Jak2突变的制作方法

专利名称：Jak2突变的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌症诊断和治疗领域。
背景技术：
以下本发明背景的讨论仅被提供以辅助读者理解本发明，并非承认描述或构成了 本发明的现有技术。一些肿瘤性疾病——包括非-CML骨髓增生性疾病(MPDs)如真性红细胞增多 症(PV)、特发性血小板增多(ET)和慢性特发性骨髓纤维变性(IMF)以及仍有如未分类 的骨髓增生性疾病(MPD-NC)——的特征是血细胞的异常增加。见例如，Vainchenker和 Constantinescu, HematoloRY (ifiy-fl'^ ) (American Society of HematoloRy (美.国血夕夜学 学会))，195-200(2005)。这种增加通常由位于骨髓内的多能造血干细胞的自发突变引发。 Id.由于该突变，干细胞产生远多于正常的特定谱系的血细胞，导致细胞如类红细胞、巨核 细胞、粒细胞和单核细胞的生产过剩。MPD患者的一些共同的症状包括脾增大，肝增大，白细 胞、红细胞和/或血小板细胞数增多，血凝块(血栓形成)，虚弱，晕眩和头痛。疾病如PV、 ET和IMF可能预示白血病，但是，转化(例如，到白血病急性发作)的比率不同于每种疾病。 Id.造成许多MPD的具体的基因和伴随的一种突变或多种突变尚且未知。但是，詹纳 斯(Janus)激酶2 (Janus kinase 2，JAK2)基因——一种细胞质的、非受体酪氨酸激酶—— 内的突变，已在许多MPD中被鉴定出。例如，该突变已在多至97%的患有PV的患者、多于 40%的患有ET或IMF的患者中被报道。见例如，Baxter等，Lancet 365 1054-1060 (2005)； James 等，Nature 438 1144-1148 (2005) ；Zhao 等，T. Biol. Chem. 280 (24) 22788-22792(2005) Levine 等，Cancer Cell. 7 387~397 (2005) :Kralovics 等，New Eng. Τ. Med. 352(17) 1779-1790 (2005) Jones 等，Bloodl06 2162~2168 (2005) ；Steensma 等， Blood 106:1207-2109(2005)。詹纳斯激酶是在细胞因子信号中具有作用的酪氨酸激酶家族。例如，JAK2激酶 担当着膜结合的细胞因子受体如促红细胞生成素受体(EpoR)和信号转导途径的下游成员 如STAT5(信号转导及转录蛋白质激活因子5 (Signal Transducers and Activators of Transcription protein 5))之间的媒介物。见例如，Schindler，CW. , Τ. Clin Invest. 109 1133-1137 (2002) ；Tefferi 禾口 Gilliland, Mayo Clin. Proc.80 947~958 (2005)； Giordanetto 禾口 Kroemer, protein Engineering, 15 (9) :727_737 (2002)。当细胞因子受体 /配体复合体(complexes)使相关的JAK2激酶磷酸化时，JAK2被激活。1然后JAK2可 以磷酸化并激活其底物分子，例如STAT5，其进入细胞核并与其它调节蛋白相互作用以影响 转录。丛；Nelson, Μ. Ε.禾口 Steensma，D. P.，Leuk. Lymphoma 47 177—194 (2006)。在一种JAK2突变体中，缬氨酸(密码子“GTC”)在氨基酸位置617处被苯丙氨酸 (密码子“ TTC”)置换(“V617F 突变体”)。Baxter 等，Lancet365 1054-1060 (2005)。氨 基酸617位于外显子12内，该外显子12包括假激酶(pseudokinase)、称为JH2的自抑制 (或负调节(negativeregulatory))结构域(Jak 同源 2 结构域)。1 James 等，Nature
4438 1144-1148 (2005)。尽管该结构域没有激酶活性，但是它与具有激酶活性的JHl (Jak同 源1)结构域相互作用。Baxter等，Lancet 365:1054-1060(2005)。野生型蛋白质内两个 结构域之间的适当接触允许适当的激酶活化和调节；但是，V617F突变引起两个结构域之 间不适当的接触，导致突变体JAK2蛋白内的组成型激酶活性。1多种不同的方法和大量证据表明，当存在时，JAK2V617F突变促成MPD的 发病机理。 见例如，Kaushansky，HematoloRY (Am Soc HematolEduc ProRram), 533-7(2005)。从血液样品、骨髓和口腔样品中已经探测到突变(见例如，Baxter等， Lancet 365 1054-1060 (2005) ； James 等，Nature438 1144-1148 (2005) ；Zhao 等， T. Biol. Chem. 280(24) :22788_22792(2005) ；Levine 等，Cancer Cell, 7 387~397 (2005)； Kralovics等，New Eng. Τ. Med. 352(17) :1779_1790 (2005))，并且纯合的和杂合的细胞群已 在 MPD 患者中被报道。Baxter 等，Lancet 365 1054-1060 (2005)。

发明内容
