通过正义抑制的木质素生物合成的改良的制作方法

专利名称：：通过正义抑制的木质素生物合成的改良的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物中木质素生物合成的改良、木质素生物合成途径包含的酶和编码这些酶的核酸，以及更具体地，涉及通过正义抑制改良木质素生物合成的方法、相关的核酸和结构。本发明发还涉及调控元件，以及更具体地，涉及在植物细胞中能够引起外源基因表达的启动子，如编码植物中木质素生物合成途径涉及的酶的基因。本发明还涉及包含本发明的核酸和调控元件的载体，转化有这些调控元件、核酸和载体的植物细胞、植物、种子和植物其它部分，以及使用这些核酸、调控元件和载体的方法。
背景技术：
：木质素是复杂的酚聚合体，其增强细胞壁抵抗机械和化学的降解。木质化过程典型地发生在具有结构性的、传导或防御作用的细胞的壁的次生加厚过程中。通过脱氢聚合将三个单体前体，芥子醇、松柏醇和P-香豆醇化合，分别形成木质素聚合体的丁香基(S)、愈创木基(G)和羟基(H)亚单元，木质素聚合体也能够通过过氧化物酶和其它氧化性同工酶的作用与细胞壁多糖连接。在禾本科中，单体前体的生物合成是多步过程，由芳香族氨基酸苯丙氨酸和酪氨酸开始。这是该途径中最后的两个还原/脱氢步骤，由肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)催化，肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)被认为是木质素生物合成中特异性酶。根据植物种类、组织、发育阶段和亚细胞定位，木质素聚合体中结合的单体的比例有所变化。咖啡酸0-甲基转移酶(OMT)、4_香豆酸辅酶A连接酶(4CL)、肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)是木质素生物合成中的关键酶。全世界的永久牧场估计覆盖了70%的农业耕作面积。黑麦草(Loliumspp.)和其密切相关的羊茅(Festucaspp.)对温带草原有重要价值。商业上最有价值的黑麦草是意大利或一年生黑麦草(L.multiflorumLam.)和多年生黑麦草(L.perenneL.)。在牲畜生产是密集型产业的国家，如荷兰、英国和新西兰，它们是关键的草料种类。商业上最重要的羊茅是高羊茅(F.anundinaceaSchreb.)、牛尾草(F.pratensis)禾口紫羊茅(F.rubra)。多年生黑麦草(LoliumperenneL.)是播种在澳大利亚温带乳牛牧场的主要的草类，和贯穿世界温带气候的关键牧草。在澳大利亚温带牧场观察到的草的饲喂价值显著下降是在晚春和初夏，此时以多年生黑麦草为基础的牧场的营养价值不能满足哺乳乳牛的代谢要求。多年生黑麦草也是重要的草皮草。草和豆科植物体外干物质消化率与木质素含量呈负相关。另外，具有较高瘤胃消化率的玉米、高粱和珍珠粟中的木质素生物合成的酶的自然突变体，表现为具有较低的木质素含量和改变的S/G亚单元比例。因此，当它们成熟时，植物细胞壁的木质化是降低草料组织的消化率的主要因素。期望有改变植物中木质素生物合成的方法，包括草类如黑麦草和羊茅，通过降低关键生物合成酶的活性，以减少木质素含量和/或改变木质素成分，以增加干物质消化率和改良草本性质。但是，对于一些申请，是期望提高木质素生物合成以增加木质素含量和/或改变木质素成分，例如增加木材的机械强度，增加草皮草的机械强度，降低植物高度和减轻倒伏或改善抗病性。虽然编码木质素生物合成途径中的一些酶的核酸序列已经从某些种类植物中分离出，仍然需要用于改良植物中，特别是草种类如黑麦草和羊茅中的木质素生物合成的材料。可能通过转基因处理改良的植物的其它表型特征包括疾病抗性、矿物质含量、营养品质和抗旱性。但是，植物中，表型特征的转基因处理需要能够引起外源基因在植物细胞中表达的调控元件的有效作用。
发明内容本发明的一个目的是克服、或至少减轻，现有技术相关的一个或多个难点或不足。在一个方面，本发明提供实质上提纯的或分离的编码黑麦草(Lolium)或羊茅(Festuca)种类的下列酶的核酸或核酸片段4_香豆酸辅酶A连接酶(4CL)、肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)。黑麦草(Lolium)或羊茅(Festuca)种类可以是任何合适类型，包括意大利或一年生黑麦草、多年生黑麦草、高羊茅、牛尾草和紫羊茅。优选地，黑麦草或羊茅的种类是黑麦草属(Lolium)禾中，如Loliumperenne或Loliumarundinaceum，也被认为是Festucaarundinacea0“核酸”意思是能够携带遗传信息的核苷酸链。本术语通常指基因或功能性活性片段或它们的变异体以及或能够影响表型的生物体基因组中其它序列。术语“核酸”包括DNA(如cDNA或基因组DNA)和RNA(如mRNA或microRNA)，单链或双链，可选择地包括合成的、非自然的或改变的核苷酸碱基、合成的核酸和它们的组合物。核酸或核酸片段可以是任何合适的类型，包括DNA(如cDNA或基因组DNA)和RNA(如mRNA)，单链或双链，可选择地包括合成的、非自然的或改变的核苷酸碱基以及它们的组合物。“实质上提纯的”意思是核酸或启动子从基因中分离出，在生物体自然存在的、本发明的核酸或启动子源于的基因组中，基因在核酸或启动子的侧部。因此本术语包括，例如，融合至载体、自主复制质粒或病毒、或者原核生物或真核细胞基因组DNA的核酸或启动子，或者作为不依赖其它序列的单独的分子(如，cDNA或通过PCR或限制性核酸内切酶消化的基因组的或cDNA片段)存在的核酸或启动子。还包括是杂交基因一部分的核酸或启动子。优选地，实质上提纯的核酸或启动子至少是大约90%的纯度；更优选地，至少大约95%的纯度，甚至更优选地，至少大约98%的纯度。术语“分离的”意思是材料从它的初始环境(如，如果是自然存在即自然环境)中移开。例如，存在于活的植物中的自然存在的核酸不是分离的，但是，从自然系统中某些或全部共存材料中分离出来的同样的核酸，是分离的。这样的核酸可以是载体的一部分和/或这样的核酸可以是组合物的一部分，并且在载体或组合物中仍然是分离的，这样的载体或组合物不是它们自然环境的一部分。在本发明这方面的一个优选实施方式中，实质上提纯的或分离的编码4CL的核酸或核酸片段包括核苷酸序列，该核苷酸序列选自(a).本发明图2、3和4中所示的序列(序列号分别为1、3和5)；(b).本发明图2、3和4中所示的序列(序列号分别为1、3和5)的互补序列；(c).(a)和(b)中序列的反义序列；和(d).(a)、(b)和(c)中序列的功能活性片段和变异体组成的组。在本发明这方面的进一步优选实施方式中，实质上提纯的或分离的编码CCR的核酸或核酸片段包括核苷酸序列，该核苷酸序列选自(a).本发明图10中所示的序列(序列号7)；(b).本发明图10中显示的序列(序列号7)的互补序列；(c).(a)和(b)中序列的反义序列；和(d).(a)、(b)和(c)中序列的功能活性片段和变异体组成的组。在本发明这方面的进一步优选实施方式中，实质上提纯的或分离的编码CAD的核酸或核酸片段包括核苷酸序列，该核苷酸序列选自(a).本发明图13、14、26和27中显示的序列(序列号分别为9、11、14和16)；(c).(a)和(b)中序列的反义序列；和(d).(a)、(b)和(c)中序列的功能活性片段和变异体组成的组。“功能活性”意思是片段或变异体(如相似物、派生物或突变体)能够参与或改良植物中木质素的生物合成。这样的变异体包括自然存在的等位基因变异体和非自然存在的变异体。另外，可以考虑一个或多个核苷酸的增加、缺失、取代和衍生化，只要这样的修改没有导致片段或变异体的功能性活性的损失。优选地，功能活性片段或变异体与该片段或变异体相应的上面提到的序列的相关部分至少大约80%同源；更优选地，至少大约90%同源；甚至更优选地，至少大约95%同源；最优选地，至少大约98%同源。这样的功能活性变异体和片段包括，例如，具有保守的核苷酸变化。“保守的核苷酸变化”意思是由于遗传密码的兼并，导致在编码的蛋白中的氨基酸的保守的核苷酸取代。这样功能活性变异体和片段还包括，例如，那些具有导致在相应的氨基酸序列中一个或多个残基的保守的氨基酸的取代的核苷酸变化。“保守的氨基酸取代”意思是一个氨基酸由同类中的另一个氨基酸取代，这些类别如下非极性的Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp极性的中性的Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gin酸性的Asp、Glu碱性的Lys、Arg、His还可以按如下形成其它的保守的氨基酸取代芳香族的Phe、Tyr、His质子供体Asn、Gin、Lys、Arg、His、Trp质子受体Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gin优选地，片段大小至少为20个核苷酸；更优选地，至少50个核苷酸；更优选地，至少100个核苷酸；更优选地，至少200个核苷酸；更优选地，至少500个核苷酸。本发明这方面的进一步优选实施方式中，功能活性片段或变异体能够通过正义抑制改良植物中木质素生物合成。因此，本发明提供实质上提纯的或分离的核酸，该核酸包括编码木质素生物合成酶的基因的片段或变异体，所述核酸能够通过正义抑制改良植物中木质素生物合成。“正义抑制”的意思是当功能活性片段或变异体以正义方向(senseorientation)引入植物中时，相对于非转化的对照植株，能够引起转化植株中相应基因的表达的可鉴定地减少。“正义”方向的意思是核酸与编码成或可编码成蛋白的信使RNA拷贝具有相同的方向或相同的极性。用于正义抑制的片段和变异体包括在根据本发明的核酸和核酸片段中有一个或多个核苷酸增加、缺失、取代或衍生化的片段和变异体。用于正义抑制的片段和变异体优选地包括具有短的缺失的，例如，1-大约500、1-大约300、或1-大约100个核苷酸，优选地是连续的核苷酸。在一个优选的实施方式中，短的缺失可以位于或接近于片段或变异体所基于的基因的3’或5’末端的例如大约200、100、50或20个碱基内。在本发明这方面的优选实施方式中，能够通过正义抑制改良木质素生物合成的功能活性片段或变异体可以是编码4CL、CCR或CAD的核酸或核酸片段的功能活性片段或变异体，例如这里之前描述的，或者如在国际专利申请W002/26994或W003/40306中描述的；或者编码肉桂酸-4-羟基化酶(C4H)、咖啡酰辅酶A3-0-甲基转移酶(CCoAOMT或CCoAMT)、咖啡酸-0-甲基转移酶(0MT或C0MT)、阿魏酸-5-羟基化酶(F5H)或苯丙氨酸解氨酶(PAL)的核酸或核酸片段的功能活性片段或变异体，例如在国际专利申请W002/26994或W003/40306中所描述的；或者肉桂酸-3-羟基化酶(C3H)的功能活性片段或变异体，例如在国际专利申请W02008/064289中描述的。优选地，功能活性片段或变异体编码4CL、CCR、CAD、C3H、C4H、CCoAOMT、C0MT、F5H或PAL多肽，该多肽没有酶活性或者具有实质上降低的酶活性。“实质上降低的酶活性”的意思是酶活性明显降低，例如至少比野生型植株的酶活性低大约25%、50%或75%。优选地，功能活性片段或变异体包括相对于片段或变异体所基于的相关基因的移码突变。这可能导致编码的多肽的酶活性实质性降低。“移码突变”的意思是插入或缺失多个核苷酸的突变，核酸序列不能被3整除。由于基因以三联密码子表达，插入或缺失可能破坏读码框，或者形成密码子的核酸组，导致与原本不同的翻译结果。序列中缺失或插入发生的越早，蛋白被改变的几率越大。移码突变可以引起读码的差异，所以突变后大多数的密码子(有一些例外，由于冗余或同时发生的相似性)与野生型序列中相应的密码子相比，将编码不同的氨基酸，导致实质上改变的多肽序列。此外，终止密码子“UAA、UGA或UAG”不能被读出，或者终止密码子在早一些的位点产生。产生的蛋白可能异常地短、异常地长、和/或包括错误的氨基酸。这不可能有功能。发生在或靠近5’末端的缺失或添加可以优选地在短的距离内，例如大约在ATG起始密码子的20、50、100或200个碱基之内，优选地在ATC起始密码子下游的短的距离内，例如大约在ATG起始密码子下游的20、50、100或200个碱基内。“下游”的意思是沿着核酸的5’-3’方向。优选地，这样发生在或靠近5’末端的缺失或添加可以导致移码突变，因此得到的多肽具有很少或没有酶活性。在具体优选实施方式中，位于或靠近5’末端的缺失或添加可以在ATG起始密码子下游的短距离内的1、2、4、5、7或8个碱基的缺失或添加，优选地，是连续碱基，因此导致移码突变，得到的多肽具有很少或没有酶活性。更优选地，移码突变是一个碱基缺失。发生在或靠近3’末端的缺失可以优选地起始于3’末端或在3’末端短距离内，例如大约20、50、100或200个碱基开始，并且向5’方向延伸。优选地，这样的缺失的大小在大约50至500个核苷酸之间，更优选地，大约100至300个核苷酸之间。在本发明这方面具体优选实施方式中，能够通过正义抑制改良木质素生物合成的功能活性片段或变异体可以是编码的CCR、4CL或CAD、C3H、C4H、CCoAOMT、COMT、F5H或PAL的核酸或核酸片段的功能活性片段或变异体。