在真核生物中生产二羧酸的制作方法

专利名称：在真核生物中生产二羧酸的制作方法
在真核生物中生产二羧酸本发明涉及包含下述核苷酸序列的重组真核细胞，所述核苷酸序列编码催化磷酸 烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)转化为草酰乙酸(oxaloacetate)的酶，还涉及用于生 产二羧酸的方法。4-碳二羧酸苹果酸、富马酸和琥珀酸是大量化学品的潜在前体。例如，琥珀酸可以 被转化为1，4_ 丁二醇(BDO)、四氢呋喃和γ 丁酸内酯。衍生自琥珀酸的另一产物是通过连 接琥珀酸和BDO制造的聚酯聚合物。琥珀酸主要通过丁烷氢化的石油化学方法生产。这些方法被认为是对环境有害和 昂贵的。琥珀酸的发酵生产可能是生产琥珀酸的一种吸引人的替代性方法，其中可以使用 可再生的原料如碳源。已知大量不同的细菌如Escherichia coli和瘤胃细菌Actinobacillus、 Anaerobiospirillum、Bacteroides、Mannheimia 或 Succinimonas sp.生产玻拍酸。这些 细菌菌株的代谢改造提高了琥珀酸产量和/或生产力，或者减少了副产物形成。W02007/061590公开了用于生产苹果酸和/或琥珀酸的丙酮酸脱羧酶阴性酵母， 所述酵母用丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和苹果酸转运蛋白 (MAE)转化。尽管二羧酸的发酵生产有所改进，但是仍然需要用于发酵生产二羧酸的改进的微 生物。本发明的一个目的是提供用于生产二羧酸的替代性真核微生物。根据本发明用包含下述核苷酸序列的重组真核微生物细胞实现了这一目的，所述 核苷酸序列编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸(OAA)从而产生ATP的酶，其中所述 酶包含与SEQ ID NO =USEQ ID NO :3和/或SEQ ID NO 5的氨基酸序列具有至少50%序 列同一性的氨基酸序列。优选地，所述酶具有磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性，优选地所述酶是磷酸烯醇丙酮 酸(PEP)羧激酶(E. C. 4. 1. 1. 49)。优选地，PEP羧激酶在存在可发酵的碳源或甘油时，在缺 氧或氧受限的条件下有活性。可发酵的碳源可以是葡萄糖、果糖、半乳糖、棉子糖、阿拉伯糖 或木糖。发现包含本发明的PEP羧激酶的真核细胞是有利的，因为催化PEP转化成为OAA 的PEP羧激酶固定CO2并且产生ATP形式的能量。出人意料地发现，与野生型真核细胞生产的二羧酸量相比，根据本发明的重组真 核细胞生产提高量的二羧酸，例如琥珀酸和富马酸。优选地，根据本发明的真核细胞与不 包含下述核苷酸序列的野生型真核细胞相比，生产至少1.2、优选至少1.5、1.6、1.8、优选 至少2倍的二羧酸，所述核苷酸序列编码本发明的催化磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸的 酶。优选地，根据本发明的真核微生物细胞表达下述核苷酸序列，所述核苷酸序列编 码具有PEP羧激酶活性的酶，优选如下的PEP羧激酶，其中所述PEP羧激酶包含与SEQ ID NO 1, SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO :5的氨基酸序列具有至少55%、优选地至少60%、 65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性的
3氨基酸氨基酸序列。优选地，PEP羧激酶包含SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :3和/或SEQ ID NO :5。序列同一性在本文中被定义为通过比较序列测定的两个或更多氨基酸(多肽或 蛋白质)序列或两个或更多核酸(多核苷酸)序列之间的关系。通常，在比较的序列的整 个长度上比较序列同一性或相似性。在本领域中，“同一性”也表示氨基酸或核酸序列之间 的序列相关度，根据情况通过这类序列串之间的匹配测定。测定同一性的优选方法被设计为在测试的序列之间给予最大匹配。测定同一性和 相似性的方法在公众可获得的计算机程序中编码。测定两条序列之间同一性和相似性的优 选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN，公众可从NCBI和其他来源(BLAST Manual, Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894)获得。使用 BLASTP 的氨基酸序列比 较的优选参数为缺口开放11.0，缺口延伸1，Blosum 62矩阵。编码在本发明细胞中表达的酶的核苷酸序列也可以通过它们在中度杂交条件或 优选严格杂交条件下与编码具有SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3和/或SEQ ID NO 5的PEP 羧激酶活性的酶的核苷酸序列，或与编码SEQ IDNO 14的苹果酸脱氢酶的核苷酸序列，或 与编码SEQ ID NO :16的富马酸酶的核苷酸序列杂交的能力来定义。严格杂交条件在本文 中定义为下述条件，所述条件允许至少约25个、优选至少约50个核苷酸、75或100个、优选 至少约200或更多个核苷酸的核酸序列，在约65°C的温度下，在包含约IM盐的溶液(优选 6xSSC(氯化钠、柠檬酸钠))或具有与之相当的离子强度的任何其他溶液中杂交，并在65°C 下，在包含约0. IM或更少盐、优选0. 2xSSC的溶液或具有与之相当的离子强度的任何其他 溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，并优选地至少进行1小时洗涤， 其中至少将洗涤溶液更换两次。这些条件通常会允许具有约90%或更多序列同一性的序列 的特异性杂交。中度条件在本文中定义为下述条件，所述条件允许至少50个核苷酸、优选至少约 200或更多个核苷酸的核酸序列，在约45°C的温度下，在包含约IM盐的溶液(优选6x SSC) 或具有与之相当的离子强度的任何其他溶液中杂交，并在室温下，在包含约IM盐的溶液 (优选6x SSC)或具有与之相当的离子强度的任何其他溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进 行，即至少进行10小时，并优选地至少进行1小时洗涤，其中至少将洗涤溶液更换两次。这 些条件通常会允许具有多达50%序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员应当能 够调整这些杂交条件，从而特异性地鉴定同一性在50%和90%之间变化的序列。根据本发明的重组真核微生物细胞被定义为下述细胞，所述细胞含有不天然存在 于该真核细胞中的核苷酸序列或用其转化或遗传修饰，或者含有额外的一个或多个拷贝的 内源核酸序列。野生型真核细胞在本文中被定义为重组细胞的亲本细胞。用于表示给定(重组)核酸或多肽分子和给定宿主生物或宿主细胞之间相互关系 时，术语“同源的”被理解为表示所述核酸或多肽分子天然地由相同物种的宿主细胞或生物 生产，优选由相同变种或菌株的宿主细胞或生物生产。对于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源的”是指下述核酸或蛋白质，所 述核酸或蛋白质不作为其出现的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在， 或者存在于与其天然存在的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个不同位置中。 异源核酸或蛋白质对引入它的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或合成生产或重组
