检测核酸的装置和方法

专利名称：检测核酸的装置和方法
技术领域：
本发明涉及用于检测核酸，例如用于分子诊断的方法和设备，例如生物传感器。
背景技术：
磁性颗粒在核酸检测方法中是用途是公知的。例如，W02006131892描述了在其中 扩增核酸的磁性生物传感器。在扩增期间，磁性颗粒掺入到扩增的DNA中。扩增的核酸随后 利用掺入的磁性颗粒来检测。检测方法涉及在传感器表面附近磁性颗粒的结合。在传感器 表面附近的结合是通过目标与附着到传感器表面的探针的结合来实现的。在这些方法中， 必需添加严格的步骤来获得对探针/目标相互作用的高灵敏性和特异性。这一般涉及改变 温度和/或缓冲条件。现有技术提出了在固体表面上的杂化分析，其中信号产生在核酸酶的作用下被控 制(W003052139、W002059364)。在这些公开物中，描述了一些方法，其中核酸目标/探针杂 化物被酶裂解，引起可检测信号的分离。这样的酶裂解步骤使得该分析更为选择性和更严 格。选择对某些碱基序列为选择性的酶的可能性进一步提高了检测的特异性。在某些情况 下，甚至可以检测到单个核苷酸错配(例如，SNP)。W002059364提出了磁性颗粒作为标记 物的用途。现有技术的分析具有几个缺点，它们是在反应表面附近或反应表面上进行检测的 结果。在酶消化之后需要洗涤步骤，来确保低背景信号和消除假阳性。虽然可能等待裂解 的标记物扩散远离表面，但这显著地提高了得到结果的时间。在涉及快速检测的应用中，过 程步骤的数量的减少是期望的。第二，由于标记物附着到表面，可测量的浓度的动态范围与 在总(bulk)体积中产生信号的同质的分析相比会是有限的。另外，存在着很少的方法，其容许从目标产生的信号的扩增而不扩增目标本身或 添加更多标记物。这些方法对于低浓度的核酸目标的检测是有益的，而不会扩增这种目标。具有核酸酶活性的核酸(DNAzymes)已经用于在扩增期间核酸的定量实时检测。 在同质阶段，Qzyme探针(Clontech)采用DNAzymes通过供体和接受体染料之间的拴系物 的酶裂解来控制光的产生。染料还已经与金纳米粒子组合作为探针中的淬灭剂。这些探针 的检测利用包括荧光和比色方法的方法光学地进行。这些定量性的方法需要探针和染料标 记物的复杂的设计。发明概述本发明公开了基于磁性或可磁化颗粒的操作检测核酸目标的方法，所述磁性或可 磁化颗粒从探针上朝向传感器表面释放。这种释放是裂解酶的作用的结果。这些方法可以 应用于例如核酸的定量检测。它们可以任选地与扩增技术(例如，PCR)组合。本发明的特别的和优选的方面在附随的独立和从属权利要求中列出。从属权利要 求的特征可以视情况与独立权利要求的特征以及与其他从属权利要求的特征组合，不仅仅 是如权利要求中明确阐述的。本发明的一个方面涉及检测样品中目标核酸分子(1)的方法。最特别地，本发明 涉及一些方法，其组合了通过磁场移动的磁性颗粒的使用和核酸特异性酶的作用。在特定
3的实施方式中，提供了检测样品中的目标核酸分子(1)的方法，其包括步骤a)提供了与目标核酸分子(1)互补的核酸探针(2)，其中所述探针(2)与磁性或 可磁化颗粒(3)连接，并附着到表面(4)b)在容许所述探针(2)与所述目标核酸(1)的结合的条件下使所述样品与所述探 针接触，从而形成探针/目标杂化物，c)施加或活化核酸裂解酶(E)，其区别未结合的探针和结合的探针/目标杂化物，d)至少在步骤(c)期间，施加磁场(F)以操作未结合的磁性或可磁化颗粒朝向远 离所述表面的区域，e)在一个或更多个时间点检测在所述表面⑷上磁性或可磁化颗粒的浓度和/或 在远离所述表面的所述区域中磁性或可磁化颗粒的浓度，在特定的实施方式中，在所述表面处和/或在远离所述表面的所述区域中的检测 通过测量所述磁性或可磁化颗粒的磁场来进行。在进一步的实施方式中，在所述表面处和/或在远离所述表面的区域中磁性或可 磁化颗粒的检测是通过FTIR(frustrated total internalreflection，受抑全内反射)进 行的。在进一步特定的实施方式中，在所述表面处和/或在远离所述表面的区域中磁性 或可磁化颗粒的检测通过测量附着到所述磁性或可磁化颗粒的可检测标记物来进行。在特定的实施方式中，在本发明的上下文中使用的磁性或可磁化颗粒是包含磁性 材料和荧光标记物的颗粒。在特定的实施方式中，本发明的方法利用了核酸裂解酶，其至少裂解所述探针/ 目标杂化物中的所述探针。在可选择的实施方式中，本发明的方法利用了核酸裂解酶，其裂解双链DNA。在特定的实施方式中，本发明的方法利用了核酸裂解酶，其是序列特异性酶，或是 对甲基化的核酸具有特异性的酶。在此处描述的方法的某些实施方式中，在核酸裂解酶之前添加切口酶。在特定的实施方式中，本发明的方法利用核酸裂解酶，其是形成所述探针(2)的 一部分的 DNAzyme 或 RNAzyme。在又进一步的实施方式中，本发明的方法利用核酸裂解酶，其在所述目标核酸分 子(1)的PCR扩增期间被掺入到所述目标核酸分子(1)中。在特定的实施方式中，本发明的方法利用核酸裂解酶，其裂解DNA/RNA杂化物。在进一步的实施方式中，描述了一些方法，其中所述目标核酸(1)是DNA，所述探 针⑵是RNA，其中所述酶(E)是仅消化RNA/DNA杂化物中的RNA的酶。本发明的进一步的方面涉及用于根据磁性或可磁化颗粒的检测来检测目标核酸 的设备。根据本发明的设备包括反应表面(4)和检测区域，其中所述检测区域是能够检测 结合到所述表面的标记物的检测区域，或是能够检测在远离所述表面的区域中的标记物的 检测区域。一般地，此处描述的设备进一步包括移动磁性或可磁化颗粒远离和/或朝向能 够检测结合到所述表面的标记物的检测区域、和/或远离和/或朝向能够检测在远离所述 表面的区域中的标记物的检测区域的装置。在进一步特定的实施方式中，本发明的设备包 括