因此，在优选实施方式中，本发明提供核酸的片段或变异体，该核酸选自具有本发明图10中所示的序列(序列号7)，和公布号为W002/26994的专利申请中的图38、40、41、43禾口44中的序列(序列号分别为102、104-106、107、109-110和111)，和公布号为W003/40306的专利申请中的序列号为147和148中的序列的核酸组成的组；其中所述的片段或变异体能够通过正义抑制所述植物中编码CCR的基因，改良植物中木质素生物合成。在进一步优选实施方式中，本发明提供核酸的片段或变异体，该核酸选自具有本发明图13、14、26和27所示的序列(序列号分别为9、11、14和16)，和公布号为TO02/26994的专利申请中的图9、11、13、15、16、18、19、21和22中的序列(序列号分别为23、25、27、29至33、34、36至40、41、43至44和45)，和公布号为W02008/064289的专利申请中的序列号为7中的序列，和公布号为W003/40306的专利申请中序列号为35和145中的序列的核酸组成的组；其中所述片段或变异体能够通过正义抑制所述植物中编码CAD的基因，改良植物中木质素生物合成。在进一步优选实施方式中，本发明提供核酸的片段或变异体，该核酸选自具有本发明图2、3和4中所示的序列(序列号分别为1、3和5)，和公布号为W002/26994的专利申请中的图68、70、71和73中的序列(序列号分别为154、156-161、162和164)，和公布号为TO03/40306的专利申请中的序列号为29、31、27、142和143中的序列的核酸组成的组；其中所述片段或变异体能够通过正义抑制所述植物中编码4CL的基因，改良植物中木质素生物合成。在进一步优选实施方式中，本发明提供核酸的片段或变异体，该核酸选自具有公布号为W002/26994的专利申请中的图32、34、36和76中所示的序列(序列号分别为96、98、100和166)，和公布号为W02008/064289的专利申请中的序列号为6中的序列，和公布号为W003/40306的专利申请中的序列号为33和144中的序列的核酸组成的组；其中所述片段或变异体能够通过正义抑制所述植物中编码C4H的基因，改良植物中木质素生物合成。在进一步优选实施方式中，本发明提供核酸的片段或变异体，该核酸选自具有公布号为W002/26994的专利申请中的图1、3、4、6、7、82和87中所示的序列(序列号分别为1、3-11、12、14-20、21、168和170)，和公布号为W02008/064289的专利申请中的序列号为8中的序列，和公布号为W003/40306的专利申请中的序列号为37和146中的序列的核酸组成的组；其中所述片段或变异体能够通过正义抑制所述植物中编码CCoAOMT的基因，改良植物中木质素生物合成。在进一步优选实施方式中，本发明提供核酸的片段或变异体，该核酸选自具有公布号为W002/26994的专利申请中的图24、26、27、29、30、93和99中所示的序列(序列号分别为47、49-58、59、61-93、94、172和174)，和公布号为W02008/064289的专利申请中的序列号为2、8和9中的序列，和公布号为W003/40306的专利申请中的序列号为149、42、150和43中的序列的核酸组成的组；其中所述片段或变异体能够通过正义抑制所述植物中编码C0MT的基因，改良植物中木质素生物合成。在进一步优选实施方式中，本发明提供核酸的片段或变异体，该核酸选自具有公布号为W002/26994的专利申请中的图59和61中所示的序列(序列号分别为135和137-139)，和公布号为W003/40306的专利申请中的序列号为45和151中的序列的核酸组成的组；其中所述片段或变异体能够通过正义抑制所述植物中编码F5H的基因，改良植物中木质素生物合成。在进一步优选实施方式中，本发明提供核酸的片段或变异体，该核酸选自具有公布号为W002/26994的专利申请中的图62、64、65和67中所示的序列(序列号分别为140、142-148、149和151-153)，和公布号为W003/40306的专利申请中的序列号为152、153、50、54、48、53、156、49、51、154、52和155中的序列的核酸组成的组；其中所述片段或变异体能够通过正义抑制所述植物中编码PAL的基因，改良植物中木质素生物合成。在进一步优选实施方式中，本发明提供核酸的片段或变异体，该核酸选自具有公布号为W02008/064289的专利申请中的序列号为1中所示的序列；其中所述片段或变异体能够通过正义抑制所述植物中编码C3H的基因，改良植物中木质素生物合成。优选地，片段或变异体包括位于或靠近如这里之前所述的序列的3’或5’末端的短的缺失。优选地，片段或变异体包括相对于如这里之前所述的序列的移码突变。在特别优选的实施方式中，片段或变异体包括选自表1和表2所示的移码DNA序列组的序列，或者编码包括选自表1和表2所示的移码蛋白序列组的序列的多肽。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>__^_甲基转移ι_^_ι_丨__<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在本发明的第二个方面,提供包括根据本发明的核酸或核酸或核酸片段的基因构建体或载体.在本发明这方面的优选实施方式中，载体可以包括调控元件如启动子、根据本发明的核酸或核酸片段和终止子，所述调控元件、核酸或核酸片段和终止子是有效地连接。“基因构建体”的意思是重组核酸分子。“载体”的意思是用于转移遗传材料至目标细胞的基因构建体。“有效地连接”的意思是核酸和调控序列，如启动子，以这样一种方式连接能够使所述核酸在合适的条件下表达，例如当合适的分子如转录激活因子蛋白结合至调控序列时。优选地，有效连接的启动子在相关的核酸的上游。载体可以是任何合适的类型，可以是病毒的或非病毒的。载体可以是表达载体。这样的载体包括染色体的、非染色体的和合成的核酸序列，如植物病毒衍生物；细菌质粒；来自于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti质粒的衍生物；来自于毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的Ri质粒的衍生物；噬菌体DNA；酵母人工染色体；细菌人工染色体；双元细菌人工染色体；来自于质粒和噬菌体DNA的联合体的载体。但是，可以使用任何其它的载体，只要它能够在植物细胞中复制或者整合或者可生存。调控元件和终止子可以是任何合适的类型，并且可以是目标植物细胞内源的，或者是外源的，只要它们在目标植物细胞中起作用。优选地，调控元件是启动子。可以用在本发明的载体的多种的启动子是本领域技术人员所熟知的。影响启动子选择的因素包括期望的载体的组织特异性，和期望是组成型表达或诱导型表达和需要转化的植物细胞的种类(如单子叶植物或双子叶植物)。特别合适的启动子包括花椰菜花叶病毒35S(CaMV)启动子，玉米泛素启动子，水稻肌动蛋白启动子和黑麦草内源的0MT、4CL、CCR或CAD启动子。可以用在本发明的载体的多种的终止子是本领域技术人员所熟知的。终止子可以来自与启动子序列同一个基因或不同的基因。特别合适的终止子是多聚腺苷酸化信号，如CaMV35S的多聚A和其它来自胭脂碱合酶(nos)和章鱼碱合酶(ocs)基因的终止子。载体，除调控元件、本发明的核酸或核酸片段和终止子之外，可以包括更多的对于核酸或核酸片段的表达必须的元件，以不同的方式组合，例如载体骨架、复制起点(ori)、多克隆位点、间隔序列、增强子、内含子(如玉米泛素Ubi内含子)、抗生素抗性基因和其它选择性标记基因(如新霉素磷酸转移酶(npt2)基因、潮霉素磷酸转移酶(hph)基因、草丁膦乙酰转移酶(bar或pat)基因)、和报告基因(如β_葡糖苷酸酶(GUS)基因(gusA))。载体还可以包含用于翻译起始的核糖体结合位点。载体还可以包括用于扩增表达的合适序列。作为可选择的标记基因使用的选择，可选择的标记基因提供用于挑选转化的宿主细胞的表型，在转化细胞中载体的存在可以通过本领域熟知的其它技术测定，例如PCR(聚合酶链式反应)，Southern印迹杂交分析，组织化学⑶S试验，Northern和Western印迹杂交分析。本领域技术人员将意识到载体的多种成分是有效地连接，导致所述的核酸或核酸片段的表达。将本发明中的载体的成分有效地连接的技术是本领域技术人员熟知的。这样的技术包括连接物的使用，如合成的连接物，例如包括一个或多个限制性内切酶位点。本发明的载体可以融合至多种植物，包括单子叶植物(来自于黑麦草属、羊茅属、狗牙根属、臂形草属、雀稗属、黍属、芒属、狼尾草属、薦草属的草，和其它的草料、草皮和生物能草，玉米，燕麦，甘蔗，小麦和大麦)，双子叶植物(如拟南芥属、烟草、豆类、苜蓿属、橡树、桉属、枫、杨属、油菜、大豆和鹰嘴豆)和裸子植物(如松属)。在优选实施方式中，载体用于转化单子叶植物，优选地草种类如黑麦草属、羊茅属、狗牙根属、臂形草属、雀稗属、黍属、芒属、狼尾草属、薦草属、和其它的草料、草皮和生物能草，更优选地是黑麦草种如多年生黑麦草(Looliumperenne)或Loliumarundinaceum，包括用于草料和草皮使用的栽培品种。用于将本发明的载体融入至植物细胞的技术(例如通过转导、转染或转化)是本领域技术人员熟知的。这样的技术包括农杆菌介导的导入，电转化至组织、细胞和原生质体，原生质体融合，注射至繁殖器官，注射至未成熟的胚和高速弹射介导至细胞、组织、愈伤组织、未成熟的和成熟的胚。技术的选择很大程度上依赖于要转化的植物的类型。融合有本发明的载体的细胞可以筛选，如前面所述，然后使用本领域公知的技术，在合适的培养基上培养以产生转化的植物。培养环境，如温度、PH值等等，对本领域技术人员是显而易见的。得到的植物可以繁殖，有性繁殖或无性繁殖，利用本领域公知的方法，以产生转化植物的连续世代。本发明的进一方面，提供了转化的植物细胞、植物、植物种子或其它植物部位、或植物生物量，包括可消化的生物量如干草，包括，如转化有本发明的核酸、基因构建体或载体。优选地，转基因植物细胞、植物、植物种子或其它植物部位通过根据本发明的方法制造出ο本发明还提供转基因植物、植物种子或其它植物部位，或植物生物量，来自于本发明的植物细胞以及包括本发明的核酸、基因构建体或载体。本发明还提供转基因植物、植物种子或其它植物部位，或植物生物量，来自于本发明的植物以及包括本发明的核酸、基因构建体或载体。本发明的核酸、基因构建体或载体可以是稳定地融入至植物基因组、植物种子、其它植物部分或植物生物量。植物细胞、植物、植物种子或其它植物部分可以来自于任何合适的种类，包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物。在优选的实施方式中，植物细胞、植物、植物种子和其它植物部分可以来自于单子叶植物，优选地是草种类，如黑麦草属、羊茅属、狗牙根属、臂形草属、雀稗属、黍属、芒属、狼尾草属、薦草属、和其它的草料、草皮和生物能草，更优选地是黑麦草禾中如多年生漂麦草(Loliumperenne)或Loliumarundinaceum。本发明的进一方面，提供了一种改良植物中木质素生物合成的方法，所述方法包括向所述植物中导入有效量的根据本发明的核酸或核酸片段、基因构建体和/或载体。“有效量”的意思是在所述植物、或植物、植物种子或其它植物部分、或来自它们的植物生物量中足以引起可识别的表型的量。本领域的技术人员在考虑植物的类型、处理顺序和其它相关因素后，可以很容易地测定这样的量。这样的技术人员可以很容易地测定合适的量和处理方法。参见，例如，Maniatis等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，所有公开的内容以参考引用的方式结合至此。使用本发明的方法和材料，植物木质素生物合成相对于非转化的对照植物可以增力口、减少或其它方式地改良。可以是增加或其它方式地改良，例如，通过融合本发明的正义核酸或核酸片段的额外的拷贝。可以是减少，例如，通过融合本发明的反义核酸或核酸片段或通过融合能够通过正义抑制改良植物中木质素生物合成的功能活性片段或变异体。另外，可以操作编码木质素生物合成途径中的不同酶基因拷贝的数量以修改每一个合成的单体的相对量，因此导致具有改变的成分的木质素的形成。因此，本发明这方面的优选实施方式提供了改良植物中木质素生物合成的方法，所述方法包括向所述植物中引入正义方向的有效量的根据本发明的核酸、基因构建体或载体，致使相关基因的表达被抑制。优选的用于正义抑制的功能活性片段和变异体包括这里之前所描述的那些。本发明的进一方面，提供了根据本发明的核酸、基因构建体或载体用于在植物中木质素生物合成的正义抑制的应用。本发明的进一方面，提供了根据本发明的核酸或核酸片段的应用，和/或它们的核苷酸序列信息，和/或它们的单核苷酸多态性，作为分子遗传标记。更特别地，根据本发明的核酸或核酸片段，和/或它们的核苷酸序列信息，和/或它们的单核苷酸多态性，可以用作分子遗传标记，用于数量性状基因座(QTL)标记、定位、DNA印记和标记辅助选择，以及可以用作候选基因或优选标记，特别是在黑麦草或羊茅中。