专利名称：：用交叉β结构靶向诱导蛋白质聚集的制作方法
技术领域：
：本发明属于蛋白质聚集领域。本发明揭示了干扰靶蛋白质功能的方法以及使用被称作聚集剂(aggregator)的非天然的、使用者设计的分子，其对靶蛋白质具有特异性且在与所述靶蛋白质接触时诱导聚集。本发明还揭示了这种聚集剂分子及其在治疗和诊断中的应用。
背景技术：
：蛋白质聚集已经成为生物技术和医学领域的主要议题。其是蛋白质生产中的主要瓶颈，縮小了通过重组技术获得的相关多肽的范围；其降低存放期且可以增加多肽药物的免疫原性；以及其与人类关键疾病的数目增加相关，所述疾病包括阿尔茨海默氏病、海绵状脑病、n型糖尿病以及帕金森氏病。最近十年数据已经开始不断提示多肽的组成和一级结构在很大程度上决定其聚集倾向，且较小的改变对于溶解性可能具有巨大影响。如通过能预测蛋白质中P-聚集序列的很多算法证实，根据其序列预测蛋白质聚集倾向的能力非常具有价值。这些算法可用于通过特异性序列靶向治疗剂控制不希望的蛋白质沉积事件或者揭示生物技术感兴趣蛋白的更可溶的变体。通常假定不是多肽的所有区域在决定其聚集倾向中均是相同重要的。在这方面，最近已经证实极短的一段特殊氨基酸序列可作为淀粉样原纤维形成的促进剂或抑制剂。在功能蛋白质组学领域需要开发创新技术以促进发明及使功能蛋白质组学中通过互补方法赋予的潜力最大化。需要具有一种可灵活应用的技术，其可以直接靶向特定胞外或胞内蛋白质的生物学功能，而不是靶向翻译其的mRNA或者操作编码其的基因。在本发明中我们尝试开发基于聚集而靶向特定蛋白质的技术。迄今为止，蛋白质聚集主要作为不希望的导致疾病的现象而被研究，且普遍认为交叉-P介导的聚集是最经常发生的且是聚集的生物学相关机制2。交叉-P聚集(Cross-betaaggregation)是用于表示聚集是通过分子间P-折叠形成而成核(nucleated)的术语，聚集物中的每个分子均提供典型包含至少三个连续氨基酸的相同的链。专利申请W003102187(Scegen，PtyLtd)揭示了通过将分子与膜易位序列(membranetranslocatingsequence)融合而增强所述分子活性的方法，从而所得嵌合分子自主装配成较高分子量的聚集物。US20050026165(Aret6Associates)揭示了能与不溶蛋白质如朊病毒的P_折叠构象相互作用的构象肽作为朊病毒疾病诊断工具的应用。专利申请W02007010110描述了通过使用多环化合物诱导蛋白质聚集。发明概述本发明涉及特定靶蛋白质的受控且可诱导的蛋白质聚集的技术。本发明还提供了重新设计的分子，在本文称作聚集剂分子，其包含与对于靶蛋白质具有亲和性的结合区偶联的至少一个P-聚集区。在一个优选的实施方案中，所述聚集剂分子包含至少一个P_聚集区，其与能结合靶蛋白质(或者与之相互作用)的区域融合。在选择的靶蛋白质与特殊设计的聚集剂分子接触时，在所述靶蛋白质与聚集剂之间出现特异性共聚集，导致所述靶蛋白质的生物学功能的功能性敲除或者下调。这种蛋白质敲低(knock-down)是取决于聚集剂的存在的，其由存在聚集剂分子而被诱导。另一额外的优势是蛋白质干扰的强度可以通过改变聚集剂分子中P-聚集区的数目而实验性地控制。本发明不仅提供了下调特定胞外或胞内蛋白质生物学功能的有效研究工具，而且也具有重要的治疗、农业和诊断应用。图1:该图示出通过离心除去共聚集物之后上清中残余HRP活性百分比(见实施例l)。所述聚集剂(生物素酰化肽)的存在显然从可溶级分中除去了所述酶。发明目的和详细描述在本发明中，我们开发了通过使用非天然发生的分子下调蛋白质的生物学功能的方法，所述分子包含能结合所述蛋白质的区域及至少一个P-聚集序列。在与靶蛋白质接触时，所述非天然发生的分子与所述靶蛋白质之间发生共聚集。所述聚集使得靶从其可溶环境中退出，导致所述可溶靶蛋白质的功能性敲低。"聚集"应理解为可以是指无定形或者纤维状(淀粉样或者交叉-P纤维状是相同含义术语)聚集。事实上，P-聚集区的种类决定靶蛋白质的无定形或纤维状聚集的诱导。因此，本发明的一个实施方案提供了下调蛋白质生物学功能的方法，包括将所述蛋白质与非天然发生的分子接触，所述分子包含能结合所述蛋白质的区域以及至少一个P-聚集序列。文中用语"能结合靶蛋白质"是指"能与靶蛋白质相互作用"或者换言之是"对于靶蛋白质具有亲和性"。应理解所述亲和性是在微摩尔至皮摩尔亲和性的范围内，优选在纳摩尔至皮摩尔亲和性的范围内。因此聚集剂(或者其能结合靶蛋白质的结合结构域)对于靶蛋白质的亲和性为至少1()4mo"(例如至少105、106、107、108、109、10,1011或者1012！1101—1)。应理解这种非天然发生的分子是嵌合分子，其包含两个元件的融合结合区与至少一个P-聚集序列，所述两个元件彼此无亲和性和/或所述元件彼此不结合。无亲和性是指该亲和性低于高于104！1101—1。在一个优选的实施方案中，所述元件与靶蛋白质不同，其目的在于下调(或者等价而言其目的在于聚集)。在另一优选的实施方案中，所述结合区可以调节靶蛋白质的功能。在再一优选的实施方案中，所述结合区不调节靶蛋白质的功能，意味着所述结合区(当单独结合时)仅结合靶蛋白质而不干扰所述靶蛋白质的生物学功能。在一特殊的实施方案中，耙蛋白质是融合蛋白，如组氨酸融合蛋白、链霉抗生物素蛋白融合蛋白、GFP融合蛋白等。术语"结合区"或者"结合结构域"典型是指与靶蛋白质相互作用的分子。在某些情况中，结合结构域是化学化合物(例如对至少一种靶蛋白质具有亲和性的小化合物)；在其他某些情况中，结合结构域是多肽；在其他某些情况中，结合结构域是蛋白质结构域。蛋白质结合结构域是整个蛋白质结构的元件，其是自稳定的且通常不依赖于其余蛋白质链而折叠。结合结构域的长度可以在大约25个氨基酸直至500及更多个氨基酸的范围内变化。许多结合结构域可以分类为折叠及可识别的、可鉴别的3-D结构。一些折叠在许多不同蛋白质中很常见，以致于给其特定名称。非限制性的例子是罗斯曼折叠、TIM桶、犰狳(armadillo)重复、亮氨酸拉链、钙粘蛋白结构域、死亡效应结构域(deatheffectordomain)、免疫球蛋白样结构域、磷酸酪氨酸_结合结构域、血小板_白细胞C激酶底物同系结构域、src同源2结构域、BRCA1的BRCT结构域、G-蛋白结合结构域、Eps15同源(EH)结构域以及p53的蛋白质结合结构域。抗体是具有通过称作互补决定区(CDR)的超变环区介导的特异性的特异结合蛋白的天然原型。尽管通常抗体样支架已证明作为特异结合剂工4作良好，但是已经清楚其不必须与展示CDR样环的刚性支架范例(paradigm)严格粘合。除了抗体之外，许多其它天然蛋白质介导结构域之间的特异性高亲和性相互作用。或者免疫球蛋白提供了设计新的结合(识别)分子的有吸引力的起始点。如本发明所用，术语"支架"是指蛋白质构架，其可以携带改变的氨基酸或者序列插入，赋予与特定靶蛋白质结合的能力。工程化支架和设计文库是相互依赖的程序。为了获得特定结合剂，需要产生支架的组合文库。这通常是通过使用简并密码子或者三核苷酸在DNA水平通过随机化在适当氨基酸位置的密码子进行。具有广泛不同来源和特性的众多不同的非免疫球蛋白支架通常用于组合文库展示。其中一些大小与抗体的scFv相似(大约30kDa)，而大多数更小。基于重复蛋白质的模块支架的大小根据重复单位的数目而不同。非限制性的实例包括基于人10th纤连蛋白III型结构域的结合剂、基于脂笼蛋白的结合剂、基于SH3结构域的结合剂、基于knottin家族成员的结合剂、基于CTLA-4的结合剂、T_细胞受体、新制癌菌素、碳水化合物结合模块4-2、tendamistat、kunitz结构域抑制剂、PDZ结构域、Src同源结构域(SH2)、蝎毒素、昆虫防卫素A、植物同源结构域指蛋白、细菌酶TEM-113-内酰胺酶、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)蛋白A的Ig-结合结构域、大肠杆菌(E.coli)大肠杆菌素E7免疫性蛋白、大肠杆菌细胞色素b562、锚蛋白重复结构域。本发明还包括这样的结合结构域，其是对指定靶蛋白质具有特异性的化合物、环形或线性肽结合剂、肽适配体、多价avimer蛋白质或者小模块免疫药物学药物、对于受体或者共同受体具有特异性的配体、在双杂交分析中鉴别的蛋白质结合配偶体、基于生物素-抗生物素蛋白高亲和性相互作用的特异性的结合结构域、基于亲环蛋白-FK506结合蛋白的特异性的结合结构域。本发明也包括对于特殊碳水化合物结构具有亲和性的凝集素。在另一实施方案中，本发明提供了下调蛋白质生物学功能的方法，包括将所述蛋白质与非天然发生的分子(或者与嵌合分子)接触，所述分子包含A部分和B部分，其中i)A部分是能结合所述蛋白质的结合区，以及ii)B部分包含至少一个P-聚集区。在特殊的实施方案中，所述至少一个P-聚集区由至少3个连续氨基酸组成。在一个特异实施方案中，所述P-聚集区衍生自靶蛋白质。在另一个特异实施方案中，所述P-聚集区与靶蛋白质不同(即其衍生自不同的蛋白质)。在再一个实施方案中，所述P-聚集区是人工多肽序列(即其非衍生自现有蛋白质序列，也就是不是在自然界中发现的)。在另一特异实施方案中，在A部分与B部分之间存在接头。一个特殊类型的P-聚集区是淀粉样区域。在另一个实施方案中，非天然发生的分子(或者嵌合分子)的B部分包含至少2个P-聚集区。术语"非天然发生的分子"或者"嵌合分子"或者"嵌合融合分子"是指这种分子是人工制造的。例如，当分子是多肽时(即A部分和B部分均是肽时)，这种多肽B部分在计算机上(insilico)设计或者分离自天然蛋白质(即P-聚集区)并且融合(或者偶联)所述B部分与A部分(是能结合蛋白质的区域)，其中应了解A和B彼此无亲和性(即彼此不结合或者彼此不相互作用)。