本发明基于JAK2基因和蛋白质内以前未知的突变的发现。具体地，JAK2基因突 变包括G1920T/C1922T双突变、G1920A突变和T1923C突变，这些突变分别导致JAK2蛋白 的JH2结构域中的V617F、V617I和C618R氨基酸取代。本发明进一步提供了用于包括例如 骨髓增生性疾病的肿瘤性疾病的诊断和预后的方法和组合物。因此，在一方面，本发明提供了用于诊断肿瘤性疾病的方法，包含确定在患者的 JAK2核酸内一个或多个突变的存在或不存在，所述突变选自G1920A、T1923C和G1920T/ C1922T。在另一方面，本发明提供了用于确定诊断患有肿瘤性疾病的个体的预后的方法， 包括确定在患者的JAK2核酸内存在或不存在一个或多个突变，所述突变选自G1920A、 T1923C和G1920T/C1922T，以及使用突变状况来预测个体的临床结果。在一些实施方式中，JAK2核酸包含T1923C突变与G1920T突变、G1920T/C1922T突 变或G1920A突变的结合。在用于预后的优选的方法中，JAK2突变状况与至少一种其它临床参数相结合。适 合的临床参数包括，例如，年龄和胚细胞数百分比。在另一方面，本发明提供了用于诊断肿瘤性疾病的方法，包括确定在患者的JAK2 蛋白质内存在或不存在突变，所述突变选自V617A和C618R。在一些实施方式中，除了包括例如V617A突变和V617F突变的另一 JAK2突变外， JAK2蛋白包含C618R突变。在其它实施方式中，JAK2核酸和/或JAK2蛋白中的一个或多个突变影响JAK2激 酶的活性。优选地，JAK2激酶的活性降低。更优选地，JAK2激酶的活性降低是因为JAK2的 JH2 (假激酶)结构域和JHl结构域之间的相互作用减少。肿瘤性疾病——本发明方法的主题——包括骨髓增生性疾病，该疾病包括例如真 性红细胞增多症、特发性血小板增多、特发性骨髓纤维变性和未分类的骨髓增生性疾病。在其它实施方式中，JAK2蛋白和/或核酸由来自患者的生物样品(例如，体液)获 得。在其它实施方式中，体液是无细胞的体液。在另一方面，本发明提供了分离的JAK2核酸。优选的JAK2核酸包含SEQ ID NO
51的至少12个连续的核苷酸或其互补序列，其中核酸包含选自G1920A、T1923C和G1920T/ C1922T的突变。优选地，JAK2核酸包含与G1920T突变、G1920T/C1922T突变或G1920A突变 结合的T1923C突变。在其它优选的实施方式中，JAK2核酸包含至少14、16、18、20、22、25、 30、40、50、75、100、150、200、250、500个或更多个核苷酸。任选地，JAK2核酸可以进一步包 含可检测的标记(例如，荧光标记)。在另一方面，本发明提供了分离的JAK2多肽。优选的JAK2多肽包含SEQ ID NO 3的至少10个连续的氨基酸，其中多肽包含V617I突变和/或C618R突变。在其它优选的 实施方式中，JAK2 多肽包含至少 12、14、16、18、20、22、25、30、40、50、75、100、150、200、250、 500个或更多个氨基酸。如本文所用，“血浆”指血液中发现的无细胞的流体。“血浆”可以从血液用本领域 已知的方法(例如，离心，过滤等)从血液中除去全部的细胞物质获得。如本文所用，“外周 血血浆”指从外周血样品获得的血浆。如本文所用，“血清”包括在血浆或血液被允许凝块并将凝块部分除去后获得的血 浆部分。术语“核酸”或“核酸序列”指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸，以及其片段或部分，其 可以是单链或双链的，表示有义链或反义链。核酸可以包括DNA或RNA，并且可以是天然或 合成源的。例如，核酸可以包括mRNA或cDNA。核酸可以包括被扩增(例如，使用聚合酶链 式反应)的核酸。表达式(convention) “NTwt###NTmut”被用于指这样的突变该突变导 致在核酸内位置###处的野生型核苷酸NTwt被突变体NTmut取代。例如，G1920A指在SEQ ID NO :1(参考核苷酸序列)中的核苷酸位置1920处的突变，其中野生型鸟嘌呤变为(突 变为)腺嘌呤。“氨基酸序列”指多肽或蛋白质序列。表达式“AAwt###AAmut，，被用于指这样的 突变，该突变导致在多肽内位置###处的野生型氨基酸AAwt被突变体AAmut取代。例如， C618R指在SEQ ID N0:3(参考多肽序列)的氨基酸位置618处的突变，其中野生型半胱氨 酸变为(突变为)精氨酸。术语“野生型”指最频繁地在人群中被观察到并且与疾病不相关联的基因或基因 产物。“野生型”也可以指特定的核苷酸位置(一个或多个)处的序列，或特定的密码子位 置(一个或多个)的序列，或特定的氨基酸位置(一个或多个)的序列。例如，基因可以在 核苷酸位置1849或在密码子617处是“野生型”的。如本文所用，“突变体”、“修饰的”或 “多态的”是指，当与野生型基因或基因产物相比时，显示出序列上和/或功能特性上的改变 (即，改变的特征)的基因或基因产物。“突变体”、“修饰的”或“多态的”也指在特定的核 苷酸位置(一个或多个)的序列，或在特定的密码子位置(一个或多个)的序列，或在特定 的氨基酸位置(一个或多个)的序列。“突变”意指相对于正常序列或野生型序列，在核酸序列中包含至少一个单核苷酸 变异。突变可以包括取代、缺失、倒位或插入。对于编码的多肽，突变可以是“沉默的”并且 不导致编码的多肽序列的改变，或者突变可以导致编码的多肽序列的改变。例如，突变可以 导致编码的多肽序列中的取代。突变可以导致相对于编码的多肽序列的移码。如本文所用术语“密码子”是指构成遗传密码的三个邻近的核苷酸(RNA或DNA)序 列，所述遗传密码在蛋白质合成期间决定多肽链中特定氨基酸的插入或是停止蛋白质合成的信号。术语“密码子”也用于指相应的(和互补的)信使RNA中的三个核苷酸序列，其中 原始的DNA被转录为信使RNA。术语“基本上所有”意指在大约60-100%之间，更优选地在大约70-100%之间， 更优选地在大约80-100%之间，更优选地在大约90-100%之间，以及更优选地在大约 95-100%之间。对靶核酸特异的寡核苷酸(例如，探针或引物)将在合适的条件下与靶核酸“杂 交”。如本文所用，“杂交”或“使杂交”指这样的处理通过该处理寡核苷酸单链与互补链在 限定的杂交条件下通过碱基配对退火。当指核酸(例如，寡核苷酸)时，“分离的”意思是与基因组的大部分(substantial portion)分离的核酸，其中分离是自然发生的。例如，已被合成(例如，通过连续的碱基缩 聚(base condesation))产生的任何核酸被认为是分离的。同样地，重组表达的核酸、由引 物延伸反应(例如，PCR)产生的核酸，或者以其他方式从基因组切离的核酸也被认为是分 离的。“特定的杂交(特异性杂交)”是两个核酸序列共有高度互补性的指示。特定的杂 交复合体在允许退火的条件下形成并且在任何随后的清洗步骤之后保持杂交。允许核酸 序列退火的条件可由本领域普通技术人员按照常规决定，其可以发生在，例如，65°C在大约 6XSSC的存在下。杂交的严紧性可以部分地参考实施清洗步骤进行的温度表示。这种温 度通常被选择为低于特定序列在限定的离子强度和PH值下的热解链温度(Tm)大约5°C到 20°C。Tm是50%的靶序列与完全配对的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH值 下)。计算Tm的方程式以及核酸杂交的条件在本领域内是已知的。用作特异性扩增(即，扩增特定的靶核酸序列)或特异性检测(即，检测特定的靶 核酸序列)靶核酸的引物或探针的寡核苷酸通常能够与靶核酸特异地杂交。对于JAK2核酸序列，“突变”意指与参考序列GenBank登录号NM004972相比包括 至少一个核酸变异的JAK2核酸序列。为方便起见，JAK2的cDNA序列提供在