-反应表面(4)，-具有能够检测与所述反应表面(4)结合的标记物的第一检测区域的第一传感器 (61)，-用于施加从所述检测表面到远离所述检测表面的区域的磁场(F)的装置-具有远离所述检测表面的第二检测区域的第二传感器(62)，和-任选地，用于将磁性或可磁化颗粒移动朝向所述第二检测区域的装置。在特定的实施方式中，设备包括反应室，其中所述反应室包括_包括反应表面(4)和能够检测结合到所述反应表面(4)的标记物的第一检测区 域的第一区域，-远离所述第一区域的第二区域，包括能够检测所述远离第一区域的区域中的标 记物的第二检测区域，和-施加从所述第一区域到所述第二区域的磁场(F)的装置。在此处描述的设备的特定的实施方式中，所述第一和/或第二传感器能够检测不 同的标记物。在进一步特定的实施方式中，此处设想的设备进一步包括具有附着于所述反应表 面的磁性或可磁化颗粒的多个不同的探针，其中每个探针包括不同的可检测标记物。在又进一步特定的实施方式中，在此设想的设备的第一和第二区域处在所述反应 室的对侧上。根据以下详细说明，连同附图，本发明的上述和其他特征、特点和优点将变得明 显；


了，举例来说，本发明的原理。给出这种描述仅是为了举例，而不是限制本发明 的范围。以下引用的附图标记涉及附图。附图的简要说明附图1显示了根据本发明的核酸探针/目标杂化的核酸酶依赖性检测的特定实施 方式的示意图。画面A到C描绘了其中存在于样品中的目标核酸结合到探针的情况(A 目标核酸 存在但是不杂化)。探针/目标杂化物的存在(B:探针/目标杂化物的形成)引起了这种 杂化物被仅消化双链核酸的酶的裂解(画面C)，并引起磁性或可磁化颗粒从探针释放(C: 释放的磁性或可磁化颗粒被磁场F移动离开反应表面)。画面D到F描绘了不与目标杂化的(过量的)探针的结局(其也相应于样品中不 存在目标核酸的情况)。不形成杂化物，不发生消化，磁性或可磁化颗粒不释放。(1 目标核酸；2 探针核酸；3 磁性或可磁化颗粒；4 反应表面；E 核酸酶；F磁 力)。附图2显示了其中没有目标核酸的扩增而发生信号放大的本发明的特定实施方 式的示意图。在第一个步骤(A)中，核酸目标结合探针。然后添加仅消化探针/目标杂化 物中的探针的酶，引起附着到探针的磁性或可磁化颗粒的释放(画面B)。然后所述释放的 目标核酸可再次结合探针(画面B)。所述探针/目标杂化物中的探针再次消化，引起其他 磁性或可磁化颗粒的释放(画面C)。1 目标核酸；2 探针核酸；3 磁性或可磁化颗粒；4 反应表面；E 核酸酶；F磁 场。
附图3显示了根据本发明的实施方式用于进行核酸酶依赖性分析的设备的示意 图。所述设备包括具有反应表面(4)和两个传感器(61和62)的反应室(5)和产生磁场(F) 的装置。附图3显示了利用不同的探针和标记物用于多路化的设备起作用的实施方式。带 有磁性或可磁化颗粒和标记物的每个探针的部分在杂化和核酸酶处理之后被裂解。存在于 未消化的探针(21)和(22)的部分上的磁性或可磁化颗粒(31)和(32)保持在传感器(61) 附近。释放的磁性或可磁化颗粒(31')和(32')通过磁力F被操纵朝向传感器(62)。
在不同的附图中，相同的附图标识是指相同的或类似的元件。将针对特定的实施方式和参考某些附图描述本发明，但是本发明不受此限制，仅 由权利要求限制。权利要求的任何附图标识将不被看做限制范围。描述的附图仅是示意性 的而非限制性的。在附图中，为了说明性的目的，某些元件的大小可以被扩大，并且没有按 比例尺描绘。当术语“包括”在本说明书和权利要求中使用时，它不排除其他元素或步骤。 当涉及单名词时使用不定冠词或冠词例如“a”、或“an”、“the”的地方，这包括该名词的复 数，除非特别声明了其他的情况。此外，在说明书中和在权利要求中，术语第一、第二、第三等等，是用于区分相似的 要素，而不一定描述次序或时间顺序。要理解的是，这样使用的术语在合适的状况下是可互 换的，在此描述的本发明的实施方式能够以不同于在此描述和说明的其他顺序来操作。单独地提供以下术语或定义来帮助理解本发明。这些定义不应当被认为具有小于 本领域普通技术人员所理解的范围。发明的详细说明定义在此使用的术语“目标”是指在本发明的方法中要被检测和/或定量的核酸。本 申请设想的目标分子的实例的非限制性列表在说明书中提供。术语目标可以指样品中存在 的核酸，但还可以指其扩增的版本(通过PCR、AMR、TMR、NASBA等)。在本申请中使用的术语“探针”是指包含能够特异性结合目标(的部分)的序列 的核酸。在本发明中“核酸”是指在天然的样品中存在的DNA和RNA，但还指合成的分子，例 如PNA (具有肽骨架的核酸)。当在磁场中的操作的上下文中被提及时，能够在磁场中被磁吸的磁性珠子、球体 或其他形状被称为“颗粒”。在此使用的术语“标记物”是指产生可检测信号的任何化合物。在这方面，磁性或 可磁化颗粒当它们在例如它们的磁场的检测或它们的光学性质的检测的上下文中被提及 时，被称为“标记物”。术语“反应表面”是指探针可以附着之上的表面，并且在本发明的方法中核酸酶消 化在此处发生。如在此使用的“检测区”(或区域)是指一种区域，任选地相应于反应室的一部分， 其处在传感器的范围之内，容许这个区域内标记物的检测。当在表面上进行检测时，这也被 称为检测表面。检测表面可以相同于或不同于反应表面。本发明的一个方面涉及检测样品中的目标核酸分子的方法。这些方法基于目标核 酸分子与探针的结合，其除核酸酶活性以外还确保释放可检测的标记物。根据特定的实施