换句话说，与结合区融合的P-聚集区(或序列)与A部分与B部分之间通过至少一个天然氨基酸天然发生的融合不同。典型地，这种嵌合分子不作为连续多肽存在于由非重组基因组中基因编码的蛋白质中。应明了所述聚集剂分子可以模块方式通过导入重复及改变A部分和B部分的顺序而设计。非限制性的组合如下具有A-B结构的聚集剂、具有B-A结构的聚集剂、具有A-B-A结构的聚集剂、具有B-A-B结构的聚集剂、具有A'-B-A"结构的聚集剂，以及具有B'_A_B"结构的聚集剂，其中接头(间隔序列)任选位于A，A'，A"和B，B'，B"之间。A、A，和A"是不同的相似部分(例如不同的肽序列或者不同的化学部分)。B、B'和B"是不同或相似的自缔合序列(例如B是衍生自靶蛋白质的P-聚集序列，B'是合成的P-聚集序列)。文中用语"下调蛋白质功能"是指蛋白质的正常生物学活性被降低(在此抑制、下调、降低和破坏是等价词)或者蛋白质通过诱导的聚集(即聚集剂与靶蛋白质之间的共聚集)而脱离其正常生物学环境(例如是内质网的正常居住者的蛋白质由于其功能下调而不存在)。因此，通过应用本发明方法，所述蛋白质与本发明的非天然分子通过接触而发生蛋白质聚集，破坏所述蛋白质的功能。所述非天然分子在此被称作"聚集剂"或者"聚集剂分子"。聚集是指通常可溶的蛋白质在其正常生物学环境中通过与所述聚集剂直接接触或者结合而被改变为不溶蛋白质或者聚集的蛋白质的事实。文中用语"下调蛋白质的功能"也可以与用语"敲低蛋白质的功能"或者"负面干扰蛋白质的功能"互换使用。蛋白质功能的下调也可以意味着蛋白质不再以可溶形式存在于细胞中或者蛋白质不再以可溶形式存在于其正常生物学环境中(例如(亚)细胞或者细胞外定位)。此外，其也可以意味着聚集的蛋白质通过细胞的天然清除机制被降解且不再以可溶或不可溶形式被检测到。此外，其也可以意味着跨膜受体蛋白通过聚集剂诱导的所述跨膜蛋白的聚集而不再能结合其正常配体(例如通过正常结合所述生长因子受体的配体与至少一个P-聚集结构域之间形成融合体)。因此，蛋白质功能的下调也可以意味着是例如线粒体正常居住者的蛋白质通过诱导蛋白质聚集的方法而不再存在于其中。在一个特异实施方案中，"蛋白质功能的下调"或者"蛋白质功能的负面干扰"或者"敲低蛋白质功能"是与所述蛋白质的正常功能(100%)相比其功能丧失至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或者甚至100%。蛋白质的功能或者蛋白质不在其正常生物学环境中存在(定位)可以便利地通过本领域已知方法确定。例如，根据感兴趣的靶蛋白质，通过测量降低的酶活性而可以确定功能。蛋白质在其正常生物学环境中的存在减少可例如通过测量复合物形成减少、耙蛋白质在亚细胞区室中出现减少、以可溶形式存在的靶蛋白质、以聚集(在此与不溶是等价词)形式存在的靶蛋白质等进行测量。或者，下调靶蛋白质的作用可以在细胞测定中测量(例如生长的丧失或获得，侵润的丧失或获得，蛋白酶解活性的丧失或获得)。在一个特异实施方案中，蛋白质的这种正常生物学活性(或者正常功能或正常定位)可以在细胞内或细胞外被干扰。"细胞内"是指生物体或宿主细胞内的蛋白质定位(例如细胞质、线粒体、溶酶体、液泡、核、叶绿体、内质网(ER)、细胞膜、线粒体膜、叶绿体膜等)。"细胞外"不仅是指在细胞胞外基质中的蛋白质定位，而且还指接触胞外基质的蛋白质如膜锚定蛋白质、跨膜蛋白质等。胞外蛋白质的非限制性实例是分泌的蛋白质(例如血液或血浆中存在的蛋白酶、抗体和细胞因子)或者存在于胞外基质中的蛋白质(例如基质金属蛋白和跨膜蛋白(例如生长因子受体))。对其可以用本发明方法靶向的细胞和宿主包含原核细胞和真核细胞。非限制性实例是病毒、细菌、酵母、真菌、原生动物、植物和哺乳动物包括人。应了解下调蛋白质生物学功能的方法可用于同时干扰1、2、3、4、5或者甚至更多种蛋白质的生物学功能。特别是由于A部分包含至少一个结合区，因此A部分可例如包含6特异于不同蛋白质的不同结合区。用于干扰至少一种靶蛋白质生物学功能的聚集剂非天然存在于自然界中，可以通过化学合成或者通过重组蛋白质表达或者通过后者组合而制备。因此，聚集剂分子包含至少一个P-聚集区(因此B部分包含至少一个|3-聚集区)。P-聚集区在本文定义为具有与相同或者极密切相关序列形成紧密分子装配的高度倾向性的连续氨基酸序列。"P-聚集区"也可以被称作"自缔合区"。用语"具有形成紧密分子装配的高度倾向性"也可以解释为"具有高亲和性"。亲和性通常以解离常数的值(Kd值)释义。P-聚集区之间的Kd-值典型在微摩尔与纳摩尔范围之间，但是也可以是亚纳摩尔或者超微摩尔。举例的P-聚集区是分子间P折叠区、a-螺旋元件、淀粉样区域、发夹环、跨膜序列以及信号序列。在一个特异实施方案中，至少一个P-聚集区存在于B部分中。在另一特异实施方案中，至少两个P-聚集区存在于B部分中。在另一特异实施方案中，3、4、5、6或更多个P-聚集区存在于B部分中。所述P-聚集区可以通过接头区(例如大约2至大约4个氨基酸的间隔序列)互相连接。靶蛋白质在本文被定义为希望干扰其功能的蛋白质。因此，为了产生特异于至少一个蛋白质的聚集剂，A部分中至少一个结合区应能结合所述靶蛋白质。优选P-聚集区的长度由至少3个连续氨基酸组成。在一个优选的实施方案中，所述区域由大约3至大约30个氨基酸组成。在另一个优选实施方案中，所述区域由大约3至大约25个氨基酸组成。在特别优选的实施方案中，所述区域由大约5至大约20个氨基酸组成。所述聚集剂分子B部分中存在的P-聚集区任选在所述P-聚集区之间用间隔序列(或接头)偶联。例如，可以使用的P-聚集区可以衍生自在宿主中非正常存在的蛋白质的P-聚集区(因此B部分中的一些P-聚集区可以得自不相关的生物体)。P-聚集区的性质决定通过诱导的聚集对靶蛋白质的抑制水平(即抑制强度)。在聚集剂分子中可以使用一个以上的P-聚集区，且也可以使用合成的P-聚集区。在一个特异实施方案中，这种P-聚集区由合成序列组成，所述合成序列非衍生自现有蛋白质且因此是非天然发生的。这种合成的自缔合区域的例子在L6pezdelaPazM.etal(2002)PNAS99，25，p.16053表1中描述，该文在本文援引加入。在所述聚集剂分子中B部分和A部分可任选通过接头区(间隔序列是其等价词)连接(或偶联)。所述接头区可例如是通过化学合成的非天然接头(例如柔性接头如羟基取代的烷链、葡聚糖、聚乙二醇或者也由氨基酸同系物组成的接头)或者所述接头可以是天然氨基酸如聚(苏氨酸)或者聚(丝氨酸)。优选当接头包含氨基酸时，所述接头区的长度为大约3至大约15个氨基酸，更优选大约5至大约10个氨基酸。通常可以选择柔性接头，但是可知刚性接头也可使用。柔性接头序列可以得自天然来源，通常这种区域与天然发生的蛋白质中的结构域连接，如src酪氨酸激酶SH2与SH3结构域之间的接头或者BRCA1的BRCT结构域之间的接头。术语"接触"是指所述聚集剂与靶蛋白质相互作用的过程。在一种形式中，向包含靶蛋白质的样品中加入聚集剂(例如聚集剂以在溶液中的特定浓度存在)。在另一种形式中，将聚集剂分子注射进包含靶蛋白质的生物体中。接触可例如通过转化包含靶蛋白质的细胞进行，所述细胞如分离的细胞、例如细胞培养物中的细胞、单细胞微生物或者多细胞生物体中的一个细胞或多个细胞。转化是指所述聚集剂分子通过通常已知的转染或转化方法(例如通过基因转移技术包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射、病毒方法，使用阳离子脂质体(见例如Feigner,P.L.etal.(1987)，Proc.Natl.Acad.SciUSA84，7413)，可商购的阳离子脂质配制物例如Tfx50(Promega)或者Lipofectamin2000(LifeTechnologies)、粒子轰击等)被导入宿主(例如细胞)中。所述聚集剂分子可以由重组载体(例如质粒、粘粒、病毒载体)编码且可以在宿主内合成。在另一实施方案中，聚集剂分子可以通过载体介导的输送方式被导入细胞中，例如通过脂质体载体或者纳米粒子或者通过注射导入。在另一实施方案中，聚集剂分子可以通过介导细胞穿透(或者细胞易位)的序列进入细胞。在后者情况中，聚集剂分子通过细胞穿透序列的重组或者合成附着而被进一步修饰。因此，聚集剂分子(例如多肽)可以与促进融合或化学偶联蛋白质转导进原核细胞或真核细胞中的序列进一步融合或化学偶联。促进蛋白质转导的序列为本领域技术人员已知，包括但不限于蛋白质转导结构域。优选所述序列选自包含HIVTAT蛋白、聚精氨酸序列、penetratin和p印-l的组中。其它常用的细胞穿透肽(天然肽和人工肽)在JoliotA.andProchiantzA.(2004)NatureCellBiol.6(3)189-193中描述。在一个特异实施方案中，聚集剂基本上由氨基酸组成。"多肽"是指其中单体是氨基酸且通过酰胺键连接在一起的聚合物，或者称作肽。当氨基酸是a-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或者D-光学异构体。此外，也可包括非天然氨基酸，如P-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。在本发明中也可以使用非基因编码的常见氨基酸。聚集剂中使用的所有或部分氨基酸可以是D-异构体或者L-异构体。此外，其它肽模拟物也可用于本发明中。我们在本文特别提及且援引加入SillerudL0andLarsonRS(2005)CurrProteinP印tSci.6(2):151-69关于肽模拟物作为蛋白质-蛋白质相互作用拮抗剂的开发与利用的综述。