甚至更特别地，根据本发明的核酸或核酸片段，和/或它们的核苷酸序列信息，可以在草料和草皮草改进中用作分子遗传标记，如用于干物质消化率、草品质、机械压力忍受性、疾病抗性、虫害抗性、植物株高以及叶片和茎颜色的标记QTLs。本发明更进一方面，提供了从黑麦草(黑麦草属)或羊茅(羊茅属)种中实质上纯化或分离的多肽，该多肽选自酶4CL、CCR和CAD组成的组。黑麦草(黑麦草属)或羊茅(羊茅属)种可以是任何合适类型，包括意大利或一年生黑麦草、多年生黑麦草、高羊茅、牛尾草和紫羊茅。优选地种类是黑麦草，更优选地是多年生黑麦草(L.perenne)。在本发明的这方面的优选实施方式中，实质上纯化的或分离的酶4CL包括选自本发明的图2、3和4中所示的序列(序列号分别为2、4和6)组成的组的氨基酸序列，和它们的功能活性片段和变异体。在本发明的这方面的更进一步优选实施方式中，实质上纯化的或分离的酶CCR包括选自本发明的图10中所示的序列(序列号为8)组成的组的氨基酸序列，和它的功能活性片段和变异体。在本发明的这方面的进一步优选实施方式中，实质上纯化的或分离的酶CAD包括选自本发明图13、14、26和27中所示的序列(序列号分别为10、12、15和17)组成的组氨基酸序列，和它们的功能活性片段和变异体。本内容中“功能活性”的意思是片段或变异体分别具有酶4CL、CCR和CAD的一种或多种生物学特性。可以考虑一个或多个氨基酸的增加、缺失、取代和衍生化，只要这些修改没有导致片段或变异体的功能活性的丧失。优选地，片段或变异体与上述提及的序列的相应部分有至少大约60%的同源性；更优选地，有至少大约80%的同源性；最优选地，有至少大约90%的同源性。这样的功能活性变异体和片段包括，例如，那些在相应氨基酸序列中有一个或多个残基的保守氨基酸取代。优选地，片段大小至少是10个氨基酸，更优选地是至少15个氨基酸，最优选地至少20个氨基酸。本发明这方面的进一步优选实施方式中，提供了根据本发明的核酸或核酸片段重组产生的多肽。重组产生多肽的技术是本领域技术人员所熟知的。本发明的更进一方面，提供了从本发明的植物、植物种子或其它植物部位中实质上或部分纯化的或分离的木质素或改良的木质素。这样的木质素可以根据其长度、聚合度(单元数)、支化度和/或单元间的连接性质，从自然存在的木质素中改良。在更进一方面，本发明提供了分离的调控元件，该调控元件能够引起外源基因在植物细胞中的表达。优选地，调控元件从编码0MT、4CL、CCR或CAD的核酸或核酸片段中分罔。调控元件可以是单链或双链的核酸分子，包括DNA(如cDNA或基因组DNA)和RNA(如mRNA)，任选地包括合成的、非自然的或改变的核苷酸碱基，以及它们的组合。优选地，调控元件包括启动子；更优选地，O-甲基转移酶启动子；更加优选地，来自黑麦草(黑麦草属)或羊茅(羊茅属)种的0-甲基转移酶启动子；更优选地，是黑麦草的O-甲基转移酶启动子；最优选地，是多年生黑麦草(Loliumperenne)的0-甲基转移酶启动子。在本发明这方面的特别优选实施方式中，调控元件包括来自于咖啡酸0-甲基转移酶基因的启动子，所述咖啡酸0-甲基转移酶基因与来自于多年生黑麦草的cDNA同源LpOMTl相应。优选地，调控元件包括核苷酸序列，该核苷酸序列包括本发明图18所示序列(序列号13)的最初的大约4630个核苷酸；或它的功能活性片段或变异体。本内容中“功能活性”的意思是片段或变异体(如相似物、衍生物或突变体)能够引起转基因在植物细胞中的表达。这样的变异体包括自然存在的等位基因变异体和非自然存在的变异体。可以考虑一个或多个核苷酸的增加、缺失、取代和衍生化，只要该修改没有导致调控元件功能活性的丧失。优选地，功能活性片段或变异体与上述序列的相关部分有至少大约80%的同源性；更优选地，至少大约90%的同源性；最优选地，至少大约95%的同源性。优选地，片段的大小为至少100个核苷酸，更优选地至少150个核苷酸，最优选地至少200个核苷酸。在本发明的这方面的特别的优选实施方式中，调控元件包括核苷酸序列，该核苷酸序列选自由本发明图18(序列号13)序列组成的组核苷酸-4581至-1核苷酸-4285至-1核苷酸-4020至-1核苷酸-2754至-1核苷酸-1810至-1核苷酸-831至-1核苷酸-560至-1核苷酸-525至-1核苷酸-274至-1核苷酸-21至-1;或它们的功能活性片段或变异体。在另一个优选实施方式中，调控元件包括4-香豆酸辅酶A连接酶启动子；更加优选地，来自黑麦草(黑麦草属)或羊茅(羊茅属)种的4-香豆酸辅酶A连接酶启动子；更优选地是黑麦草的4-香豆酸辅酶A连接酶启动子，最优选地是多年生黑麦草(Loliumperenne)的4-香豆酸辅酶A连接酶启动子。在本发明这方面的特别优选实施方式中，调控元件包括来自4-香豆酸辅酶A连接酶基因的启动子，该4-香豆酸辅酶A连接酶基因与多年生黑麦草cDNA同源Lp4CL2相应。优选地，调控元件包括核苷酸序列，核苷酸序列包括本发明图38中所示序列(序列号17)的最初的大约2206个核苷酸；或者它们的功能活性片段或变异体。本内容中“功能活性”的意思是片段或变异体(如相似物、衍生物或突变体)能够引起转基因在植物细胞中的表达。这样的变异体包括自然存在的等位基因变异体和非自然存在的变异体。可以考虑一个或多个核苷酸的增加、缺失、取代和衍生化，只要该修改没有导致调控元件的功能活性的丧失。优选地，功能活性片段或变异体与上述序列的相关部分有至少大约80%的同源性；更优选地，至少大约90%的同源性；最优选地，至少大约95%的同源性。优选地，片段的大小为至少100个核苷酸，更优选地至少150个核苷酸，最优选地至少200个核苷酸。在本发明的这方面的特别优选实施方式中，调控元件包括核酸序列，该核酸序列选自本发明图38的序列(序列号17)组成的组核苷酸-2206至-1核苷酸-1546至-1核苷酸-1186至-1核苷酸-406至-1核苷酸-166至-1;或者它们的功能活性片段或变异体。在另一个优选实施方式中，调控元件包括肉桂酰辅酶A还原酶启动子；更加优选地，来自黑麦草(黑麦草属)或羊茅(羊茅属)种的肉桂酰辅酶A还原酶启动子；更优选地是黑麦草的肉桂酰辅酶A还原酶启动子，最优选地是多年生黑麦草(Loliumperenne)的肉桂酰辅酶A还原酶启动子。在本发明这方面的特别优选实施方式中，调控元件包括来自肉桂酰辅酶A还原酶基因的启动子，该肉桂酰辅酶A还原酶基因与多年生黑麦草的LpCCRlcDNA相应。优选地，调控元件包括核苷酸序列，该核苷酸序列包括本发明图39所示序列(序列号18)的最初的6735个核苷酸；或者它们的功能活性片段或变异体。本内容中的“功能活性”的意思是片段或变异体(如相似物、衍生物或突变体)能够引起转基因在植物细胞中的表达。这样的变异体包括自然存在的等位基因变异体和非自然存在的变异体。可以考虑一个或多个核苷酸的增加、缺失、取代和衍生化，只要这种修改没有导致调控元件的功能活性的丧失。优选地，功能活性片段或变异体与上述序列的相关部分有至少大约80%的同源性，更优选地至少大约90%的同源性，最优选地至少大约95%的同源性。优选地，片段大小为至少100个核苷酸，更优选地至少150个核苷酸，最优选地至少200个核苷酸。在本发明这发明的特别优选的实施方式中，调控元件包括核苷酸序列，该核苷酸序列选自本发明图39的序列(序列号18)组成的组核苷酸-6735至-1核苷酸-5955至-1核苷酸-5415至-1核苷酸-4455至-1核苷酸-4035至-1核苷酸-3195至-1核苷酸-2595至-1核苷酸-1755至-1核苷酸-1275至-1核苷酸-495至-1核苷酸-255至-1核苷酸-75至-1;或它们的功能活性片段或变异体。“外源基因”的意思是没有与所述调控元件自然连接的基因。在本发明的一些实施方式中，外源基因也没有自然存在于相关的植物或植物细胞中。外源基因可以是任何合适的类型。外源基因可以是核酸如DNA(如cDNA或基因组DNA)或RNA(如mRNA)，和它们的组合。外源基因可以与靶基因相一致，例如能够影响疾病抗性、草料消化率、营养物品质、矿物质含量或干旱忍受力的基因，或能够改良所述靶基因表达的基因的片段或变异体(如相似物、衍生物或突变体)。这样的变异体包括反义于所述靶基因的核酸序列或它们的相似物、衍生物、突变体或片段。转基因可以编码蛋白或RNA序列，取决于目标的环境以及是否需要上调或下调的基因表达。优选地，靶基因选自编码编码蛋白的mRNA的外源编码序列，该蛋白可以是细菌起源(如细胞壁变异或细胞壁新陈代谢、细胞分裂素生物合成中所涉及的酶)，或真核起源(如药物学活性多肽)或植物起源(如酚化合物合成、细胞壁新陈代谢、糖新陈代谢、木质素生物合成中所涉及的酶)的。优选地，靶基因选自0-甲基转移酶、4-香豆酸辅酶A连接酶、肉桂酰辅酶A还原酶、肉桂醇脱氢酶、肉桂酸-4-羟基化酶、酚酶、漆酶、过氧化物酶、松柏醇葡糖基转移酶、松柏苷β-葡糖苷酶、苯丙氨酸氨解酶、阿魏酸-5-羟基化酶、几丁质酶、葡糖聚酶、异戊烯转移酶、木聚糖酶组成的组。植物细胞可以是任何合适的类型，本发明的调控元件在所述植物细胞中能够引起外源基因的表达。植物细胞可以来自单子叶植物(如来自于黑麦草属、羊茅属、狗牙根属、臂形草属、雀稗属、黍属、芒属、狼尾草属、薦草属的草、和其它的草料和草皮草、玉米、谷物、燕麦、甘蔗、小麦和大麦)，双子叶植物(如拟南芥属、烟草、豆类、苜蓿属、橡树、桉属、枫、杨属、油菜、大豆和鹰嘴豆)和裸子植物(如松属)。优选地，植物细胞来自于单子叶植物，更优选地是草的种类如黑麦草属、羊茅属、狗牙根属、臂形草属、雀稗属、黍属、芒属、狼尾草属、薦草属、和其它的草料、草皮和生物能草，更优选地是黑麦草属种如多年生黑麦草(Loliumperenne)或Loliumarundinaceum。根据本发明的调控元件可以用于表达外源基因，在转基因植物的产生中，调控元件有效地与外源基因连接。因此，本发明的进一方面，提供了包含根据本发明的调控元件的载体。在本发明这方面的优选实施方式中，载体可以包括根据本发明的调控元件、如这里之前所述的外源基因、和终止子；所述调控元件、外源基因和终止子有效地连接，因此所述调控元件能够引起所述外源基因在植物细胞中的表达。优选地，所述调控元件在所述外源基因的上游，所述终止子在所述外源基因的下游。载体可以是任何合适的类型，可以是病毒的或非病毒的。载体可以是表达载体。这样的载体包括染色体、非染色体和合成的核酸序列，例如，植物病毒衍生物；细菌质粒；来自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti质粒的衍生物；来自毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的Ri质粒的衍生物；噬菌体DNA；酵母人工染色体；细菌人工染色体；双元细菌人工染色体；来自质粒和噬菌体DNA的联合体的载体。但是，可以使用其它载体，只要能够在植物细胞中整合的复制或可存活。终止子可以是任何合适的类型，包括例如多聚腺苷化信号，如花椰菜花叶病毒35S多聚A(CaMV35S多聚Α)和其它来自胭脂碱合酶(nos)和章鱼碱合酶(ocs)基因的终止子。载体，除调控元件、外源核酸和终止子之外，可以包括更多核酸表达所必须的元件，以不同的方式组合，例如载体骨架、复制起点(ori)、多克隆位点、间隔序列、增强子、内含子(例如玉米泛素Ubi内含子)、抗生素抗性基因和其它选择性标记基因(如新霉素磷酸转移酶(npt2)基因、潮霉素磷酸转移酶(hph)基因、草丁膦乙酰转移酶(bar或pat)基因)、和报告基因(如葡糖苷酸酶(GUS)基因(gusA))。载体还可以包含用于翻译起始的核糖体结合位点。载体还可以包括用于扩增表达的合适序列。本发明的调控元件还可以与其它全长启动子或部分启动子元件一起使用。作为提供用于筛选转化的宿主细胞的表型的选择性标记基因使用的选择，在转化细胞中存在的载体可以通过本领域公知的其它技术测定，例如PCR(聚合酶链式反应)，Southern印迹杂交分析，组织化学⑶S试验，Northern和Western印迹杂交分析。本领域技术人员将意识到载体的多种成分是有效地连接，从而导致所述转基因的表达。将本发明中的载体的成分有效地连接的技术是本领域技术人员熟知的。这样的技术包括连接物如合成的连接物的使用，例如包括一个或多个限制性内切酶位点。本发明的载体可以融合至多种植物中，包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物。在优选实施方式中，载体用于转化单子叶植物，优选地草的种类为如黑麦草(黑麦草属种)和羊茅(羊茅属种)，更优选地为多年生黑麦草(Loliumpererme)，包括用于草料和草皮使用的栽培品种。用于将本发明的载体融入至植物细胞的技术(例如通过转导、转染或转化)是本领域技术人员熟知的。这样的技术包括农杆菌介导的导入，电转化至组织、细胞和原生质体，原生质体融合，注射至繁殖器官，注射至未成熟的胚和高速弹射介导至细胞、组织、愈伤组织、未成熟的和成熟的胚。技术的选择很大程度上依赖于要转化的植物的类型。融合有本发明的载体的细胞可以使用本领域公知的技术如前面所述的筛选，然后在合适的培养基上培养以产生转化的植物。培养环境，如温度、PH值等等，对本领域技术人员是显而易见的。