专利名称：：早期肝癌检测的诊断测试的制作方法
技术领域：
：本发明提供了检测哺乳动物的早期肝细胞癌或肝细胞癌分级改变的方法和试剂盒。诊断标记物是基于对存在于体液如血清中的诊断性碳水化合物作谱(profiling)和鉴定。
背景技术：
：肝细胞癌(HCC)或肝癌是最常见的癌症之一并且是导致世界范围内死亡的首要原因之一(1)。HCC通常发生在乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)感染后的硬化肝中(2，3)。确实，肝硬化是重要的死亡原因并且是HCC发展的主要风险因素，60-80%的HCC之前是硬化(4)。因此，筛选硬化人群的早期HCC可减少死亡率。多种成像技术被用于诊断HCC，例如超声波检查术，计算机断层扫描和核磁共振成像(5，6)。但是这些技术不能区分良性肝损害如发育不良结节和HCC的硬化大结节。长期以来血清肿瘤标记物已被用作检测恶性肿瘤的有效方法(7-9)，它们是超声波检查术和计算机断层扫描诊断HCC时的有价值的补充(10-12)。血清AFP(甲胎蛋白)是广泛用于HCC诊断和随访的唯一的血清标记物(13，14)。新近的综合分析显示AFP敏感性和特异性变化广泛，这些变化不能完全归因于使用的不同截断值水平的阈值作用(15)。其他改良的血清学标记物(无论单独使用或联合其它的)对于早期HCC诊断是需要的。经肝或B淋巴细胞合成大多数的血清N-联糖蛋白。血清总N-聚糖的任何改变可以反应肝或B淋巴细胞生理学的改变。因为糖蛋白的糖链对于在多细胞生物体中维持分化细胞的有序"社会行为"是重要的，糖链的改变导致异常的分子基础例如肿瘤细胞侵入周围组织及其转移。在多种肿瘤中确实发现了N-联糖链的改变(6,16-18)。最近由于缺少适当的分析技术限制了糖组学在诊断上的应用，但是至少在血清N-糖组的情况下这已被克服了(19,20)。在本发明中我们评价了使用血清N-聚糖指纹作为工具诊断由乙肝病毒诱导的硬化病人的肝细胞癌(HCC)。特别地，我们发现分枝a(1，3)_岩藻糖基化聚糖在HCC病人中比硬化病人，纤维化病人和健康血供者中丰度更高，但是平分型(bisecting)GlcNac(N-乙酰葡糖胺)-核心a(1，6)-岩藻糖基化聚糖在硬化病人中升高。这2种聚糖形式的浓度和其对数比率(命名为GlycoHCCTest)与肝癌肿瘤分期相关。图1:上图显示麦芽糖寡糖作为糖质量参照。指示这些结构中的糖单位数(DP，聚合度)。总血清蛋白质中典型的去唾液酸化N-聚糖谱示于下图。N-聚糖峰的结构示于图下。峰1是无半乳糖，核心-a_1，6-岩藻糖基化双触角聚糖(agalacto，core-a-1，6-fucosylatedbiantennaryglycan)(NGA2F)，峰2是无半乳糖，核心-a-1，6-岩藻糖基化平分型双触角(NGA2FB)，峰3和峰4是单无半乳糖，核心-a_1，6_岩藻糖基化双触角(NG1A2F)，峰5是双半乳糖，双触角聚糖(NA2)，峰6是双半乳糖，核心-a-1，6-岩藻糖基化双触角(NA2F)，峰7是双半乳糖，核心-a-1，6-岩藻糖基化平分型双触角(NA2FB)，峰8是三触角(NA3)，峰9是分枝型a-1，3-岩藻糖基化三触角(NA3Fb)，峰10是核心-a_1，6-岩藻糖基化三触角(NA3Fc)，峰ll是四半乳糖，四触角(NA4)，峰12是分枝型a-l，3-岩藻糖基化四触角(NA4Fb)。用于结构式的符号是BP-连接的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc);IP-连接的半乳糖；Ka-l，3/6-连接的岩藻糖；參a/p-连接的甘露糖。图2:在硬化病人中检测HCC的衍生诊断变量的趋势。纵轴表示峰9，峰7和GlycoHCCTest的聚糖值。在HCC病人中峰9的聚糖值增加(A)，但是在硬化病人中峰7增加(B)。HCC组与硬化，纤维化和对照组比较，GlycoHCCTest显著增高(C)。误差线代表均数的95%置信区间。图3:接受者操作特征(R0C)曲线预测在硬化组使用GlycoHCCTest和AFP值检测HCC的临床意义。曲线下面积(AUC)显示GlycoHCCTest(0.81±0.03)的诊断能力类似AFP(0.78±0.03)。图4:肿瘤分期和聚糖值，AFT，GGT和AST/ALT比率之间的关系。分析具有限定肿瘤分期的98个HCC病人。与硬化组比较，HCC组中的峰9、GlycoHCCTest、AFP和GGT的水平显著增加，但是峰7和AST/ALT比率显著减少。峰9，GlycoHCCTest,AFP和GGT显示与肿瘤分期正相关，而峰7负相关。发现AST/ALT比率与肿瘤分期不相关。纵轴表示峰9(A)和峰7(B)的峰高，GlycoHCCTest(C)，AFP水平(D)，GGT水平(E)和AST/ALT比率(F)。误差线代表均数的95%置信区间。图5:GlycoHCCTest标记物和肝纤维化的相关性。使用Scheuer记分系统评估针对纤维化分期作图的GlycoHCCTest值。在GlycoHCCTest和纤维化分期之间无统计学显著相关性。上下拟合线代表均数值(中间拟合线)的95%置信区间。图6:峰9(b)和9'(a)的外切糖苷酶测序。使用NP-HPLC分离总血清N_聚糖和如指示使用单独或联合的外切糖苷酶阵列处理分离的级分。峰如图l所示编号。gal二半乳糖；fuc=岩藻糖；hex=N-乙酰葡糖胺。图7:外切糖苷酶处理总血清N-聚糖。使用a-l，3/4-岩藻糖苷酶处理总血清N-聚糖，显示峰9和12是GlycoHCCTest中定量的。这个酶分别转变这些结构为峰8和11，但是它们的异构结构9'和12'保持不变。峰如图1所示编号。gal=半乳糖；fuc=岩藻糖；hex二N-乙酰葡糖胺。图8:聚糖转移酶催化的反应图示。在HCC硬化病人中NA3Fb(峰9)浓度增加和NA2FB(峰7)水平降低可以由与GnT-111竞争底物的GnT-V活性增加并导致N-聚糖的Pl-6分枝来解释。