此外，可以在所述肽序列中加入D-氨基酸以稳定转角特征(尤其在甘氨酸的情况中)。在另一方法中，a、P、Y或者S转角模拟物(如a、13、Y或者S二肽可用于模拟肽中结构基序和转角特征且同时提供蛋白酶解稳定性以及增强其它性质如构象稳定性和溶解性。P-聚集区从靶蛋白质中的分离P-聚集序列通常是疏水的，但不总是这样。例如，酵母朊病毒的P-聚集(或者自缔合)区是相当极性的。事实上，衍生自多肽或蛋白质的氨基酸区域的交叉-P聚集在当其处于如下情况时可被起始(l)其具有高疏水性，(2)其具有良好的P-折叠倾向，(3)其具有低净电荷以及(4)其暴露于溶剂。因此，P-聚集蛋白质区域("节段"是"区域"的等价词)通常以折叠状态被埋藏且不暴露于溶剂。后者通过实验结果证实，即在许多球状蛋白质中，在重折叠期间或者在其中变性或部分折叠的状态显著增加的条件(即在高浓度或者由于去稳定化条件或突变的结果)下发生聚集。基于这些发现，开发了能预测蛋白质中P-聚集区的计算机算法("P-聚集序列或节段"是等价词)。一种这样的算法TANGO基于统计力学算法，其考虑到上述三个物理-化学参数，也考虑到不同结构构象之间的竞争P-转角、a-螺旋、P-折叠聚集物以及折叠状态(Fer薩dez-Escamilla，AMetal(2004)Nat.Biotechnol.22，1302-1306，尤其是在第1305和1306页的方法章节特别援引加入本文，以及同一文章对于用于TANGO算法的校准和测试的方法和数据集的进一步描述的补充说明l和2)。因此，耙蛋白质中存在的|3-聚集区可通过计算机算法如TANGO获得。确定P-聚集区、特别是淀粉样区域的另一算法是SALSA，其由ZibaeeSetal(2007)ProteinSc.16(5):906-18描述。可以确定蛋白质中淀粉样结构区的另一算法是PASTA，其由TrovatoAetal(2006)PLoSComputBiol2(12):el70描述。另一算法是Aggrescan(Conchillo-Sole0etal(2007)BMCBioinformatics8:65。后一算法也预测蛋白质中有聚集倾向的节段(即P-聚集区)。P-聚集区通常埋藏在靶蛋白质核心内部^通过相应于靶蛋白质稳定性的能量屏障有效地屏蔽肽免于分子间缔合11。在其正常环境(例如细胞质、胞外基质)中，耙蛋白质获得来自分子伴侣的帮助，有助于蛋白质保持其功能性单体形式12。TANG0可以登录WorldWideWebhttp://tango,embl.de/获取。另一实例是zyggregator算法(PawarAPetal(2005)J.Mol.Biol.350,379-392)。这些算法通过对比指定氨基酸序列的聚集倾向得分与从相似长度的一组序列中计算的平均倾向得分鉴别聚集倾向得分。本发明使用这些13-聚集区制备用于特异性诱导蛋白质聚集的聚集剂分子。聚集剂分子的B部分包含至少l个聚集区。通过在聚集剂分子B部分中掺入一个以上的聚集区可以控制蛋白质干扰强度(蛋白质干扰强度是例如当靶蛋白质或者包含所述靶蛋白质的细胞与特定聚集剂分子接触时靶蛋白质的生物学功能的丧失百分比)。事实上，低TANGO得分(典型在5%至大约20%之间)的聚集区可以在聚集剂B部分中重复2、3、4或更多个聚集区。在另一个实施方案中，可以在聚集剂B部分中掺入1、2或3或4个或者更多个不同的低TANGO得分聚集区。在另一个实施方案中，可以组合1、2、3、4或更多个合成的聚集区进入B部分中以增强靶蛋白质的下调。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了能聚集靶蛋白质的非天然发生的分子。在一个特异实施方案中，所述非天然分子是天然蛋白质样分子。蛋白质样分子意味着分子包含L-氨基酸或者D-氨基酸或者L-和D-氨基酸的混合物或者天然氨基酸与肽模拟物的组合。在再一个实施方案中，本发明提供了非天然发生的分子，其包含分离自能溶解于水的蛋白质结构域的至少一个P-聚集区，其中所述P-聚集区与防止所述P-聚集区聚集的部分融合。在再一个实施方案中，本发明提供了非天然发生的分子，其包含与能结合靶蛋白质的区域融合的至少一个P-聚集区。在一特异实施方案中，包含与能与靶蛋白质相互作用的结合区融合的至少一个13_聚集区的聚集剂分子是多肽。在另一特异实施方案中，本发明提供了重组载体，其包含编码这些聚集剂分子的多核苷酸。在另一特异实施方案中，本发明的聚集剂分子用作药物。聚集剂分子的治疗性应用蛋白质负责很多生物活性，从众多的酶反应至信号的转导以及提供结构。蛋白质结构、丰度或活性的改变是根本原因或许多疾病。许多药物通过特异性干扰一种或者有限数目的蛋白质而起作用。本发明提供了开发新类别化合物的方法，所述化合物通过使用能与靶蛋白质相互作用的结合区而能特异性干扰选择的靶蛋白质。这些新化合物被称作聚集剂。因此，在再一个实施方案中，本发明提供了包含至少一个P-聚集区的非天然发9生的分子作为药物的应用，其中所述P-聚集区与能与靶蛋白质相互作用的区域融合。所述结合区防止所述聚集剂分子的自动聚集。所述聚集剂分子可用于治疗疾病和/或生产治疗疾病的药物，所述疾病与至少一种靶蛋白质如致癌蛋白的异常表达相关，如癌症。术语"异常表达"是指例如在癌症情况中致癌基因的(过)表达，其也包括显性失活蛋白(dominantnegativeprotein)的表达、特殊蛋白质或者特殊蛋白质的剪接变体的不希望的定位、特殊蛋白质的特殊剪接变体的不希望的表达、突变蛋白的更高活性或者特殊蛋白质的更高活性。在一个特异实施方案中，"异常表达"是指翻译后修饰的蛋白质的不希望的存在或者非翻译后修饰的蛋白质的不希望的存在。翻译后修饰改变修饰的氨基酸的物理-化学性质，由此其具有改变指定多肽节段的聚集倾向的潜力，可用于特异性靶向具有最强聚集倾向的形式。因此如果翻译后修饰显著降低e-聚集区的聚集倾向，则用未修饰的蛋白质的干扰将是最有效的。相反，在翻译后修饰增加e-聚集区聚集倾向的情况中，则用修饰的蛋白质的干扰将是最有效的。单独基于疏水性，设想修饰如磷酸化和糖基化将会降低聚集倾向，而脂质附着将会增加聚集倾向。本发明的聚集分子针对的靶蛋白质可以与病理状况相关联。例如，所述蛋白质可以是病原体相关蛋白，如病毒蛋白，肿瘤相关蛋白，或者自身免疫疾病相关蛋白。一方面，本发明特征在于治疗处于不希望的细胞增殖风险或者患有不希望的细胞增殖的对象的方法，所述不希望的细胞增殖如恶性或非恶性细胞增殖。所述方法包括提供聚集剂分子，如具有本文描述结构的聚集剂，其中所述聚集剂分子能干扰(抑制)促进不希望的细胞增殖的蛋白质的功能和/或存在，将所述聚集剂施用给该对象、优选人从而治疗该对象。在一个优选实施方案中，所述蛋白质是生长因子或者生长因子受体、激酶(例如蛋白质酪氨酸、丝氨酸或者苏氨酸激酶)、衔接蛋白质、G蛋白偶联受体超家族的蛋白质，或者转录因子。在一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰PDGF-I3蛋白的生物学功能，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的PDGF-I3表达的病症如睾丸癌和肺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂抑制(敲低)Erb-B蛋白的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的Erb-B表达的病症如乳腺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂抑制Src蛋白的功能(或者与其等价的"干扰Src蛋白质功能")(或者干扰Src蛋白质存在)，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的Src表达的病症如结肠癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂抑制CRK蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的CRK表达的病症如结肠癌和肺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂干扰GRB2蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的GRB2表达的病症如鳞状细胞癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰RAS基因的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的RAS表达的病症如胰腺癌、结肠癌和肺癌以及慢性白血病风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰MEKK蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的MEKK表达的病症如鳞状细胞癌、黑素瘤或白血病风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰JNK蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的JNK表达的病症如胰腺癌或乳腺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰RAF蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的RAP表达的病症如肺癌或白血病风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰Erk1/2蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的Erkl/2表达的病症如肺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰PCNA(p21)蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的PCNA表达的病症如肺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰MYB蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的MYB表达的病症如结肠癌或慢性骨髓性白血病风险的对象。