6方式，这些方法包括以下步骤提供包含与目标核酸分子(1)互补的序列的核酸探针(2)，其中所述探针(2)与磁 性或可磁化颗粒(3)连接，并附着到表面(4)，在容许探针(2)与目标核酸(1)的结合的条件下使怀疑含有目标核酸的样品与所 述探针接触，从而，如果所述目标核酸存在于样品中，容许探针/目标杂化物的形成，施加或活化核酸裂解酶(E)，其区别未结合的探针和结合的探针/目标杂化物，施加磁场(F)，以操纵未结合的磁性或可磁化颗粒朝向远离所述表面的区域，在一个或更多个时间点检测所述表面(4)上磁性或可磁化颗粒的数量，和/或在 远离所述表面的检测区域中磁性或可磁化颗粒的数量。在本发明的上下文中，提及“远离”或“远离所述表面”的区域，是指一种区域，其 特征在于，磁性/可磁化颗粒在该区域中的存在不影响在所述表面上磁性颗粒的检测，和/ 或在该区域中的检测不受到所述表面上磁性/可磁化颗粒的存在的影响。对于检测来说， 远离所述表面的区域与在所述表面处的区域是不相关的。取决于使用的核酸酶的特征，在所述表面处或在远离所述表面的区域中磁性或可 磁化颗粒的检测直接地或逆反地与样品中目标核酸的数量相关。在特定的实施方式中，区别未结合的探针和结合的探针/目标杂化物的核酸酶能 够至少裂解探针/目标杂化物中的探针，并且不裂解未结合的探针。在这些实施方式中，仅 未结合的探针将保持在反应表面上。在反应表面处由未结合的探针上的标记物产生的信号 与样品中目标的数量逆相关。在远离结合表面的检测区域中释放的颗粒所产生的信号(裂 解的探针/目标杂化物)与样品中目标的数量直接相关。在可选择的实施方式中，区别未结合的探针和结合的探针/目标杂化物的核酸酶 仅裂解未结合的探针核酸。在这些实施方式中，仅在使探针与样品接触时形成的探针/目 标杂化物保持在反应表面上。在反应表面处由探针/目标杂化物上的标记物产生的信号与 样品中目标的数量直接相关。在远离结合表面的区域中释放的颗粒所产生的信号(裂解的 未结合的探针)与样品中目标的数量逆相关。在此处设想的方法中，组合核酸杂化、核酸酶裂解和磁性分离。在这些方法的特定 实施方式中，杂化和核酸酶消化都不受磁场的存在的影响。因而，磁场的应用不必限于方法 中的那些步骤，其中释放的磁性或可磁化颗粒被操纵朝向远离所述表面的区域，和/或其 中在所述表面上磁性或可磁化颗粒的存在被检测。这具有的优点是，检测可以在整个方法 中发生，以及目标的检测可以与例如目标的PCR扩增同时地进行。本发明的方法适合于各种各样的样品中核酸的检测。样品可以是任何来源，包括 环境样品、法医样品、来自工业过程的样品、微生物样品、组织或体液样品，等等。本发明的 方法适合于DNA以及RNA。在特定的实施方式中，样品中的核酸在分析前被加工，通过，例 如，除去蛋白质、从RNA分离DNA、分离mRNA、经由逆转录酶将RNA转化成DNA、经由超声处理 或限制消化的DNA的断裂，等等。在特定的实施方式中，经由PCR或其他方法，例如SDA (链置换扩增)、TMA (转录介 导的扩增)或NASBA(基于核酸序列的扩增)，DNA或RNA目标核酸在此处描述的分析之前 或期间被扩增。在本发明的方法中使用的核酸探针可以是DNA、RNA或甚至合成的核酸样分子，例
7如PNA。探针一般经由化学方法合成，但是也可以通过从质粒或其他载体分离核酸来制备。 做为选择，所述探针通过体外转录和/或翻译方法，或通过扩增方法例如PCR来制备。在特 定的实施方式中，除了能够特异性结合目标(的部分)的序列之外，探针任选地含有间隔 区。这样的间隔区的功能是进一步提高酶裂解位点和磁性颗粒之间，和/或酶的裂解位点 和反应表面之间的物理距离。这样，酶较少地被各种表面阻碍。间隔区可以是任何物质，核 酸、蛋白质、小分子、肽，等等，其不是分析中使用的核酸酶的底物。在本发明的方法中，核酸探针通过微阵列领域中公知的方法附着到表面。所述表 面被用作反应表面，一般地是反应室的部分。在现有技术中使核酸与其他化合物反应的不同方法是已知的，例如通过反应性功 能基团(_C00H、NH2、HS、环氧基、醛、甲苯磺酰基、马来酰亚胺，等等)的化学偶联或经由中 间结合基团和结合基团对来偶联，例如抗生物素蛋白/生物素、抗体/抗原、抗体/半抗原、 蛋白质/蛋白质、蛋白质/凝集素、蛋白质/DNA、DNA/DNA、蛋白质/适体。这些和其他方法 可以用于将探针附着到本发明的方法中设想的表面上。此处描述的方法中使用的探针一般进一步用磁性或可磁化颗粒来功能化。将磁性 或可磁化颗粒结合到DNA的方法是技术人员公知的，由例如Dynal商品化。 为了最佳灵敏度，本发明的方法利用磁性颗粒，其中磁性颗粒/探针比例是1。在此处设想的方法的特定的实施方式中，磁性或可磁化颗粒作为标记物起作用， 被能够在它的检测区域(例如，在检测表面上)中检测磁性或可磁化颗粒的存在的传感器 来检测。例如，这可以由颗粒的磁场的检测来确保。做为选择，磁性颗粒通过它们的光学性 质利用例如FTIR来检测。在本发明的上下文中设想的方法的进一步特定的实施方式中，使用探针，其除了 磁性或可磁化颗粒之外包含一个或更多个其他功能基团。这样的基团一般是可检测标记 物，例如光学标记物(荧光、磷光、SERRS)或超声标记物。