4生产。在本文中使用时，术语“基因”表示含有核酸聚合酶(在真核生物中为RNA聚合酶 II)的模板的核酸序列。基因被转录为mRNA，随后被翻译为蛋白质。在本文中使用时，术语“核酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷 酸多聚体，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸主要特性的已知类似物，因 为它们能够以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如肽核酸)。多核苷酸 可以是天然或异源的结构基因或调节基因的全长或亚序列。除非另有说明，该术语包括特 定的序列及其互补序列。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，表示氨基酸残基的多聚体。 该术语适用于下述氨基酸多聚体，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸 的人工化学类似物，还适用于天然存在的氨基酸多聚体。天然存在的氨基酸的这类类似物 的关键特征是，当被引入蛋白质中时，蛋白质与下述抗体特异反应，所述抗体针对相同但是 完全由天然存在的氨基酸组成的蛋白质产生。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”也包括修饰， 所述修饰包括但不限于糖基化、脂质结合、硫酸盐化、谷氨酸残基的Y-羧基化、羟基化和 ADP-核糖基化。在本文中使用时，术语“酶”被定义为在细胞中催化(生物)化学反应的蛋白质。为了提高引入的酶在本发明的真核细胞中以活性形式表达的可能性，可以调整相 应的编码核苷酸序列，从而针对选择的真核宿主细胞优化其密码子选择。用于密码子优化 的若干方法是本领域已知的。针对根据本发明的真核细胞优化核苷酸序列密码子选择的一 种优选的方法是W02008/000632中公开的密码子对优化技术。密码子对优化是在宿主细胞 中生产多肽的一种方法，其中修饰了编码多肽的核苷酸序列的密码子选择、尤其是使用的 密码子对选择，从而获得编码多肽的核苷酸序列提高的表达和/或提高的多肽生产。密码 子对被定义为编码序列中两个相继三联体(密码子)的集合。通常，编码酶(例如具有PEP羧激酶活性的酶或本文公开的任何其他酶)的核苷 酸序列与引起相应核苷酸序列在本发明真核细胞中足量表达的启动子可操作地连接，从而 赋予所述细胞生产二羧酸的能力。在本文中使用时，“可操作地连接”是指处于功能性关系中的多核苷酸元件(或编 码序列或核酸序列)的连接。当核酸序列被放置为与另一核酸序列处于功能性关系时，其 是“可操作地连接”的。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与编码序列 可操作地连接。在本文中使用时，术语“启动子”是指下述核酸片段，其发挥控制一个或多个基因 转录的功能，就转录方向而言位于基因转录起点的上游，并且在结构上通过DNA-依赖型 RNA聚合酶结合位点、转录起点和本领域技术人员已知的任何其他DNA序列的存在而被识 别。“组成型”启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。“诱导型”启动子是 在环境或发育调节下有活性的启动子。能够用于实现编码酶(例如具有PEP羧激酶活性的酶)的核苷酸序列表达的启动 子对编码待表达的酶的核苷酸序列而言可以不是固有的，即对与之可操作地连接的核苷酸 序列(编码序列)而言异源的启动子。优选地，所述启动子对宿主细胞而言是同源的，即内 源的。
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真核宿主细胞中合适的启动子是本领域技术人员已知的。合适的启动子可以是， 但不限于 TDH、GPDA、GAL7、GALlO 或 GALl、CYCl、HIS3、ADHl、PGL、PH05、GAPDH、ADCl、TRPl、 URA3、LEU2、EN0、TPI 禾口 A0X1。其他合适的启动子包括 PDC、GPD1、PGKl 和 TEF1。通常，编码酶的核苷酸序列包含终止子。本发明中可以使用在细胞中有功能的任 何终止子。优选的终止子得自宿主细胞的天然基因。合适的终止子序列是本领域公知的。 优选地，这类终止子与下述突变组合，所述突变防止本发明宿主细胞中无义介导的mRNA衰 退(见例如 Shirley 等，2002，Genetics 161 :1465_1482)。在一个优选的实施方案中，编码酶(例如具有PEP活性的酶)的核苷酸序列被过 表达。发现过表达所述核苷酸序列时可以实现细胞对苹果酸、富马酸或琥珀酸的提高的生产。本领域有多种手段用于过表达编码酶的核苷酸序列。可以通过提高细胞中编码酶 的基因的拷贝数，例如通过在细胞的基因组中整合额外的基因拷贝，通过表达来自着丝粒 (centromeric)载体、来自附加体多拷贝表达载体的基因，或者通过引入包含多拷贝的一个 或多个基因的(附加体)表达载体，来过表达编码酶的核苷酸序列。优选地，用(强)组成 型启动子实现编码本发明酶的核苷酸序列的过表达。本发明还涉及包含选自SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 10的一种或多种核苷酸序列的核苷酸构建体。编码酶的核苷酸序列可以被连接进核酸构建体例如质粒(例如低拷贝质粒或高 拷贝质粒)中。根据本发明的真核细胞可包含单个、但是优选地包含多个拷贝的编码催化 PEP转化成为OAA的酶的核苷酸序列，例如通过多拷贝的核苷酸构建体来实现。核酸构建体可以保持为附加体，并因此包含用于自主复制的序列，例如常染色体 复制序列。如果真核细胞是真菌来源的，则合适的附加体核酸构建体可例如基于酵母2 μ 或 pKDl 质粒(Gleer 等，1991，Biotechnology 9:968-975)或 AMA 质粒(Fierro 等，1995， Curr Genet. 29 :482-489)。或者，可以将每种核酸构建体以一个或多个拷贝整合进真核细 胞的基因组中。进入细胞基因组的整合可以通过非同源重组随机发生，但是优选地，可以如 本领域所公知的，通过同源重组将核酸构建体整合进细胞的基因组中。在一个优选的实施方案中，根据本发明的真核微生物细胞包含具有PEP羧 激酶活性的酶，其中所述酶是异源酶，优选地所述异源酶来自细菌，更优选地所述具 有 PEP 羧激酶活性的酶来自于 Escherichia coli、Mannheimia sp.、Actinobacillus sp.或 Anaerobiospirillum sp.,更优选地来自于 Mannheimia succiniciproducens、 Actinobacillus succinogenes 或 Anaerobiospirillum succiniciproducens。在一个优选的实施方案中，编码在根据本发明的真核细胞中具有PEP羧激酶活性 的酶的核苷酸序列在胞质溶胶中表达。令人惊讶的是，酶的胞质溶胶活性导致真核细胞对 二羧酸的生产提高。发现编码具有PEP羧激酶活性的酶的核苷酸序列可包含过氧化物酶体或线粒体 靴向信号，例如通过 SchlUter 等，Nucleic acid Research 2007，Vol25，D815-D822 所公开 的方法所测定。发现来自Actinobacillus succinogenes的PEP羧激酶包含过氧化物酶体靶向信 号。惊讶地发现，用来自Mannheimia succiniproduces的PEP羧激酶中相应的基序(motif)
6替换过氧化物酶体靶向信号时，过氧化物靶向被阻止。优选地，根据本发明的真核细胞表达编码具有PEP羧激酶活性的酶的核苷酸序 列，其中所述酶是PEP羧激酶，包含与SEQ ID NO :3和/或SEQID NO 5的氨基酸序列具有 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98% 或 99%序列同 一性的氨基酸序列。优选地，PEP羧激酶包含SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO :5。在一个实施方案中，优选根据本发明的真核细胞中，催化OAA转化成PEP的固有或 内源或同源酶的活性被降低或完全敲除。敲除或降低催化OAA转化成为PEP的酶活性的方 法是本领域技术人员已知的。这可例如通过对编码具有PEP羧激酶活性的酶的核苷酸序列 进行突变、断裂或缺失来实现。为了阻止OAA成为PEP的逆反应发生，优选降低固有PEP羧 激酶活性。根据本发明的真核微生物细胞优选地选自由酵母和丝状真菌组成的组。