这依次导致产生LexisX聚糖的a-l，3-FuT表达增加。也显示GlcNAcT-III表达增加的结果。虚线框显示Lewis结构的实例。图9:在硬化病人中用于诊断HCC的GlycoHCCTest和LogAFP之间的关系。使用针对LogAFP作图的GlycoHCCTest来分析针对80个硬化病人作图的227个HCC病人。2条垂直线代表在lng/ml和400ng/ml的AFP截断线，一条垂直线代表在AFP灰色区中(l-400ng/ml)在-0.34处的GlycoHCCTest的ROC确定的截断值。如果未检测到AFP，我们指定它的值为0.001ng/ml。图10:使用GlycoHCCTest和AFP值，接受者操作特征(ROC)曲线预测在AFP灰色区(l-400ng/ml)检测HCC的临床意义。在AFP灰色区glycoHCCTest可从硬化病人中区分HCC病人，正确性是83±3%。聚糖标记物的诊断能力比通常使用的AFP标记物高很多，在相同的病人组内AFP标记物具有更低的诊断正确性(53±3%)。图11:肿瘤分期和与AFP结合的聚糖值之间的关系。分析具有限定肿瘤分期的44个病人和AFP灰色区(l-400ng/ml)中的54个硬化病人。峰9单独和GlycoHCCTest显示与肿瘤分期的正相关，而单独的峰7负相关。未发现AFP值与肿瘤分期之间存在相关性。纵轴代表峰9(A)和峰7(B)的峰高，GlycoHCCTest(C)，AFP水平(D)，平分型GlcNac(峰2+峰7)(E)和峰9与GlcNac平分型的对数比率(F)。误差线代表均数的95%置信区间。发明目的和详细描述因为肝组织活检对于病人具有明显的不适和具有并发症风险，因此它不适合于并入慢性肝病病人的常规(通常是每年)的随诊中。因此临床上需要可以常规评估肝病进程和能够可靠地检测早期肝细胞癌的标记物。在本发明中，我们满足了这个需要并且我们已经发展了能够检测早期肝细胞癌的诊断剂。"早期"指肝细胞癌的T1和T2期(如本文材料和方法中的进一步描述)。在本发明中，我们已经鉴定了衍生自存在于血清中的糖蛋白的碳水化合物结构之间的比率并已鉴定衍生自这些参数的定量参数和研究的病人的组织学早期肝细胞癌分期之间的统计学相关性。换言之，在本发明中已令人惊奇地鉴定了诊断性碳水化合物的量或所述碳水化合物之间的相关量，这与早期肝细胞癌相关。本发明的第一个实施方案提供了检测哺乳动物早期肝细胞癌或肝细胞癌分级改变的方法，包括a)从哺乳动物获得血清或血浆样品，b)在所述样品中测量分枝a(1，3)-岩藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，6)-岩藻糖基化聚糖之间的比率和c)将所述比率归因于在所述哺乳动物中早期肝细胞癌的存在。在另一个实施方案中，本发明提供了检测哺乳动物早期肝细胞癌或肝细胞癌分级改变的方法，包括a)从哺乳动物获得血清或血浆样品，所述样品表示血清或血液N-联糖蛋白的总混合物，b)产生N-联碳水化合物或其衍生片段、或所述N-联碳水化合物或所述N-联碳水化合物片段的标记的衍生物、或由所述N-联碳水化合物或所述N-联碳水化合物片段的结构确定的所述N-联碳水化合物或所述N-联碳水化合物片段的特征的第一个谱；所述N-联碳水化合物或所述N-联片段得自血清或血浆样品中存在的血清或血浆蛋白质的总混合物，其中所述第一个谱代表所述样品中血清或血浆蛋白质总混合物的N-联碳水化合物部分的多样性和浓度，c)在所述第一个谱中测量分枝a(1，3)-岩藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，6)-岩藻糖基化聚糖的比率，d)比较在步骤c)获得的测量比率和获得自衍生自无肝细胞癌哺乳动物的谱的所述相同的分枝a(1，3)-岩藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，6)-岩藻糖基化聚糖的比率以检测肝细胞癌或肝细胞癌分级的改变，比较在步骤c)获得的数据和在所述相同哺乳动物中的比率以检测肝细胞癌或肝细胞癌分级的改变，其中所述比率代表所述哺乳动物的血清或血浆蛋白质的总混合物的分枝a(1，3)-岩藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，6)-岩藻糖基化聚糖的多样性和浓度，和e)将在步骤d)获得的比较结果归因于在哺乳动物中检测肝细胞癌或肝细胞癌分级的改变。在另一个实施方案中，分枝a(1，3)-岩藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，e)-岩藻糖基化双触角聚糖之间的比率是从血液蛋白质的分离血清计算(测量)的。术语"分离"指比率的计算不是根据存在于样品中的血清或血液蛋白质的总量而是根据与血液或血清样品分开(或分离)的特殊蛋白质(例如已知分泌自肝的N-糖基化蛋白)测量的。本领域已知分离蛋白质的方法(例如抗体_捕获技术)。分枝a(1，3)-岩藻糖基化聚糖示于图1并可以使用峰9或峰12或组合峰9和峰12。平分型GlcNac核心a(1，6)-岩藻糖基化聚糖示于图1并可以使用峰7或峰2或组合峰7和峰2。在另一个实施方案中，本发明提供了利用存在于血液或血清中的分枝a(1，3)-岩藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，6)-岩藻糖基化聚糖制备诊断检验以检测早期肝细胞癌或肝细胞癌分级的改变。在另一个实施方案中，本发明提供了利用存在于血液或血清中的分枝a(1，3)-岩藻糖基化聚糖和平分型GlcNac核心a(1，6)-岩藻糖基化聚糖联合检测血清中的甲胎蛋白浓度制备诊断检验以检测早期肝细胞癌或肝细胞癌分级的改变。文字"检测肝癌或肝细胞癌的方法"可被广泛理解为筛选、诊断或预后(监控)肝癌的方法。文字"肝癌或肝细胞癌分级的改变"指肝癌随时间的进展，其可以表示肝癌分期的进展或肝癌分期的稳定或肝癌分期的恶化。