这些标记物可直接附着到核酸探 针上。在进一步特定的实施方式中，所述磁性或可磁化颗粒包含一个或更多个功能基团，其 可以用作标记物。标记物可以经由化学方法附着到磁性或可磁化颗粒的表面，或可以掺入 到磁性或可磁化颗粒中(例如，含有顺磁材料的荧光聚合物颗粒)。对此处描述的方法的主 要要求是，在分析期间，例如，作为核酸酶处理的结果，所述磁性或可磁化颗粒和可检测标 记物不相互分离。本发明的方法设想DNA/DNA、DNA/RNA或RNA/RNA探针/目标杂化物的形成。一 般地，能够与目标特异性杂化的探针内的序列相应于比目标核酸更短的寡核苷酸。任选地， 如上所述，探针可以包含间隔区。因素例如杂化物的性质(DNA/DNA或DNA/RNA)、探针/目 标杂化物的长度、探针和目标之间互补性的程度对杂化具有影响。探针的长度和序列、缓 冲剂组成和温度的合适的选择容许探针和目标之间特异性结合的操作。合适的条件的选 择是技术人员已知的，且例如在 Sambrook 等(2001) 〃 Molecular Cloning :A Laboratory Manual"，Cold Spring HarborPress)中被解释。如上文详述的，根据本发明的方法包括形成的目标/探针杂化物内探针(任选地 还有目标)的裂解，或仅单链探针，即，不与目标杂化的探针的裂解，从而确保磁性或可磁 化颗粒的释放。这一般通过添加或活化核酸酶(核酸裂解酶)到反应表面上的目标/探针 杂化物来保证。在本发明的方法中设想了不同类型的核酸裂解酶的使用。使用的酶可以
8是裂解或消化核酸的任何类型的催化分子，包括蛋白质、肽和核酶(DNAzymes、RNAzymes或 DNA和RNA的组合)。所选的酶可以在探针内的单个位置或在多个位置裂解(包括其中的 间隔区内)。合适的酶的选择取决于探针和目标的性质和序列。在本发明的特定的实施方式中，提供了一些方法，其包括探针/目标杂化物的消 化。在此，使用核酸酶，其至少裂解所述探针/目标杂化物中的探针，任选地还裂解目标。在特定的实施方式中，目标和探针都是DNA。在这样的方法中，所选的酶一般仅作 用于双链DNA。其实例是双链特异性DNAses，例如T7核酸外切酶和核酸外切酶III。双链DNA的裂解还可以用仅在特定的位置识别特定碱基并裂解的限制性内切酶 来进行。这些特异性裂解序列可以是目标中固有的，或是在目标扩增过程期间修饰的结果。 稀有限制性酶识别位点(例如，8bp切割物)的掺入显著地提高分析的特异性。在其中不发 生扩增步骤的那些分析中，特异性可以通过筛选目标核酸的序列中较低频繁地出现的限制 性酶识别位点并利用这种区域用于探针的设计来提高。在此处描述的方法的其他实施方式中，目标和探针都是RNA。在这样的方法中，所 选的酶一般仅作用于双链RNA。其实例是E.coli的核糖核酸酶(RNAse)III。在此处描述的方法的进一步的实施方式中，目标是DNA，探针是RNA。在这样的方 法中，所选的酶一般仅作用于DNA/RNA杂化物，其中至少RNA被裂解。其实例是Rnase H，其 特异性地降解RNA/DNA杂化物中的RNA，或T7核酸外切酶，其降解RNA/DNA杂化物中的RNA 和DNA，但不降解单链RNA。在此处描述的方法的又另一个实施方式中，目标是RNA，探针是DNA。在这些方法 中，所选的酶一般仅作用于DNA/RNA杂化物，其中至少DNA被裂解，例如来自堪察加半岛蟹 的双链特异性核酶(DSN) (Shagin 等(2002) Genome Res. 12,1935-1942)。在进一步特定的实施方式中，目标和探针都是DNA，其中在目标和探针DNA之 间发生错配(突变或环体)。酶例如CEL1 (US658322)或SP1 (Pimkin等(2007) BMC Biotechnol.7,29)可以在存在错配时切开DNA。切口酶一般特异于双链核酸，不裂解单链 核酸。任选地，核酸外切酶例如核酸酶Bal-31或T7核酸外切酶可以进一步降解切口的DNA， 并促进磁性或可磁化颗粒的释放。在本发明的特定的实施方式中，提供了一些方法，其包括仅未结合的探针，S卩，不 与目标杂化的探针的消化。在此，使用裂解单链探针、但是不裂解探针/目标杂化物中的探 针或目标的核酸酶。在使用DNA探针时，适合于在这些方法中使用的酶的实例包括单链特异性 DNAses (例如，核酸外切酶1、绿豆核酸酶、核酸酶Bal31、Recjf, SI核酸酶)。在其他实施 方式中，对于RNA探针，使用的酶是单链特异性RNAse(RNAse I、RNAse A、RNAse T1、绿豆核 酸酶、核酸酶Bal31)。这样的酶的使用在其中形成DNA/RNA杂化物的分析中是特别适合的。 为了避免在目标的结合之前探针的非期望的消化，单链特异性核酸酶在目标/探针杂化物 形成之后添加。在本发明的特定的实施方式中，核酸酶是具有催化性质的核酸。最特别地，核酸酶 在探针和/或扩增的目标核酸之内存在。在这些实施方式中，所述酶不需要添加到探针，而 是被活化以确保所需的活性。在特定的实施方式中，使用基于核酸的酶(例如，DNAzymes和RNAzymes)，从而催化性质被构建到探针之中，使得DNA或RNAzyme成为探针的整体部分。一种这样的探针的实 例是在 Sando 等(2005 Org. Biomol. Chem. 3，1002-1007)中描述的 TASC (Target-Assisted-SelfCleaving,目标辅助的自我裂解)探针。这样的探针与目标的结合产生了导致DNAzyme 裂解自身的构象变化。