真核细胞 优选地属于以下属Saccharomyces、Aspergillus、Penicillium、Pichia、Kluyveromyces> Yarrowia> Candida、Hansenula、Humicola、Torulaspora、Trichosporon、Brettanomyces、 Rhizopus>Zygosaccharomyces>PachysoIen gJc Yamadazyma0 itifeiiil，^t^ifflIfiMT-^T"ft Saccharomyces cervisiae>Saccharomyces uvarum>Saccharomycesbayanus>Aspergi1Ius niger、Penicillium chrysogenum、P. symplissicum、Pichia stipidis、Kluyveromyces marxianus、K. lactis、K. thermotolerans、Yarrowia lipolytica、Candida sonorensis、 C.glabrata、 HansenuIapolymorpha> Torulaspora delbrueckii、 Brettanomyces bruxellensis> Rhizopusorizae gJc Zygosaccharomyces bailii。优选地，根据本发明的真核细胞是酵母，优选地为Saccharomycescerevisiae，优 选地为包含一个或多个选自SEQ ID NO :9和SEQ ID NO 10的核苷酸序列的Saccharomyces cerevisiae。真核细胞也可以是丝状真菌，优选地为A. niger，优选地为包含一个或多个选 自SEQ ID NO 7和SEQ IDNO 8的异源核苷酸的A. niger。除了编码具有PEP羧激酶活性的核苷酸序列以外，根据本发明的真核细胞还可以 用编码同源或异源的下述酶的核苷酸序列遗传修饰或转化，所述酶在细胞中催化反应，导 致提高的朝向苹果酸、富马酸和/或琥珀酸的通量。例如可有利地引入和/或过表达下述 核苷酸序列，所述核苷酸序列取决于要生产的二羧酸而编码i)催化OAA转化成为苹果酸的 苹果酸脱氢酶；ii)催化苹果酸转化成为富马酸的富马酸酶；或iii)催化富马酸转化成琥 珀酸的富马酸还原酶。优选地，根据本发明的真核细胞过表达下述核苷酸序列，所述核苷酸序列编码丙 酮酸羧化酶(PYC)，优选地编码在核苷酸序列表达后在胞质溶胶中有活性的丙酮酸羧化酶， 例如包含根据SEQ ID NO :26的氨基酸序列的丙酮酸羧化酶。优选地，过表达内源或同源的 丙酮酸羧化酶。惊讶地发现，过表达内源丙酮酸羧化酶导致根据本发明的包含本文所述磷 酸烯醇丙酮酸羧激酶的真核细胞具有提高的琥珀酸生产水平。发现丙酮酸羧化酶和磷酸烯 醇丙酮酸羧激酶的并行(过)表达导致与本文所述的包含丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇丙酮酸 羧激酶之任一的真核细胞相比，令人惊讶的琥珀酸生产水平的至少1. 5倍的提高。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的细胞还包含下述核苷酸序列，所述核 苷酸序列编码在核苷酸序列表达后在胞质溶胶中有活性的苹果酸脱氢酶(MDH)。胞质溶胶 MDH可以是任何合适的同源或异源苹果酸脱氢酶。优选地，所述MDH是S. cerevisiae MDH,
7例如MDH3或MDHl。优选地，所述MDH缺乏过氧化物酶体或线粒体靶向信号，从而将酶定位 于胞质溶胶中。或者，所述MDH是已经修饰的S. cerevisiae MDH，从而其在存在葡萄糖时不 失活，并且在胞质溶胶中有活性。已知向葡萄糖_饥饿的细胞中添加葡萄糖后MDH2的转录 被阻抑并且Mdh2p降解。12个氨基端氨基酸缺失的Mdh2p对葡萄糖诱导的降解更不易感 (Minard和 McAlister-Henn，J Biol Chem. 1992Aug 25 ；267 (24) 17458-64)。优选地，根据 本发明的真核细胞包含编码下述苹果酸脱氢酶的核苷酸序列，所述苹果酸脱氢酶与SEQ ID NO 14的氨基酸序列具有至少70%，优选地至少75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、 96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。优选地，通过本领域已知的方法过表达编码 核苷酸序列，来提高苹果酸脱氢酶的活性。优选地，根据本发明的真核细胞还包含编码催化苹果酸转化成富马酸的酶的核苷 酸序列，所述酶可以是异源或同源酶。催化苹果酸转化成富马酸的酶(例如富马酸酶)可来 自于任何合适的来源，优选地来自微生物来源，例如酵母如Saccharomyces或丝状真菌如 Rhizopus oryzae。优选地，根据本发明的真核细胞包含编码下述富马酸酶的核苷酸序列， 所述富马酸酶与SEQ ID NO :16的氨基酸序列具有至少70%，优选地至少75%、80%、85%、 90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性，优选地为包含 SEQ ID NO 16 的富马酸酶。优选地，核苷酸序列表达后，催化苹果酸转化成富马酸的酶在胞质溶胶中有活性。 就真核细胞对二羧酸的高生产力而言，具有富马酸酶活性的酶的胞质溶胶活性是优选的。 在本发明中，编码具有富马酸酶活性的酶的核苷酸序列包含过氧化物酶体或线粒体靶向信 号(例如通过 SchlUter 等，Nucleic acid Research 2007, Vol 25，D815-D822 所公开的方 法测定)，可以优选缺失所述靶向信号，将具有富马酸酶活性的酶定位于胞质溶胶中。优选 地，通过本领域已知的方法过表达编码催化苹果酸转化成富马酸的酶的核苷酸序列。优选地，根据本发明的细胞是其中至少一种编码醇脱氢酶的基因没有功能的细 胞。无功能的醇脱氢酶在本文中用于描述下述真核细胞，其与所有编码醇脱氢酶的基因都 有功能的细胞相比包含降低的醇脱氢酶活性。可以通过本领域已知的方法，例如通过突变、 断裂或缺失，例如通过 Gueldener 等 2002，Nucleic Acids Research, Vol. 30, No. 6，e23 所 公开的方法，使基因变得没有功能。优选所述细胞是Saccharomyces cerevisiae，其中编码 醇脱氢酶的一个或多个基因adhl和/或adh2失活。优选地，根据本发明的细胞还包含至少一种编码无功能的甘油-3-磷酸脱氢酶的 基因。无功能的甘油-3-磷酸脱氢酶在本文中用于描述下述真核细胞，其中例如通过突变、 断裂或缺失编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因而包含降低的甘油-3-磷酸脱氢酶活性，导致 与野生型酵母相比降低的甘油形成。在另一个优选的实施方案中，根据本发明的重组真核细胞包含至少一种编码没有 功能的琥珀酸脱氢酶的基因。无功能的琥珀酸脱氢酶在本文中用于描述下述真核细胞，其 通过突变、断裂或缺失至少一种编码琥珀酸脱氢酶的基因而包含降低的琥珀酸脱氢酶活 性，导致与野生型细胞相比提高的琥珀酸形成。包含编码无功能琥珀酸脱氢酶的基因的真 核细胞可以例如是Aspergillus niger，优选地为其中一个或多个编码琥珀酸脱氢酶的基 因(例如 sdhA)没有功能的 Aspergillusnus niger。优选地，包含本文所述任一遗传修饰的本发明真核细胞能够生产至少0. 3,0. 5、