换言之，检测肝癌分级的方法是监控手段，其可用于预后预先诊断患有肝癌的病人(病人群体)和可用作生物标记物作为肝癌治疗剂的共同开发的辅助。文字"将比较结果归因于"指可以获得的结果的不同形式。"结果"可包括数值的增加，数值的减少，数值的稳定。或者"结果"可落入得自例如分析具有组织学确定的肝癌特异分期的一组病人的值的范围(例如95%置信区间，标准差)。在一个实施方案中，对于N-联糖蛋白检测本文所述碳水化合物的比率而没有任何所述碳水化合物的分离步骤；因此样品可以被这样使用和不意味着碳水化合物的任何分离步骤，但是文字"从体液样品分离"指的是碳水化合物分离自样品中存在的糖缀合物。在一个特殊的实施方案中，本发明的方法可用于监控给予患有肝癌的哺乳动物的治疗的作用。在另一个特殊的实施方案中，本发明的方法特异性检测早期肝癌。术语"特异性"指的是肝癌可与其他肝病不同地被诊断，所述其他肝病包括肝硬化或甚至晚期肝硬化或肝纤维化或还有其他肝病。文字"聚糖"和"碳水化合物"可互换。"糖缀合物"表示含碳水化合物部分的任意化合物(例如蛋白质或脂质)。文字"碳水化合物或其衍生片段"表示碳水化合物可被片段化以在片段化过程的产物之中产生至少一个寡糖或其衍生物。这个片段化过程的其他产物可包括单糖和寡糖或其衍生物。寡糖是化学结构由本领域已知为单糖的至少2个化学连接的单位组成的碳水化合物。所述片段化过程可包括酶的、化学的和物理的处理。例如，使用糖苷酶(例如唾液酸酶从碳水化合物去除唾液酸残基)处理(或消化)碳水化合物和因此获得的谱由碳水化合物片段组成。例如，可以进行糖苷酶消化以获得更简单的碳水化合物谱。采用化学方法通过柔和的酸解碳水化合物也可以去除唾液酸。在质谱分析方法中，文字"片段"指碳水化合物在分析过程中经常被片段化(例如碰撞诱导解离)，其中片段化产物也可以产生寡糖衍生物，其由化学连接到片段化发生之前是碳水化合物部分结构的残余的一或多个单糖的寡糖组成。本领域已知是质谱片段化过程的产物的这样的寡糖衍生物的实例是十字架切割(crossringcleavage)产物离子。"所述碳水化合物的特征"指其性质和/或数量由碳水化合物的结构确定的任意可测量参数。例如，这种可测量参数的实例是核磁共振参数如化学位移，同核和异核耦合常数，核欧沃豪斯效应和残留偶极耦合。或者，这种可测量参数可以是所述碳水化合物结合其他分子例如血凝素和识别特异性结构决6定簇或其组合的抗体的程度。或者，其他这种可测量参数可以是碳水化合物起酶的底物作用的能力的程度，所述酶特异性修饰某些碳水化合物如糖基转移酶和糖苷酶。使用肽N-糖苷酶F或其他本领域已知的内切糖苷酶酶促消化可以从血清或血液混合物中的糖蛋白释放N-聚糖。在另一个实施方案中，使用包括肼的本领域已知的方法释放N-聚糖。在谱是得自仍化学连接到混合物中糖缀合物的碳水化合物的情况中，一个实施方案包括在获得谱之前使用酶或化学过程修饰糖缀合物的非聚糖部分，例如修饰糖脂的脂质部分的蛋白酶或酶。文字"碳水化合物的谱"表示包含所述碳水化合物的定性和/或定量信息的任意实体。例如，这可以表示所述碳水化合物的电泳或层析谱。在一个特殊情况中，所述谱是所述碳水化合物的质谱。或者，所述谱可以是通过核磁共振分析获得的信息。在另一个实例中，所述谱可以是描述凝集素结合碳水化合物的定性或定量方面的信息。或者，所述谱可以是描述碳水化合物是特殊酶例如糖基转移酶或糖苷酶底物程度的信息。这样的信息可包括这种酶反应的副产物的读出检测，如在糖基转移酶反应中核苷酸以等摩尔量释放。在特殊的实施方案中，文字"产生碳水化合物的谱"或"对碳水化合物作谱"也可暗示聚糖结构被分离和随后被检测。通常在碳水化合物谱中可鉴定大量的碳水化合物。通常碳水化合物存在于复杂的混合物中并且需要分离才能进行有效的检测。使用包含电泳和层析的方法进行分离。使用包含抗体检测，凝集素检测，NMR，质谱和荧光的方法进行检测。在特殊的实施方案中，在产生聚糖谱之前需要从糖蛋白化学和/或酶促去除N-聚糖。本领域已知从糖蛋白制备N-聚糖的方法。在另一个特殊的实施方案中，在分离和检测之前需要衍生N-聚糖。在一个方案中，可联合DNA测序仪进行本发明的方法以对N-聚糖作谱(包括分离和检测)。但是，本领域技术人员已知这种方法也可应用于适于激光诱导荧光检测器的任何电泳系统。例如这样的系统包括PACE系列毛细管电泳系统(Beckmanlnstruments，Inc.，Fullerton，Calif.)。本发明也可以用于适合激光诱导荧光检测器的任意电泳系统。在另一个实施方案中也可以使用质谱检测方法如MALDI-TOF-MS检测至少一种碳水化合物或其衍生片段的量。在质谱方法中，碳水化合物经常被片段化并因此在所述方法中检测碳水化合物的片段。在另一个实施方案中也可以使用微流体学方法作谱。微流体学是一个快速成长的领域，其基于通过经借鉴自微芯片工业(光蚀刻和化学湿蚀刻)的技术在固体介质(主要是硅晶片或高纯度玻璃板)中产生的窄孔通道的流体迁移。通过毛细管作用或活性泵，液体可流经这些通道，通过电泳(Schmalzingetal(2001)MethodsMol.Biol.163，163-173)分析物在充满液体的通道中迁移。在另一个实施方案中，使用包括薄层层析(TLC)，高效液相层析或气相层析的方法通过层析分离进行碳水化合物的分离。术语"所述N-联碳水化合物或所述片段的标记的衍生物"指标记有导致有效检测碳水化合物的物质的N-联碳水化合物。所述标记的碳水化合物也被称为衍生的碳水化合物。例如，发荧光化合物可被用于标记碳水化合物。所述发荧光化合物优选也带有电荷以便于衍生的化合物在电泳条件下可以迁移。当荧光团标签未带有电荷时，其可与可产生电荷的物质偶联。所述荧光团标记也允许通过荧光定量测量衍生的碳水化合物。发荧光化合物如9-氨基芘-l，4，6-三磺酸(APTS)和8-氨基萘-l，3，6-三磺酸(ANTS)特别适于电泳分离衍生的碳水化合物。用于荧光标记碳水化合物的其他化合物包括2-氨基吡啶(AP)，5-氨基萘-2-磺酸盐/酯(ANA)，l-氨基-4-萘磺酸(ANSA)，l-氨基-6，8-二磺酸(ANDA)，3-(4-羧苯甲酰基)-2-喹啉甲醛7(CBQCA)，荧光黄，2-氨基吖啶酮和4-氨基苄腈(ABN)。