在一个优选的实施方案中，所述聚集剂分子干扰c-MYC蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的c-MYC表达的病症如Burkitt's淋巴瘤或成神经细胞瘤风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰JUN蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的JUN表达的病症如卵巢癌、前列腺癌或乳腺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰FOS蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的F0S表达的病症如皮肤癌或前列腺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子抑制BCL-2蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的BCL-2表达的病症如肺癌或前列腺癌或非霍奇金淋巴瘤风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰细胞周期蛋白D的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的细胞周期蛋白D表达的病症如食管癌和结肠癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰VEGF蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的VEGF表达的病症如食管癌、结肠癌或病理性血管发生风险的对象。在一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰EGFR蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的EGFR表达的病症如乳腺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰细胞周期蛋白A的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的细胞周期蛋白A表达的病症如肺癌和子宫颈癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰细胞周期蛋白E的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的细胞周期蛋白E表达的病症如肺癌和乳腺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰WNT-l蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的WNT-1表达的病症如基底细胞癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰13-连环蛋白的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的e-连环蛋白表达的病症如腺癌或肝细胞癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰c-MET蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的c-MET表达的病症如肝细胞癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰蛋白激酶C(PKC)蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的PKC表达的病症如乳腺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰NFK即pa-B蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的NFK即pa-B表达的病症如乳腺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰STAT3蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的STAT3表达的病症如前列腺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰存活蛋白的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的存11活蛋白表达的病症如子宫颈癌或胰腺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰Her2/Neu蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的Her2/Neu表达的病症如乳腺癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰拓扑异构酶I蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的拓扑异构酶I表达的病症如卵巢癌和结肠癌风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰拓扑异构酶IIa蛋白质的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的拓扑异构酶IIa表达的病症如乳腺癌和结肠癌风险的对象。另一方面，本发明提供了治疗患有或者处于可能通过血管发生抑制而受益的疾病例如癌症的风险中的对象如人的方法。所述方法包括提供聚集剂分子例如具有本文所述结构的聚集剂分子，该聚集剂分子可抑制(或者干扰)介导血管发生的蛋白质，以及将所述聚集剂分子施用给对象，从而治疗该对象。在一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰qv-整联蛋白的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的a.v-整联蛋白表达的病症如脑瘤或者源于上皮的肿瘤风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰Flt-l受体蛋白的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的Flt-.l受体表达的病症如癌症和类风湿性关节炎风险的对象。在另一个优选实施方案中，所述聚集剂分子干扰微管蛋白的功能和/或存在，因此可用于治疗患有或处于特征在于不希望的微管蛋白表达的病症如癌症和视网膜新血管形成风险的对象。另一方面，本发明提供了治疗感染了病毒或者处于病毒感染相关病症或疾病风险中或者患有该病症或疾病的对象的方法。所述方法包括提供聚集剂分子例如具有本文所述结构的聚集剂分子，该聚集剂同源于且可以沉默介导病毒功能如侵入或生长的病毒蛋白或细胞蛋白；以及将所述聚集剂施用给对象优选人，从而治疗该对象。因此本发明提供了使用聚集剂生产治疗病毒感染的患者的药物的方法，所述病毒包括人乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、鼻病毒、西尼罗病毒、蜱传脑炎病毒、麻疹病毒(MV)或者脊髓灰质炎病毒。另一方面，本发明提供了治疗病原体感染的对象的方法，所述病原体如细菌、阿米巴虫、寄生虫或者真菌病原体。所述方法包括提供聚集剂分子例如具有本文所述结构的聚集剂分子，其中所述聚集剂分子能干扰衍生自所述病原体的病原性蛋白质的功能，以及将所述聚集剂分子施用给对象优选人，从而治疗该对象。来自病原体的靶蛋白质可以是参与生长、细胞壁合成、蛋白质合成、转录、能量代谢(例如三羧酸循环)或者毒素产生的蛋白质。