得到的植物可以利用本领域公知的方法繁殖，有性繁殖或无性繁殖，以产生转化植物的连续世代。本发明的进一方面，提供了包括，例如转化有本发明的载体的植物细胞、植物、植物种子或其它植物部分。植物细胞、植物、植物种子或其它植物部分可以来自任何合适的种，包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物。在优选实施方式中，植物细胞、植物、植物种子或其它植物部分来自单子叶植物，优选地来自禾本科的种，更优选地来自黑麦草(黑麦草属种)或羊茅(羊茅属种)，更加优选地来自多年生黑麦草(Loliumpererme)，包括用于草料和草皮使用的栽培品种。本发明还提供源自本发明的植物细胞的植物、植物种子、或其它植物部分。本发明还提供源自本发明的植株的植物、植物种子、或其它植物部分。本发明的更近一方面提供了包括根据本发明的调控元件的重组植物基因组。在本发明这方面的优选实施方式中，重组植物基因组进一步包括有效地连接于所述调控元件的外源基因。本发明的进一方面，提供了用于在植物细胞中表达外源基因的方法，所述方法包括将有效量的根据本发明的调控元件和/或载体导入所述植物细胞中。“有效量”的意思是在所述植物细胞、或植物、植物种子或来自它们的其它植物部分中足够引起可识别的表型变化的量。本领域的技术人员在考虑植物细胞的类型、处理顺序和其它相关因素后，可以很容易地测定这样的量。这样的技术人员可以很容易地测定合适的量和处理方法。参见，例如，Maniatis等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，冷泉港，所有公开的内容以参考引用的方式结合至此。参照随附的实施例和附图可以更充分地描述本发明。但，应当理解，以下的描述仅是说明性的，不能以任何方式理解为对本发明以上描述的一般性的限制。图中图1表示编码多年生黑麦草4CL同源的三个cDNAs的质粒图谱。图2表示Lp4CLl的核苷酸序列(序列号1)和氨基酸序列(序列号2)。图3表示Lp4CL2的核苷酸序列(序列号3)和氨基酸序列(序列号4)。图4表示Lp4CL3的核苷酸序列(序列号5)和氨基酸序列(序列号6)。图5表示由Lp4CLl(序列号2)、Lp4CL2(序列号4)和Lp4CL3(序列号6)编码的推定的蛋白质的氨基酸序列比对。图6表示使用Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3为杂交探针对发育的多年生黑麦草的northern杂交分析。SR苗的根(发芽后3_5天)；SS苗的芽(发芽后3_5天)；ML:12周植株的叶片；MS:12周植株的茎。斑点在65°C下用0.2XSSPE，0.SDS清洗。在这样的严格条件下，Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3没有交互杂交。大小以kb给出。图7表示说明在创伤的多年生黑麦草叶片中4CLmRNA的表达的时间进程的northern杂交分析。图8表示使用Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3作探针的基因组Southern杂交分析。IOyg的消化的多年生黑麦草基因组DNA或20yg消化的高羊茅基因组DNA在1.0%的琼脂糖凝胶中分开，转移至HybondN+膜上，然后用32P标记的Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3探针杂交。黑麦草Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3基因表现出在高羊茅中的同源序列，说明黑麦草4CL基因能够用于分离和操控高羊茅(Festucaarundinacea)4CL基因的表达。图9表示LpCCRl的限制性酶切图谱。在Ubi-ZAP(Stratagene)中构建的多年生黑麦草(L.perenne)苗的cDNA文库在42°C下在溶液中筛选，所述溶液包括10XPIPES、50%的去离子甲酰胺和10%的SDS。在室温下，在0.1%SDS、2XSSPE中三次，然后在0.1%SDS,0.2XSSPE中两次清洗筛选物。用于northern和Southern杂交分析的探针的定位通过黑线标记的LpCCR531表示。图10表示LpCCRl的核苷酸序列(序列号7)和氨基酸序列(序列号8)。图11表示以LpCCRl为杂交探针的双单倍体(DH)多年生黑麦草的DNA的Southern杂交分析。用Dral,BamHI、EcoRI、EcoRV、HindIII或XbaI消化10μg的DH基因组DNA,在琼脂糖凝胶分离，然后用毛细管点在尼龙膜上(AmershamHybond-Ν)。在杂交液中，用25ng/ml的地高辛标记的LpCCR531片段探测膜。42°C下，在4XSSC、50%甲酰胺、0.1%N-月桂酰-肌氨酸、0.02%SDS、2%封闭液中完成杂交。室温下在2XSSC、0.1%SDS中清洗膜两次5分钟，然后68°C下在0.5XSSC、0.1%SDS中清洗膜两次15分钟。通过与地高辛标记的marker对比测量分子量(罗氏分子生物化学)。图12表示以LpCCRl为探针对来自多年生黑麦草的不同器官和发育期的RNA样品的northern杂交分析。苗的根(发芽后3_5天)、苗的芽(发芽后3_5天)、苗的根(发芽后7-10天)、苗的叶片(发芽后7-10天)、6和10周植株的根、6和10周植株的叶片、6和10周植株的茎、11天的薦草属和7天的羊茅属的全苗。使用Trizol(GibcoBRL)分离总RNA，在含有6%甲酰胺的1.2%琼脂糖凝胶中分开15μg的总RNA，然后用毛细管点在尼龙膜上(AmershamHybond-N)。使用0.2%亚甲基蓝/0.3M醋酸钠将膜染色，使marker显色，并确保RNA均勻沉淀。使用32P_dCTP(AmershamMegaprime)随机标记50ng的LpCCR531；杂交条件是4XSSC、50%甲酰胺、0.5%SDS、5Xdenhardt溶液、5%硫酸葡聚糖、0.鲱鱼精DNA，42°C过夜。黑麦草LpCCRl基因显示了在高羊茅和薦草属中的同源转录本，因此表明黑麦草CCR基因能够用于操控高羊茅(Festucaarundinacea)和薦草属CCR同源基因的表达。图13表示LpCADl的核苷酸序列(序列号9)和氨基酸序列(序列号10)。图14表示LpCAD2的核苷酸序列(序列号11)和氨基酸序列(序列号12)。图15表示编码多年生黑麦草CAD的同源LpCADl的cDNA克隆的质粒图谱。图16表示使用A)LpCADl和B)LpCAD2作为杂交探针的多年生黑麦草的不同器官和发育期的RNA样品的northern杂交分析。发芽后3_5天的苗的根、发芽后7_10天的苗的根、6周和10周苗的根、发芽后3-5天和7-10天的苗的芽、6周和10周植株的叶片、6周和10周植株的茎组织。从薦草属和羊茅属的11天和7天的苗中分离RNA。黑麦草CAD基因显示了在高羊茅和薦草属中的同源转录本，因此表明黑麦草CAD基因能够用于操控高羊茅和薦草属CAD同源基因的表达。图17表示基因组Southern杂交分析。将10μg用一系列限制性内切酶消化的多年生黑麦草基因组DNA在0.8%琼脂糖凝胶中分开，转移至HybondN，然后用地高辛标记的A)LpCADl和B)LpCAD2杂交探针杂交。图18表示LpOmtl启动子的核苷酸序列(序列号13)。图19表示携带在多年生黑麦草LpOmtl启动子控制下的报告基因β_葡糖苷酸酶(GUS)基因(gusA)的植物转化载体的质粒图谱。图20(上面的图)表示包含在多年生黑麦草LpOMTl启动子控制下的gusA基因的转基因烟草植株的PCR分析(上图)。用gusA特异性引物完成PCR反应。图20(下面的图)表示组织化学GUS试验，表明木质部特异性的gusA表达(A和B)和在转基因烟草植株的叶片腺体毛状体(C和D)中gusA表达，转基因烟草植株包含多年生黑麦草LpOMTl启动子控制的gusA基因。图21表示LpCCRl基因组克隆1的分离。A)用XbaI、Ncol、SalI、XhoI、XhoI/SalI消化的CCR基因组克隆λLp6.1.Ia的Southern杂交分析，DNA在0.8%的琼脂糖凝胶中分开，转移至HybondN,用地高辛标记的CCRl探针杂交。B)表示基于序列结果的LpCCRl克隆1的基因组基因结构图谱。C)在不同植物种(多年生黑麦草(Loliumperenne),Lp.；桉属力口梓按(Eucalyptusgunni),Eg.；柳按(Eucalyptussaligna),Es.；大口十钻天杨(Populusbalsamifera)，Pb.)中的植物CCR外显子的大小和数量的比较。图22表示LpCCRl基因组克隆2的分离。A)用XbaI、Ncol、SalI、XhoI、XhoI/SalI消化的CCR基因组克隆λLp6.1.Ia的Southern杂交分析，DNA在0.8%的琼脂糖凝胶中分开，转移至HybondN，用200bp的CCRl启动子(图21B)杂交。B)表示基于序列结果的LpCCRl克隆2的启动子区的图谱。图23表示Lp4CL基因组克隆的分离。A)用BamHI、KpnI或SalI消化的4CL基因组克隆λLp4CL2的Southern杂交分析，DNA在0.8%的琼脂糖凝胶中分开，转移至HybondN，用地高辛标记的4CL1杂交探针杂交。B)使用C)中标出的指定位置的正向和反向寡聚核苷酸的10μ1标准PCR反应。PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶中分开，并用溴化乙锭染色。C)表示基于序列和PCR结果的λLp4CL2的基因组基因结构的图谱。图24表示Lp4CL基因组克隆的分离。A)用BamHI、KpnI、SalI消化的4CL基因组克隆λLp4CL2的Southern杂交分析。DNA在0.8%的琼脂糖凝胶中分开，转移至HybondN，用地高辛标记的4CL1探针杂交。B)表示Lp4CL2克隆1的基因组基因结构和克隆2的启动子区的图谱。图25表示携带有在多年生黑麦草Lp4CL2启动子控制下的gusA基因的植物转化载体质粒图谱(Lp4CL2::gusA)。图26表示基因组克隆CAD2cvBarlano的核苷酸序列(序列号14)和氨基酸序列(序列号15)(内含子1和编码区最前边的Illbp缺失)。图27表示从基因组克隆CAD2cvBarlano推测的核苷酸序列(序列号16)和氨基酸序列(序列号15)(黑体区域在基因组克隆中缺失)。图28表示LpCAD2基因组克隆的分离。A)用BamHI、EcoRI、KpnI、SalI或XbaI消化的CAD基因组克隆λLpCAD2的Southern杂交分析。DNA在0.8%琼脂糖凝胶中分开，转移至HybondN，用地高辛标记的CAD2杂交探针杂交。B)表示基于序列结果的λLpCAD2的基因组基因结构的图谱。图29表示A)CaMV35S启动子控制下的正义和反义的Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3转化载体；B)玉米泛素启动子控制下的正义和反义的Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3转化载体。图30表示A)CaMV35S启动子控制下的正义和反义的LpCCRl转化载体；B)玉米泛素启动子控制下的正义和反义的LpCCRl转化载体。图31表示A)CaMV35S启动子控制下的正义和反义的LpCADl转化载体；B)玉米泛素启动子控制下的正义和反义的LpCADl转化载体。图32表示Lp4CLl_转基因烟草的分子分析。A)携带融合正向Lp4CLl基因的转化载体质粒图谱。B)使用Lp4CLl特异引物的独立转基因烟草克隆的PCR分析。C)使用Lp4CLl特异探针的独立转基因烟草的Southern杂交分析。D)使用Lp4CLl特异探针的独立转基因烟草的Northern杂交分析。图33表示LpCCRl-转基因烟草的分子分析。A)携带融合正义和反义LpCCRl基因的转化载体的质粒图谱。B)使用LpCCRl特异引物的独立正义转基因烟草克隆的PCR分析。图34表示用于转基因多年生黑麦草植株的不依赖悬浮液培养液的产物的方案。A)分离合子胚，种植在MSM5培养基上，第0天；B)胚性愈伤组织的形成和发芽繁殖，胚分离后的6-8周；C)在基因枪转化之前将胚性愈伤组织排布在高渗透的MSM3Plus培养基上；D)组织化学GUS试验表明GUS的表达聚集在轰击了融合的gusA基因后的3-4天；E)在包含100mg/l巴龙霉素(Pm)的SM3培养基上筛选胚性愈伤组织，微粒轰击后2周；F)Pm抗性芽在包含100mg/lPm的MSK培养基上再生，微粒轰击后4周；G)来自PM抗性胚性愈伤组织的体外植株再生，微粒轰击后6周；H)胚分离后28周的转基因多年生黑麦草植株。图35表示携带正义和反义LpOmtl转基因的转基因多年生黑麦草植株的分子分析。用于多年生黑麦草胚性愈伤组织共转化的载体的质粒图谱；PHP23携带融合的新霉素磷酸转移酶(npt2)选择性标记基因；pUbiomtl携带驱动正义LpOmtl基因的玉米泛素启动子；pUbitmol携带驱动反义LpOmtl基因的玉米泛素启动子(上面)。使用npt2特异性引物的来自用正义和反义LpOmtl载体基因枪转化的5株独立转基因多年生黑麦草植株的PCR分析(上面中间)。