80. 7g/L的琥珀酸，优选地至少lg/L的琥珀酸，优选地至少1. 5g/L，优选地至少2g/L或2. 5、 4. 5g/L，优选地至少8、10、15或20g/L的琥珀酸，但是通常低于200g/L或低于150g/L。根据本发明的优选的真核细胞可以能够在本领域已知的任何合适碳源上生长，并 如前文所述将其转化为期望的二羧酸。真核细胞可以能够直接转化植物生物质、纤维素、 半纤维素、果胶、鼠李糖、半乳糖、岩藻糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍 生物、蔗糖、乳糖和甘油。因此，一种优选的宿主生物表达能将纤维素转化为葡萄糖单体和 将半纤维素转化为木糖和阿拉伯糖单体的酶，例如纤维素酶(内切纤维素酶和外切纤维素 酶)和半纤维素酶(例如内切和外切木聚糖酶、阿拉伯糖酶)，能够将果胶转化为葡糖醛酸 和半乳糖醛酸的果胶酶，或将淀粉转化成葡萄糖单体的淀粉酶。优选地，细胞能够转化选自 下组的碳源，所述组由葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、棉子糖和甘油组 成。在另一方面中，本发明涉及用于制备二羧酸的方法，包括在合适的发酵培养基中 发酵根据本发明的真核细胞并制备二羧酸。发现在生产二羧酸如琥珀酸的方法中，使用上 文定义的真核细胞是有利的，因为大部分真核细胞的繁殖不需要无菌条件，并且对噬菌体 感染不敏感。根据本发明的方法可以在需氧和缺氧的条件下进行。优选地，所述方法在缺氧 条件下或微需氧或氧受限的条件下进行。缺氧发酵方法在本文中被定义为下述发酵方法， 其在无氧情况下进行，或其中基本无氧(优选地少于5、2. 5或lmmol/L/h)被消耗，并且其 中有机分子发挥电子供体以及电子受体两种作用。氧受限的发酵方法是其中氧消耗受从气体到液体的氧转移限制的方法。氧限制程 度由进入气流的量和组成以及使用的发酵装置的实际混合/物质转移性能决定。优选地， 在氧受限条件下的方法中，氧消耗速率至少为5. 5mmol/L/h，更优选地至少为6mmol/L/h， 甚至更优选地至少为7mmol/L/h。根据本发明的用于生产二羧酸的方法可以在1和9之间的任何合适的pH下进行。 优选地，发酵液中的pH在2和7之间，优选地在3和5之间。发现能够在低pH下进行根据 本发明的方法是有利的，因为这防止细菌污染并且在二羧酸的生产过程中将PH保持在期 望水平需要更少量的滴定剂。可以进行根据本发明的方法的合适温度在5°C和60°C之间，优选地在10°C和50°C 之间，更优选地在15°C和35°C之间，更优选地在18°C和30°C之间。本领域技术人员已知用 于发酵特定真核细胞的最适温度。在根据本发明的方法中生产的二羧酸可以是琥珀酸、富马酸或苹果酸，优选地为 琥珀酸。优选地，通过本领域已知的合适方法，例如通过结晶、铵沉淀或离子交换技术，从 发酵液中回收二羧酸。优选地，在根据本发明的方法中制备的二羧酸被进一步转化成期望的产物，例如 药物、化妆品、食物、饲料或化学制品。在生产琥珀酸的情况下，琥珀酸可以被进一步转化成 聚合物，例如聚丁二酸丁二醇酯(PBS)或由其衍生的任何合适的聚合物。本发明还涉及包含能够通过根据本发明的方法获得的二羧酸的发酵液。本发明涉及用于生产二羧酸的方法，其中使用真核细胞作为二羧酸生产者，其 中使用磷酸烯醇丙酮酸羧激酶来提高二羧酸生产，优选地其中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶在
9胞质溶胶中有活性。优选地所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶是优选地来自Actinobacillus succinogenes 或 Mannheimiasucciniciproducens 的异源酶。遗传修饰标准的遗传技术例如宿主细胞中酶的过表达、宿主细胞的遗传修饰或杂交技 术是本领域已知的方法，例如如Sambrook和Russel(2001) “ Molecular Cloning :A Laboratory Manual (第三版)，Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press 或 F. Ausubel 等编，"Currentprotocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience，NewYork(1987)中所述。用于真菌宿主细胞 转化、遗传修饰等等的方法从 EP-A-0635574、WO 98/46772、WO 99/60102 和 WO 00/37671、 W090/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574 和 US 6，265，186 中已知。附图描述

图1 用于在A. niger中表达磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pGBTOP-ll载体的图谱。图 2 用于在 Saccharomyces cerevisiae 中表达的 pGB414SUS_01 的质粒图谱，其 编码来自Actinobacillus succinogenes的PEP羧激酶。CPO代表经密码子对优化的。图 3 用于在 Saccharomyces cerevisiae 中表达的 pGB414SUS_04 的质粒图谱，其 编码来自Mannheimia succiniciproducens的PEP羧激酶。CPO代表经密码子对优化的。图4 :pDEL-SDHA的质粒图谱。图5 =SdhA的替换示意图。图6 :PGBT0PAn5的图谱，其中组成型启动子gpdA驱动PCKa的表达。使用Gla侧 翼用于整合。通过NotI消化去除E. coli DNA。图7 :PGBT0PAn6的图谱，其中组成型启动子gpdA驱动PCKm的表达。使用Gla侧 翼用于整合。通过NotI消化去除E. coli DNA。图 8 用于在 Saccharomyces cerevisiae 中表达的 pGBS416PPK_l 的质粒图谱，其 编码来自Actinobacillus succinogenes的PEP羧激酶。CPO代表经密码子对优化的。图 9 用于在 Saccharomyces cerevisiae 中表达的 pGBS416PEK_l 的质粒图谱，其 编码来自Mannheimia succiniciproducens的PEP羧激酶。CPO代表经密码子对优化的。图 10 用于在 Saccharomyces cerevisiae 中表达的 pGBS415FUM_3 的质粒图谱， 胃 自 Rhizopus oryzaeSl Bl (FUMR)禾口 * 自 Saccharomyces cerevisiae 白勺 氧化物酶体苹果酸脱氢酶(MDH3)。将合成基因构建体TDH 1启动子-FUMR-TDH1终止子和 TDH3启动子-MDH3-TDH3终止子克隆进表达载体pRS415中。CPO代表经密码子对优化的。图11 菌株 SUC-IOl (〇，空载体对照)、SUC-152 ( □，PCKa、MDH3、FUMR 的过表达)、 SUC-154( _，PCKm、MDH3、FUMR)中的琥珀酸(虚线)和富马酸(实线)水平。所有过表达 的基因针对在S. cerevisiae中的表达进行了密码子对优化。所有数据代表SUC-152的3 个独立生长实验和SUC-154的2个独立生长实验的均值和标准差，以及SUC-IOl的6个独 立生长实验的均值和标准差。图 12 用于在 Saccharomyces cerevisiae 中表达的pGBS414PPK_3 的质粒图谱，其 -^WJfe S Actinobacillus succinogenes 白勺 PEP(PCKa)禾口* 自 Trypanosomii brucei 的糖酵解酶体富马酸还原酶(FRDg)。将合成基因构建体TDH 1启动子-PCKa-TDHl终止子 和TDH3启动子-FRDg-TDH3终止子克隆进表达载体pRS414中。
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图 13 用于在 Saccharomyces cerevisiae 中表达的 pGBS426PYC_2 的质粒图谱， 其含有来自Saccharomyces cerevisiae的丙酮酸羧化酶。使用来自菌株CEN. PK113-OT的 基因组DNA作为模板，通过PCR获得编码PYC2的核苷酸序列，并将PCR产物克隆进表达载 体 p426GPD 中。图 14 用于在 Saccharomyces cerevisiae 中表达的 pGBS414FRE_l 的质粒图谱， 其编码来自Trypanosoma brucei的糖酵解酶体富马酸还原酶(FRDg)。将合成基因构建体 TDH3启动子-FRDg-TDH3终止子克隆进表达载体pRS414中。图 15 菌株 SUC-226 ( □，PCKa, MDH3、FUMR、FRDg)、-227 ( ▲, PYC2、PCKa, MDH3、 FUMR、FRDg)、SUC-228 ( ■，PYC2、MDH3、FUMR、FRDg)和 SUC-230 (0，MDH3、FUMR、FRDg)中的 琥珀酸水平。数据代表3个独立生长实验的均值。以下实施例仅用于阐述的目的，不应被理解为限制本发明。