附着到包含这样的DNAzyme的探针的磁性或可磁化颗粒，由此可以 通过目标与探针的结合被裂解下来并释放。在另一个实施方式中，除了能够与目标杂化的序列之外，所述探针还含有作为核 酶的裂解反应的底物的序列。在这种情况下，探针可能必需满足某些酶要求，例如，在裂 解位点处特定核糖核苷酸的存在。相关的活性核酶在扩增的核酸目标中(例如，经由PCR 中的引物)提供，或在扩增期间释放。在探针与目标的杂化之时，磁性或可磁化颗粒被 释放。裂解的颗粒的数量可以与核酶的浓度、因而与目标的浓度相关。核酶的实例包括 (Qzyme (Clontech)，Hammerhead。这样的核酶的使用容许PCR产物的实时、定量的检测。本发明的方法中设想的核酸酶对于它们的活性可能需要特定的条件，例如，ATP、 GTP等等和任何辅因子(例如，NAD+)的存在。这些条件是已知的，可以在反应表面保证(例 如，通过使用适合的缓冲剂)。在对如上所述的核酸酶可应用时，探针结构可以调配来满足合适的核酸酶的要 求(例如，游离的3’或5’末端、切口、缺口)。此外，如果目标要经历目标扩增过程(PCR、 NASBA、SDA...),扩增的目标可以被修饰(例如，通过引物)来满足核酸酶的要求，或容许在 目标和探针两者中的相似的修改。本发明的方法包括通过探针将磁性或可磁化颗粒结合到表面，然后释放磁性或可 磁化颗粒，并确保它移动远离它所结合的表面。更特别地，此处描述的方法包括其中磁性或 可磁化颗粒被磁场操纵远离所述反应表面的步骤。本发明的方法公开了根据磁性或可磁化颗粒与表面的结合、裂解酶释放所述颗粒 的比活性、和磁性或可磁化颗粒经受磁力远离所述表面、降低洗涤需要的，用于核酸目标的 定量分析。在此处描述的其中核酸酶仅作用于探针/杂化物的方法的实施方式中，当核酶 酶是活性的时候，施加磁场将所述颗粒拉离所述反应表面进一步确保了裂解的磁性或可磁 化颗粒被快速地从反应表面除去而不影响扩增，容许实时检测。样品中目标的存在所产生的信号可以在两个水平上检测。首先，与反应表面结合 的颗粒的数量可以在核酸酶的活性之前和之后来检测。在这个实施方式中，反应表面作为 检测区域、任选地作为检测表面起作用。在仅仅设想来自探针/目标杂化物的标记物的裂 解、以及标记物仅可以在存在目标分子的情况下从表面释放的那些实施方式中，从所述表 面释放的颗粒的数量(以及因而在所述反应表面上降低的信号)与样品中存在的目标的 数量相关。在其中核酸酶特异于单链探针的实施方式中，标记物仅可以从处在所述表面上、 不结合目标分子的那些探针释放。因而在这些实施方式中，从所述表面释放的颗粒的数量 (因而，在反应表面上降低的信号)，与样品中存在的目标的数量逆相关。其次，释放的磁性或可磁化颗粒可以在远离所述反应表面的检测区域中测量(例 如，在传感器表面)，从而从所述反应表面释放的颗粒(至少部分地)通过磁场被移动朝向 该检测区域(在此称为第二检测区域)。这个检测区域远离所述反应表面。再一次，在仅探 针/目标杂化物被裂解的那些方法中，在远离所述反应表面的这个检测区域中检测到的颗 粒的数量，与样品中存在的目标的数量直接相关(越多目标存在于样品中，信号越强)，而在利用仅降解单链探针的核酸酶的方法中，在第二检测区域中检测的信号与样品中目标的 数量逆相关(越多的目标存在于样品中，信号越弱)。不论在此处描述的方法的不同实施方 式中是否使用两个检测区域，能够检测所述反应表面上标记物的存在的传感器和相应的检 测区域被称为第一传感器/第一检测区域，而能够检测远离所述反应表面的区域中的标记 物的传感器和相应的检测区域被称为第二传感器/第二检测区域。进行两个独立测量的可能性允许以高精度和在大的动态范围之内核酸目标的浓 度的动力学测定，因为可以对一个浓度进行若干测量。用磁场从反应表面除去的磁性或可 磁化颗粒的使用进一步提供了物理地采集颗粒以及计数它们的数量的选项(例如，作为远 离反应表面的第二传感器的特定的实施方式或除该实施方式以外)。这容许以高准确度和 精确度确定目标浓度。要注意的是，在上文设想的检测方案中，在反应表面处和在远离反应表面的检测 区域中的检测都可以根据检测区域中磁性或可磁化颗粒的磁性或光学性质，或根据如下文 详述的在磁性或可磁化颗粒之中或之上的在一个或两个检测区域中可检测的另一个标记 物(不同于磁场)来发生。因而，在特定的实施方式中，所述磁性或可磁化颗粒的磁性本身用作检测的标记 物。这可以用任何适合的电磁传感器来进行，所述电磁传感器可以检测磁性或可磁化颗粒 的存在，例如，电极、电线、线圈、磁抗性传感器GMR、AMR、TMR)、磁限的传感器、Hal 1传感器、 平面的Hall传感器、SQUID、磁共振传感器。做为选择，检测根据磁性或可磁化颗粒本身的 光学性质发生(例如，检测例如氧化铁的FTIR)。做为选择，或与磁性和/或FTIR检测组合地，可以使用其他标记物或检测方法。例 如，磁性或可磁化颗粒也可以用于电检测。做为选择，磁性或可磁化颗粒可以包含磁性材料 和例如荧光物质的混合物，还容许使用两种独立的方法检测这样的颗粒。在其他实施方式 中，核酸可以例如单独地用磁性或可磁化颗粒和荧光标记物(参见上文)两者来标记。还设想了其中磁性或可磁化颗粒根据一种材料来检测的方法，所述材料不被包含 在磁性或可磁化颗粒本身之内，或不附着于所述磁性或可磁化颗粒本身。例如，磁性或可磁 化颗粒结合的探针可以进一步包含光学标记物。所设想的检测方法的这样的实施方式仅适 合于其中在酶消化步骤中核酸探针不被完全消化的分析(其将引起磁性或可磁化颗粒从 标记物上的释放)。