因此，本发明提供了治疗例如如下病原体感染的患者的方法恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、溃嫁分枝杆菌(Mycobacteriumulcerans)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacteriuml印rae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、月市炎链球菌(Str印tococcuspneumoniae)、酉良月农链球菌(Streptococcuspyogenes)、月市炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)或者月市炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)。另一方面，本发明提供了治疗处于特征在于不希望的免疫应答的疾病或病症风险中或者患有该疾病或病症的对象的方法，所述疾病或病症如炎症性疾病或病症或者自身免疫疾病或病症。所述方法包括提供聚集剂分子例如具有本文所述结构的聚集剂分子，所述聚集剂分子能抑制(下调)介导不希望的免疫应答的蛋白质的功能和/或存在，以及将所述聚集剂分子施用给对象，从而治疗该对象。在一个优选实施方案中，所述疾病或病症是缺血性或者再灌注损伤，例如与如下相关的缺血性再灌注或损伤急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、心肺转流术、手术干预(例如血管成形术，如经皮冠状动脉成形术)、移植的器官或组织(例如移植的心或血管组织)的反应，或者溶栓。在另一个优选实施方案中，所述疾病或病症是再狭窄，例如与手术干预(例如血管成形术，如经皮冠状动脉成形术)相关的再狭窄。在另一个优选实施方案中，所述疾病或病症是炎症性肠病，例如克罗恩病或溃疡性结肠炎。在另一个优选实施方案中，所述疾病或病症是感染或损伤相关的炎症。在另一个优选实施方案中，所述疾病或病症是哮喘、狼疮、多发性硬化症、糖尿病如II型糖尿病、关节炎如类风湿性关节炎或者银屑病关节炎。在另一个优选实施方案中，聚集剂分子干扰整联蛋白或者其共同配体(co-ligand)例如VLA4、VCAM、ICAM的功能。在另一个优选实施方案中，聚集剂分子干扰选择蛋白或者其共同配体例如P-选择蛋白、E-选择蛋白(ELAM)、L-选择蛋白或者P-选择蛋白糖蛋白-(PSGLl)的功能。在另一个优选实施方案中，聚集剂分子干扰补体系统成分例如C3、C5、C3aR、C5aR、C3转变酶、C5转变酶的功能。在另一个优选实施方案中，聚集剂分子干扰趋化因子或者其受体例如TNF-a、IL-1a、IL_1、IL_2、IL_2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL_8、TNFRI、TNFRII、IgE、SCYA11或者CCR3的功能。另一方面，本发明提供了治疗处于急性疼痛或者慢性疼痛风险中或者患有急性疼痛或者慢性疼痛的对象如人的方法。所述方法包括提供聚集剂分子如具有本文所述结构的聚集剂分子，该聚集剂分子能干扰介导疼痛过程的蛋白质，以及将所述聚集剂分子施用给对象，从而治疗该对象。在另一个优选实施方案中，聚集剂分子干扰离子通道成分的功能。在另一特别优选的实施方案中，聚集剂分子干扰神经递质受体或配体的功能。另一方面，本发明提供了治疗处于神经疾病或病症风险中或者患有该疾病或病症的对象如人的方法。所述方法包括提供聚集剂分子例如具有本文所述结构的聚集剂分子，所述聚集剂分子能干扰介导神经疾病或病症的蛋白质，以及将所述聚集剂分子施用给对象，从而治疗该对象。在特殊的实施方案中，可以治疗的疾病(或病症)包括阿尔茨海默病(在这种情况中所述聚集剂分子干扰导致APP加工的分泌酶的功能，例如参与Y-分泌酶复合物的蛋白质(例如早老蛋白l或2、Aphl蛋白、呆蛋白、BACEl或者BACE2)。所述聚集剂抑制APP的加工并防止不溶的淀粉样13的形成。可以使用相同的策略预防和/或治疗其它神经变性疾病如亨廷顿病、脊髓小脑共济失调(例如SCA1、SCA2、SCA3(Machado-Jos印h病)、SCA7或者SCA8)。因此一方面，本发明提供了产生或生产药物或者药物组合物的方法，所述药物或药物组合物包含至少一种聚集剂分子以及进一步混合所述聚集剂分子与药物可接受的载体。在一个优选的实施方案中，聚集剂分子是多肽且可以合成产生或者是以重组蛋白产生。所述重组蛋白可以通过使用重组表达系统生产，所述表达系统包括细菌细胞、酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或者转基因动物或植物。重组蛋白可以通过接近均质和/或混合添加剂的任何常规蛋白质纯化方法纯化。包含聚集剂分子的药物组合物的施用可以是通过口服、吸入、经皮或者胃肠外(包括静脉内、肿瘤内、腹膜内、肌内、腔内和皮下)施用。活性化合物可以单独施用或者优选配制成药物组合物施用。单位剂量通常含有0.01-500mg，例如0.01-50mg、或13者0.01-10mg、或者0.05-2mg的化合物或者其药物可接受的盐。单位剂量通常每天施用一或多于一次，例如每天2、3或4次，更通常是每天1-3次，由此每天总剂量通常在0.0001-10mg/kg范围，因此对于70kg成年人而言适合的每天总剂量是0.01-700mg，例如0.Ol-lOOmg，或者0.Ol-lOmg，或者更通常为0.05_10mg。优选所述化合物或者其药物可接受的盐以单位剂量组合物形式施用，如单位剂量口服、胃肠外、经皮或者吸入组合物。这种组合物通过混合制备且适于口服、吸入、经皮或胃肠外施用，由此其可以是片剂、胶囊、口服液体制品、粉末、颗粒、锭剂、可复水(reconstitutable)粉末、可注射及可灌注溶液或悬浮液或者栓剂或气雾剂的形式。用于口服施用的片剂和胶囊通常以单位剂量呈现，含有常规的赋形剂如结合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、分散剂、着色剂、调味剂和增湿剂。所述片剂可以根据本领域熟知的方法包衣。适用的填充剂包括纤维素、甘露醇、乳糖及其它相似物质。合适的分散剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物如羟基乙酸淀粉钠。合适的润滑剂包括例如硬脂酸镁。合适的药物可接受的增湿剂包括十二烷基硫酸钠。这些固体口服组合物可以通过常规的混合、填充、压片等方法制备。重复的混合操作可用于将活性剂彻底分布于应用大量填充剂的这些组合物中。当然这种操作在本领域中式常规的。口服液体制备物可以是例如水或油悬浮液、溶液、乳状液、糖浆或者酏剂的形式，或者可以是在使用之前用水或者其它合适载体重建(reconstitution)的燥产物。合适的液体制备物可含有常规添加剂如悬浮剂例如山梨糖醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或者氢化可食用脂肪，乳化剂例如卵磷脂、单油酸山梨聚糖或者阿拉伯树胶；非水载体(可包括食用油)例如杏仁油、分馏椰子油，油脂如甘油酯、聚乙二醇或者乙醇；防腐剂，例如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯或山梨酸，以及如果需要的常规调味剂或着色剂。口服配制物还包括常规的缓释配制物，如具有肠衣的片剂或颗粒。优选地，吸入组合物是作为鼻吸剂或气雾剂或者喷雾器溶液或者是吹入的微细粉末、单独或者组合惰性载体如乳糖施用给呼吸道。在这种情况中，合适的活性化合物的颗粒直径低于50微米，优选低于10微米，例如在1-5微米如2-5微米之间。或者可以使用包被的纳米颗粒，颗粒大小在30-500nm之间。优选吸入剂量在0.05-2mg例如0.05-0.5mg、0.l-lmg或者0.5-2mg的范围内。对于胃肠外施用，制备含有本发明化合物和无菌载体的液体单位剂量形式。根据载体和浓度，活性化合物可以是悬浮或者溶解的。胃肠外溶液通常通过将化合物溶解于载体中并且过滤灭菌、之后填充于合适的小瓶或安瓿中并密封而制备。有利地，也可以将佐剂如局麻剂、防腐剂和缓冲剂溶解于载体中。为了增强稳定性，可以在将组合物填充于小瓶中以及在真空下出去水分之后冷冻。以基本相同方式制备胃肠外悬浮液，不同之处是将化合物悬浮于而不是溶解于载体中且在悬浮于无菌载体之前暴露于环氧乙烷灭菌。有利地，组合物中包含表面活性剂或者增湿剂以促进活性化合物的均匀分布。适当时，可以包含少量支气管扩张剂例如拟交感胺如异丙肾上腺素、异他林(isoetharine)、沙丁胺醇(salbutamol)、去氧肾上腺素和麻黄碱；黄嘌呤衍生物如茶碱和氨茶碱，以及皮质类固醇如强的松龙和肾上腺剌激剂如ACTH。在正常情况下，所述组合物通常附有书写或打印的用于医学治疗中的使用指导。在一个优选的实施方案中，所述聚集剂分子进一步包含蛋白质转导结构域。已经示出称作蛋白质转导结构域(PTD)的一系列小型蛋白质结构域有效且不依赖于转运蛋白或特异性受体穿过生物膜，并且促进肽和蛋白质输送至细胞中。例如，人免疫缺陷病毒(HIV-1)的TAT蛋白能在体内输送生物学活性蛋白质。相似地，触角足(Ante皿即edia)同源结构域的第三个a-螺旋和单纯疱疹病毒的VP22蛋白促进共价连接肽或蛋白质输送进细胞中(见FordKGetal(2001)GeneTher.8，1-4综述)。基于短的两亲性肽载体P印-l的蛋白质输送可以将各种肽和蛋白质以完全生物学活性形式有效输送至一些细胞系中，不需要预先化学共价偶联(MorrisMCetal，(2001)Nat.Biotechnol.19，1173-1176)。VP22嵌合蛋白从最初转导细胞传播至周围细胞的能力可以改良基因治疗方法(ZenderLetal(2002)CancerGeneTher.9，489-496)。促进蛋白质转导的序列为本领域技术人员已知，包括但不限于蛋白质转导结构域。