实施例实施例1在 AsperRillus niRer 中克隆 来自 Actinobacillus succinoRenes 禾口 MannheimiasucciniciproducensIlItMiI1. 1.表达构建体使 用 SignalP 3. O (http//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)(Bendtsen, J.等(2004)Mol.Biol.,340 783-795)禾口 TargetP 1. 1 (http://www. cbs. dtu. dk/ services/TargetP/)(Emanuelsson, 0.等(2007)NatureProtocols 2,953-971)针对 信号序列的存在分析来自Actinobaci llussuccinogenes的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶 [E. C. 4. 1. 1. 49] (GenBank 查询号 152977907)。Schluter 等，(2007) NAR, 35, D815-D822 所 述分析揭示了 115-123位上推定的PTS2信号序列。通过用DAF替换120-122位上的氨基酸 EGY (氨基酸序列SEQ ID NO 3 ；核苷酸序列SEQ ID NO 4)来修饰A. succinogenes序列(氨 基酸 SEQ ID NO :1，核苷酸序列 SEQ ID NO :2)，使其与 Mannheimia succiniciproducens 蛋白质序列相似。对序列SEQID NO 3进行如W02008/000632中针对A. niger所公开的密 码子对方法。将得到的序列SEQ ID NO 7置于组成型GPDA启动子序列SEQ ID NO :11之 后，其中至少10个核苷酸的序列被替换为最优的Kozak序列CACCGTAAA。添加便利的限制 性位点。得到的序列在Sloningpuchheim，德国)合成。片段是使用合适的限制性位点在 A. niger表达载体pGBTOPll (见图1)中克隆的SnaBI、Sfil。类似地，如Schluter 等，(2007)NAR，35，D815-D822 所述分析来自 Mannheimia succiniciproducens的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶[E. C. 4. 1. 1. 49] (GenBank查询号 52426348)中信号序列的存在。如SEQ ID NO :5 (核苷酸序列SEQ ID NO 6)中所示序列 不需要修饰。随后对序列进行如W02008/000632中针对A. niger所公开的密码子对方法。 将得到的序列SEQ ID NO 8置于组成型GPDA启动子序列SEQ ID NO 11之后，并添加便利 的限制性位点。得到的序列在Sloningpuchheim，德国)合成。片段是使用合适的限制性 位点在A. niger表达载体pGBTOPll (见图1)中克隆的SnaBI、Sfil。将PCKa基因克隆进 pGBTOPll中后，将载体重新命名为pGBT0PAn5(图6)。将PCKa基因克隆进pGBTOPll中后， 将载体重新命名为pGBT0PAn6 (图7)。
1. 2. A. niger 的转化A. nigerWT-Ι 该A. niger菌株是包含编码葡糖淀粉酶(glaA)、真菌淀粉酶和酸 性淀粉酶的基因缺失的CBS513.88。通过使用如EP 0635574B1中所述的“无标记物基 因”(〃 MARKER-GENE FREE")途径构建 A. nigerWT-1。根据Tilburn, J.等(1983) Gene 26，205-221 和 Kelly, J. &Hynes, Μ. (1985) EMBO J.，4，475-479中所述方法，使用以下修饰用表达构建体共转化菌株A. niger WT-I 在Aspergillus最小培养基(IOOml)中，在置于300rpm旋转摇床中的摇瓶中，在 30°C下使孢子萌发并培养16小时。每升Aspergillus最小培养基含有6g NaN03>0. 52g KCl、1.52g KH2PO4U. 12ml 4M Κ0Η、0· 52gMgS04 · 7H20、IOg 葡萄糖、Ig 水解酪蛋白氨基酸、 22mg ZnSO4 · 7H20、llmg H3BO3>5mg FeSO4 · 7Η20、1· 7mg CoCl2 · 6Η20、1· 6mgCuS04 · 5H20、5mg MnCl2 · 2H20、1. 5mg Na2MoO4 · 2H20、50mg EDTA、2mg 核黄素、2mg 硫胺 _HCl、2mg 烟酰胺、Img 吡哆醇-HCL、0. 2mg泛酸、4g生物素、IOml青霉素(5000IU/ml)、链霉素(5000UG/ml)溶液 (Gibco) ο-使用Novozym234 (Novo Industries)代替螺旋酶来制备原生质体；-原生质体形成(60-90分钟)后，添加KCl缓冲液(0.8M KC1、9. 5mM柠檬酸， PH 6.2)至45ml的终体积，将原生质体悬浮液在4°C下于摆动桶转子(swinging-bucket rotor)中3000rpm离心10分钟。将原生质子重悬于20ml KC缓冲液中，随后添加25ml STC 缓冲液(1. 2M山梨糖醇、IOmM Tris-HCl pH 7. 5,50mM CaCl2)。将原生质体悬浮液在4°C下 于摆动桶转子中3000rpm离心10分钟，在STC-缓冲液中洗涤，并以10E8原生质体/ml的 浓度重悬于STC-缓冲液中；-向200微升原生质体悬浮液中，添加溶于100微升TE缓冲液(IOmMTris-HCl pH 7. 5,0. ImM EDTA)中的 DNA 片段和 100 微升 PEG 溶液(20% PEG 4000 (Merck)、0. 8M 山梨糖 醇、IOmM Tris-HCl pH 7. 5、50mM CaCl2)。-将DNA-原生质体悬浮液在室温下孵育10分钟后，缓慢添加1.5mlPEG溶液(60% PEG 4000 (Merck) UOmM Tris-HCl pH 7. 5、50mMCaCl2)，期间重复进行管的混合。在室温下 孵育20分钟后，将悬浮液用5mll. 2M山梨糖醇稀释，通过翻转混合，并在室温下于4000rpm 离心10分钟。将原生质体柔和地重悬于lmll. 2M山梨糖醇中，并置于固体选择性再生培养 基上，所述再生培养基由不含核黄素、硫胺、HC1、烟酰胺、吡哆醇、泛酸、生物素、水解酪蛋白 氨基酸和葡萄糖任一的Aspergillus最小培养基组成。在乙酰胺选择的情况下，培养基含 有IOmM乙酰胺作为唯一氮源，含有IM蔗糖作为渗压剂和C-源。或者将原生质体涂布在下 述PDA (马铃薯葡萄糖琼脂，Oxoid)上，所述PDA补充有1-50微克/ml腐草霉素和IM蔗糖作 为渗压剂。使用2%琼脂(琼脂No. l,0xoid Lll)固化再生平板。在30°C孵育6-10天后，将 转化体的分生孢子转移至含有含2%葡萄糖和1.5%琼脂糖(Invitrogen)的Aspergillus 选择性培养基(在乙酰胺选择的情况下含有乙酰胺作为唯一氮源的最小培养基，或在腐草 霉素选择的情况下补充有1-50微克/ml腐草霉素的PDA)的平板上，并在30°C下孵育5_10 天。分离单个转化体并将该选择性纯化步骤重复一次，之后储藏经纯化的转化体。1. 3. A. niger 的摇瓶生长对每个构建体而言总计选择10个转化体，使用构建体特异性引物通过PCR证实构 建体的存在。随后将孢子接种于IOOml含100g/l葡萄糖的[rAspergillus最小富集培养