图1(SEQ ID NO 1)中，假激酶结构域提供在图2(SEQ ID NO 2)中。突变可以包括取代、缺失或插入。 JAK2核酸中的突变可以导致编码的多肽序列的改变，或者突变相对于编码的多肽序列可以 是沉默的。导致多肽序列改变的JAK2突变的实例包括但不限于V617F。与SEQ ID NO :3相 比——图3作为参考氨基酸序列，可以确定氨基酸序列的改变。在核酸中“确定一个或多个突变的存在或不存在”也包括检测核酸。例如，在确定 JAK2中突变的存在或不存在时，JAK2核酸也被检测。确定一个或多个突变的存在或不存在 的方法可以包括多种本领域已知的方法，包括IAK2 RNA到cDNA的反转录、扩增JAK2核酸、 探针或引物与JAK2核酸杂交和测序JAK2核酸中的一种或多种。术语“寡核苷酸”被理解为是一个分子，该分子具有基于主链的序列，该主链以限 定的间隔主要由同样的单体单元组成。碱基以这样的方式被安排在主链上它们可以进 入与核酸的键，该核酸具有与寡核苷酸的碱基互补的碱基序列。最普通的寡核苷酸具有 糖-磷酸酯单元的主链。在2’位置不具有羟基的寡脱氧核苷酸和在该位置有羟基的寡核 糖核苷酸之间可以进行分离(distinction)。寡核苷酸也可以包括衍生物，其中羟基基团的 氢被有机基团取代，例如，烯丙基。作为引物或探针起作用的该方法的寡核苷酸通常为至少 大约10-15个核苷酸长，更优选地至少大约15-25个核苷酸长，尽管更短或更长的寡核苷酸可以用在本方法中。确切的大小依赖于许多因素，这些因素反过来取决于寡核苷酸的最终 功能或用途。寡核苷酸可以以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、反转录、PCR或其组 合。寡核苷酸可以被修饰。例如，寡核苷酸可以用产生可检测信号的试剂标记(例如，荧光 团)。“引物”是指，当放置在引物延伸被引发的条件下时(例如，与应用如PCR有关的引 物延伸)，能够作为合成的引发点起作用的寡核苷酸。寡核苷酸“引物”可以自然生成，如在 纯化的限制酶切消化中，或者可以合成产生。“探针”指通过杂交与靶核酸相互作用的寡核苷酸。探针可以与靶核酸序列完全互 补或部分互补。互补的水平将依赖于许多因素，一般基于探针的功能而定。借助于靶的序 列特征，一种或多种探针可以用于，例如检测核酸序列内突变的存在或不存在。探针可以被 标记或者不标记，或者以本领域熟知的许多方式中的任一种来修饰。探针可以与靶核酸特 异性杂交。“靶核酸”指包含与探针寡核苷酸和/或引物寡核苷酸至少部分互补的序列的核酸 分子。探针可以与靶核酸特异性杂交。如本文所用，与JAK2相关的术语“激活结构域”通常指涉及细胞激活的结构域。激 活结构域的实例是激酶结构域或假激酶结构域。如本文所用，术语“假激酶结构域”指多肽的一部分或编码所述多肽的一部分的核 酸，其中该部分显示出对功能激酶的同源性但并不具有催化活性。假激酶结构域也可以被 称为“类激酶结构域”。假激酶结构域的实例是JAK2假激酶结构域，也称为JH2结构域，在 图2的SEQID NO 2内表示。术语“激酶结构域”指多肽的一部分或编码所述多肽的一部分的核酸，其中要求该 部分具有多肽的激酶活性(例如，酪氨酸激酶活性)。在本发明的一些方法中，突变可以“影响JAK2激酶活性”。受影响的JAK2激酶活 性可以包括增加、减少、变成组成型的、完全停止或影响更多、更少或不同的靶的激酶活性。 影响激酶活性的突变可以存在于激酶结构域或与激酶结构域相关的结构域如JAK2假激酶 结构域。如本文所用术语“诊断(diagnose)”或“诊断(diagnosis)”或“诊断 (diagnosing)，，是指区别或鉴定疾病、症状或状况，或者区别或鉴定具有特定疾病、症状或 状况的人。附图简述图1是JAK2的核酸序列。图2是JAK2假激酶结构域区的核酸序列。图3是JAK2的氨基酸序列。图4是JAK2假激酶结构域区的氨基酸序列。图5是一系列电泳图示踪(tracings)。图5A显示了来自野生型JAK2基因的电泳 图示踪，其中编码氨基酸617的密码子是GTC(缬氨酸)。图5B是来自个体的血细胞样品 的JAK2基因的电泳图示踪，指示了在对应于SEQ ID NO :1的位置1920的核苷酸位置处的 杂合性。点指示了与硫胺素相关的峰。图5C是来自如在图5B中使用的同一个体的血浆样 品的电泳图示踪，指示了该个体对在位置1920处的硫胺素点突变是纯合的或半合子的。
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图6是一系列电泳图示踪。图6A是来自野生型JAK2基因的电泳图。图6B是来 自这样的个体的电泳图，该个体在密码子617中具有双点突变(灰箭头)并在密码子618 中具有单点突变(黑箭头)。突变的密码子617和618分别是TTT和CGT。图6C是突变电 泳图。在每种情况中，核苷酸编号参考Genbank登录NM004972。供参考，位置2343相应于 SEQ ID NO 1 的位置 1920。图7是一系列电泳图示踪。图7A是来自这样个体的电泳图，该个体在相应于SEQ ID NO 1的位置1920的核苷酸位置处具有G > A点突变。图7B是来自这样的个体的电泳 图，该个体在相应于SEQ ID NO :1的位置1920的核苷酸位置处具有G > T点突变。图7C是 来自野生型JAK2基因的电泳图。在每种情况中，核苷酸编号参考Genbank登录NM004972。 供参考，位置2343相应于SEQ ID NO 1的位置1920。发明详述本发明基于JAK2基因和蛋白质内与骨髓增生性疾病相关的以前未知的突变的发 现。特别地，JAK2基因突变包括G1920T/C1922T双突变、G1920A突变和T1923C突变，这些 突变分别导致JAK2蛋白中的V617F、V617I和C618R氨基酸置换。生物样品收集和制备使用从个体获得的生物样品，本发明的方法和组合物可以用于检测JAK2基因和/ 或JAK2蛋白内的突变。可以依据本领域技术人员熟知的任何方法从样品中分离核酸(DNA 或RNA)。如果必要，可以通过离心等收集或浓缩样品。