使用omtl杂交探针的用正义(1-3甬道)和反义(4-7甬道)LpOmtl载体共转化的7株独立的多年生黑麦草植株的Southern杂交分析。使用npt2杂交探针的独立的多年生黑麦草植株的Southern杂交分析(下面中间右边)。用反义LpOmtl载体共转化的多年生黑麦草植株的Northern杂交分析(底部)。C=未转化的多年生黑麦草的阴性对照；P=阳性质粒对照。图36表示LpOmtl-转基因多年生黑麦草的生物化学分析。测量来自筛选的独立LpOmtl-转基因多年生黑麦草植株(Ell8、Ell11、Ell14和Ell15)的叶片样品的OMT活性，并且与未转化的多年生黑麦草阴性对照植株Lperermecv.Ellett(野生型)对比。显示出重复检测的平均值和标准偏差。图37表示转基因黑麦草植株的PCR筛选。使用npt2特异性引物的来自转化有反义LpUbi4CL2载体的基因枪转化的8株独立的转基因多年生黑麦草植株的PCR分析。图38表示多年生黑麦草的基因组克隆4CL2的核苷酸序列(序列号17)。图39表示多年生黑麦草的基因组克隆CCRl的核苷酸序列(序列号18)图40表示Lp4CLl、Lp4CL3、LpCADl、LpCAD2、LpCCRl、LpOMTl和Lp0MT2(黑体)在多年生黑麦草遗传连锁图中的图谱定位。图41.用于形成表达多年生黑麦草木质素生物合成基因的结构的Gateway来源的表达载体的说明。图42.用于LpCAD3cDNA的GatewayEntry克隆的载体详细说明。图43.用于启动子LpCAD2的GatewayEntry克隆的载体详细说明。图44.用于终止子LpCAD2的GatewayEntry克隆的载体详细说明。图45.结构1的质粒图谱，LpCAD2pLpCAD3LpCAD2t在载体pAUX3132中。图46.结构2的质粒图谱，LpCCRlLpCCRlLpCCRl在载体pAUX3169中。图47.LpCCRl基因的序列(序列号19)和给予LpCCRl基因单一碱基缺失的修饰的正向引物(序列号20)。图48.结构3的质粒图谱，LpCCRl:LpCCRl(fs)LpCCRl在载体pAUX3169中。图49.对含有表达结构ActlD::hph:35S的用作植物选择性标记的pAcHl结构的载体详细说明。图50.来自未成熟花序的胚性愈伤组织的微粒轰击的转基因多年生黑麦草的制备。A)多年生黑麦草的离体未成熟花序，2-3mm;B-E)胚性愈伤组织的诱导和繁殖，花序切除后1-8周；F)在基因枪转化前，将胚性愈伤组织分布在高渗透性培养基LP3-0S培养基上；G)基因枪转化装置，PDS-1000/He；H-I)潮霉素抗性芽的生长和发育，轰击后30-75天；J)体外潮霉素抗性芽的生长和发育；K)潮霉素抗性植株种植在土壤中并且密封温室条件下生长。图51.来自苗分裂组织的胚性愈伤组织的微粒轰击的转基因多年生黑麦草的制备。A)用于基部分生组织(basalmeristem)分离的体外芽培养物，再生于苗分生组织来源的愈伤组织；B)将基部分生组织材料分布在愈伤组织诱导培养基(initiationmedium)上；C-E)多年生黑麦草的芽分生组织的胚性愈伤组织的诱导和繁殖；F)在基因枪转化前将胚性愈伤组织分布在高渗透性培养基上；G)基因枪转化装置，PDS-1000/He；H-I)潮霉素抗性芽的生长和发育，轰击后30-84天J)体外潮霉素抗性芽的生长和发育；K)潮霉素抗性植株种植在土壤中并且密封温室条件下生长。图52.描述用于产生包含关注的表达结构和选择性标记基因(hph)的转基因多年生黑麦草的转化方法的流程图。图53.在用质粒pAcHl和pAUX3132_LpCAD2LpCAD3LpCAD2共轰击后再生的假定的转基因多年生黑麦草中提取的基因组DNA的样品中通过Q-PCR的潮霉素磷酸转移酶(hph)基因的扩增。图54.用EcoRl(Rl)消化和用琼脂糖凝胶电泳分离的基因组DNA的Southern分析，用hph或Ubi启动子探针检测转基因。所有的六株假定的转基因植株确定包含hph和关注的基因，hpLpCCRl。图55.来自野生型和转基因pUbi::hpCCRl::35S黑麦草的Rl和R2期的横截面节间部分的Maule染色说明在转基因植株中微红色的强烈减少可能暗示相比与野生型植株的S木质素含量的减少。图56.Rl发育期的多年生黑麦草节间部分的总木质素含量说明从节间部分1(底部)到节间部分5(顶部)的木质素含量的逐渐减少。图57.从野生型多年生黑麦草种提取的木质素的thioacidlysis衍生化后说明G-木质素和S-木质素单体的分离和确定的气相色谱(GC-MS)的例子。具体实施例方式实施例1多年生黑麦草(Loliumperenne)的3个4_香豆酸辅酶A连接酶(4CL)cDNAs的分离和表征材料和方法植物材料多年生黑麦草(LoliumperenneL.)cvEllet禾口高羊茅(FestucaarundinaceaSchreb.)cvTriumph的植株和胚细胞悬浮液的建立和保存如之前所述(Heath等，1998)。创伤实验使用10日龄的多年生黑麦草(cvEllet)如前所述(Heath等，1998)完成。cDNA文库的筛选从多年生黑麦草苗分离出的RNA制备的cDNA文库(Heath等，1998)用[32P]dCTP-标记的水稻部分4CL探针筛选。水稻4CL探针和844bp组成的4CL特异性序列插入PUC119中。这个插入序列与水稻4CL的cDNA序列(Genbank，L43362，碱基453-1300)有93%的序列同源性。使用ExAssist辅助性噬菌体在SOLR株系(Stratagene)中，如制造商所述的将cDNA插入序列切除和再环化(recircularized)。DNA测序cDNA克隆用8个限制性内切酶(BamHI、EcoRI、KpnI、NotI、PstI、SalI、XbaI、XhoI)消化，选择的克隆使用M13正向和反向引物利用双脱氧链终止法对双链均测序。为Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3的内部区域的测序，合成的寡聚核苷酸引物从提前测定的DNA序列中设计。测序使用ABI染料终止子试剂盒和自动测序仪完成。核苷酸序列用SeqEd程序(ABI)比对，使用HIBIODNASISvs2程序(日立软件公司)完成进一步分析。基因组DNA印迹分析根据Lichtenstein和Draper(1985)，从多年生黑麦草和高羊茅的单一基因型来源的细胞悬浮液中分离基因组DNA。将10μg的多年生黑麦草DNA和20μg的高羊茅DNA用限制性内切酶HindIII和XbaI分别消化，在1%琼脂糖凝胶中分开，并根据制造商(Amersham)的说明转移至HybondN+膜上。由Lp4CLl(1771bp)、Lp4CL2(2034bp)或Lp4CL3(2080bp)的BamHI/Kpnl片段组成的探针使用Megaprime标记试剂盒(Amersham)和[32P]dCTP标记。65°C下，在5XSSPE、5XDenhardt，s溶液、0.5%(w/v)SDS和200μg/mL变性鲱鱼精DNA中完成杂交。25°C下在2XSSPE、0.1%SDS中将膜清洗10分钟，三次；然后在65°C下在0.1XSSPE、0.1%SDS中清洗20分钟，两次。RNA印迹分析将总RNA(10μg)在1.2%甲醛凝胶中分开，并根据制造商的说明转移至HybondN(Amersham)膜上。膜用0.2%亚甲基蓝染色以确定RNA准确的附着和转移。42°C下，在5XSSPE、5XDenhardt，s溶液、0.5%SDS、50%去离子甲酰胺、200μg/mL变性鲱鱼精DNA中完成杂交。探针的制备和膜的清洗如同DNA印迹分析，除了高羊茅Northern印迹，其最后两次清洗在42°C下、0.1XSSPE、0.SDS中10分钟完成。结果多年生黑麦草4CL的cDNAs的分离和序列分析从多年生黑麦草苗提取的RNA中制备的cDNA文库用水稻4CL杂交探针筛选，从2X105pfu中分离出10个cDNAs。cDNAs用8个限制性内切酶的限制性分析表征。所有的克隆都是全长(大约2.0-2.2kb)，具有多聚(A)尾，并且能够被分成3组Lp4CLl(4个克隆)、Lp4CL2(5个克隆)和Lp4CL3(1个克隆)。(图1)显示Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3的质粒图谱。Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3全长测序(分别为图2、3和4)。Lp4CLl有2284bp长，具有1710bp的开放阅读框(ORF)，322bp的5，非编码区和包含多聚(A)尾的252bp的3，非编码区。Lp4CL2有1992bp长，具有1668bp的0RF，61bp的5，非编码区和包含多聚(A)尾的263bp的3，非编码区。Lp4CL3有2038bp长，具有1671bp的ORF，112bp的5，非编码区和包含多聚(A)尾的255bp的3，非编码区。在编码区中，Lp4CLl与Lp4CL2和Lp4CL3均具有70%的核酸序列同源性，而Lp4CL2与Lp4CL3具有79%的序列同源性。克隆之间，3’非编码区具有很少的序列同源性(52-55%)。氨基酸序列比较由三个cDNAs编码的推定的蛋白中，Lp4CLl由570个氨基酸组成(60290u(Da))、Lp4CL2由556个氨基酸组成(59238u)以及Lp4CL3由557个氨基酸组成(59735u)。(图5)显示了Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3的推断的氨基酸序列。Lp4CL2和Lp4CL3具有79%氨基酸序列同源性，Lp4CLl和Lp4CL2具有61%氨基酸序列同源性，而Lp4CLl和Lp4CL3仅有58%氨基酸序列同源性。高序列同源性的区域在酶的中间和C-末端区域更普遍。例如Lp4CL2和Lp4CL3的每个酶的氨基酸208-568之间的序列同源性是85%，Lp4CLl和Lp4CL2M72%,Lp4CLl和Lp4CL3是67%。Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3与其它植物4CLs共有几个共同区域。特别地，它们包含假定的AMP-结合域和保守的GEICIRG基序，除了Lp4CL3，其第二个异亮氨酸被缬氨酸取代(图5)。已经提出区域II与4CL的催化活性相关联。同样，在植物4CLs中保守的4个Cys残基在Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3中保守存在(图5)。三个结果暗示多年生黑麦草(L.perenne)cDNAs编码很可能起源于三个不同4CL基因的三个不同的4CL酶。多年生黑麦草4CL基因的表达Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3在含有两个发育期的多年生黑麦草的不同器官中制备的RNA的Northern印迹中被用作杂交探针。所有的三个探针与大约2.2-2.3kb的单一的mRNA种类杂交。Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3在发育的苗期和成熟期均表达，在所有检测的器官中都表达。对于Lp4CL2和Lp4CL3，最强的信号出现在苗期的根和成熟期的茎的RNA样品中(图6)。Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3也在含有从高羊茅中制备的RNA的Northern印迹中被用作杂交探针。所有的三个探针与多年生黑麦草中相似的mRNA种类(2.3kb)杂交(图6)。最强的信号出现在成熟期的茎的RNA样品中，在根和苗期的芽的RNA中的信号较弱。在叶片中没有发现Lp4CLl、Lp4CL2或Lp4CL3的表达。三个探针在高羊茅中与相关同源序列的杂交能力不同，Lp4CL3导致最强的信号，Lp4CLl仅仅很微弱地杂交。为检测4CL是否能够在胁迫条件下被诱导，对多年生黑麦草的苗的叶片进行创伤。在创伤中没有观察到Lp4CLl、Lp4CL2或Lp4CL3在转录水平有增加(图7)。多年生黑麦草4CL基因的基因组结构多年生黑麦草DNA用两种限制性内切酶HindIII或XbaI消化。这些酶的酶切位点在Lp4CLl、Lp4CL2或Lp4CL3的cDNA序列中不存在。当Lp4CLl、Lp4CL2或Lp4CL3用作探针，暴露出几个变化强度的DNA杂交片段(图8)。每一个探针与独特组的片段杂交，暗示Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3代表三种不同基因。此外，Lp4CLl和Lp4CL2与每次消化的2_3个主要片段杂交，可能表明同样基因的等位基因，或说明在每一个种类中存在多于一个基因。在高严格条件下的高羊茅的基因组Southern印迹中，Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3还揭示了几个不同大小的杂交DNA片段(图8)，暗示在高羊茅(F.arundinacea)中存在三个相似的4CL基因。