优选地，所述序列选自包括HIVTAT蛋白、聚精氨酸序列、penetratin和p印-l的组中。其它常用的可透过细胞的肽(天然肽以及人工肽)在JoliotA.andProchiantzA.(2004)NatureCellBiol.6(3)189-193中揭示。药物组合物的第二方面是使用编码聚集剂分子的核苷酸序列。在使用编码聚集剂分子的核酸序列的情况中，所述药物优选用于在基因治疗中将所述核酸输送至细胞。本领域技术人员熟知许多输送方法。优选施用所述核酸用于体内或离体(exvivo)基因治疗应用。非病毒载体输送系统包括DNA质粒、裸核酸以及与输送载体如脂质体复合的核酸。病毒载体输送系统包括DNA和RNA病毒，其在输送至细胞之后具有附加型或整合的基因组。非病毒输送核酸的方法包括脂转染、显微注射、生物射弹(biolistics)、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒，以及制剂增强的DNA吸收。脂转染在例如USPat.No.5，049，386、USPatNo.4，946，787和USPat.No.4，897，355中描述，脂转染试剂可商购(例如Transfect咖TM和Lipofectin)。适于多核苷酸的有效受体识别脂转染的阳离子和中性脂质包括在Flegner的W091/17424、W091/16024中所述的那些。可以输送至细胞(离体施用)或者靶组织(体内施用)。脂质核酸复合物包括靶向的脂质体如免疫脂质复合物的制备为本领域技术人员熟知(见例如Crystal,1995;Blaeseetal.，1995;Behr，1994;Remyetal.，1994;GaoandHuang，1995;U.S.Pat.No.4，186，183，4，217，344，4，235，871，4，261，975，4，485，054，4，501，728，4，774，085，4，837，028以及4，946，787).使用用于输送核酸的基于RNA或DNA病毒系统利用了使病毒靶向体内特异细胞且运输病毒荷载至核的高度进化过程。病毒载体可以直接施用给患者(在体内)或者可用于在体外治疗细胞并将修饰的细胞施用给患者(离体)。常规的基于病毒的输送核酸的系统包括例如用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒以及单纯疱疹病毒载体。病毒载体目前是最有效且通用的在靶细胞和组织中基因转移的方法。用逆转录病毒、慢病毒和腺伴随病毒基因转移方法可以实现在宿主基因组中的整合，通常导致被插入的转基因的长期表达。此外，在许多不同类型细胞和靶组织中观测到高转导效率。在优选核酸瞬时表达的情况中，可以使用基于腺病毒的系统，包括复制缺陷腺病毒载体。基于腺病毒的载体在许多细胞类型中能非常高效转导而不需要细胞分裂。使用这种载体，已经获得高效价和高表达水平。这种载体可以在相对简便的系统中大量产生。腺伴随病毒(AAV)载体包括重组腺伴随病毒载体也用于用靶核酸转导细胞，例如在体外产生核酸和肽中，以及用于体内和离体基因治疗过程中(见例如U.S.PatentNo.4，797，368;W093/24641;Kotin，151994;重组AAV载体的构建在许多出版物中描述，包括U.S.Pat.No.5，173，414;Hermonat&Muzyczka，1984;S画lskietal.，1989)。基因治疗载体可以通过施用给个体患者而体内输送，典型通过系统施用(例如静脉内、腹膜内、肌内、气管内、皮下或者颅内注入)或者局部应用。在一个特异实施方案中，本发明还涉及流体力学基因治疗方法的应用。流体力学基因治疗在US6627616(MirusCorporation,Madison)中揭示，包括血管内输送编码聚集剂的非病毒核酸，从而通过例如使所述血管内部压力增加或者通过共同施用增加血管通透性的化合物如罂粟碱增加血管通透性。或者，载体可以输送至离体细胞，如从各个患者外植的细胞(例如淋巴细胞、骨髓穿剌细胞、组织活检)或者通用的供体造血干细胞，通常在选择已经掺入载体的细胞之后将该细胞再植入患者中。用于诊断、研究或者基因治疗的离体细胞转染(例如通过将转染的细胞再注入宿主生物体中)为本领域技术人员熟知。在一个优选实施方案中，细胞分离自对象生物体，用核酸(基因或cDNA)转染，并且再注入该对象生物体(例如患者)。适于离体转染的各种细胞类型为本领域技术人员熟知(见例如Freshneyetal.，1994及其中关于论述怎样分离和培养患者细胞的参考文献)。在再一个实施方案中，本发明的蛋白质聚集(或者蛋白质干扰)方法可用于确定能介导蛋白质干扰的细胞或生物体中蛋白质的功能。所述细胞可以是原核细胞或者可以是真核细胞或者可以是细胞系，例如植物细胞或动物细胞，如哺乳动物细胞，例如胚胎细胞、多能干细胞、肿瘤细胞如畸胎癌细胞或者病毒感染的细胞。所述生物体优选是真核生物体，例如植物或动物，如哺乳动物，特别是人。本发明的聚集剂分子针对的靶蛋白质可以与病理状况相关。例如，所述蛋白质可以是病原体相关蛋白，例如病毒蛋白、肿瘤相关蛋白或者自身免疫疾病相关蛋白。所述靶蛋白质也可以是在重组细胞或者遗传改变的生物体中表达的异源基因。通过抑制这种蛋白质的功能，可以获得在农业领域或者在医药或兽用医药领域的重要信息和治疗益处。在特别优选的实施方案中，本发明的方法使用呈现靶蛋白质特异性敲除表型的真核细胞或者真核非人生物体，所述表型包含至少一种内源靶蛋白质的至少部分缺陷表达，其中将所述细胞或生物体与能抑制至少一种内源靶蛋白质功能的至少一种聚集剂分子接触或者与编码能干扰至少一种内源蛋白质的功能和/或存在的至少一种聚集剂分子的载体接触。应注意由于聚集剂分子的特异性，因此本发明也可以允许对一些不同的内源蛋白质进行靶特异性敲除。细胞或非人生物体、特别是人细胞或者非人哺乳动物的蛋白质特异性敲除表型可用于分析过程中，例如用于复杂的生理学过程的功能和/或表型分析如蛋白质组分析。例如，可以在培养细胞中制备假定是可变剪接过程的调节剂的人蛋白质的敲除表型。其中这些蛋白质特别是SR剪接因子家族成员，例如ASF/SF2、SC35、SRp20、SRp40或者SRp55。此外，可以分析SR蛋白对于预先确定的可变剪接基因如CD44的mRNA谱的作用。使用本文描述的基于蛋白质敲除技术，耙细胞或靶生物体中内源靶蛋白质的表达可被抑制。所述内源蛋白质可以由编码靶蛋白质或者靶蛋白质变体或突变形式的外源靶核酸例如基因或cDNA互补，其任选可以与编码可检测肽或多肽的另一个核酸序列融合，例如亲和性标记，特别是多重亲和性标记。靶蛋白质的变体或突变形式与内源靶蛋白质的区别在于氨基酸取代、插入和/或缺失一或多个氨基酸而与内源蛋白质不同。所述变体或突变形式可以具有与内源靶蛋白质相同的生物学活性。另一方面，所述变体或突变的靶蛋白质也可以具有与内源靶蛋白质不同的生物学活性，例如部分缺失的活性、完全缺失的活性、增强的活性等。所述互补可以通过共表达外源核酸编码的多肽而实现，所述多肽例如包含靶蛋白质及亲和性标记以及用以敲除靶细胞中的内源蛋白质的聚集剂分子的融合蛋白。这种共表达可以通过使用合适的表达载体实现，所述表达载体表达外源核酸编码的多肽例如标记修饰的靶蛋白质以及聚集剂分子，或者这种共表达通过使用表达载体组合或者聚集剂分子可以在细胞外接触靶细胞而实现。在靶细胞中重新合成的蛋白质和蛋白质复合物含有所述外源蛋白质，例如修饰的融合蛋白。为了避免外源蛋白质功能被聚集剂分子抑制，所述外源蛋白质在选择用于设计聚集剂分子的聚集区中必须具有足够的氨基酸差异。或者，所述内源靶蛋白质可以用来自其它物种的相应蛋白质互补，或者内源靶蛋白质可以用所述靶蛋白质的剪接形式互补。内源蛋白质的敲除及通过使用突变的例如部分缺失的外源靶蛋白质的拯救的组合与使用敲除细胞相比具有优势。此外，这种方法特别适用于鉴别靶蛋白质的功能性结构域。在另一个优选实施方案中，对比至少两个细胞或生物体的基因表达谱和/或蛋白质组和/或表型特征。这些生物体选自(i)无靶蛋白质抑制的对照细胞或者对照生物体，(ii)具有靶蛋白质抑制的细胞或生物体，以及(iii)具有靶蛋白质抑制加上编码所述靶蛋白质的外源靶核酸互补靶蛋白质的细胞或生物体。本发明的方法也适用于鉴别和/或鉴定药物制剂例如从一组检测物质中鉴别新的药物制剂和/或鉴定已知药物制剂的作用机制和/或副作用的程序中。因此，本发明还涉及鉴别和/或鉴定作用于至少一种靶蛋白质的药物制剂的系统，该系统包含(a)能表达编码所述靶蛋白质的至少一个内源靶基因的真核细胞或者真核非人生物体，(b)能抑制所述至少一个内源靶基因表达的至少一种聚集剂分子，以及(c)一种检测物质或者一组检测物质，其中所述检测物质或者所述一组检测物质的药学性质需要被鉴别和/或鉴定。此外，上述系统优选包含(d)编码靶蛋白质或者靶蛋白质的变体或突变形式或剪接形式的至少一个外源靶核酸，其中所述外源靶蛋白质与内源靶蛋白质的区别在于聚集区的氨基酸水平不同，由此与内源蛋白质表达相比外源靶蛋白质的功能基本上被聚集剂分子较少地抑制。此外，本发明还包括包含聚集剂分子的细胞和生物体。生物体可例如是转基因植物，其携带编码聚集剂的遗传信息。在一个优选的实施方案中，这种转基因植物是沉默植物(即由于所述植物的一部分细胞或器官或者所有细胞和器官中存在特异聚集剂导致特定的靶蛋白质被下调)。包含聚集剂的细胞可以通过将所述细胞与特定聚集剂分子接触或者用特定聚集剂分子电穿孔所述细胞而产生。在一个特异实施方案中，包含聚集剂的细胞是通过转染(或者转化)产生的，其中所述聚集剂由重组表达载体如质粒或病毒载体编码。分离分离与检测在另一个实施方案中，本发明提供了从样品中分离蛋白质的方法，所述方法包括将所述样品与非天然发生的分子接触并且从所述样品中分离所得共聚集的分子_蛋白质复合物，所述非天然发生的分子包含与能结合靶蛋白质的区域融合的至少一个P-聚集区。