样品的细胞可以经受裂解，如通过用 酶、热、表面活性剂、超声破碎或其组合来处理。进行裂解处理的目的是获得足够量的来自 个体细胞的DNA以利用聚合酶链反应进行检测。可选地，JAK2基因内的突变可以依据美国 专利申请11/408，241中描述的方法使用无细胞的体液来检测，该专利申请通过参考并入 本文。各种DNA提取方法均适用于分离DNA或RNA。适合的方法包括苯酚和氯仿提 取。见 Maniatis 等，Molecular Cloning, A LaboratoryManual,2d, Cold Spring Harbor Laboratory Press，16-54页(1989)。许多商业的试剂盒也生产适合的DNA和RNA，包 括但不限于:QIAamp 迷你血液试剂盒、Agencourt Genfind 、Roche Cobas Roche MagNA Pure ，或者使用 Eppendorf Phase Lock Gels 的苯酚氯仿提取和 NucliSens 提 取试剂盒(Biomerieux, Marcy 1' Etoile, France)。在其它方法中，使用 MagNA Pure LC mRNA HSi式齐[J盒禾口Mag NA Pure LC工具(Roche Diagnostics Corporation,Roche Applied Science, Indianapolis, IN)，可以从患者血液/骨髓样品中提取mRNA。核酸提取和扩增提取自组织、细胞、血浆或血清的核酸可以使用本领域熟知的核酸扩增技术来扩 增。许多这些扩增方法也可以用于简单地通过设计寡核苷酸引物或探针以与特定的靶序 列以特定的方式相互作用或杂交来检测突变的存在。以举例的方式但不是限制这些技术 的方式，可以包括聚合酶链反应(PCR)、反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、巢式PCR、连接酶链 反应(见 Abravaya，K.等，nucleic acids Research (核酸研究)23 :675_682，(1995)，分 支 DNA 信号扩增(branched DNA signalamplification), Urdea, Μ. S.等，AIDS 7(suppl 2) :S11-S14, (1993))、可扩增的RNA报道分子、Q-β复制、基于转录的扩增、自返式DNA 扩增(boomerang DNA amplification)、链置换激活、循环探针技术、等温核酸序列基扩增(NASBA) (isothermal nucleic acid sequence basedamplification)(见 Kievits，Τ·等， J Virological Methods 35:273-286，(1991))、侵入物技术或其它序列复制试验或信号扩
增试验。RNA至cDNA的反转录一些方法使用RNA至cDNA的反转录。如同所指出的，反转录和扩增的方法可以 通过以前出版的或推荐的方法进行，这些参考出版物以其整体通过引用并入本文。可以使 用各种反转录酶，包括但不限于MMLV RT、MMLV RT的RNase H突变体如Superscript和 SuperscriptlKLife Technologies, GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.),AMV RT 以及来自嗜 热栖热菌(Thermus Thermophilus)的热稳定反转录酶。例如，可以用于将从血浆或血清提 取的RNA转化成cDNA的一种方法，但不是唯一的方法，是改良自Superscript II预扩增系 统(Life Technologies, GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.；目录号 18089-011)的方案，如由 Rashtchian, A. , PCR Methods Applic. 4 :S83_S91，(1994)所描述的，改良如下。13 μ 1 DEPC-处理的水中的、提取自血浆或血清的1_5微克RNA被加入到一个干净 的微量离心管中。然后加入一微升的oligo (dT) (0.5mg/ml)或随机的六聚体溶液(50ng/ μ 1)并轻轻混合。然后混合物被加热至70摄氏度10分钟，然后在冰上温育1分钟。然后， 其被简单地离心，随后加入2μ 1的IOX合成缓冲液(200mM Tris-HCl，pH 8. 4,500mMKCl, 25謹氯化镁，lmg/ml的BSA)、1 μ 1的IOmM的每种dNTP混合物、2 μ 1的0. IM DTT、1 μ 1的 superscript II RT(200U/μ 1)(LifeTechnologies, GIBCO BRL, Gaithersburg, Md·)。轻 轻混合之后，通过简单的离心收集反应物，并在室温下温育十分钟。然后该管被转移到42°C 的水浴或电热板并温育50分钟。然后，通过在70°C温育该管15分钟并然后将之放置在冰 上来终止反应。通过简单的离心来收集反应物，并加入Ιμ 的RNase Η(2单位)，随后，在 进行核酸扩增之前在37°C温育20分钟。核酸扩增向cDNA混合物中加入以下物质8 μ 1的10 X合成缓冲液(200mMTris-HCl， pH 8. 4,500mM KC1，25mM氯化镁，lmg/ml的BSA)、68 μ 1无菌重蒸馏水、1 μ 1扩增引物 1 (10 μ Μ)、1 μ 1扩增引物2 (10 μ Μ)、1 μ 1 Taq DNA聚合酶(2-5U/ μ 1)。轻轻混合并用矿物 油覆盖反应混合物。混合物被加热至94°C持续5分钟以使剩余的RNA/cDNA杂化物变性。然 后在自动化热循环仪中进行PCR扩增15-50个循环，94°C 1分钟、55°C 30-90秒以及72°C2 分钟。循环参数和镁浓度可以依赖于要扩增的具体序列而改变，但是，最优化的程序和 方法也是本领域所熟知的。另外，引物可以包含适当的限制酶切位点，并且限制酶切消化可以在扩增的产物 上进行以允许在突变体和野生型序列之间的进一步辨别。可选的方法可以使用的核酸扩增的可选方法包括RT-PCR变异，该变异包括定量RT-PCR，例 如对由 Wang，A.M.等，PNAS USA86 :9717_9721，(1989)中或 Karet，F. Ε.等，Analytical Biochemistry220 =384-390, (1994)描述的方法的改良。可以使用的核酸扩增或突变检测的可选的方法是连接酶链反应(ligase chain reaction) (LCR)，如由 Wiedmann 等在 PCR Methods Appl. 3 :551_564，(1994)中所描述的。