12基中。在34°C下将菌株在250rpm的培养箱中培养4天。通过HPLC分析培养基上清液的草 酸、苹果酸、富马酸和琥珀酸形成，并与未经转化的菌株比较。1. 4HPLC 分析进行HPLC来测定不同种类样品中的有机酸和糖。Phenomenex Rezex-RHM-单糖柱 上的分离原则基于使用反相机制的离子交换、离子排除和尺寸排除。检测通过示差折射系 数(differential refractive index)检测器和紫外检测器进行。实 M #ll 2A ^h Saccharomyces cerevisiae 巾 # 帛 ^fe 自 ActinobacillussuccinoRenes 或 Mannheimia succiniciproducens 的碟酸烯酉享丙酮酸豫激酶。2A. 1.表达构建体如§ 1. 1中所述分析来自Actinobacillus succinogenes的磷酸烯醇丙酮酸羧 激酶[E. C. 4. 1. 1. 49] (GenBank查询号152977907)中信号序列的存在。对SEQ ID NO 3进行如W02008/000632中针对S. cerevisiae所公开的密码子对方法。将得到的序列 SEQ ID NO :9置于组成型TDHl启动子序列SEQ ID NO :12之后和TDHl终止子序列SEQ ID NO :13之前，并添加便利的限制性位点。得到的序列在Sloningpuchheim，德国)合 成。BamHI/NotI 限制性消化 S. cerevisiae 表达载体 pRS414 (Sirkoski R. S. andHieter P, Genetics, 1989,122(1) 19-27)并随后在该载体中连接由磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(来源 Actinobacillus succinogenes)合成基因构建体组成的BamHI/NotI限制性消化片段，创 建表达载体PGBS414SUS-01 (图2)。使用连接混合物转化E. coli DH IOB (Invitrogen)，得 到酵母表达构建体PGBS414SUS-01 (图2)。如§ 1. 1中所述鉴定和修饰来自Mannheimia succiniciproducens的磷酸烯 醇丙酮酸羧激酶[E. C. 4. 1. 1. 49] (GenBank查询号52426348)。对SEQID NO :5进行如 W02008/000632中针对S. cerevisiae所公开的密码子对方法。将得到的序列SEQ ID N0: 10置于组成型TDHl启动子序列SEQ IDNO 12之后和TDHl终止子序列SEQ ID NO 13之 前，并添加便利的限制性位点。得到的序列在Sloningpuchheim，德国)合成。BamHI/ NotI 限制性消化 S. cerevisiae 表达载体 pRS414 (Sirkoski R. S. and Hieter P, Genetics, 1989，122(1) 19-27)并随后在该载体中连接由磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(来源Marmheimia succiniciproducens)合成基因构建体组成的BamHI/NotI限制性消化片段，创建表达载体 pGBS414SUS-04(图3)。使用连接混合物转化E. coli DH IOB (Invitrogen)，得到酵母表达 构建体 PGBS414SUS-04(图 3)。2A. 2.转化和摇瓶生长将构建体pGBS414SUS-01 和 pGBS414SUS_04 独立地转化进 S. cerevisiae 菌株 CEN. PKll3-6B(MATA ura3_521eu2_l12trpl_289)、RWB066 (MATA ura3-521eu2-l12trpl -289adhl::Iox adh2::Kanlox)和 RWB064(MATA ura3_521eu2_l12trpl_289adhl::Iox adh2::lox gpdl::Kanlox)中。将转化混合物涂布在补充有适当氨基酸的酵母氮基(YNB) w/o AA(Difco)+2%葡萄糖上。将转化体接种于包含葡萄糖、补充有适当氨基酸的Verduyn 培养基(Verduyn等，1992，Yeast. Jul ；8(7) :501_17)中，并在摇瓶中于需氧、缺氧和氧受限 条件下生长。用于缺氧培养的培养基补充有溶于乙醇中的0.42g/l Tween 80和0.01g/l麦 角固醇(Andreasen 禾口 Stier, 1953，J. cell. Physiol, 41, 23-36 ；Andreasen 禾口 Stier, 1954，
13J. Cell. Physiol,43 :271_281)。所有酵母培养物在30°C下于250_280rpm的摇动培养箱中 生长。在不同的孵育时间取出培养物的小份试样，离心并如章节1. 4中所述通过HPLC分析 草酸、苹果酸、富马酸和琥珀酸形成。实施例2B在 Saccharomyces cerevisiae 中克隆来自 Actinobacillus succinoRenes 或 Mannheimia succiniciproducens 白酉享ΜΒΜΙΙ·ΜΙΙ。2Β. 1.表达构建体以与实施例2Α. 1中所公开相似的方式，将PCKa基因(SEQ ID NO 9)连接到 S. cerevisiae 表达载体 pRS416 (Sirkoski R. S.和 Hieter P, Genetics, 1989,122(1) 19-27)中。使用连接混合物转化E. coli TOPlO细胞(Invitrogen)，得到酵母表达构建体 PGBS416PPK-1 (图 8)。类似地，将PCKm基因(SEQ ID NO 10)连接进pRS416中。使用连接混合物转化 E.coli TOPlO 细胞(Invitrogen)，得到酵母表达构建体 pGBS416PEK-l (图 9)。2B. 2.转化和微量滴定板(MTP' s)生长实验将构建体pGBS416PPK-l 和 pGBS416PEK_l 独立地转化进 S. cerevisiae 菌株 CEN. PK113-5D(MATA ura3_52)中。作为阴性对照，将空载体pRS416转化进菌株CEN. PK 113-5D 中。将转化混合物涂布在酵母氮基(YNB)w/o AA(Difco)+2%葡萄糖上。将以下数量的各转 化体一式两份(in duplo)接种于96深孔MTP中250微升包含2%葡萄糖的Verduyn培养 基中，并在30°C、550rpm和80 %的湿度下，在Infors微量培养板摇动培养箱中预培养12 个 pGBS416PPK-l (PCKa)、12 个 pGBS416PEK_l (PCKm)和 24 个 pRS416 空载体对照转化体。3 天后将MTP孔中存在的25微升预培养物转移至含有Verduyn培养基的新的96深孔MTP中， 所述Verduyn培养基含有葡萄糖和CaCO3 (终浓度250微升总体积中葡萄糖10%，CaCO3I % w/v)。在30°C、550rpm和80%湿度下在Infors微量培养板摇动培养箱中生长3天和7天 后，将MTP以2000rpm离心2分钟，使用Multimek 96 (Beckman)收获200微升上清液，并如 实施例1.4中所述通过HPLC分析上清液中琥珀酸的存在。结果展示于表2中。表1.与包含空载体PRS416的对照菌株相比，在S. cerevisiae中插入PCKa和PCKm 对培养7天后琥珀酸生产水平的影响。
包含以下质粒的S. cerevisiae菌株CEN. PK113-5D 琥珀酸(mg/1)PRS416203 士 48 (η = 48)PGBS416PPK-1(PCKa)259 士 63 (η = 24)PGBS416PEK-1(PCKm)268 士 49 (η = 24) 表1中的结果显示，引入并过表达来自Actinobacillus succinogenes 或Mannheimia succiniciproducens的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶导致3天的孵育后 S. cerevisiae中提高的琥珀酸生产水平(分别为1. 28倍ρ = 4. 92Ε-，和1. 32倍，ρ = 2. 95Ε-6，学生t-检验)。