例如，当探针包含某接头和该接头时，所述标记物可以连接到所述接头， 条件是标记物所结合的接头的至少这个部分(和将这个部分连接到所述颗粒的区域)未进 行酶裂解。基于磁性或可磁化颗粒本身的性质，或被包含在颗粒之内的或直接附着到所述 颗粒的材料的性质的检测方法，特别适合于其中核酸探针被完全地消化、因而通过核酸酶 从所述颗粒完全除去的分析。当除了磁性或可磁化颗粒本身的磁性或光学性质之外使用标记物时，探针的差异 化标记提供了进行多路化分析的可能性。例如，不同的探针(即，结合不同的目标)各自用 不同的标记物标记，从而可以同时检测不同的目标的存在。例如，设想了细菌的不同菌株的 检测。这可以在一种分析中进行，在所述分析中，结合到反应表面的菌株特异性探针各自用 包含磁性材料和不同的荧光材料的聚合物颗粒标记。取决于样品内存在的菌株的种类，特 异性着色的磁性或可磁化颗粒将在探针/目标杂化物的消化之后从所述表面释放。如上文 详述的，这可以任选地在反应表面处和/或在远离反应表面的检测区域中检测。
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依靠探针/目标杂化物中探针的选择性裂解的、此处描述的方法的那些实施方式 仅仅提供了额外的益处，即，任一检测区域(或附着到任一传感器表面)中标记物数量的检 测可以在分析期间进行，以及作为时间的函数的信号的测量可以用于确定目标浓度。虽然 在单个时间点的信号足以评估浓度，一般进行在几个时间点的测量，因为这改善了精确度。 基于动力学的测量的另一个优点是可以测定在大的范围内的浓度。对于高浓度，可能希望 的是使用短的反应时间，因为标记物从反应表面的完全除去可以快速地获得，而对于低浓 度，结合到反应表面的标记物的数量不受限制，长的反应时间是实现尽可能大的信号改变 所希望的。依靠终点或单一时间点测量的分析，例如在现有技术中描述的，检测更有限的浓 度范围。来自高目标浓度的信号的动力学检测可以在短时间方式中测量(在从反应表面除 去所有标记物之前)，并外推到长时间方式，或反之，来自低目标浓度的信号可以在长时间 方式中测量，并内推到短时间方式。由于测量可以实时地完成，有可能原位地根据反应速度 确定浓度是属于高浓度方式还是低浓度方式。在信号改变的测量中，大信号中的小的改变(即，低目标浓度)将具有高误差。为 了提高测量的精确度，在此处描述的方法的特定的实施方式中，测量从反应表面释放的标 记物的数量，而不是保持附着到所述表面的标记物的数量。与其他力场(优选磁性的)组 合地、被用于除去已经被酶裂解反应释放的颗粒的磁力，被用于收集和重定向裂解的颗粒 到另一个区域，在其中任选地检测它们的标记物和测定它们的数量。裂解的和未裂解的颗 粒的测量产生了目标浓度的确定方面的非常高的精确度。容许裂解的和未裂解的颗粒的同 时实时测量的特定结构是通过与在反应表面处的第一传感器、在远离但是平行于这个反应 表面的检测区域(例如，在传感器表面处)中的第二传感器，以及能够拖动颗粒远离所述反 应表面并朝向所述第二检测区域的磁力的一种反应。所有裂解的颗粒通过磁力被拖离所述 反应表面，以及任选地在第二检测区域就位，并被检测。其他可能的结构包括邻近的传感器 (例如，在同一平面上相互远离的两个区域)与磁力组合，所述磁力能够将平行于这些表面 的磁性或可磁化颗粒从反应表面处的第一检测区域移动到远离所述反应表面的第二检测 区域。进一步的结构包括磁场与例如颗粒的微流运动组合，从而在通过磁力从所述反应表 面上除去之后，所述颗粒通过微流转运到第二检测区域。本发明的方法容许扩增的目标核酸的实时检测。在包括病原体鉴定、病毒载荷测 试、食物测试和mRNA表达作图的许多应用中，低数量的目标核酸使得必需利用各种指数性 (例如，PCR，NASBA)和线性(例如，LCR、TMA)扩增技术来扩增目标。这些核酸目标的定量 检测例如在某些诊断方法中通常是理想的。在扩增期间目标核酸的实时检测确保拷贝形成 的速率与原始目标核酸浓度的偶联。因此，本发明的方法进一步确保实时地测定作为模板 的核酸目标的扩增速率。在这些实施方式中，核酸探针含有可在核酶的作用下裂解的片段 (DNA、RNA或组合)。如上所述，核酶的活化可以在核酸目标的扩增期间发生。更具体地，模 板复制的循环过程(聚合酶结合、引物结合或链延伸)可以引起核酶的释放、活化或产生。 对于PCR和NASBA来说，有可能使用例如含有核酶的模板的引物，从而链延伸引起附着到扩 增子的活性核酶序列的产生(这样的引物是在W02007056312A2中公开的Qzyme引物)。活 性核酶可以与含有必需的识别序列的核酸探针杂化，并从反应表面释放磁性或可磁化颗粒 (即，标记物)。随着每一轮扩增，酶的数量与扩增子的数量成正比地提高。在释放的标记 物的提高中观察到酶活性的指数式提高。如在标准的实时PCR中，目标的浓度越高，达到某一检测水平所需的循环数越少。游离标记物由于酶作用仅可在溶液中存在，背景信号将是 极低的。在特定的实施方式中，本发明的方法被用于检测甲基化的目标核酸。DNA甲基化一 般通过DNA甲基化酶在CpG位点(在顺序上为胞嘧啶随后是鸟嘌呤)发生。在细菌中，甲基 化通过酶，例如通过EcoR I甲基化酶(识别GAATTC序列)在腺嘌呤位点发生。还描述了 甲基化RNA底物的RNA甲基化酶。取决于分析的设计(甲基化的或未甲基化的探针DNA)， 可以使用某些核酸内切酶，对于它们，裂解取决于甲基化DNA的存在(例如，MCRBc, Dpnl) 或甲基化DNA的缺乏(例如，DpnII、SacI)。