10在连接酶链反应中，提取自血浆或血清的RNA被反转录成cDNA。LCR是检测单个碱基突变的 技术。引物以两个片段合成并被与在两个引物片段的边界处具有可能的突变的模板退火。 连接酶将连接两个片段，如果它们与模板序列精确地匹配的话。仅当引物被连接时随后的 PCR反应才扩增。限制酶切位点也能够被用于突变体和野生型序列之间的辨别。扩增或突变检测的可选的方法是等位基因特异的聚合酶链式反应(ASPCR)。利用 模板和引物的3 ’末端碱基之间的配对或错配的ASPCR是本领域熟知的。见例如，美国专利 5，639，611。可以使用的扩增或突变检测的另一可选的方法是分支DNA信号扩增(branched DNA signal amplification)，例如对由 Urdea，Μ. S.等在 AIDS 7(suppl 2) :S Il-S 14， (1993)中描述的方法的改良，其中来自参考文献的改变如下RNA提取自血浆或血清然，然 后直接加入到微孔。然后进行与肿瘤相关的或肿瘤有关的RNA的检测的方法，如参考Urdea 等Id.的，使用对关注的肿瘤相关的或肿瘤有关的RNA或cDNA特异的靶探针，并且使用与 血浆或血清样品中肿瘤相关RNA的量成比例的化学发光光发射。所参考的方法的细节进一 步被 Urdea，M. S.等在 nucleic acids Research Symposium Series 24 197-200, (1991) 中描述，该文献以其整体并入本文。可以使用的扩增或突变检测的可选的方法是等温核酸序列基扩增(NASBA)，例如 对由 Kievits，T.等在 J Virological Methods 35:273-286，(1991)中或由 Vandamme， A.M.等在 J. Virological Methods 52:121-132，(1995)中所描述的方法的改良。可以使用的核酸的定性或定量扩增的可选的方法包括但不限于Q_i3复制、其它 自动维持序列扩增试验、基于转录的扩增试验和可扩增的RNA报道分子、自返式DNA扩增、 链置换激活以及循环探针技术。突变检测的另一方法是核酸测序。可以使用本领域已知的许多方法、试剂盒或系 统进行测序。一个实例是使用染料终止化学(dyeterminator chemistry)和ABl序列分析 仪(Applied Biosystems,Foster City，CA)。测序也可以包括单碱基测定方法如单核苷酸 引物延伸(“SNapShot ”测序方法)或等位基因或突变特异性PCR。检测JAK2核酸突变的示例性方法核酸(例如，总核酸)可以用合适的方法从患者的生物样品中提取。接下来，可以 使用总核酸制备或RNA制备进行RT-PCR反应以特异地扩增患者RNA的一部分。示例性的 一步 RT-PCR 系统是 Superscript III 系统(Invitrogen，Carlsbad, CA)。用于 RT-PCR 反 应的其它方法和系统是本领域熟知的并且是商业可得的。引物对被设计为包括所关注的区 域，例如，SEQ ID NO 1的核苷酸1920-1923，以产生PCR产物。以举例的方式，而不是限制 的方式，JAK2 的引物对可以是 5' -GAC TAC GGTCAA CTG CAT GAA A_3' (SEQ ID NO 5)， 和 5' -CCA TGC CAA CTGTTT AGC AA-3' (SEQ ID NO :6)。得到的 RT-PCR 产物是 273 个 核苷酸长。RT-PCR产物然后可以被纯化，例如通过凝胶纯化，并且得到的纯化产物可以被测 序。核酸测序方法是本领域已知的；示例性的测序方法包括ABI Prism BigDye Teminator v3. ICycle SequencingKit (AppliedBiosystems,Foster City, CA) 然后，可以分析测序数 据，针对JAK2核酸中一个或多个突变的存在或不存在进行分析。测序数据也可以被分析以 确定样品中存在的野生型与突变体核酸的比例。突变JAK2蛋白的检测
突变JAK2蛋白的检测可以使用，例如，抗体、适配体、配体/底物、其它蛋白质或蛋 白质片段，或其它蛋白质结合剂来进行。优选地，蛋白质检测剂对本发明的突变JAK2蛋白 是特异的并且因而能够在突变的蛋白质和野生型蛋白质或另一变体形式之间进行辨别。这 通常可以通过，例如，选择或设计检测剂来进行，该检测剂与在变体和野生型蛋白质之间存 在不同的蛋白质区结合。用于检测突变JAK2蛋白的一种优选试剂是能够选择性地结合蛋白质的变体形式 的抗体。能够辨别野生型和突变JAK2蛋白的抗体可以通过本领域已知的任何合适的方法 制成。抗体可以是单克隆或多克隆抗体，单链或双链，嵌合的或人源化抗体，或免疫球蛋白 分子的一部分——包含本领域已知的相应于抗原结合片段的部分。制备多克隆抗体的方法是本领域熟知的。一般而言，是通过给予(例如，经皮下注 射)突变的JAK2蛋白到白色的新西兰兔子来产生抗体。JAK2抗原通常被注射在多个位点 并且该注射被重复多次(例如，大约每两周一次)以引起免疫反应。期望地，兔子被同时 给予佐剂以增强抗JAK2的免疫性。然后从血清样品中纯化多克隆抗体，例如，使用相同的 JAK2抗原通过亲和层析来捕获抗体。用于检测突变JAK2蛋白的体外方法还包括，例如，酶联免疫吸附测定(ELISAs)、 放射免疫测定(RIA)、蛋白质印迹、免疫沉淀法、免疫荧光和蛋白质阵列/芯片(例如，抗体 或适配体阵列)。对于进一步的关于免疫测定和相关蛋白质检测方法的信息，见于Current Protocols inlmmunology, John Wiley & Sons, N Y,禾口 Hage, “Immunoassays，，，AnalChcm 1999Jun 15，71(12)294R-304R。检测氨基酸变体的其它分析方法包括但不限于电泳迁 移率的改变(例如，2-双向电泳)、胰蛋白酶消化肽段消化的改变、在基于细胞或无细胞试 验中JAK2激酶活性的改变、配体或抗体结合模式的改变、等电点的改变和直接的氨基酸测 序。诊断工具本发明的JAK2核酸包括，例如，这样的核酸或其互补序列(complement)，所述基 本上与SEQ ID NO 1的JAK2核苷酸序列的一部分具有同一性并进一步包含一种或多种以 下突变G1920A、G1920T、G1920T/C0922T和T1923C。