在一个特殊的实施方案中，关于荧光标记的碳水化合物的检测，可使用本领域已知的任意检测方法，但是优选检测使用激光器如二极管激光器、He/Cd激光器或氩离子激光器进行。在一个特殊的实施方案中，使用基于电荷耦合装置(CCD)照相机的成像系统观测由电泳分离产生的标记的碳水化合物条带的谱。来自CCD照相机的信息随后以数字形式储存和经多种计算机程序分析比较个体之间与参照标准之间诊断性碳水化合物模式。在另一个特殊实施方案中，凝胶分离的诊断性碳水化合物可被转移到固定膜上，即印迹和然后用多种诊断性碳水化合物_特异性试剂如凝集素或所述诊断性碳水化合物的特异性单克隆或多克隆抗体探查。在一个特殊的实施方案中，本发明提供了在哺乳动物中检测肝纤维化的方法，包括通过使用特异性结合至少一种聚糖结构和/或糖缀合物的配体测量和检测衍生自患有或未患有纤维化的个体的样品中具有不同丰度的所述至少一种聚糖结构和/或糖缀合物。配体包括凝集素和抗体。例如，体液样品中具有"平分型GlcNAc"残基的N-聚糖结构(或其缀合物)(GnT-III产物)的增加的丰度可以用特异性识别用平分型GlcNAc修饰的聚糖(或其缀合物)的凝集素如来自红腰豆(Phaseolusvulgaris)的红细胞凝集素(E-PHA)，膜联蛋白V(动物凝集素)或其具有例如改良的特异性的突变体或这种修饰聚糖的特异性抗体检测。因此，E-PHA凝集素可用于检测平分型GlcNacal-6岩藻糖基化葡聚糖结构(在实例中还命名为聚糖(或峰)2和7)。或者，通过结合N-聚糖(或其缀合物)到仅结合未被平分型GlcNAc残基替代的N-聚糖(或其缀合物)的凝集素的降低可检测具有"平分型GlcNAc"残基的N-聚糖结构(或其缀合物)的增加的丰度。这种凝集素的实例是来自洋刀豆(Canavaliaensiformis)的凝集素(ConA)。使用来自Lotustetragonolobus的凝集素LotusA和来自鳗鲡(Anguillaanguilla)的凝集素AAA可检测a1-3岩藻糖基化聚糖结构(在实例中也命名为聚糖(或峰)9)。或者，使用(1，3)岩藻糖(抗-岩藻糖抗体)和平分型(抗-平分型抗体)的特异性抗体可免疫检测平分型聚糖和al-3岩藻糖基化聚糖。在本发明中术语"平分型"和"平分型GlcNac"可互换使用。在另一个实施方案中，所述碳水化合物作谱方法可以通过用不同于附着所述碳水化合物分析物的标记的生色团或荧光团标记的一或多个内部标准的预电泳补充。通过将衍生的碳水化合物的电泳迁移率与内部标准混合物的成分的迁移率参照，内部标准允许精确和可重复地确定衍生的碳水化合物的电泳迁移率。例如，罗丹明标记的寡核苷酸标准Genescan500(AppliedBiosystems，FosterCity，CA，USA)或罗丹明标记的6_，18-，30-，和42-具体寡核苷酸的混合物在作谱之前可加入衍生的聚糖中。在标记分析样品之前标记诊断标准；但是优选诊断标准在标记分析标准时伴随标记。而且优选定量标准中的诊断性碳水化合物以提供与分析样品中诊断性碳水化合物的量的定量或定性比较。优选用于分析的体液是那些可方便地获得自病人的体液，特别优选体液包括血清和血浆。虽然进行本发明时不需要在(衍生的)聚糖作谱之前预处理样品，在一个特殊的实施方案中，在分离和定量诊断性碳水化合物之前需要处理分析样品。依据依赖于样品液体的选择和诊断性碳水化合物性质的许多因素，处理样品的预先方法可不同；这些因素包括诊断性碳水化合物的丰度，背景碳水化合物的浓度，干扰分子例如不利影响诊断性碳水化合物条带迁移或诊断性碳水化合物的荧光标记的分子的存在，和是否荧光标签需要与衍生的诊断性碳水化合物分离。适合这个处理或预处理样品的方法包括透析，去除干扰分子(例如用于有效质谱检测的盐)；超滤，浓縮诊断性碳水化合物和去除干扰分子；离心，去除干扰颗粒或浓縮细胞；沉淀，去除干扰分子，从血清去除白蛋白以富集糖基化蛋白质和因此富集较低丰度的聚糖，使用糖苷酶去糖基化(例如唾液酸酶消化聚糖)以产生更简单的聚糖谱；层析例如亲合层析以从血清去除例如白蛋白。在本发明另一个实施方案中，为了能够测量碳水化合物的相对量，诊断标准包括在凝胶上，用于在对象样品中分析诊断性碳水化合物；但是，在与分析样品暴露的条件相似的条件下，也可以通过与从预先进行了荧光团辅助碳水化合物电泳的诊断标准产生的储存记录比较获得诊断标准体现的信息例如条带迁移距离和强度。诊断标准可以是阳性的，即相应于患病个体中的全部碳水化合物模式，或是阴性的，即相应于未患病个体。诊断标准可以与分析样品具有相似组成，因此它们可以包含组成类似于在实际样品中发现的组成的诊断性碳水化合物和背景碳水化合物二者。诊断标准可衍生自得自患病和未患病个体的样品。或者，诊断标准可包含一或多个无背景碳水化合物的诊断性碳水化合物。在另一个实施方案中，本发明也包括用于进行肝癌诊断或检测肝癌分级改变的试剂盒。例如诊断试剂盒可以制备为进行肝癌的荧光团辅助碳水化合物电泳诊断。作为另一个例子，诊断试剂盒被制备用于进行肝癌的质谱诊断。荧光团辅助碳水化合物电泳诊断试剂盒提供了进行肝癌诊断所需的试剂集合。适合的试剂盒能够在实验室中方便地进行荧光团辅助碳水化合物电泳诊断。试剂盒可包括用于进行肝癌鉴定实验的试剂。试剂盒可包括诊断标准，荧光标记，免疫印迹和结合材料，例如膜，碳水化合物特异性结合试剂，凝集素，抗体，指导，样品容器，和聚丙烯酰胺凝胶试剂，预制凝胶，酶缓冲液，还原剂(用于荧光团标记碳水化合物)，和能够催化诊断性碳水化合物的结构性改变的糖苷酶(例如唾液酸酶，半乳糖酶，岩藻糖苷酶)。更完全的试剂盒可包括进行荧光团辅助碳水化合物电泳所需的设备，例如聚丙烯酰胺凝胶装置，CCD，激光器，DNA测序仪，计算机，软件等。包括在荧光团辅助碳水化合物电泳诊断试剂盒中的试剂优选以预先测量的量提供。优选试剂盒包括进行本发明荧光团辅助碳水化合物电泳方法的指导。诊断测试在实践中是有用的，因为通过正常训练的实验室人员其足以易于大规模应用。