换言之，本发明提供了从样品中分离蛋白质的方法，所述方法包括-将所述蛋白质与包含A部分和B部分的非天然发生的分子接触，其中i)A部分是能结合蛋白质的区域，ii)B部分包含至少一个由至少3个连续氨基酸组成的P-聚集区，其中A部分和B部分之间任选存在接头；-从所述样品中分离所得共聚集的分子_蛋白质复合物。分离在另一个实施方案中，分离至少一种蛋白质的方法进一步包括从样品中分离至少一种蛋白质。从样品中分离至少一种蛋白质的一个应用是从样品中除去(或耗竭)高丰度蛋白质。事实上，耙蛋白质发现及确认中的主要问题是怎样特异性剖析复杂的蛋白质样品(例如血浆、尿液、脑脊液)并测量微量靶。高丰度蛋白质通常比低丰度蛋白质浓度高出6-10个数量级。因此，必须除去高丰度蛋白质以检测并测量医药学重要的微量蛋白质。由于白蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、IgA、运铁蛋白和触珠蛋白组成人血清中总蛋白质含量的大约90X，因此非常需要诊断工具以快速耗竭这些不希望的高丰度蛋白质并揭示低丰度的低分子量蛋白质生物标记。一些方法已经用于本领域中1)免疫球蛋白G(IgG)作为亲和性试剂捕获和分离高丰度蛋白质靶，2)卵黄免疫球蛋白(IgY)是分离自经免疫的禽类卵黄的IgG-样抗体，3)使用预分级分离法将蛋白质混合物分离成不同级分以除去原始混合物中的某些蛋白质，4)蛋白质A和蛋白质G是细菌细胞壁蛋白，与IgG抗体具有特异性，因此蛋白质A和G亲和性树脂可以除去IgG，以及5)IgG-和IgY-小珠用于蛋白质检测。检测在另一特异实施方案中，分离至少一种蛋白质的方法进一步包括检测所述分子_蛋白质复合物中至少一种蛋白质。可以通过例如电泳、柱层析、离心、过滤、静电吸附、磁性或顺磁性吸附、质谱分析等方法分离聚集剂分子_靶蛋白质复合物进行检测。在一个特异实施方案中，聚集剂分子由与P-聚集区融合的小化学化合物或者药物(例如其靶向的蛋白质未知的活性药物化合物)组成。这种聚集剂分子可用于鉴别(或者检测)复杂的蛋白质混合物(例如细胞溶解产物)中的药物靶。最广泛使用的生物检测技术基于抗体的使用。抗体基于其形状和物理化学性质识别并结合其它分子。抗体特别适于检测复杂的蛋白质混合物中存在的少量靶蛋白质。本发明揭示了当聚集剂分子结合区与抗体结合元件不同时，聚集剂分子(对于至少一种特定蛋白质具有特异性和亲和性(识别))可以代替抗体(作为识别元件)用于靶蛋白质的特异性捕获。事实上，聚集剂分子可用于典型使用抗体的许多应用中。仅举几个例子是在诊断、微观分析、法医以及病原体的特异检测中。对于本发明的检测和分离应用，可以使对于指定靶蛋白质具有特异性的聚集剂分子与载体结合。载体可以是平坦表面如塑料或硝化纤维素或者层析柱，但优选是珠如小球状珠。聚集剂的结合(偶联)可以通过A部分(对于特定蛋白质具有亲和性的结合区)或者B部分(至少一个P-聚集区)介导。关于适合结合聚集剂分子的各种类型珠和小球体的一般论述在US6682940的第9和10页描述，所述文献在此援引加入。在一个特异实施方案中，聚集剂分子结合在碳水化合物类型载体上，例如纤维素或琼脂糖。可以使用交联剂如戊二醛使聚集剂与所述碳水化合物载体共价偶联。18在另一特异实施方案中，聚集剂结合在如纤维素、玻璃或合成聚合物等支持物上。可以通过A或B部分的氨基酸残基与叠氮化物、碳二亚胺、异氰酸盐/酯或者其它化学衍生物进行共价附着。在再一特异实施方案中，所述支持物是多孔硅烷化玻璃微珠。聚集剂可以通过其肽胺基团与和硅原子化学连接的縮水甘油氧基丙基硅烷的高碘酸盐氧化作用形成的醛基团共价结合(通过Schiff反应，随后用氢硼化钠还原)(这个偶联在SportsmanandWilson(1980)Anal.Chem.52,2013-2018中描述)。在一特异实施方案中，所述载体部分由与聚集剂交联的蛋白质样膜包膜(见US4478946中权利要求1_50及关于载体的实施例)。在另一特异实施方案中，所述支持物是荧光珠如荧光乳胶颗粒。专利US4550017、特别是在第4页中描述了可用于生产荧光珠的荧光化合物。在另一特异实施方案中，所述珠的大小可变，其也可以含有或者充满荧光染料。由于珠的大小以及染料可变，因此可以在一个反应中检测且量化多个蛋白质。揭示这种珠的方法在US6159748中描述。在再一特异实施方案中，珠与聚集剂之间的偶联通过聚(苏氨酸)、聚(丝氨酸)、葡聚糖或者聚(乙二醇)连接。US6399317的实施例6、7、8和9例证了怎样进行这种偶联。在再一特异实施方案中，所述支持物是磁珠。磁珠、磁珠与蛋白质物质(如多肽聚集剂)之间的偶联及其应用在US6489092第8页描述。定义除非另有限定，本文所用所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。尽管在实施或测试本发明时可以使用与本文所述相似或等价的方法和材料，描述了优选的方法和材料。为本发明目的，下述术语定义如下。本文所用冠词"一个"是指一或多于一个(即至少1个)该冠词的语法宾语。例如，"一个靶蛋白"是指一个靶蛋白或多于一个靶蛋白。如本文所用，术语"大约"是指数量、水平、值、尺寸、大小或量与参考数量、水平、值、尺寸、大小或量相比变化至多30%、优选至多20%、更优选至多10%。"双官能交联试剂"是指含有两个反应基团的试剂，该试剂由此具有共价连接两个元件如聚集剂分子的A部分和B部分的能力。交联试剂中的反应基团典型地属于包括琥珀酰亚胺基酯、马来酰亚胺和卤代乙酰胺如碘乙酰胺的官能团类别。在整个说明书中，除非上下文需要相反，单词"包含"应被理解为暗示包括所述步骤或元件或步骤或元件组，但不排除任何其它步骤或元件或步骤或元件组。"表达载体"或"重组载体"是指能够指导由该载体编码的聚集剂分子的合成的任何自主遗传元件。这种表达载体是本领域技术人员已知的。"衍生物"是指聚集剂分子，其通过修饰例如通过缀合或复合其它化学部分(例如PEG化)或通过本领域了解的翻译后修饰技术衍生自基础序列。术语"衍生物"范围还包括对亲代序列产生的变化，包括添加或缺失，其提供功能等价分子。"有效量"在调节活性或治疗或预防病症上下文中是指施用该量的聚集剂分子给需要这种调节、治疗或预防的个体，以单剂量或作为系列的部分施用，其有效调节该作用或治疗或预防该病症。有效量根据被治疗个体的健康和生理状态、被治疗个体的分类学组、组合物配方、医学状况的评估及其它相关因素而变化。预期该量会落入相对宽的范围，可以通过常规试验确定。"分离的"是指基本上或实质上不含在其天然状态中通常伴随的组分的材料。例如，"分离的多肽"如本文所用是指从在天然状态下在其两侧的序列中纯化的多肽，例如已从通常相邻于所述序列的序列取出的P-聚集序列。e-聚集序列可以通过氨基酸化学合成产生或者可以通过重组产生。术语"寡核苷酸"如本文所用是指由多个核苷酸单位(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关结构变体或合成类似物)经磷酸二酯键连接组成的聚合物(或其相关结构变体或合成类似物)。寡核苷酸典型地长度较短，通常大约10-30个核苷酸，但是该术语可以指任何长度的分子，尽管术语"多核苷酸"或"核酸"典型用于大的寡核苷酸。术语"多核苷酸"或"核酸"如本文所用是指mRNA，RNA，cRNA，cDNA或DNA。该术语典型地指长度大于30个核苷酸的寡核苷酸。术语"重组多核苷酸"如本文所用是指在体外操纵核酸形成为不是在自然界通常发现的形式的多核苷酸。例如，重组多核苷酸可以是表达载体形式。通常这种表达载体包括可操纵连接于核苷酸序列的转录和翻译调节核酸。"可操纵连接"是指转录和翻译调节核酸相对于编码多肽的多核苷酸以该多核苷酸被转录和多肽被翻译的方式放置。术语"对象"或"个体"或"患者"在本文可互换使用，是指任何对象、特别是脊椎动物对象、更特别是哺乳动物对象，其希望治疗或预防。落入本发明范围的合适的脊椎动物包括但不限于灵长类、禽类、鱼类、爬行类、家畜(例如羊、牛、马、驴、猪)、实验室试验动物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、陪伴动物(例如猫、狗)和捕获野生动物(例如狐狸、鹿、澳洲野狗)。但是，应理解前述术语不暗示症状存在。"药学可接受载体"是指可以安全用于患者的局部或系统施用的固体或液体填充剂、稀释剂或包囊物质。"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物，及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物(其中一或多个氨基酸残基是合成的非天然发生的氨基酸，如相应天然发生氨基酸的化学类似物)以及天然发生的氨基酸聚合物。"重组多肽"是指用重组技术制备的多肽，即通过表达重组或合成多核苷酸制备。当嵌合多肽或其生物学活性部分是重组产生的时，优选其基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制备物体积的大约20%以下，更优选大约10%以下，最优选大约5%以下。术语"序列相同性"如本文所用是指序列根据比较窗在核苷酸对核苷酸基础或氨基酸对氨基酸基础上的相同性。因此"序列相同性百分比"是如下计算在比较窗比较两个最佳排列的序列，确定在两个序列中发生相同核酸碱基(例如A，T，C，G，I)或相同氨基酸残基(例如Ala，Pro，Ser，Thr，Gly，Val，Leu，Ile，Phe，Tyr，Trp，Lys，Arg，His，Asp，Glu，Asn，Gln，Cys和Met)的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗的总位置数(即窗口大小)，将结果乘以100获得序列相同性百分比。