这些核酸可以用作诊断个体患有(或 者倾向于发展为)骨髓增生性疾病的工具。可选地，JAK2突变状况——单独使用或与其它 临床参数结合使用——也可以被用于确定诊断为患有骨髓增生性疾病的患者的预后。在优 选的实施方式中，JAK2核酸具有至少10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、75、100或更多核 苷酸。在其它优选的实施方式中，JAK2核酸进一步包含可检测的标记并被用作探针 (“JAK2探针”)以检测患者样品中的突变JAK2核酸。可以用本领域已知的方法可检测地 标记JAK2探针。有用的标记包括，例如，荧光染料(例如，Cy5 ，Cy3 ，FiTC，罗丹明，镧系 元素无机发光材料(lanthamide phosphors)、德克萨斯红(Texas red)、FAM、JOE、CaIFluor Red 610 、Quasar 670 )、放射性同位素(例如，32P，35S，3H, 14C，125I，131I)、电子致密试剂 (electron dense reagent)(例如，金)、酶(例如，辣根过氧化物酶，β-牛乳糖苷酶，荧 光素酶，碱性磷酸酶)、比色标记(colorimetric labels)(例如，胶体金)、磁标记(例如， Dynabeads )、生物素、地高辛(异羟基洋地黄毒甙元，dioxigenin)或半抗原和蛋白质—— 对于其抗血清或单克隆抗体是可用的。其它标记包括能够分别与相应的受体或寡核苷酸互补序列形成复合物的配体或寡核苷酸。标记能够被直接掺入待被检测的核酸，或者可以连 接于与待被检测的核酸杂交或结合的探针(例如，寡核苷酸)或抗体。在其它优选的实施方式中，JAK2探针是TaqMan 探针、分子信标和 ScorpionM例如，Scorpion 探针)。这些类型的探针是基于荧光猝灭的原理并且包括供体 荧光团和猝灭部分。如本文所用术语“荧光团”指吸收特定波长(激发频率)的光然后发射 更长波长(发射频率)的光的分子。如本文所用术语“供体荧光团”意指这样的荧光团当 接近于猝灭剂部分时，将发射能量供给或传输给猝灭剂。将能量供给猝灭剂部分的结果是， 供体荧光团本身发射更少的特定发射频率的光，该特定发射频率的光是当位置紧邻的猝灭 剂部分不存在时具有的。如本文所用术语“猝灭剂部分”意指这样的分子与供体荧光团非常靠近，吸收供 体产生的发射能量，损耗热能或发射比供体发射波长更长波长的光。在后者情况下，猝灭剂 被认为是一种受体荧光团。猝灭部分可通过接近(即，碰撞)猝灭或通过Forster或荧光 共振能量转移(“FRET”)起作用。通过FRET的猝灭通常在TaqMan 探针中使用，而接近 猝灭在分子信标和Scorpion 型探针中使用。合适的猝灭剂基于特定荧光团的荧光光谱来 选择。有用的猝灭剂发包括，例如，Black Hole 猝灭剂BHQ-I、BHQ_2和BHQ-3 (Biosearch Technologies, Inc.)，以及 ATTO-系列猝灭剂(ΑΤΤ0 540Q、ATTO 580Q 和 ATTO 612Q ； Atto-TecGmbH)。对于Scorpion引物，使用单个分子实现序列特异性引发和PCR产物检测。 Scorpion引物保持了处于未杂交状态的茎-环构型。荧光团连接在5’端且被连接在3’ 端的部分猝灭，尽管在合适的实施方式中，这一设置可能被转换。茎的3’部分还包含与引 物的延伸产物互补的序列。这一序列经不可扩增的单体连接在特异性引物的5’端。在引 物部分的延伸后，特异性探针序列能够在伸展的扩增子内连接至其互补序列因而使发夹环 展开。这防止荧光被猝灭且信号被观察到。通过反向引物和Scorpion引物的引物部分，特 异性靶被扩增，生成延伸产物。由于荧光团与猝灭剂的分离，荧光信号产生，这种分离是由 Scorpion引物的探针元件(例如，JAK2探针)与延伸产物的结合造成的。TaqMan 探针(Heid 等，Genome Res 6 :986_994，1996)使用 Taq 聚合酶的荧光 5’外切核酸酶活性来测量在cDNA样品中靶序列的量。TaqMan 探针是寡核苷酸，其包含 通常在5’碱基处或靠近5’碱基的供体荧光团，和一般位于或靠近3’碱基的猝灭部分。猝 灭剂部分可以是染料如TAMRA或者可以是非荧光分子如4- (4- 二甲基氨基苯基偶氮)苯甲 酸(DABCYL)。见 Tyagi 等，I6Nature Biotechnology 49-53(1998)。当照射时，激发的荧光 供体通过FRET而非荧光将能量转移到邻近的猝灭部分。因此，供体与猝灭剂的紧密接近防 止了供体荧光的发射，而探针是完整的。TaqMan 探针被设计为与PCR产物的内部区域退火。当聚合酶(例如，反转录 酶)复制其上TaqMan 探针结合的模板时，其5'外切核酸酶活性使探针裂开。这结束了 猝灭剂的活性(没有FRET)，并且供体荧光团开始发射荧光，其在每一循环的增长与探针裂 开的速度成比例。通过监测报道分子染料荧光的增加(注意引物未被标记)，PCR产物的累 积被检测到。如果猝灭剂是受体荧光团，那么PCR产物的积累可以通过监测受体荧光团荧 光的减少而被检测到。检测JAK2突变的试剂盒
本发明也提供了检测JAK2突变的试剂盒。该试剂盒包含至少一对引物对和检测 靶内JAK2突变的工具，所述引物对能够扩增包含SEQID NO 1的核苷酸1920-1923的靶 JAK2核酸序列。优选地，使用试剂盒的引物对的扩增导致产生具有至少20、40、60、80、100、 125、150、200、300、500或更多核苷酸的反应产物。适合的引物对包括，例如，具有SEQ ID NO 5和6序列的引物。用于检测反应产物内JAK2突变的适合的工具包括使用可检测地标 记的JAK2探针，如本文所描述的那些。诊断和预后JAK2突变的存在——包括，例如，单独的V617F、V6171和C618R突变，彼此的组合， 或与其它JAK2突变的组合——可以作为疾病的指示物。另外，这些突变的接合性状态是疾 病的进程和一些患者人群的患者寿命的预后症状。在患者样品中的突变体与野生型核酸之 比可以被用于监测实况如疾病的进程和治疗效果。样品中的接合性状态和野生型与突变体核酸之比可通过本领域已知的方法测定， 包括序列特异的、定量检测方法。其它方法可以包括测定来自标准测序电泳图的序列峰曲 线下的面积，如使用ABI测序系统(Applied Biosystems, Foster City CA)产生的那些。例 如，在电泳图上代表特异性核苷酸的位置仅存在一个单峰如“G”，说明样品中的核酸在该位 置仅包含一种核苷酸“G”。那么样品可以被归类为纯合的，因为只有一种等位基因被检测 到。两个峰的存在，例如，在电泳图的相同位置上的“G”峰和“T”峰，说明样品包含两种核 酸；一种在正在讨论的核苷酸位置带有“G”，另一个在正在讨论的核苷酸位置带有“T”。那 么样品可以被归类为杂合的，因为多于一个等位基因被检测到。两个峰的尺寸可以被测量(例如，通过测量每一曲线下的面积)，两种不同核酸种 类的比例可以被计算出来。野生型与突变型核酸的比例可以被用于监测疾病进程、确定治 疗或作出诊断。例如，带有一个或多个本文鉴定的突变的癌细胞的数量可以在骨髓增生性 疾病的进程中发生改变。如果基线比例在疾病早期被建立，那么后来测得的突变体核酸相 对于野生型核酸的较高比例可以是疾病恶化或治疗无效的指示；患者内携带突变的细胞数 可能增多。突变体相对于野生型核酸的较低比例可能是治疗有效或疾病不再发展的指示； 患者内携带突变的细胞数可能减少。