而且因为用于DNA测序和突变检测的基于电泳的高分辨率和高敏感性分析仪已经在大量快速增加的临床实验室中存在或大多数临床实验室可负担，用于肝癌的新的诊断性糖组学测试可以用其进行。而且，可获得的DNA分析仪允许每天每台机器从几个到成百上千个样品规模的样品通量，这依赖于每个实验室的需要。这种DNA分析设备提供额外的自动化优势，减少全部分析过程的复杂性。替代使用N-联糖蛋白的总混合物，N-糖基化(即在此描述的峰7和9的2个峰谱)也可用纯化的糖蛋白进行。在另一个实施方案中，检测肝癌的方法还包括临床化学参数和/或组织学数据。因此，本发明也可以联合临床化学参数和/或组织学和/或成像参数方便地进行。临床化学参数的测量包括测量胆红素和/或白蛋白和/或凝血酶原时间和/或C反应蛋白质和/或IgA丰度和/或血清透明质酸浓度和/或氨基转移酶和/或本领域已知的几个肝代谢测试。在优选的实施方案中，本发明的glycoHCCtest联合甲胎蛋白的检测。组织学包括肝活检。成像包括超声和/或CT-扫描和/或MRI扫描和/或肝特异性放射性示踪剂的成像。以下实施例用于说明某些实施例。因此本质上它们仅仅示例性的而不是限制性的。实施例1.在HCC和硬化病人中改变的N-聚糖谱使用DSA-FACE，我们检测肝纤维化(n=143)和具有或不具有HCC并发症的肝硬化(HCCn=227;硬化n=80)的中国病人的去唾液酸血清(图1)的N-糖组谱。我们也分析了健康供者的血液(n=130)。通过将谱中每个峰的高度对其所有峰高的总和进行标准化，我们定量每个峰，然后统计学比较健康对照组，纤维化病人，硬化病人和HCC病人的峰。为在硬化背景中能特异性检测HCC，我们主要鉴定聚糖结构，其丰度在硬化病人中不增加，但在HCC病人中升高。我们发现这种模式的一个峰，命名为峰9(图2A)。这个峰的丰度与HCC紧密相关(P<0.OOOl)，潜在地表明其上调中的一个普遍机制。而且，与硬化病人比较，峰7和总的平分型(峰7+峰2)在HCC病人中显著更低(p<0.0001)(图2B和2D)。与硬化病人，纤维化病人和健康对照组比较，对数比率(峰9/峰7)和对数(峰9/平分型)在HCC病人中显著升高(p<0.0001)(图2C和2E)。最终，我们重命名1og(峰9/峰7)为GlycoHCCTest，与我们之前研究采取的"GlycoCirrhoTest"命名平行，其中我们使用相同方法但是限定了不同组的峰(19)。2.多糖标记如AFP—样具有相同的HCC诊断功效虽然检测血清AFP在筛选HCC时是重要的，先前的研究(15)已指出其在肝硬化病人中检测HCC时由于在硬化中AFP水平常轻微上升而具有有限的应用。在我们的硬化病人群体中也发现低阈值时AFP对于HCC的低特异性，如表2所示，显示不同AFP截断值的数据。正如ROC曲线分析所确定，glycoHCCTest能从硬化病人中区分HCC病人，正确性是81±3%(图3)。聚糖标记物的诊断正确性与通常使用的AFP标记物非常类似，后者在同样的病人组中具有78±3%的诊断正确性(图3)。而且，在截断值-O.34时，GlycoHCCTest检测HCC具有88%的特异性和57%的敏感性，其与AFP在截断值100ng时类似(表2)。3.多糖变化与肿瘤分期相关为了评估HCC糖组标记物和肿瘤分期之间的相关性，分析具有限定肿瘤大小和分期的HCC亚组(n=98)的糖组学改变。依据TNM标准，HCC病人分类为Tl(n=6)，T2(n=28)，T3(n=59)和T4(n=5)。因为仅仅有少数病人被分类为Tl或T4，为了统计分析的目的，我们合并Tl和T2为一组，T3和T4为另一组。峰9的浓度在T3-T4组比Tl-T2组更高(图4A)，但是显示峰7与肿瘤分期负相关(图4B)。GlycoHCCTest与肿瘤分期正相关(p<0.0001)(图4C)。在病毒性肝炎中AST/ALT比率被认为是硬化进展的敏感标记物(24)。当病毒性肝炎达到损害结构的阶段时，Y-谷氨酰转移酶(GGT)也显示良好的敏感性(25)。因此我们在这个HCC病人亚组中分析肿瘤分期与AFP，GGT和AST/ALT比率之间的相关性。如图4D-E所示，AFP和GGT水平在HCC组中比在硬化组中更高(分别是p<0.001和0.006)并且它们与肿瘤分期正相关(分别是P<0.023和p<0.016)。AST/ALT比率在在HCC病人中比在硬化病人中显著更低(P<0.0001)，其与肿瘤分期的相关性不显著(p<0.174)(图4F)。皮尔逊相关性显示GlycoHCCTest水平与AFP水平(p=0.5680)和AST/ALT比率(0.351)无相关性，但是与GGT浓度(p=0.001)相关。GGT也被成为胆汁淤积性肝酶。因为肥胖，酗酒，脂肪肝和对肝有毒性的某些药物或草药可升高GGT水平，因此不能排除HCC病人中存在的GlycoHCCTest的高水平与胆汁淤积不相关。另外，我们在慢性HBV感染病人组(n=143)中评估HCC糖组学标记。在纤维化病人中GlycoHCCTest值在纤维化阶段中始终恒定，指示其是HCC特异性的(图5)。4.聚糖的结构分析可以在硬化病人中诊断HCC。通过对NP-HPLC-纯化级分进行外切糖苷酶测序证实N-聚糖结构。在此，我们给出峰9和9'的实例(图6)。级分A的主要结构(峰9')(图6a)中的3个半乳糖可以使用P-l，4-半乳糖苷酶去除。当这个酶与N-乙酰己糖胺酶组合，3个额外的N-乙酰葡糖胺残基被去除。这表明N-聚糖具有3个未修饰的、完全半乳糖基化的分枝。而且，这个结构是岩藻糖基化的，因为其对于低特异性a-岩藻糖苷酶敏感(未显示)。这个结构不是a-l，3/4-岩藻糖苷酶的底物，表明这个岩藻糖修饰是a-l，6-结合到核心N-乙酰葡糖胺。当使用半乳糖苷酶处理级分B(峰9)(图6B)的结构时，仅2个残基被去除。额外的己糖胺酶消化去除2个其他残基，表明3个分枝中的一个是修饰的，因此其对于酶活性不敏感。其对于仅当结合分枝N-乙酰葡糖胺残基时可去除岩藻糖的a-l，3/4-岩藻糖苷酶的敏感性确认了这点。