藤、平滑钩藤和滇钩藤中的任意一种。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于鉴别被检试样中含有的钩藤属植物是否为钩藤、华钩藤和大叶钩藤中的任意一种或者除此之外其他的种。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于对选自将序列号1的碱基序列作为参考序列时相当于12位、37位、43位、47位、78位、79位、84位、85位、86位、94位、104位、105位、169位、172位、177位、209位、210位、211位、215位、365位、395位、412位、413位、415位、433位、446位、447位、450位、451位、461位、514位、518位、526位、532位、537位、546位、554位、567位、570位、585位、588位、590位、592位、608位或609位的位置的碱基中的至少1个碱基进行比对。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于对选自将序列号1的碱基序列作为参考序列时相当于12位、37位、43位、47位、79位、84位、85位、86位、94位、104位、105位、169位、172位、177位、209位、210位、211位、215位、365位、395位、412位、413位、415位、433位、446位、447位、450位、451位、461位、514位、518位、526位、532位、537位、546位、554位、567位、570位、585位、588位、590位、592位、608位或609位的位置的碱基中的至少1个碱基进行比对。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于对选自将序列号1的碱基序列作为参考序列时相当于12位、37位、43位、85位、94位、104位、169位、177位、209位、211位、215位、412位、413位、415位、450位、461位、532位、537位、585位、588位或608位的位置的碱基中的至少1个碱基进行比对。全文摘要本发明提供高精度判别钩藤属植物的种的方法。本发明涉及鉴别被检试样中含有的钩藤属植物的种的方法，包括将被检试样中含有的植物的核糖体DNA的ITS区域碱基序列与选自序列号1～11的碱基序列中的至少1个ITS区域碱基序列进行比较的步骤。文档编号C12Q1/68GK101772579SQ20088010053公开日2010年7月7日申请日期2008年7月25日优先权日2007年7月26日发明者山路弘树申请人:株式会社津村