为本发明目的，"序列相同性"应被理解为由DNASIS计算机程序(Windows版本2.5;可得自HitachiSoftwareengineeringCo.，Ltd.，SouthSanFrancisco,Calif.，USA)计算的"匹配百分比"，使用软件所附参考手册中使用的标准默认值。"相似性"是指相同或组成保守取代的氨基酸百分数。相似性可以用序列比较程序如GAP(Deverauxetal.1984，NucleicAcidsResearch12,387—395)确定。以此方式，与本文所述那些相似或基本上不同长度的序列可以通过在排列中插入缺口而比较，这种缺口例如通过GAP使用的比较算法确定。术语"转化"是指通过导入外源或内源核酸使生物体例如细菌、酵母或植物的基因型改变。用于转化的载体包括质粒、逆转录病毒和其它动物病毒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)等。"载体"是指多核苷酸分子，优选DNA分子，其衍生自例如质粒、噬菌体、酵母或病毒，其中可以插入或克隆多核苷酸。载体优选含有一或多个独特限制位点并且能在限定的宿主细胞包括靶细胞或组织或其祖先细胞或组织中自我复制，或者可以与限定宿主的基因组整合从而克隆的序列是可繁殖的。因此，载体可以是自我复制载体，即作为染色体外成分存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如线性或闭合环状质粒，染色体外元件，微染色体或人工染色体。载体可以含有保证自身复制的任何手段。或者，载体可以是当导入宿主细胞时整合进基因组并且与其整合进的染色体一起复制的载体。载体系统可以包含单个载体或质粒，两个或更多个载体或质粒，其一起含有待被导入宿主细胞基因组中的总DNA，或者转座子。载体的选择典型依赖于载体与导入载体的宿主细胞的相容性。在优选的实施方案中，载体优选是病毒或病毒衍生载体，其在动物中优选在哺乳动物细胞中是可操纵地功能性的。载体还可以包括选择标记如抗生素抗性基因，可用于选择合适的转化体。这种抗性基因的例子是本领域技术人员已知的，包括赋予对卡那霉素及G418(Geneticin)抗性的即tll基因及赋予对潮霉素B的抗性的hph基因。除非另有定义，本文所用所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的相同含义。尽管在实施或测试本发明时可以使用与本文所述相似或等价的方法和材料，以下描述有用的方法和材料。材料、方法及实施例是示意性而非限制性。本发明其它特点和优点从详细描述和权利要求中显而易见。实施例1.从溶液中耗竭酶在这个实施例中通过将作为结合区的生物素融合偶联至P-聚集区而构建聚集剂。这一聚集剂用于耗竭辣根过氧化物酶(HRP)和链霉抗生物素蛋白(来自阿维丁链霉菌(Str印tomycesavidinii)的60kDa蛋白质链霉抗生物素蛋白)之间的N-末端融合蛋白。HRP是一种将3，3'，5，5'_四甲基联苯胺(TMB)转化为在370nm有效吸光的蓝色产物的酶。生物素(作为结合元件)对链霉抗生物素蛋白具有强亲和性(生物素-链霉抗生物素蛋白复合物的解离常数(Kd)在10—"mol/L数量级)。使用TANG0算法鉴别来自大肠杆菌的P-半乳糖苷酶的e-聚集氨基酸序列。合成这个e-聚集氨基酸序列(得自JeriniP印tideTechnologies,Germany)并偶联于生物素分子(作为N_末端融合体)，产生具有下述序列的聚集剂生物素-ALAVVLQ-NH2。为了显示融合蛋白HRP-链霉抗生物素蛋白由于与聚集剂共聚集而从溶液的耗竭，我们将聚集剂与链霉抗生物素蛋白-HRP融合蛋白共保温。这个实验的目的是经过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用，HRP酶将与聚集肽共聚集，导致在可溶级分中HRP活性降低。为此，链霉抗生物素蛋白-HRP原液(AbDSerotec，产品号710005)在PBS中稀释1:20，000并与终浓度为1PM的聚集剂保温。样品在室温于750rpm振荡保温过夜。包括由融合蛋白SA-HRP单独在相同缓冲液(PBS加上10%DMSO)组成的对照样品。另外，也包括非生物素酰化的P-聚集序列的对照样品以证实特异性。在过夜保温后，共聚集材料通过在冷却的台式微型离心机中在17000g于l(TC离心15分钟从样品中除去。回收10iiL上清并加入96孔板(Falcon,353072)中的90yLTMB溶液中。这个混合物在室温保温l分钟，之后通过加入100iiL2M!12504停滞比色反应。所得黄色产物的吸光度在0045。用UltraMicroplateReader(BioTEK，ELx808IU)测量。图1示出在离心除去聚集物(见上)后上清中残余HRP活性百分比。聚集剂(生物素酰化肽)的存在明显从可溶级分除去酶。2.从溶液耗竭单克隆抗体我们构建了聚集剂分子，其中B部分由3个合成的P-聚集区组成，所述|3-聚集区具有连接所述P_聚集区的2个氨基酸的短接头(STLIVL-QN-STVIFE-QN-STVIFE)。所述3个P-聚集区是六肽，其具有强聚集倾向。注意在本发明中所有氨基酸序列均从氨基末端部分开始示出并以羧基末端部分的方向读出-因此，"STLIVL"读作"NH2-STLIVL-COOH")。合成的干扰物(interferor)分子的B部分N_末端融合于结合区(A部分)，结合区防止所述P-聚集区的自聚集并使所述P-聚集区与环境(在此为大肠杆菌的细胞溶胶)直接接触(图l描绘了合成的聚集剂设计的结构)。所述结合区是NusA蛋白，其在重组蛋白生产中经常用作增溶标记13，N-末端与多组氨酸标记融合。制备所得合成干扰物分子(A-B-组氨酸标记结构)并以重组体方式在大肠杆菌中纯化。为通过与聚集剂共聚集而从溶液中耗竭单克隆抗体，我们采用了由对多组氨酸(6xHis)具有特异性的小鼠单克隆抗体融合于辣根过氧化物酶(HRP)组成的融合蛋白。HRP酶提供了抗体存在的读出系统(见实施例1)。通过将所述抗-hismAb与his-标记的聚集剂共保温，我们的目的在于通过与his-标记的聚集剂共聚集而从溶液中除去mAb(抗His-HRP)。为此，抗His-HRP在PBS中稀释1:5000并与终浓度为Ing/mL的聚集剂保温。样品在EppendorfThermomixer中在室温和37t:振荡(750rpm)保温过夜。也包括由抗His-HRP单独在相同缓冲液中组成的对照样品。保温后，通过在台式微型离心机中离心(15min，l(TC，17，000g)从样品中除去聚集的材料。5X10iil每种上清快速回收进96孔板(Falcon,353072)。加入90iUTMB溶液并在室温保温1分钟后通过加入100iiL2MH2S04终止反应。所得黄色产物的吸光度在OD450nm用UltraMicroplateReader(BioTEK，ELx808IU)测量。与10pg/iiL聚集构建体在RT保温过夜导致HRP活性下降为对照(其中不存在聚集剂)观测值的20.5%。[cms]参考文献1.Dobson，C.M.Protein-misfoldingdiseases:Gettingoutofshape.Nature418，729-730(2002).2.Dobson，C.M.Principlesofproteinfolding,misfoldingandaggregation.SeminCellDevBioll5，3-16(2004).3.Nelson,R.etal.Structureofthecross-betaspineofamyloid-likefibrils.Nature435,773-8(2005).4.Makin，O.S.，Atkins，E.，Sikorski，P.，Johansson,J.&Serpell，LC.Molecularbasisforamyloidfibrilformationandstability.ProcNatlAcadSciUSA102，315-20(2005).5.Hamada，D.，Yanagihara，I.&Tsumoto，K.Engineeringamyloidogenicitytowardsthedevelopmentofnanofibrillarmaterials.TrendsBiotechnol22，93-7(2004).6.Fernandez-Escami1la，A.M.，Rousseau,F.，Schymkowitz，J.&Serrano，LPredictionofsequence—dependentandmutationaleffectsontheaggregationofp印tidesandproteins.NatBiotechnol22，1302-6(2004).7.Chiti，F.，Stefani，M.，Taddei，N.，Ramponi，G.&Dobson，C.M.Rationalizationoftheeffectsofmutationsonpeptideandproteinaggregationrates.Nature424，805-8(2003).8.Pawar，A.P.etal.Predictionof"aggregation-prone"and"aggregation-susceptible"regionsinproteinsas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