当所有3个酶联合时，在岩藻糖苷酶去除阻碍的岩藻糖后额外的半乳糖和N-乙酰葡糖胺被去除。总之，这些实验显示峰9和9'是异构体，仅在岩藻糖残基位置上不同。为了确认GlycoHCCTest定量峰9而不是其异构体，我们对总血清进行了a-l，3/4-岩藻糖苷酶消化(图7)。这个酶分别转化峰9和12为峰8和11;峰9'和12'未改变。5.通过联合GlycoHCCTest和AFP提高HCC诊断的正确性虽然检测血清AFP在筛选HCC时是重要的，先前的研究(18)已指出其在肝硬化病人中检测HCC时由于在硬化中AFP水平时常轻微上升而具有有限的应用。因此实际上不得不使用非常高的AFP截断值(400ng/ml而非10或20ng/ml，其可被用于非硬化病人)来维持高特异性，伴随HCC检测敏感性的降低。在我们的硬化病人群体中也发现低阈值时AFP对于HCC低特异性，如表2所示，显示不同AFP截断值的数据。AFP截断值〈lng/ml具有高敏感性，对于HCC检测直至96%，但是其特异性低(26%)。但是在AFP截断值400ng/ml时，诊断HCC的特异性增加到95%，敏感性下降到46%。因此当AFP水平低于400ng/ml时需要补充标记物用于检测HCC。为了评价是否GlycoHCCTest可帮助解决这个问题，我们针对LogAFP绘制了GlycoHCCTest图(图9)。我们注意到在AFP低水平(<lng/ml)时仅有3%真正HCC病例(9/227)和26%硬化病例(21/80)，示于图9。为了增加检测HCC的特异性，我们在AFP>lng/ml和AFP<400ng/ml病人(AFP的"灰色区"，其涵盖了227个HCC病人中的114个和89个硬化病人中的55个)中应用我们的GlycoHCCtest。GlycoHCCTest(在截断值-O.34)检测在这个AFP的灰色区中的HCC，具有95X特异性(3/55假阳性)和57%敏感性(65/114真阳性)(表3;图9)。正如R0C曲线分析所确定(图10)，glycoHCCTest可以在AFP灰色区中从硬化病人中区分HCC病人，正确性是83士3X。聚糖标记物的诊断能力比通常使用的AFP标记物高很多，AFP标记物在同样的病人组中具有更低的诊断正确性(53±4%)(图10)。很显然GlycoHCCTest可用于AFP值在l-400ng/ml之内的HCC病人。因此，在AFP的灰色区通过联合AFP>400ng/ml和GlycoHCCTest截断值>-0.34，我们可从硬化病人区分HCC，具有74X敏感性和91X特异性(表3)。换言之，联合GlycoHCCTest和AFP诊断HCC比单独使用AFP(截断值>400ng/ml;46%敏感性)增加28%敏感性。6.联合GlycoHCC-test和AFP(灰色区)与HCC肿瘤分期正相关在AFP灰色区评价HCC糖组标记与肿瘤分期之间的相关性，分析已确定肿瘤大小和分期的落入AFP灰色区(l-400ng/ml)的HCC亚组(n=44)的糖基化谱的改变。依据TNM标准，HCC病人被分为Tl(n=3)，T2(n=15)，T3(n=25)和T4(n=1)。AFP水平HOOng/ml的硬化组(n=55)被用作对比参照。峰9的浓度在T3-T4组比Tl-T2组高(图11A)，但是揭示了峰7和平分型(峰2+峰7)与肿瘤分期的负相关性(图11B和E)。GlycoHCCTest与肿瘤分期明显正相关(P<0.0001)(图11C)。峰9/平分型聚糖(图11F)的对数比率与肿瘤分类之间也显著相关。但是在灰色区AFP值与肿瘤分期不相关(图IID)。在AFP灰色区诊断HCC的具有特异性和敏感性的GlycoHCCTest截断值显示在表4中。glycoHCCTest显示在AFP灰色区检测HCC的诊断能力在68.2到88.6%的敏感性和81.1到94.3%的特异性之间变化。材料和方法病人选择石开究已被EthicsCommitteeofPekingUniversityHealthScienceCentre、EthicsCommitteeofRenjiHospital、ShanghaiSecondMedicalUniversity批准。已获得每个病人的知情同意。病人征集自4个中国北京的医院(佑安医院，武警医院，地坛医院和北大医院)，中国南京的南京第二医院和中国上海医院。总共征集497个HBV感染的慢性肝病病人；由于转移，自体免疫性肝病，药物相关性肝炎，酒精性肝炎或阻塞性黄疸，47个病人被排除。所有病人的抗HAV，HCV和HDV(AbbottEIA)，EBV和CMV(EIA，HumanCo.Ltd,Germany)和HEV(EIA，Genelabs，Sing即ore)抗体是阴性的。实验室测试病人的主要临床和生物学数据总结于表1。所有病人具有或者纤维化或者硬化，感染乙肝病毒(HBV)，由血清学检测HbsAg，抗-HBsAg(HBsAb)，HBeAg，抗-HBeAg(HbeAb)，抗-HBcAg(HBcAb)和HBVDNA诊断。肝损伤程度通过检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)，总胆红素，白蛋白，总血清蛋白和y谷氨酰转移酶(GGT)评估。临床分期和肿瘤分期经组织学检查，成像方法和一些肝功化验完成肝纤维化和硬化的诊断。使用Scheuer分类确定纤维化分期。由不知道糖组学结果的2名富有经验的肝病理学家独立评价肝样品。肝纤维化病人(n=143)已被广泛研究且他们的临床数据已由Min-DeZeng等先前出版(21)。依据Child-Pugh分类对肝硬化病人分期。通过活检，尸检和手术标本组织学诊断，和临床超声波检查术和/或计算机断层扫描常规检查临床诊断，和联合AFP检测(截断值20ng/ml)诊断HCC的硬化病人(n=227)。依据TNM标准(22)对肿瘤分期分类Tl=单个，无血管侵入；T2=单个，有血管侵入，多个《5cm;T3=多个>5cm，侵入肝门静脉或肝静脉主要分枝；T4=除了胆囊穿孔脏层腹膜之外还侵入邻近器官。