实施例实施例1 JAK2突变的检测。检测了未知的MPD状态的634个个体的全血样品在编码SEQ IDNO :3的氨基酸617 的密码子周围的区域中的JAK2突变。还检测了来自证实为MPD的患者的130个血浆样品。白勺 NucliSense Extraction Kit (bioMerieux Inc. , Durham, NC)，从混合物中提取出总RNA。PCR引物对被设计为扩增包括编码氨基酸671的JAK2基 因的区域。用于PCR和测序的引物序列如下JAK2-F(5' -GAC TAC GGT CAA CTG CAT GAA A-3' )SEQ IDNO :5(对应于SEQ ID NO :1 的核苷酸 1776-1797)和JAK2_R(5' -CCATGC CAA CTG TTT AGC AA-3' ) SEQ ID NO 6 (对应于 SEQ ID NO 1 的核苷酸 2029-2048)。在 25 μ L 反应体积中，使用 superscript III 一步法 RT-PCR 系统和 Platinum Taq(Invitrogen, Carlsbad，CA)，进行一步法RT-PCR。用于RT-PCR的浓度是1X反应缓冲液、400nM每种正 向和反向JAK2引物、1个单位的SupersScript III以及5 μ L的RNA模板。热循环仪的条
14件是在55°C，进行反转录30分钟，随后在94°C进行2分钟，以及在94°C进行15秒，60°C 进行30秒，68°C进行1分钟的40个循环，最后一步是在68°C进行7分钟。使用Multiscreen PCR plate (Milhpore, Billerica, ΜΑ)，过滤纯化扩增产物，然 后，使用 ABI Prism Big Dye Terminator V3 1 CycleSequencing Kit 和 ABI PRISM 3100 遗传分析仪(Genetic Analyzer) (Applied Biosystems, Foster City CA),使用以 GenBank 登录号NM004972作为参考的JAK2序列，在正向和反向对扩增产物进行测序。最常检测的是由G1920T突变产生的在JAK2蛋白质中的V617F氨基酸取代。图5 显示了来自基于细胞和基于血浆的JAK2突变分析的代表性的电泳图示踪。图5A显示了来 自普通(野生型)个体的示踪。图5B和5C显示了来自带有G1920T突变的个体的血细胞 和血浆样品的示踪。图5B表明个体是杂合的G1920T突变。点(dot)表明峰与硫胺素碱相 关。但是，由同一个体的血浆样品获得的图5C表明该个体是纯合的或半合子的突变。来自 血细胞样品的假(spurious)结果可能是稀释/污染了白血病细胞核酸的高水平正常血细 胞的结果。因此，血浆富集了肿瘤特异性核酸并提供了更可靠的用于检测MPD的试验底物。在单个患者内发现了两个新的JAK2点突变。如图6所示，患者同时带有导致V617F 氨基酸取代的变体核酸突变和导致C618R氨基酸取代的第二核酸突变。图6A显示了来自 具有正常(野生型)JAK2的患者的电泳图示踪。图6B显示了在编码氨基酸617的密码子 内的双点突变。特别地，野生型GTC密码子(缬氨酸)包含G1920T/C1922T双点突变(灰 箭头)，导致了 TTT密码子(精氨酸)。个体还被发现带有T1923C点突变(黑箭头)，导致 密码子由TGT (半胱氨酸)变为CGT (精氨酸)。在不同的患者内发现另一新的JAK2点突变。如图7所示，这一患者具有G1920A 点突变，导致在JAK2蛋白质内的V617I氨基酸取代。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通 技术人员通常理解的相同的意义。本文说明性地描述的本发明可以适当地被应用在缺乏本文没有具体公开的 任何一种或多种元素、一种或多种限制中。因此，例如，“包含(comprising)，，、“包括 (including) ”、“含有(containing) ”等术语将被宽泛地理解而没有限制。另外，本文使用 的术语和表达方式已被用作说明的术语而不是限制的术语，并且，无意在这些术语和表达 方式的使用中排除所示和所述或其部分的任何等同物，但应意识到在本发明要求的范围内 的各种改进是可能的。因此，应当理解为，尽管本发明通过优选的实施方式和任选的特征已经被具体地 公开了，但是本文公开的体现对本发明的改变、改进和变化，可以诉诸于本领域的技术人 员，并且这些改变、改进和变化都被认为是在本发明的范围内。本文提供的材料、方法和实 例是优选的实施方式的代表，是示例性的，而不是意在限制本发明的范围。本文宽泛地和一般地描述了本发明。落入普通公开内的每个更窄的种类和亚属分 组也构成了本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述，其带有排除来自种类的任何主 题的限制性条款或否定限制，不管本文是否特别陈述了排除的材料。此外，当本发明的特征或方面按照马库什(Markush)组被描述时，本领域的技术 人员将意识到本发明因此也按照马库什(Markush)组的任何个体成员或亚属成员进行描 述。
本文提及的所有的出版物、专利申请、专利和其它参考文献清楚地通过引用以其 整体并入本文，与每篇文献单独地通过引用并入本文的程度相同。当冲突时，将依照本说明 书——包括定义。
权利要求