实施例2多年生黑麦草(Loliumperenne)的肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)cDNA的分离和表征使用玉米CCR探针对总计500，000噬菌体进行筛选，噬菌体来自由10日龄的黄化的多年生黑麦草(Lpererme)苗构建的cDNA文库。在初步筛选中发现93个阳性噬菌斑，5个随后用限制性酶切消化进行分析。5个中的4个是一样的。4个一样的cDNAs中的一个，LpCCRl，被选出用于进一步分析(图9)。多年生黑麦草CCRcDNA的核酸序列分析获得了LpCCRl的全长核苷酸序列，并预测了氨基酸序列(图10)。LpCCRl的cDNA为1395bp，具有149bp的5，非编码区和160bp的3，非编码区。1086bp的开放阅读框编码具有362个氨基酸的蛋白。发现编码区的成分是富含68%的G+C。同样检测了密码子的使用，发现偏向于XXC/G密码子(94%)，而XCG和XUA密码子经计算分别仅为9%和0.55%。G+C的富集及三联密码子第三个位置偏向于G和C是之前已经报道过的单子叶植物基因的特征。多年生黑麦草CCR基因的基因组结构在黑麦草基因组中存在的CCR基因的数量通过来自双单倍体植物的基因组DNA的Southern印迹分析测量，LpCCRlcDNA的片段(LpCCR531，图9)用作探针。双单倍体DNA减少了等位基因变异的复杂性。使用不在cDNA内部酶切的酶对基因组DNA进行酶切DraI、BamHI、EcoRI、EcoRV、HindIII和Xbal，膜在中度严格条件下杂交和清洗。每条甬道都显现单一的强烈杂交带(图11)说明在多年生黑麦草基因组中存在单一拷贝的LpCCRl基因。多年生黑麦草CCR基因的表达为研究CCR基因在黑麦草中的表达谱，使用总RNA完成Northern杂交分析，其中总RNA从苗生长期的根和芽(0.5-lcm和4-6cm芽)以及成熟生长期的根、茎和叶片(6和10周)中提取。苗在25°C黑暗中种植在滤纸上，然后转移至土壤和温室条件(25°C)直至6-10周时期。来自羊茅属和薦草属的全部苗的总RNA包括在northern分析中。使用LpCCR531(图9)的杂交在中度严格条件下完成，然后在高度严格条件下对膜进行清洗。在所有的组织中都发现大约1.5kb的转录本，表达水平随成熟度而变化，从一种组织类型到另一种组织类型也不同(图12)。LpCCRl转录本表现出在根和茎中比芽和叶片中更多。在茎中，转录本量从6周到10周增加，说明当植株成熟时，茎中的转录上调。发现表达在形成次级细胞壁的组织如茎和根中占优势，说明LpCCRl基本包括在木质化中。实施例3多年生黑麦草(Loliumperenne)的肉桂醇脱氢酶(CAD)cDNAs的分离和表征从cDNA中扩增558bp的肉桂酰脱氢酶(CAD)片段，该cDNA从多年生黑麦草苗中制备的总RNA中合成。辐射松、紫花苜蓿、食用土当归(Araliacordata)、葡萄桉和拟南芥的CADs间的保守氨基酸区域被用于设计扩增多年生黑麦草CAD的寡聚核苷酸。正向寡聚核苷酸设计在保守氨基酸区域CAGVTVYS，反向寡聚核苷酸设计在保守区域DVRYRFV。克隆出551bp的PCR片段并测序以确定其相应于多年生黑麦草CAD的PCR片段。用特异于多年生黑麦草CAD的551bp的PCR片段筛选从多年生黑麦草苗中提取的RNA制备的cDNA文库。分离出8个cDNA，并通过限制性酶切分析被分成6组。从两组中的每一组挑选出一个代表性克隆(LpCADl、LpCAD2)用于进一步表征。多年生黑麦草CADcDNAs的核酸序列分析测定多年生黑麦草CAD同源基因LpCADl的全部序列(图13)。1325bp克隆具有多聚(A)尾、典型的起始和终止密码子和编码408个氨基酸的预测蛋白的该克隆的开放阅读框(ORF)。同样测定了多年生黑麦草CAD同源基因LpCAD2的全部核苷酸序列(图14)。多年生黑麦草CAD基因的表达用从不同发育期的多年生黑麦草分离的RNA样品与全长的LpCADl的1325bpcDNA(图15)杂交完成northern杂交分析，以测定器官和发育表达的模式。探针与大约1.6kb的单一mRNA种类杂交。LpCADl转录本在所有检测组织中表达根、芽、茎和叶片(图16A)。LpCADl转录本在根组织和成熟茎中最富集，这个表达模式在包含在植物细胞壁木质化中的基因中很典型。揭示了羊茅属和薦草属的属间同源性。使用LpCAD2完成相似的northern杂交分析(图16B)，但是发现转录本在成熟茎组织和芽中最富集。多年生黑麦草CAD基因的基因组结构使用从多年生黑麦草双单倍体植株中分离的并用Dral、BamHI,EcoRI,EcoRV、HindIII和XbaI消化的DNA样品与500bpLpCADl探针杂交完成Southern杂交分析。在高严格条件下的杂交模式揭示了对于完全消化物的两条显著条带的存在，说明LpCADl属于小基因家族并且在多年生黑麦草中存在多拷贝基因(图17A)。使用LpCAD2完成相似的Southern杂交分析(图17B)，在高严格条件下的杂交模式揭示了对于完全消化物的一条或两条显著条带的存在，说明LpCAD2以单一拷贝基因或小基因家族的成员存在于多年生黑麦草中(图17B)。实施例4多年生黑麦草(Loliumperenne)的0_甲基转移酶(OMT)、肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)、4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)和肉桂醇脱氢酶(CAD)的基因组克隆和启动子的分离和表征使用相应的cDNAs作为杂交探针，从多年生黑麦草基因组文库中分离0_甲基转移酶(OMT)、肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)、4_香豆酸辅酶A连接酶(4CL)和肉桂醇脱氢酶(CAD)的基因组克隆和启动子。多年生黑麦草0-甲基转移酶(OMT)的基因组克隆和启动子的分离和表征用cDNA克隆，LpOmtl(Heath等，1998)，编码0_甲基转移酶(OMT)，筛选多年生黑麦草基因组文库。发现5’非翻译区和编码区序列与以前分离的LpOmtlcDNA—致。全部4.Skb的基因组克隆完全测序(图18)。为进一步表征启动子，形成启动子序列至β-葡糖苷酸酶(GUS)编码序列(gusA)的转录融合(图19)。向烟草原生质体的直接基因转移实验使用相应的融合基因完成以使它们在异源系统中转基因地表达，以进行通过组织化学GUS试验的原位表达模式分析。产生一组携带在LpOmtl启动子的5’调控区控制下的融合gusA基因的转基因烟草植株以评估LpOmtl启动子的木质部特异性的潜在用途，和定目标于下调编码关键木质素生物合成的酶的基因。使用LpOmtl启动子驱动融合gusA转化载体而产生的转基因烟草植株通过PCR和组织化学⑶S试验筛选。采取使用gusA特异引物的PCR筛选用于转基因烟草植株的初始鉴定(图20)。通过组织化学⑶S试验对PCR阳性烟草植株进行筛选以进行原位表达模式分析(图20)。多年生黑麦草肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)的基因组克隆和启动子的分离和表征从多年生黑麦草中分离出CCR基因组克隆，包括6.5kb启动子和全部的基因结构(内含子/外显子分界)。CCR启动子可用于外源基因在转基因植株中的靶向表达。用编码木质素生物合成酶，肉桂酰辅酶A还原酶(CCR)的cDNA克隆LpCCRl对多年生黑麦草基因组文库进行筛选。根据限制性酶切消化分析，鉴定出4个不同的基因组克隆。克隆6.1.Ia被挑选出用于进一步分析。将来自克隆6.1.Ia的6.42kb的XhoI片段亚克隆至pBluescriptSK(图21A)，该片段与LpCCRlcDNA探针强烈杂交。序列分析揭示6.42kb的XhoI片段包括整个的LpCCRl基因和200bp启动子区。内含子/外显子分界在图21B中图解说明，外显子的定位和大小显示出在不同种类的其它CCR中的保守性(图21C)。为分离LpCCRl的启动子区，包含消化的噬菌体基因组DNA的Southern印迹用200bp启动子区再探测，其中噬菌体基因组DNA从克隆λρ6.1.Ia中分离。探针与6.5kb的SalI片段强烈杂交。这个基因组片段LpCCRl克隆2亚克隆至pBluescriptSK并测序(图22A)。序列结果揭示6.5kb的SalI片段包含6.5kb的启动子(图22B)。获得了包含启动子和全部基因序列(外显子和内含子)的LpCCRl基因组克隆的全长序列并在图39中示出。多年生黑麦草4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)的基因组克隆和启动子的分离和表征从多年生黑麦草中分离4CL2基因组克隆，包含2.5kb的启动子和部分基因结构(内含子/外显子分界)。4CL2启动子可用于外源基因在转基因植株中的靶向表达。将2.5kb启动子融合至报告基因gusA以进行表达分析。用Lp4CLcDNA探针对多年生黑麦草基因组文库进行筛选。在第三次筛选后，获得了阳性4CL基因组克隆，并用限制性酶切消化和Southern杂交分析进行表征(图23A)。序列分析揭示，从多年生黑麦草中分离的4CL基因组克隆(4CL2)与Lp4CL2cDNA克隆有100%核苷酸同源性。为进一步表征这个5kbλLp4CL2基因组克隆和确定该基因组克隆与Lp4CL2的cDNA相应，使用了多个利用从cDNA中设计的引物的PCR反应。PCR结果确定这个5kb基因组片段是相应于Lp4CL2cDNA的部分基因组克隆(图23B)。使用引物联合体Fl和Rl扩增全部的4.Skb基因组片段。为测定内含子的定位，利用引物组合物F1/R2和F2/R1进行额外的PCR反应，分别扩增出Ikb和3.5kb条带。从这些结果中可以测定内含子的定位和大小，并且通过序列分析进一步确定。这个大的5kb基因组片段包含4个小的外显子，代表Lp4CL2的编码序列在508bp和1490bp之间(图23C)。基因组克隆1，Lp4CL2不包含启动子区。为分离Lp4CL2的启动子区，包含从克隆λLp4CL2中分离的消化的噬菌体基因组DNA的Southern印迹用从cDNA克隆Lp4CL2的5，末端分离的300bp的EcoRI/Bgll片段再探测。300bp探针与2.5kbBamHI片段强烈杂交。基因组片段Lp4CL2克隆2亚克隆至pBluescriptSK并测序(图24A)。序列结果揭示2.5kb的BamHI片段包含从基因组克隆1中缺失的、Lp4CL2的5，0RF的508bp和2.Okb的启动子区(图24B)。获得了包含启动子和部分基因序列(外显子和内含子)的Lp4CL2基因组克隆的全部序列，并在图39中示出。因此分离出Lp4CL2启动子，并用于融合gusA报告基因的制备(图25)。多年生黑麦草肉桂醇脱氢酶(CAD)的基因组克隆和启动子的分离和表征从多年生黑麦草中分离CAD基因组克隆，包括基因结构(内含子/外显子分界)减去包含CAD编码区的最前边Illbp的内含子1。基因组克隆对于从多年生黑麦草cv.Barlano分离的CAD2基因组克隆的编码区的851bp位置的存在G、而在多年生黑麦草cv.Ellett分离的CAD2cDNA克隆不存在G视为一致。在2个株系间发现的存在的SNP(单核苷酸多态性)具有作为分子标记的潜在的用途，用于草本品质、干物质消化率、机械压力忍受、疾病抗性、虫害抗性、植物株高以及叶片和茎颜色。以下的结果表明基因组克隆的分离，和来自多年生黑麦草cv.Barlano的基因组克隆CAD2推论的编码序列与来自cvEllett的截短的cDNACAD2的推论的编码序列的比较序列分析。在多年生黑麦草cv.Ellett中缺失的G已经高亮示出(图26和27)。用相应于LpCAD2cDNA克隆的5’末端探针对多年生黑麦草基因组文库进行筛选，该克隆编码木质素生物合成酶肉桂醇脱氢酶。在初步文库筛选中，鉴定出10个阳性噬菌斑并分离。在次级和三级筛选后，获得两个阳性噬菌斑，其相应的阳性基因组克隆通过限制酶消化和Southern杂交分析被进一步表征。根据限制性酶切消化分析，发现两个基因组克隆是一样的。一个克隆，命名为λLpCAD2被选出进行进一步Southern杂交分析。与LpCAD2cDNA探针强烈杂交的4.5kb的BamHI片段亚克隆至pBluescriptSK并测序(图28A)。序列分析揭示4.5kb的BamHI片段是LpCAD2的部分基因组克隆。这个大的4.5kb基因组片段包括4个小的外显子，代表LpCAD2的编码序列在213bp和1213bp的终止密码子之间，内含子/外显子分界的定位在图28B中图例说明。实施例5包含多年生黑麦草的4CL、CCR和CADcDNA序列的融合基因的转化载体的制备为改变木质素生物合成涉及的关键酶4CL、CCR和CAD的表达，通过反义和/或正义抑制技术及用于在转基因植物中过表达这些关键酶，制造出一组正义和反义转化载体。产生包含融合基因的转化载体，融合基因是在CaMV35s或玉米泛素启动子控制下以正向或反向方向使用多年生黑麦草4CL、CCR和CADcDNAs(图29、30和31)。实施例6表达多年生黑麦草的融合4CL、CCR和CAD基因的转基因烟草植株的制备和表征培育出一组携带多年生黑麦草4CL、CCR和CAD融合基因的转基因烟草植株并分析。