在任何处理或操作之前吸出所有血样。参照组130个通过超声排除HCC的健康个体的血液得自北京和上海红十字会。处理血样品用于蛋白质N-糖组分析12在2iU血清中存在于蛋白质上的N-聚糖如前所述被释放，标记，和分析(39，23)。使用基于毛细管电泳的(CE)ABI3130测序仪经DNA测序仪辅助荧光辅助碳水化合物电泳(DSA-FACE)技术分析标记的N-聚糖。使用GeneM即perv3.7软件(AppliedBiosystems，Fostercity，CA)分析数据。我们测量了在所有样品中检测的峰的高度以获得谱的数字描述，并使用SPSS12.0统计软件分析这些数据。结构特征结构分析APTS-标记的血清N-聚糖，其首先如描述经正相HPLC分离(23)。然后如上描述使用外切糖苷酶消化适量的多糖，使用以下酶肺炎链球菌(Str印tococcuspneumonia)，P-1，4-半乳糖苷酶(0.4mU/消化)，JackBeanP_N_乙酰己糖胺酶(10mU/消化)，牛肾a-岩藻糖苷酶(2mU/消化)和杏仁粉a-1，3/4-岩藻糖苷酶(1yU/消化)(所有酶购自Prozyme，SanLeandro，CA)。使用DSA-FACE分析消化产物。统计分析使用Windows软件的SPSS完成统计分析(SPSS,Chicago,IL，USA)。结果表示为平均数士SD。对于独立样品的所有报告的P-值使用双尾T检验。皮尔逊相关系数(95%置信区间和它们的相关概率(P)被用于评价参数之间的关联。接受者操作特征(ROC)曲线用作正确性的指数，接近1.0的值指示高诊断正确性。表表1.HBV感染的中国HCC和硬化病人的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>参考文献1.BruixJ，BoixL，SalaM，LlovetJM.Focusonhepatocellularcarcinoma.CancerCell2004;5:215-219.2.LiawYF.PreventionandsurveillanceofhepatitisBvirus—relatedhepatocellularcarcinoma.SeminLiverDis2005;25Supp11:40_47.3.KoikeK.MolecularbasisofhepatitisCvirus-associatedhepatocarcinogenesis:lessonsfromanimalmodelstudies.ClinGastroenterolH印atol2005;3:S132-135.4.BoschFX，RibesJ，BorrasJ.Epidemiologyofprimarylivercancer.SeminLiverDis1999;19:271-285.5.CaturelliE，BartolucciF，BiasiniE，VigliottiML，AndriulliA，SienaDA，AttinoV，etal.Diagnosisoflivernodulesobservedinchronicliverdiseasepatientsduringultrasoundscreeningforearlydetectionofhepatocellularcarcinoma.AmJGastroenterol2002;97:397—405.6.BolondiLScreeningforhepatocellularcarcinomaincirrhosis.JH印ato12003;39:1076-1084.7.YuenMF，LaiCL.Serologicalmarkersoflivercancer.BestPractResClinGastroenterol2005;19:91_99.8.ZhouL，LiuJ，LuoF.Serumtumormarkersfordetectionofhepatocellularcarcinoma.WorldJGastroenterol2006;12:1175—1181.9.el_HouseiniME，MohammedMS，Elshemey丽，HusseinTD，DesoukyOS，ElsayedAA.Enhanceddetectionofhepatocellularcarcinoma.CancerContro12005;12:248-253.10.QinLX，TangZY.Recentprogressinpredictivebiomarkersformetastaticrecurrenceofhumanhepatocellularcarcinoma:areviewoftheliterature.JCancerResClinOncol2004;130:497-513.11.NguyenMH，KeeffeEB.Screeningforhepatocellularcarcinoma.JClinGastroenterol2002;35:S86_91.12.El-AneedA，BanoubJ.Proteomicsinthediagnosisofhepatocellularcarcinoma:focusonhighriskhepatitisBandCpatients.AnticancerRes2006;26:3293-3300.13.DanieleB，BencivengaA，MegnaAS，TinessaV.Alpha—fetoproteinscreeningforhepatocellularcarcinoma.Gastroenterology2004;127:S108-112.14.TateishiR，ShiinaS，YoshidaH，TerataniT，ObiS，YamashikiN，AkamatsuM，etal.Predictionofrecurrenceofhepatocellularcarcinomaaftercurativeablationusingthreetumormarkers.Hepatology2006;44