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实施例2C在 Saccharomyces cerevisiae 中克隆来自 Actinobacillus succinoRenes 或Mannheimia succiniciproducens的磷酸摇醇丙酮酸豫激酶禾口来自Saccharomyces cerevisiae的苹果酸脱氢酶2C. 1.基因序列磷酸烯醇丙酮酸羧激酶如2A. 1所述设计和合成来 自A. succinogenes (PCKa)和 M. succiniciproducens (PCKm)的 PEP 羧激酶的基因序列。苹果酸脱氢酶使用具有真菌特异性预测功能的PTSl预测器http //mendel. imp. ac. at/ mendel jsp/sat/ptsl/PTSlpredictor. jsp分析过氧化物酶体苹果酸脱氢酶(Mdh3) [Ε. C. 1. 1. 1.37] (GenBank查询号1431095)在丝状真菌中的过氧化物酶体靶向。去除 341-343位的C-端氨基酸(SKL)，得到蛋白质SEQ ID Ν0:14。对SEQ ID Ν0:14进行如 W02008/000632中针对S. cerevisiae所公开的密码子对方法，得到SEQ ID NO :15。将SEQ ID N0:15中的终止密码子修饰为TAAG。将含有TAAG作为终止密码子的核苷酸序列SEQ ID NO 15合成在组成型TDH3启动子序列SEQ ID NO 18(起始密码子上游600bp)之后和TDH3 终止子序列SEQ ID而19(终止密码子下游30(^ )之前，并添加便利的限制性位点。合成 构建体 TDH3p-MDH3-TDH3t (SEQ ID NO 20)在 Sloning (Puchheim，德国)合成。富马酸酶使 用 SignalP 3. O (http//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)(Bendtsen, J.等(2004)Mol. Biol. ,340 783-795)禾口 TargetP 1. 1 (http://www. cbs. dtu. dk/ services/TargetP/)(Emanuelsson, 0.等(2007)NatureProtocols 2，953-971)针对信 号序列的存在来分析来自Rhizopus oryzae的富马酸酶[E. C. 4. 2. 1. 2] (GenBank查询号 469103)。鉴定了蛋白质最初23个氨基酸中推定的线粒体靶向序列。为了避免 S. cerevisiae中可能的到线粒体的靶向，去除最初23个氨基酸得到SEQ IDNO :16并重新引 入甲硫氨酸氨基酸。如W02008/000632中针对S. cerevisiae所公开的，对SEQ ID NO 16 进行密码子对方法，得到核苷酸序列SEQ ID N0:17。将SEQ ID NO 17中的终止密码子修 饰为TAAG。将含有TAAG作为终止密码子的核苷酸序列SEQ ID NO 17合成在组成型TDHl 启动子序列SEQ ID N0:12之后和TDHl终止子序列SEQ ID NO 13之前，并添加便利的限 制性位点。合成构建体 TDHlp-FumR-TDHlt (SEQID NO 21)在 Sloning(Puchheim，德国)合 成。2C. 2.表达构建体的构建BamHI/NotI 限制性消化 S. cerevisiae 表达载体 pRS415 (Sirkoski R. S. and Hieter P，Genetics，1989，122 (1) 19-27)并随后在该载体中连接由富马酸酶(来源 Rhizopus oryzae)合成基因构建体(SEQ ID NO 21)组成的BamHI/NotI限制性消化片段， 创建表达载体PGBS415FUM-3 (图10)。使用连接混合物转化E. coli T0P10 (Invitrogen)， 得到酵母表达构建体PGBS415FUM-1。随后用AscI和NotI限制性消化pGBK415FUM_l。为 了得到PGBS415FUM-3，将由来自S. cerevisiae的过氧化物酶体苹果酸脱氢酶(MDH3)合成基因构建体(SEQ ID NO 20)组成的AscI/NotI限制性消化片段连接进经限制性消化的 PGBS415FUM-1载体中。使用连接混合物转化E. coli T0P10 (Invitrogen)，得到酵母表达构 建体 PGBS415FUM-3 (图 10)。表达构建体pGBS414SUS-01和pGBS414SUS_04的构建描述于实施例2A. 1中。2C. 3. S. cerevisiae ^^将质粒pGBS414SUS-01、pGBS415FUM_3 和 pRS416 转化进 S. cerevisiae 菌 株 CEN. PK113-6B(MATA ura3-521eu2-112trpl-289)中，得到菌株 SUC-152。将质粒 PGBS414SUS-04、pGBS415FUM_3 和 pRS416 转化进 S. cerevisiae 菌株 CEN. PK113-6B (MATA ura3-521eu2-112trpl-289)中，得到菌株 SUC-154。通过转化 pRS414、pRS415 和 pRS416 得 到仅过表达空载体的对照菌株(SUC-101)。所有基因已针对在S. cerevisiae中的表达进 行了密码子对优化。通过电穿孔将表达载体转化进酵母中。将转化混合物涂布于酵母氮基 (YNB) w/o AA(Difco)+2%葡萄糖上。菌株SUC-152和SUC-154中过表达的基因描述于表2 中。表2 实施例2C构建的酵母菌株。 2D. 4.生长实验和琥珀酸和富马酸生产将转化体接种于20ml预培养基中并在30°C和250rpm下在摇动培养箱中IOOml 摇瓶中于需氧条件下培养，所述预培养基由含有2%葡萄糖(w/v)的Verduyn培养基 (Verduyn 等，1992，Yeast. Jul ；8 (7) :501_17)组成。72 小时后将培养物在 4750rpm 下离 心5分钟。使用Iml上清液，如章节1. 5中所述通过HPLC测量琥珀酸水平。倾析剩余的上 清液，将沉淀物(细胞)重悬于Iml生产培养基中。生产培养基由含10%半乳糖(w/v)和 1% CaCO3(w/v)的Verduyn培养基组成。将重悬的细胞接种于IOOml摇瓶中50ml生产培 养基中，并于30°C和IOOrpm下在摇动培养箱中培养。在不同的时间点从培养物中取出Iml 样品。如章节1. 4中所述通过HPLC测量琥珀酸和富马酸水平。用空载体转化的菌株(对照菌株)生产至多0.3g/L琥珀酸(图11，虚线)。来自 M. succiniciproducens的PEP羧激酶(PCKm)、来自S. cerevisiae的过氧化物酶体苹果酸
16脱氢酶(MDH3)和来自R. oryzae的富马酸酶(FUMR)的过表达导致0. 9g/L的琥珀酸生产水 平。来自A. succinogenes的PEP羧激酶(PCKa)、MDH3和FUMR的过表达导致1. Og/L的琥 珀酸生产水平。这些结果显示除了 PCKa或PCKm任一以外，另外还用截短的MDH3和FUMR 转化S. cerevisiae时，与单独过表达PCKa或PCKm的S. cerevisiae相比生产进一步提高 的琥珀酸量(表1)。用空载体转化的菌株(对照菌株)在生长8天后生产至多14mg/L富马酸(图11， 实线)。来自A. succinogenes的PEP羧激酶(PCKa)、来自S. cerevisiae的苹果酸脱氢酶 (MDH3)和来自R. oryzae的富马酸酶(FUMR)的过表达导致生长7天后55mg/L富马酸的最 大生产。来自M. succiniciproducens的PEP羧激酶、来自S. cerevisiae的苹果酸脱氢酶 (MDH3)和来自R. oryzae的富马酸酶(FUMR)的过表达导致生长8天后52mg/L富马酸的最 大生产。这些数据显示S. cerevisiae中PCKa或PCKm、MDH3和FUMR的过表达导致与相应 的野生型S. cerevisiae相比提高的富马酸生产水平。实施例2D在 Saccharomyces cerevisiae 中克隆来自 Actinobacillus succinoRenes 的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、来自Saccharomyces cerevisiae的丙酮酸羧化酶、来自 Saccharomyces cerevisiae的苹果酸月兌氧,酸、来自Rhyzopus oryzae的富马酸酸，禾口来自 Trypanosoma brucei 的富马IHI^Bfe。2D. 1.基因序列使用具有真菌特异性预测功能的PTSl预测器http //mendel. imp. ac. at/ mendel jsp/sat/ptsl/PTSlpredictor. jsp 分析来自 Trypanosoma brucei 白勺||酵角军Sl体 (glycosomal)富马酸还原酶(FRDg) [E. C. 1. 3. 1. 6] (GenBank 查询号 23928422)在丝状真 菌中的过氧化物酶体靶向。