制备具有在CaMV35S或玉米泛素启动子控制下的正向或反向方向的Lp4CLl、Lp4CL2和Lp4CL3全长cDNA序列的转化载体。制备具有在CaMV35S和玉米泛素启动子之一控制下的正向或反向方向的LpCCRlcDNA的转化载体。制备具有在CaMV35S和玉米泛素启动子之一控制下的正向的1325bp全长LpCADlcDNA和反向的1051bp的部分LpCADlcDNA的转化载体。使用这些转化载体完成向烟草原生质体的直接基因转移实验。携带在组成型CaMV35S启动子控制下的多年生黑麦草Lp4CLl和LpCCRlcDNAs的转基因烟草植株的制备和分子分析在这里详细说明。一组使用Lp4CLl正义转化载体产生的转基因烟草植株通过PCR筛选，并用于Southern禾口northern杂交分析。对于转基因烟草植株的初步的鉴定，使用npt2和Lp4CLl特异性引物进行PCR筛选。阳性转基因烟草植株被鉴别出共转化有选择性标记npt2和Lp4CLl融合基因(图32)。用来自PCR阳性转基因烟草植株的DNA样品完成Southern杂交分析以证明融合Lp4CLl转基因在烟草植株基因组的整合。阳性的转基因烟草植株携带1至5个Lp4CLl转基因拷贝。没有观察到内在的烟草4CL基因和使用的多年生黑麦草杂交探针之间的交互杂交(图32)。使用从携带融合的正义Lp4CLl转基因的转基因烟草植株中制备的总RNA样品和用Lp4CLl特异性杂交探针探测的Northern杂交分析，揭示了在一个分析的Lp4CLl转基因烟草植株中强烈表达的1.2kb的Lp4CLl转录本的存在(图32)。通过直接基因转移，在CaMV35S启动子控制下的LpCCRl正义和反义转化载体导入烟草原生质体中。制备一组转基因烟草植株并用特异性引物通过PCR进行筛选，以鉴定携带融合LpCCRl转基因的转基因烟草植株。示出LpCCRl转基因烟草植株的分子分析(图33)。实施例7表达多年生黑麦草的融合0MT、4CL、CCR和CAD基因的转基因多年生黑麦草植株的制备和表征开发了改进的转化方法用于转基因多年生黑麦草植株的制备，通过胚细胞的基因枪转化。使用多年生黑麦草的融合0MT、4CL、CCR和CAD基因和改进的转化方法培育转基因多年生黑麦草植株。用于转基因多年生黑麦草植株的制备的改进的方法该改进的程序使用产于成熟的种来源的胚的胚性愈伤组织作为基因枪转化法的直接目标，而不需要构建胚性细胞悬浮液。该方案依赖于持续地提供分离的合子胚用于胚诱导。转基因黑麦草植株在胚分离后的24-28周再生(图34)。分离的胚种植在MSM5培养基上，以产生8周内作为用于基因枪转化的目标的合适的胚性愈伤组织。胚性愈伤组织，在微粒轰击之前，在高渗透培养基MSM3Plus中处理，在含有100mg/L巴龙霉素(Pm)的MSM3培养基中筛选2周，然后转移至含有100mg/L的Pm的MSK上4周直至出现Pm抗性芽的分化。再生芽转移至新鲜的含有100mg/LPm的选择培养基MSK持续4周(图34)。表达多年生黑麦草的融合0MT、4CL、CCR和CAD基因的转基因多年生黑麦草植株的制备通过胚性愈伤组织的基因枪转化，使用融合黑麦草0MT、4CL、CCR和CAD基因培育转基因多年生黑麦草(Loliimperenne)植株。将描述这些转基因黑麦草植株的制备的例子和详细的分子分析。使用胚性愈伤组织的基因枪转化和携带在组成型玉米泛素启动子控制下的LpOmtlcDNA正向和反向序列的植物转化载体pUbiomtl和pUbitmol制备用于OMT下调的转基因多年生黑麦草植株。这些用于下调OMT活性的转基因多年生黑麦草植株从巴龙霉素抗性愈伤组织中再生，巴龙霉素抗性愈伤组织从使用覆盖有两种质粒的微粒的基因枪转化中获得，两种质粒是PHP23(携带作为选择性标记的融合npt2基因)和由玉米泛素启动子驱动的正义或反义LpOmtl转化载体之一。转基因多年生黑麦草植株用于使用npt2特异性引物的多聚酶链式反应(PCR)筛选。从胚性愈伤组织的基因枪转化中获得的独立的npt2PCR阳性转基因多年生黑麦草植株，胚性愈伤组织产生于大约60，000分离的成熟种子来源的胚，使用LpOmtl正义(pUbiomtl)和LpOmtl反义(pUbitmol)转化载体被鉴定(16个pUbiomtl转化植株和27个pUbitmol转化植株)(图35)。用未消化的和HindIII消化的DNA样品完成Southern杂交分析，DNA样品从PCR阳性转基因多年生黑麦草植株中制备，以证明它们转基因的类型和融合的npt2和LpOmtl转基因的整合。共转化有选择性标记npt2基因和LpOmtl融合基因的阳性转基因多年生黑麦草植株被鉴定(图35)。在最多的例子中，含有包括重排转基因拷贝的多拷贝的选择性标记基因的转基因多年生黑麦草植株再生。在未转化的阴性对照中没有发现npt2杂交条带。HindIII消化的基因组DNA的例子包括在使用LpOmtl基因特异性杂交探针(omtl)的分析中。Omtl探针与DNA样品中多个条带杂交，DNA样品与转基因植株和非转化的阴性对照均相应。Omtl杂交条带在所有相应于内在的LpOmtl基因序列的样品中都存在，内在的LpOmtl基因序列代表多年生黑麦草基因组的小的多基因家族(Heath等，1998)。不同的omtl杂交条带在来自转基因植株的样品中出现，在未转化的阴性对照样品中不存在，未转化的阴性对照样品相应于反义(tmol)和正义(omtl)LpOmtl转基因整合结果(图35)。使用链特异性LpOmtl探针的Northern杂交分析鉴定表达反义LpOmtl转基因的转基因多年生黑麦草植株(图35)。测定选择的反义和正义LpOmtl转基因多年生黑麦草植株的OMT活性。用于OMT活性的生物化学分析首先在未转化的植株(如烟草和多年生黑麦草)中建立。对于OMT催化的咖啡酸转化成阿魏酸实验中，利用放射性同位素标记的S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体。测量放射性阿魏酸的产物以及测定提供的OMT活性。测定选择的LpOmtl转基因多年生黑麦草植株(L.perennecv.Ellett)的OMT活性。观察到在个别的转化结果中明显改变的OMT活性(图36)。于是证明了在转基因多年生黑麦草植株中的OMT活性的操纵取决于融合的黑麦草LpOmtl基因的表达。对于编码关键的木质素生物合成酶4CL的基因的表达的操控，使用胚性愈伤组织的基因枪转化，转基因多年生黑麦草植株再生。使用分别携带融合的Lp4CL2正向和反向cDNA序列的、由组成型玉米泛素(Ubi)启动子驱动的植物转化载体pUbi4CL2和pUbi2LC4。用于4CL操纵的多年生黑麦草植株从Pm抗性愈伤组织中再生，Pm抗性愈伤组织从胚性愈伤组织的基因枪转化中获得，基因枪转化使用覆盖有携带融合的npt2基因作为选择性标记基因的质粒PHP23和反义pUbi2LC4的微粒。转基因多年生黑麦草植株用于使用npt2特异性引物的聚合酶链式反应(PCR)筛选。独立的npt2PCR阳性转基因多年生黑麦草植株从胚性愈伤组织的基因枪转化中获得(图37)。对于编码关键的木质素生物合成酶CCR和CAD的基因的表达的操控，使用胚性愈伤组织的基因枪转化，转基因多年生黑麦草植株同样再生。实施例8多年生黑麦草0MT、4CL、CCR和CAD基因的基因组图谱Lp4CLl、Lp4CL3、LpCADULpCAD2、LpCCRULpOMTl和Lp0MT2克隆用PCR扩增，并用放射性同位素标记以用作探测限制性片段长度多态性(RFLPs)的探针。RFLP用使用下面表3所述的酶酶切的P150/112多年生黑麦草参照群体的110子代个体定位。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表三RFLPs的定位Lp4CLl、Lp4CL3、LpCAD1、LpCAD2、LpCCRl、LpOMTl和Lp0MT2基因座定位在表3禾口图40显示的连锁群中。这些基因位置现在可用作数量性状基因座的候选基因，所述数量性状基因座用于木质素生物合成相关的形状，如草本品质、干物质消化率、机械压力忍受、疾病抗性、虫害抗性、植株株高以及叶片和茎的颜色。实施例9正义抑制DNA序列元件和结构制备设计三个用于具有改良的木质素生物合成的转基因多年生黑麦草的开发的结构，使用正义抑制技术。序列元件的单独的成分在表4中列出。在结构产物中使用的启动子和终止子来源于多年生黑麦草基因组序列。基因来源于多年生黑麦草cDNA序列。pAUX质粒载体的起点已经在之前描述(Goderis等，2002)。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>表4.在制备用于多年生黑麦草转化的结构中使用的成分。结构使用Gateway技术(Invitrogen)制备。Gateway克隆系统由一个载体骨架和多个基于PUC18的辅助载体组成(Goderis等，2002)。多位点的重组盒使用多克隆位点在辅助载体中建立，侧翼连接归巢核酸内切酶位点(图41)。归巢核酸内切酶是罕见的切除限制性酶，如果需要表达盒的切除，将表达盒中意外的限制性的风险降到最小。各自的启动子、cDNA和终止子序列使用合并合适的AttB重组序列引物通过PCR扩增，并克隆至单独的GatewayEntry载体。例如，LpCAD表达载体(结构1)的构建需要三个Entry克隆LpCAD3cDNA(图42)、LpCAD2启动子(图43)和LpCAD2终止子(图44)。然后这些与PAUX3132联合，用于多重组反应和表达盒pAUX3132-LpCAD2::LpCAD3::LpCAD2(图45)的生成。对于结构2，Entry克隆具有独立的成分=LpCCRl启动子、LpCCRlcDNA和LpCCRl终止子，用同样的PCR克隆策略制备。Entry克隆与基础载体pAUX3169在重组克隆反应中联合以制备最终的结构pAUX3169-LpCCRl:LpCCRlLpCCRl(图46)。对于结构3，使用改变的沉默策略，包括移码基础途径。这个方法包括单碱基对的缺失，就在起始位点下游，使用具有单碱基缺失的正向引物引入(图47)。这个结构通过正义抑制起作用，因为制备的转录本将不能编码正确的蛋白以及没有产生功能性蛋白。制备具有独立的成分LpCCRl启动子、LpCCRl(fs)cDNA和LpCCRl终止子的Entry克隆，并在重组克隆反应中与基础载体PAUX3169合并，以制备最终的结构pAUX3169-LpCCR1LpCCRl(fs)LpCCRl(图48)。在单独的质粒pAcHl中包含在抗生素潮霉素B中促进假定的转基因黑麦草的选择的植物选择性标记。质粒利用水稻ActinlD启动子驱动潮霉素磷酸转移酶(hph)基因的原位表达。PAcHl质粒已经之前在饲草转化中使用。转化方案方案的开发和建立基于胚性愈伤组织的基因枪转化，其中胚性愈伤组织从未成熟的花序中诱导，花序从多年生黑麦草的原位培养春化的收集物中分离，或源于体外苗培养物的分生组织。在两种方案中的不同时期的图示说明，来自用于胚性愈伤组织的诱导和增殖的移植体的分离，其中胚性愈伤组织用于基因组转化至转基因植株的再生，显示在图50和51中。两种基因组转化方法都考虑足以维持、容易利用的供体植物材料源，供体植物材料能够高度胜任植物的再生和基因组转化，以及与基因枪转化技术相兼容。转化中包括的过程的基本要点在图52中描述。假定的转基因植株的分子分析假定的转基因多年生黑麦草植株的分子分析已利用用于Q-PCR的引物实施。设计了下面的引物1、特异于hph基因的引物2、跨越CAD2启动子-CAD3基因连接点的引物3、特异于pAUX3169载体的引物(因为特异于CCR1连接点的引物也能够扩增内在基因组序列)。在图53中示出用于在提取的基因组DNA中探测hph的Q-PCR程序的例子。概述了对于每一个结构的转基因多年生黑麦草植株的数量的结果在表5中示出。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>表5.对于含有用于木质素生物合成改良的结构的多年生黑麦草株系转化过程总结。通过RNA干扰和正义抑制的CAD和CCR表达的下调为了改良LpCCRl在多年生黑麦草中的表达水平，使用RNA介导的转录后基因沉默策略(RNA干扰)。玉米泛素(Ubi)启动子被用于驱动LpCCRl发夹环(hp)结构在转基因多年生黑麦草中的表达，LpCCRl发夹环结构包括3’UTR的可变区。多年生黑麦草的未成熟的花序来源的愈伤组织被用作基因枪转化的目标。hpLpCCRl转基因黑麦草植株通过Southern分析确定(图54)。在同样的方式中，使用结构1、2和3改良在多年生黑麦草中CAD和CCR的表达(正义抑制)。转基因植株中木质素的分析木质素含量和成分通过特定染色方法显现，包括可以区分G-木质素和S-木质素单体的Maule组织化学染色(Moore等，1991)。来自不同节间的花茎的Maule染色对野生型和Ubi::hpLpCCRl转基因多年生黑麦草施行。结果证明在早期再生期(R1)和中间再生期(R2)的茎中均明显减少的木质素积聚(图55)。此外，在不同节间中，在全部木质素的相对量中有向顶(基底至顶点)的减少。以相同的方式，分析包含结构1、2和3的转基因多年生黑麦草株系中木质素的含量和成分。