:1518—1527.15.ColliA，FraquelliM，CasazzaG，MassironiS，ColucciA，ConteD，DucaP.Accuracyofultrasonography,spiralCT，magneticresonance,andalpha_fetoproteinindiagnosinghepatocellularcarcinoma:asystematicrevie.AmJGastroenterol2006;101:513-523.16.KobataA，AmanoJ.Alteredglycosylationofproteinsproducedbymalignantcells,andapplicationforthediagnosisandimmunotherapyoft聽urs.ImmunolCellBiol2005;83:429_439.17.DennisJW，GranovskyM，WarrenCE.Glycoproteinglycosylationandcancerprogression.BiochimBiophysActa1999;1473:21_34.18.WardDG，ChengY，N'KontchouG，TharTT，BargetN，WeiW，BillinghamLJ，etal.ChangesintheserumproteomeassociatedwiththedevelopmentofhepatocellularcarcinomainhepatitisC-relatedcirrhosis.BrJCancer2006^94:287-292.19.CallewaertN，VanVlierbergheH，VanHeckeA，LaroyW，DelangheJ，ContrerasR.NoninvasivediagnosisoflivercirrhosisusingDNAsequencer—basedtotalserumproteinglycomics.NatMed2004;10:429-434.20.MorelleW，FlahautC，MichalskiJC，LouvetA，MathurinP，KleinA.MassspectrometricapproachforscreeningmodificationsoftotalserumN_glycomeinhumandiseases-applicationtocirrhosis.Glycobiology2006;16:281-293.21.ZengMD，LuLG，MaoYM，QiuDK，LiJQ，WanMB，ChenCW，etal.PredictionofsignificantfibrosisinHBeAg—positivepatientswithchronichepatitisBbyanoninvasivemodel.Hepatology2005;42:1437—1445.22.AfdhalNH.Biopsyorbiomarkers:isthereagoldstandardfordiagnosisofliverfibrosisClinChem2004;50:1299-1300.23.LaroyW，ContrerasR，CallewaertN.GlycomemappingonDNAsequencingequipment.NatProtoc2006;1:397_405.24.Gia皿iniE，RissoD，TestaR.TransportabilityandreproducibilityoftheAST/ALTratioinchronichepatitisCpatients.AmJGastroentero12001;96:918-919.25.SilvaIS，FerrazML，PerezRM，LanzoniVP，FigueiredoVM，SilvaAE.Roleofgamma—glutamyltransferaseactivityinpatientswithchronichepatitisCvirusinfection.JGastroenterolHepatol2004;19:314—318.26.HashimotoS，AsaoT，TakahashiJ，YagihashiY，NishimuraT，Saniabadi16AR，PolandDC，etal.alphal—acidglycoproteinfucosylationasamarkerofcarcinomaprogressionandprognosis.Cancer2004;101:2825—2836.27.YazawaS，MadiyalakanR，IzawaH，AsaoT，FurukawaK，MattaKLCancer-associatedelevationofalpha(1----3)_L_fucosyltransferaseactivityinhumanserum.Cancer1988^62:516_520.28.YazawaS，AsaoT，NagamachiY，AbbasSA，MattaKLTumor-relatedelevationofserum(alpha1----3)_L_fucosyltransferaseactivityingastriccancer.JCancerResClin0ncoll989;115:451_455.29.ChandrasekaranEV，JainRK，MattaKL.Ovariancanceralphal，3_L_fucosyltransferase.Differentiationofdistinctcatalyticspecieswiththeuniquesubstrate,3'_sulfo_N_acetyllactosamineinconjunctionwithothersyntheticacc印tors.JB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