这些分析适合于，例如，肿瘤诊断，因为许多基 因的甲基化状况是某些癌症的指示。本发明的另一个方面提供了用于进行例如此处描述的那些的方法的设备。更特别 地，提供了设备，其容许磁性或可磁化颗粒从反应表面移动到远离所述反应表面的区域，和 具有检测区域的传感器，所述检测区域能够检测在所述反应表面处和/或远离所述反应表 面的颗粒。在特定的实施方式中，根据本发明的设备包括反应表面(4)远离所述反应表面的检测区域施加磁场的装置，所述磁场能够将磁性或可磁化颗粒从所述反应表面移动到远离 所述反应表面的区域。在此设想的设备的特定的实施方式进一步包括传感器(在此称为第一传感器)， 其保证第一检测区域能够检测结合到所述反应表面的标记物。在进一步特定的实施方式中，施加磁场的装置保证了在反应表面和远离所述反应 表面的检测区域之间磁场的存在。做为选择，设想了设备，其除了施加磁场的装置之外，还 包括移动磁性或可磁化颗粒朝向第二检测区域的装置。在包含第一和第二检测区域的设备中，第一和第二检测区域可以位于设备中不同 的位置，只要在一个检测区域中标记物的检测不受另一个检测区域中标记物的存在的影 响。典型的布置是检测区域处在反应室的对侧，或邻近(即，在同一平面中)但相互足够地 远离的放置。在可选择的实施方式中，提供了仅包含上文描述的第二检测区域的设备，所述第 二检测区域远离所述反应表面。在特定的实施方式中，提供了包含反应室的设备，其中所述反应室包括第一区 域，其包含反应表面和保证第一检测区域能够检测结合到所述反应表面的标记物的传感 器，和远离所述第一区域的第二区域，包含能够检测远离所述第一区域的区域中的标记物 的第二传感器(和相应的检测区域)。这样的设备进一步包括在所述第一区域和所述第二 区域之间施加磁场的装置，以确保颗粒从/到所述表面和/或从/到远离所述表面的检测 区域的移动。在进一步特定的实施方式中，提供了设备，其包括_反应室，包括所述反应室的第一区域，其包含反应表面(4)和传感器(61)，所述传感器保证在 所述反应表面附近的第一检测区域检测结合到所述反应表面的磁性或可磁化颗粒(3)反应室的远离所述第一区域的第二区域，包括第二传感器(62)，所述第二传感器
13保证第二检测区域检测从所述反应表面释放的磁性或可磁化颗粒，和-施加从所述第一区域到所述第二区域的磁场(F)的装置。如上文详述的，所述第一和/或第二传感器可以是检测磁性或可磁化颗粒的磁 性、光学或电学特征的相同或不同的传感器，和/或检测磁性或可磁化颗粒上直接存在、磁 性或可磁化颗粒内的、或通过探针的部分间接结合到所述磁性或可磁化颗粒的其他标记物 的传感器。在特定的实施方式中，设备可以随时可使用地提供，S卩，包括附着到反应表面的适 合的核酸探针(2)，从而所述探针携带磁性或可磁化颗粒。在特定的实施方式中，传感器具备能够检测结合到反应表面的标记物的检测区 域。在进一步特定的实施方式中，所述反应表面可以处在透明材料，例如玻璃或塑料(例 如，聚苯乙烯或聚碳酸酯)中，其容许结合到附着于玻璃反应表面的探针的光学(例如，荧 光)标记物的检测。在特定的实施方式中，能够检测结合到所述反应表面的标记物的传感器仅特异性 检测紧密接近于或处于反应表面上的区域中的标记物，而不是检测靠近所述反应表面的区 域中存在的主体(bulk)溶液。如上所指出的，根据所述磁性或可磁化颗粒本身的任何性 质，传感器可以是适合于检测所述反应表面上磁性标记的核酸颗粒的存在的任何传感器， 例如，它可以通过磁方法(例如，磁阻的、Hall、线圈)、光学方法，例如FTIR(受抑的全内反 射)、声波的检测(表面声波，体声波、悬臂、石英晶体等等)或电检测(例如，传导、阻抗、电 流计、氧化还原循环)来检测。在特定的实施方式中，所述磁性颗粒通过FTIR来检测。在 此，传感器表面用对给定光谱范围的光线具有高透明度的材料制成(例如，玻璃或某些透 明塑料)。这种材料的折射率大于邻近传感器表面的样品的折射率。传感器表面以一定角 度用光束(来自，例如，激光或LED)照明，从而这完全内部反映了传感器表面和样品之间的 界面。在控制条件下，所有光线将被反射到这个界面。仅当颗粒在靠近界面处结合时(例 如，具有磁性颗粒的高指数聚苯乙烯)，全内反射通过光的吸收或散射被破坏，可以测量到 反射强度的降低。另外或作为选择，所述传感器是适合于通过例如成像、荧光、化学发光、吸收、散 射、表面细胞质基因组共振、Raman等等，或上文描述的方法之一来检测直接或间接附着其 上的标记物的传感器。在特定的实施方式中，所述第一或第二传感器能够检测超过一种标记物和/或超 过一种类型的标记物。这在此处描述的方法中进行多路化的情况中是令人感兴趣的。在进一步特定的实施方式中，反应表面和相应的第一检测区域被分格，容许在所 述反应表面上的不同区域中信号的差异化检测。这还容许在本发明的方法中的多路化。下 文详述了进行多路化的方法。利用本发明的方法多路化是通过使用附着于反应表面的不同的探针(即，针对不 同的目标)来进行的。这些探针可以被同样地标记(例如，标记物是在所有探针上存在相 同的磁性或可磁化颗粒)或不同地标记。在第一实施方式中，所述不同的探针被相同地标记(例如不同的探针被施加到反 应表面的独立的区域(例如，筛格内)，其可以由传感器在检测区域内区分。信号强度方面 的降低对筛格内的每个区域同时地(或接连地)测量。