额外的木质素分析方法包括通过持续的热水、醇和氯仿/甲醇提取的细胞壁材料的分离(Fukushima和Hatfield，2001)，接着总木质素含量/干重量的测定，使用乙酰溴方法(Liyama和Wallis，1990)(图56)。为确定G/S比例的进一步的木质素单体分析通过硫代酸解(thioacidoylysis)分裂方法(Rolando等，1992)完成，用气相色谱分析(GC-MS)量化(图57)。参考文献Fukushima,R.S.和R.D.Hatfield(2001)。“木质素的提取和分离用作标准物以利用乙酰溴方法测定木质素浓度(Extractionandisolationofligninforutilizationasastandardtodetermineligninconcentrationusingacetylbromidespectrophotometricmethod)。”农业和食品化学杂志(J.Agri.FoodChem)29:3133_3139。Goderis,I.,M.DeBolle,I.Francois,P.ffouters,ff.Broekaert禾口B.Cammue(2002)。“一组允许高达6个表达单元灵活插入的标准植物转化载体(Asetofmodularplanttransformationvectorsallowingflexibleinsertionofuptosixexpressionunit)。”植物分子生物学(PlantMolBiol)50:17_27。Heath等(1998)来自多年生黑麦草(Loliumperenne)的三个咖啡酸0_甲基转移酶同源基因的cDNA克隆和差异表达(cDNAcloninganddifferentialexpressionofthreecaffeicacid0-methytransferasehomologuesfromperennialryegrass(Loliumperenne))。植物生理学杂志(JournalofPlantPhysiology)153:649_657。Lichtenstein,C,和J.Draper(1985)植物的基因工程学(Geneticengineeringofplants)。In:D.M.Glover(ed)，DNA克隆，卷2，67-119页，IRL出版社，华盛顿。Liyamam,K.和A.F.A.ffallis(1990)。“通过改良的乙酰溴方法在草本植物中的木质素白勺须lj定(Determinationoflignininherbaceousplantsbyanimprovedacetylbromideprocedure)。”食品科学与农学杂志(J.SciFoodAgric)51:145_161。Moore,K.J.,L.E.Moser,K.P.Vogel,S.S.Waller,JohnsonB.E.和P.J.F.(1991)。“多年生草料草的生长期的描述和量化(Describingandquantifyinggrowthstagesofperennialforagegrasses)。，，农学杂志(Agron.J.)831073—1077。Rolando,C.，B.Monties禾口C.Lapierre(1992)。Thioacidolysis.木质素化学中的方法(MethodsinLigninChemistry)S.Y.Lin禾口C.W.Dence,Springer-Verlag:334_349页。Spangenberg,G.，Z.Y.Wang,X.L.ffu,J.Nagel,V.A.Iglesias禾口I.Potrykus(1995)0“来自胚性悬浮液细胞的微粒轰击的转基因高羊茅和紫羊茅植株(Transgenictallfescueandredfescueplantsfrommicroprojectilebombardmentofembryogenicsuspensioncells)。”植物生理学杂志(JPlantPhysiol)145:693_701。最后，应当理解，在不背离如这里概述的本发明实质下，可以做出多种改变、修饰和/或添加。还应当理解，在本说明书中使用的术语“包含”(或它的文法上的变化)与术语“包括”等同，并且不能将其它成分或特征排除在外。说明书中引用的文件仅是起参考作用，它们包含的内容不能被确认是形成相关技术的公知的普通知识。4权利要求包括编码木质素生物合成酶的基因片段或基因变异体的充分纯化或分离的核酸，所述核酸能够通过正义抑制改良植物中的木质素生物合成。2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述的木质素生物合成酶选自4CL、CCR、CAD、C3H、C4H、CCoAOMT、COMT、F5H禾口PAL组成的组。3.根据权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，所述片段或变异体包括在片段或变异体基于的基因的3’或5’末端或附近的短的缺失。4.根据权利要求1-3任何一项所述的核酸，其特征在于，所述片段或变异体包括相对于片段或变异体所基于的基因的移码突变。5.根据权利要求1-4任何一项所述的核酸，该核酸编码没有酶活性或具有实质降低的酶活性的多肽。6.根据权利要求1-5任何一项所述的核酸，该核酸来自草料、草皮或生物能草种类。7.根据权利要求6所述的核酸，该核酸来自黑麦草属、羊茅属、狗牙根属、臂形草属、雀稗属、黍属、芒属、狼尾草属、或薦草属种类。8.根据权利要求1-7任何一项所述的核酸，其特征在于，所述基因编码4CL并包括核苷酸序列，该核苷酸序列选自本文图2、3和4中所示的序列(序列号分别为1、3和5)，和公布号为W002/26994的专利申请中的图68、70、71和73中的序列(序列号分别为154、156-161、162和164)，和公布号为W003/40306的专利申请中的序列号为29、31、27、142和143中的序列组成的组；其中，所述核酸能够通过正义抑制所述植物中编码4CL的基因，改良植物中的木质素生物合成。9.根据权利要求1-7任何一项所述的核酸，其特征在于，所述基因编码CCR并包括核苷酸序列，该核苷酸序列选自本文图10所示的序列(序列号7)，和公布号为W002/026994的专利申请中的图38、40、41、43和44中的序列(序列号分别为102、104-106、107、109-110和111)和公布号为W003/40306的专利申请中的序列号为147和148中的序列组成的组，其中所述核酸能够通过正义抑制所述植物中编码CCR的基因，改良植物中的木质素生物合成。10.根据权利要求1-7任何一项所述的核酸，其特征在于，所述基因编码CAD并包括核苷酸序列，该核苷酸序列选自本文图13、14、26和27中所示的序列(序列号分别为9、11、14和16)，和公布号为W002/26994的专利申请中的图9、11、13、15、16、18、19、21和22中的序列(序列号分别为23、25、`27、29-33、34、36-40、41、43-44和45)，和公布号为W02008/064289的专利申请中的序列号7中的序列，和公布号为W003/40306的专利申请中的序列号为35和145中的序列组成的组；其中所述核酸能够通过正义抑制所述植物中编码CAD的基因，改良植物中的木质素生物合成。11.根据权利要求1-7任何一项所述的核酸，其特征在于，所述基因编码C4H并包括核苷酸序列，该核苷酸序列选自公布号为W002/26994的专利申请中的图32、34、36和76中的序列(序列号分别为96、98、100和166)，和公布号为TO2008/064289的专利申请中的序列号6中的序列，和公布号为W003/40306的专利申请中的序列号为33和144中的序列组成的组；其中所述核酸能够通过正义抑制所述植物中编码C4H的基因，改良植物中的木质素生物合成。12.根据权利要求1-7任何一项所述的核酸，其特征在于，所述基因编码CCoAOMT并包括核苷酸序列，该核苷酸序列选自公布号为W002/26994的专利申请中的图1、3、4、6、7、82和87中的序列(序列号分别为1、3-11、12、14-20、21、168和170)，和公布号为WO2008/064289的专利申请中的序列号8中的序列，和公布号为WO03/40306的专利申请中的序列号为37和146中的序列组成的组；其中所述核酸能够通过正义抑制所述植物中编码CCoAOMT的基因，改良植物中的木质素生物合成。13.根据权利要求1-7任何一项所述的核酸，其特征在于，所述基因编码COMT并包括核苷酸序列，该核苷酸序列选自公布号为W002/26994的专利申请中的图24、26、27、29、30,93和99中的序列(序列号分别为47、49-58、59、61-93、94、172和174)，和公布号为W02008/064289的专利申请中的序列号为2、8和9中的序列，和公布号为WO03/40306的专利申请中的序列号为149、42、150和43中的序列组成的组；其中所述核酸能够通过正义抑制所述植物中编码COMT的基因，改良植物中的木质素生物合成。14.根据权利要求1-7任何一项所述的核酸，其特征在于，所述基因编码F5H并包括核苷酸序列，该核苷酸序列选自公布号为WO02/26994的专利申请中的图59和61中所示的序列(序列号分别为135和137-139)和公布号为WO03/40306的专利申请中的序列号为45和151中的序列组成的组；其中所述核酸能够通过正义抑制所述植物中编码F5H的基因，改良植物中的木质素生物合成。15.根据权利要求1-7任何一项所述的核酸，其特征在于，所述基因编码PAL并包括核苷酸序列，该核苷酸序列选自公布号为WO02/26994的专利申请中的图62、64、65和67中所示的序列(序列号分别为140、142-148、149和151-153)和公布号为WO03/40306的专利申请中的序列号为152、153、50、54、48、53、156、49、51、154、52和155中的序列组成的组；其中所述核酸能够通过正义抑制所述植物中编码PAL的基因，改良植物中的木质素生物合成。16.根据权利要求1-7任何一项所述的核酸，其特征在于，所述基因编码C3H并包括公布号为WO2008/064289的专利申请中的序列号为1中所示的核苷酸序列；其中所述核酸能够通过正义抑制所述植物中编码C3H的基因，改良植物中的木质素生物合成。17.根据权利要求1-7任何一项所述的核酸，该核酸包括选自序列号为23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63、67、71、75、79、83、87、91、95、99、103、107、111、115、119、123、127、131、135、139、143、147、151、155、159、163、167、171、175、179、183、187、191、195、199、203、207、211、215、218、222、225、229和233组成的组的核苷酸序列。18.根据权利要求1-7任何一项所述的核酸，该核酸编码包括下述序列的多肽，所述序列选自序列号为24、28、32、36、40、44、48、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、216、219、223、226、230和234组成的组。19.包括根据权利要求1-18任何一项所述的核酸的基因构建体或载体。20.包括根据权利要求1-18任何一项所述的核酸或根据权利要求19所述的基因构建体或载体的转化植物。21.包括根据权利要求1-18任何一项所述的核酸或根据权利要求19所述的基因构建体或载体的转化植物细胞。22.包括根据权利要求1-18任何一项所述的核酸或根据权利要求19所述的基因构建体或载体的转化植物种子或其它植物部分。23.包括根据权利要求1-18任何一项所述的核酸或根据权利要求19所述的基因构建体或载体的转化植物生物量。24.改良植物中木质素生物合成的方法，所述方法包括将有效量的根据权利要求1-18任何一项所述的核酸或根据权利要求19所述的基因构建体或载体以正向方向引入所述植物中，因此相应基因的表达受抑制。25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述植物选自黑麦草属、羊茅属、狗牙根属、臂形草属、雀稗属、黍属、芒属、狼尾草属、薦草属、和其它的草料和草皮草、玉米、谷物、燕麦、甘蔗、小麦、大麦、拟南芥属、烟草、豆类、苜蓿属、橡树、桉属、枫、杨属、油菜、大豆、鹰嘴豆和松属组成的组。26.根据权利要求1-18任何一项所述的核酸或根据权利要求19所述的基因构建体或载体在植物中用于木质素生物合成的正义抑制的应用。全文摘要本发明涉及植物中木质素生物合成的改良、木质素生物合成途径涉及的酶和编码这些酶的核酸，以及更具体地，涉及通过正义抑制改良木质素生物合成的方法、相关的核酸和结构。文档编号C12N9/02GK101802204SQ200880107482公开日2010年8月11日申请日期2008年7月17日优先权日2001年6月14日发明者乌尔里克·彼得·约翰,安杰拉·简·利杰特,拉塞尔·莉·麦金尼斯,杰曼·斯潘根贝格,梅甘·格里菲思,罗宾·路易丝·希思,艾登·莫拉多夫,达米安·保罗·林奇申请人:澳大利亚乳品有限公司;分子植物育种有限公司