诊断肿瘤性疾病的方法，其包含确定在患者的JAK2核酸内一个或多个突变的存在或不存在，所述突变选自G1920A、T1923C和G1920T/C1922T。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变是G1920A。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变是G1920T/C1922T。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变是T1923C。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述JAK2核酸进一步包含G1920T突变。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述JAK2核酸进一步包含G1920T/C1922T突变。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述JAK2核酸进一步包含T1920A突变。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤性疾病是骨髓增生性疾病。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述骨髓增生性疾病选自真性红细胞增多症、特 发性血小板增多、特发性骨髓纤维变性和未分类的骨髓增生性疾病。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变影响JAK2激酶的活性。
11.确定诊断患有肿瘤性疾病的个体的预后的方法，其包括确定在患者的JAK2核酸内 一个或多个突变的存在或不存在，所述突变选自G1920A、T1923C和G1920T/C1922T，以及 利用突变状况来预测所述个体的临床结果。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述突变是G1920A。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述突变是G1920T/C1922T。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述突变是T1923C。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述JAK2核酸进一步包含G1920T突变。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述JAK2核酸进一步包含G1920T/C1922T突变。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述JAK2核酸进一步包含T1920A突变。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述肿瘤性疾病是骨髓增生性疾病。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述骨髓增生性疾病选自真性红细胞增多症、 特发性血小板增多、特发性骨髓纤维变性和未分类的骨髓增生性疾病。
20.根据权利要求11所述的方法，其中所述突变影响JAK2激酶的活性。
21.根据权利要求11所述的方法，其中所述突变状况与至少一种其它临床参数相结合 以确定所述个体的临床结果。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一种其它临床参数选自年龄和胚细胞 数百分比。
23.诊断肿瘤性疾病的方法，其包括确定在患者的JAK2蛋白内存在或不存在突变，所 述突变选自V617A和C618R。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述突变是V617A。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述突变是C618R。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述JAK2蛋白进一步包含V617F突变。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述肿瘤性疾病是骨髓增生性疾病。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述骨髓增生性疾病选自真性红细胞增多症、 特发性血小板增多、特发性骨髓纤维变性和未分类的骨髓增生性疾病。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述突变影响JAK2激酶的活性。
30.分离的核酸，其包含SEQID NO :1的至少14个核苷酸或其互补序列，其中所述核 酸包含选自G1920A、T1923C和G1920T/C1922T的突变。
31.根据权利要求30所述的核酸，其中所述突变是G1920A。
32.根据权利要求30所述的核酸，其中所述突变是G1920T/C1922T。
33.根据权利要求30所述的核酸，其中所述突变是T1923C。
34.根据权利要求33所述的核酸，其中所述核酸进一步包含G1920T突变。
35.根据权利要求33所述的核酸，其中所述核酸进一步包含G1920T/C1922T突变。
36.根据权利要求33所述的核酸，其中所述核酸进一步包含T1920A突变。
37.根据权利要求30所述的核酸，其中所述核酸包含至少50个核苷酸。
38.根据权利要求30所述的核酸，其中所述核酸进一步包含可检测的标记。
39.一种分离的多肽，其包含SEQ ID NO :3的至少10个连续的氨基酸，其中所述多肽 包含选自V617I和C618R的突变。
40.根据权利要求39所述的多肽，其中所述突变是V617I。
41.根据权利要求39所述的多肽，其中所述突变是C618R。
42.根据权利要求41所述的多肽，其中所述多肽进一步包含V617I突变。
43.根据权利要求39所述的多肽，其中所述多肽包含至少50个氨基酸。
全文摘要
公开了JAK2基因和JAK2蛋白内的新突变。也公开了用于诊断或确定患有肿瘤性疾病——包括例如，骨髓增生性疾病——的个体的预后的方法和组合物。
文档编号C12N9/12GK101918588SQ200880115183
公开日2010年12月15日 申请日期2008年11月7日 优先权日2007年11月8日
发明者M·阿尔比塔 申请人:奎斯特诊断投资公司