多路化的更精致的方法利用各自具有不同的可检测标记物的不同的探针。其实例 有携带包含磁性材料和不同的荧光标记物的珠子的探针，所述标记物可以相互区别。在这 种架构中，不同的探针可以任意地附着到反应表面，在颗粒从表面释放时，在检测表面处标 记物的降低和/或在远离反应表面的第二检测区域中标记物的提高可以被检测，从而来自 不同的探针的磁性或可磁化颗粒根据不同的荧光标记物来区分。各种身体样品中目标的定性和/或定量测量已经应用于例如各种疾病如遗传性 疾病或传染性失调的诊断。对于常规分析，可以将试剂作为准备使用的反应室或反应室的部分来提供，在其 中探针、酶和缓冲剂作为干燥的或冷冻的成分保存。实现本发明的系统和方法的其他方案对于本领域技术人员是明显的。要理解的是，虽然对于根据本发明的设备已经在此讨论了优选的实施方式、特定 的结构和配置以及材料，可以进行形式和细节上各种变化和修改而不背离本发明的范围和 精神。
实施例实施例1 探针/目标结合的核酸酶依赖件检测本实施例说明了本发明的实施方式。核酸探针(2)用磁性或可磁化颗粒(3)标记 并附着到表面(4)。附图1的画面A显示了使探针⑵与包含目标核酸⑴的样品接触的 步骤。画面B显示了探针(2)与目标(1)的特异性结合。画面C显示了裂解目标和探针核 酸之间的杂化物的酶(E)的作用。探针DNA的裂解引起磁性或可磁化颗粒(即，标记物) (3)的释放。画面D到E显示了不与DNA目标结合的过量探针的结局。在探针和目标之间 不形成杂化物(画面E)。在酶(E)的作用时，不发生裂解。结果，磁性或可磁化颗粒(即， 标记物)(3)不从表面上释放(画面F)。在分析期间，磁力(F)被施加远离所述表面，从而由于酶裂解而游离的标记物被 快速和连续地从所述表面移除。实施例2 信号扩增的实时定量的检测该实施例由附图2说明。具有磁性或可磁化颗粒(3)的探针(2)附着到表面(4)， 并暴露于含有目标(1)的样品。目标(1)和探针(2)是互补的，并且相互特异性地结合。 酶(E)可以消化探针核酸(2)，但是不消化目标核酸(1)，但是仅仅是在探针结合到目标的 条件之下。在消化时，磁性或可磁化颗粒(即，标记物)(3)和原封不动的目标被释放。原 封不动的目标因而可以再次与反应表面上存在的另一个探针(2)杂化。这再次导致新的探 针对消化敏感，释放另一个标记物(3)。结果，在样品中一个单独的目标核酸的存在可以导 致几个标记物的释放。例如，可利用RNA探针和DNA目标，使用RNAse A作为酶来进行这个实施例的方法， 这种酶特异性地降解RNA:DNA杂化物中的RNA，并且将不降解DNA或未杂化的RNA。
权利要求
一种检测样品中的目标核酸分子(1)的方法，其包括步骤a)提供包含与所述目标核酸分子(1)互补的序列的核酸探针(2)，其中所述探针(2)与磁性或可磁化颗粒(3)连接，并附着到表面(4)，b)在容许所述探针(2)与所述目标核酸(1)的结合的条件下使所述样品与所述探针接触，从而形成探针/目标杂化物，c)施加或活化核酸裂解酶(E)，其区别未结合的探针和结合的探针/目标杂化物，d)至少在步骤(c)期间，施加磁场(F)以操作未结合的磁性或可磁化颗粒朝向远离所述表面的区域，e)在一个或更多个时间点检测在所述表面(4)上磁性或可磁化颗粒的浓度，和/或在远离所述表面的区域中磁性或可磁化颗粒的浓度，其中所述检测通过测量附着到所述磁性或可磁化颗粒的可检测标记物来进行。
2.根据权利要求1的方法，其中所述磁性或可磁化颗粒是包含磁性材料和荧光标记物 的颗粒。
3.根据权利要求1的方法，其中所述核酸裂解酶至少裂解所述探针/目标杂化物中的 探针。
4.根据权利要求1的方法，其中在所述核酸裂解酶之前添加切口酶。
5.根据权利要求1的方法，其中所述核酸裂解酶是形成所述探针(2)的一部分的 DNAzyme 或 RNAzyme。
6.根据权利要求1的方法，其中所述核酸裂解酶在所述目标核酸分子(1)的PCR扩增 期间被掺入到所述目标核酸分子(1)中。
7.一种用于磁性或可磁化颗粒的检测的设备，包括-反应表面(4)，-具有能够检测与所述反应表面(4)结合的标记物的第一检测区域的第一传感器 (61)，-用于施加从所述检测表面到远离所述检测表面的区域的磁场(F)的装置，-具有远离所述检测表面的第二检测区域的第二传感器(62)，和-任选地，用于将磁性或可磁化颗粒移动朝向所述第二检测区域的装置。
8.权利要求7的设备，包括反应室，其中所述反应室包括-包括所述反应表面(4)和所述能够检测结合到所述反应表面(4)的标记物的第一检 测区域的第一区域，_远离所述第一区域的第二区域，其包括能够检测所述远离第一区域的区域中的标记 物的所述第二检测区域，和-施加从所述第一区域到所述第二区域的磁场(F)的装置。
9.根据权利要求8的设备，其中所述第一和/或第二传感器能够检测不同的标记物。
10.根据权利要求9的设备，进一步包括具有附着到所述反应表面的磁性或可磁化颗 粒的多种不同的探针，其中每种探针包含不同的可检测标记物。
11.根据权利要求8的设备，其中所述第一和第二区域在所述反应室的对侧上。
全文摘要
本发明涉及用于核酸杂化的核酸酶依赖性检测的方法和工具。在这些方法中，磁性或可磁化颗粒被用于区分杂化的和未杂化的DNA。
文档编号C12Q1/68GK101855366SQ200880116004
公开日2010年10月6日 申请日期2008年11月10日 优先权日2007年11月14日
发明者W·U·迪特默 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司