从蛋白质中去除1140-1142位的C-端氨基酸(SKI)，得到SEQ ID NO :22ο 对 SEQ ID NO :22 进行如 PCT/EP2007/05594 中针对 S. cerevisiae 所公开的密 码子对方法。将得到的序列SEQ ID N0:23置于组成型TDH3Sc启动子序列SEQ ID NO 24 之后和TDH3Sc终止子序列SEQ ID NO :25之前，并添加便利的限制性位点。将SEQ ID N0 23中的终止密码子修饰为TAAG。得到的序列在Sloning (Puchheim，德国)合成。2A. 1描述了来自A. succinogenes的PEP羧激酶的基因序列。2C. 1描述了来自 S. cerevisiae的苹果酸脱氢酶和来自R. oryzae的富马酸酶的基因序列。来自Saccharomyces cerevisiae的细胞质丙酮酸羧化酶(Pyc2p) [Ε. C. 6. 4. 1. 1. ] (GenBank 查询号 1041734，SEQ ID NO 26)由核苷酸序列 SEQID NO 27 编 码。使用来自S. cerevisiae菌株CEN. PK113-5D (MATA ura3_52)的基因组DNA作为模板， 使用引物 PlSEQ ID N0:28 和 P2SEQ IDNO :29 和 Phusion DNA 聚合酶(Finnzymes，芬兰)， 根据制造商的说明扩增PYC2编码序列(SEQ ID N0:29)。引物中包含便利的限制性消化位 点，用于进一步克隆的目的。2D. 2.表达构建体的构建BamHI/NotI 限制性消化 S. cerevisiae 表达载体 pRS414 (Sirkoski R. S. and Hieter P，Genetics, 1989,122 (1) 19-27)并随后在该载体中连接由磷酸烯醇丙酮酸羧激 酶(来源 Actinobacillus succinogenes)合成基因构建体(见 2Α· 1)组成的 BamHI/NotI
17限制性消化片段，从而创建表达载体PGBS414PPK-3 (图12)。使用连接混合物转化E. coli TOPlO(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS414PPK_l。随后用AscI和NotI限制性消 化PGBK414PPK-1。为了得到pGBS414PPK_3，将由来自T. brucei的糖酵解酶体富马酸还原 酶(FRDg)合成基因构建体(见2D. 1)组成的AscI/NotI限制性消化片段连接进经限制性 消化的PGBS414PPK-1载体中。使用连接混合物转化E. coli TOPlO (Invitrogen)，得到酵母 表达构建体PGBS414PPK-3 (图12)。Spel/Xhol 限制性消化 S. cerevisiae 表达载体 p426GPD (Mumberg 等，Gene. 1995 Apr 14 ；156(1) 119-22)并随后在该载体中连接由扩增的PYC2核苷酸序列(SEQ ID NO: 29)组成的Spel/Xhol限制性消化片段，从而创建表达构建体pGBS426PYC_2 (图13)。使用 连接混合物转化E. coli TOPlO(Invitrogen)，得到酵母表达构建体pGBS426PYC-2(图13)。BamHI/NotI 限制性消化 S. cerevisiae 表达载体 pRS414 (Sirkoski R. S. and Hieter P，Genetics, 1989,122 (1) 19-27)并随后在该载体中连接由糖酵解酶体富马酸还 原酶(来源Trypanosoma brucei)合成基因构建体(见2D. 1)组成的BamHI/NotI限制 性消化片段，从而创建表达构建体PGBS414FRE-1 (图14)。使用连接混合物转化E. coli T0P10 (Invitrogen)，得到酵母表达构建体 pGBS414FRE_l (图 14)。表达构建体pGBS415FUM-3的构建描述于2C. 2中。2D. 3. S. cerevisiae ^^通过将质粒pGBS414FRE-l、pGBS414PPK_3、pGBS415FUM_l、pGBS426PYC_2 和 P426GPD 的不同组合转化进菌株 CEN. PK113-6B(MATAura3-52 leu2-112trpl_289)中获得 菌株 SUC-226、SUC-227、SUC-228 和 SUC-230，如表 3 中所示。表3 实施例2D中构建的酵母菌株。 2D. 4.生长实验和琥珀酸生产如实施例2C. 4中所述进行生长参数分析和样品分析，所述分析具有以下变更使 用2%葡萄糖(w/v)作为碳源进行预培养。在生产培养基中使用10%葡萄糖(w/v)作为碳 源。如图15中所示，过表达MDH3、FUMR和FRDg的菌株SUC-230产生至多3. Og/L的 琥珀酸。PCKa的额外过表达将琥珀酸生产提高至高达3. 4g/L(菌株SUC-226)，PYC2的额 外过表达将琥珀酸生产提高至高达3. 7g/L (菌株SUC-228)。令人惊讶的是，PCKa和PYC2 二者的过表达(SUC-227)导致与单独的PCK和PYC的作用相比，琥珀酸生产水平被提高 M 1.5倍，多达5. Og/L。这些结果显示来自A. succinogenes的PEP羧激酶(PCKa)和来自 S. cerevisiae的丙酮酸羧化酶(PYC2) 二者的组合过表达对S. cerevisiae中琥珀酸生产水 平的协同作用。实施例3# Aspergillus niger中编码琥珀酸脱氢_的某因失活3. 1.鉴定对Aspergillus niger菌株CBS513. 88的基因组DNA进行测序和分析。鉴定了 翻译的蛋白质被注释为与琥珀酸脱氢酶蛋白质同源的两个基因，将其分别命名为sdhA和 sdhBo sdhA(Anl6g07150)和sdhB(An02gl2770)基因座的序列可以在genbank中分别以查 询号145253004和145234071获得。根据已知的原则设计sdhA和sdhB的基因替换载体， 并根据常规的克隆步骤构建(见图4和图5)。载体包含sdh ORF的约IOOObp侧翼区，用于 在预定的基因组基因座处进行同源重组。另外，它们在直接重复中间含有被gpdA启动子驱 动的A. nidulans双向amdS选择标记物。这些缺失载体的一般设计先前描述于EP635574B 和 WO 98/46772 中。3. 2.使 Aspergillus niger 中的 sdhA 基因失活如 Biotechnology of Filamentous fungi :Technology and Products. (1992) Reed Publishing(USA) ；Chapter 6 transformation 第 113-156 页中所述，分离缺失载体 pDEL-SDHA(图 4)的线性 DNA，并用于转化 Aspergillusniger CBS513. 88。所述线性 DNA 能够在sdhA基因座上整合进基因组中，从而如图6中所示用amdS基因替换sdhA基因。在 乙酰胺培养基上选择转化体，并根据EP635574B中所述标准步骤纯化菌落。将孢子涂布在 氟乙酰胺培养基上来选择丢失amdS标记物的菌株。通过PCR验证生长的菌落在sdhA基因 座上的整合，并通过Southern分析测试候选菌株中sdhA基因的缺失。sdhA基因的缺失可 以通过下述DNA片段 2. 2kb的尺寸减小(4. 6kb野生型片段与成功缺失SDHA的2. 4kb相 比)来检测，所述DNA片段覆盖整个基因座并且与适当的探针杂交。在约96个初始转化体 的池中，约9个菌株显示去除了基因组sdhA基因。选择菌株dSDHA作为具有失活的sdhA基因的代表性菌株。如实施例4中所述测 量dSDHA菌株的琥珀酸生产。实施例4在A. niRer dSDHA中克隆PCKa和PCKm并在微量滴定板(MTP' s)中生长根据实施例1. 2中所述转化方法，用实施例1. 1中所述包含来自Actinobaci Ilus succinigenes 的 PEP 羧激酶(PCKa, SEQ ID NO 7)的表达构建体 pGBT0PAn5 (图 6)和包含来自 Mannheimia succinicproducens 的 PEP 羧激酶(PCKm，SEQ ID NO 8)的表达构建体 pGBT0PAn6 (图7)来转化实施例3. 2的A. niger菌株dSDHA。使用Qpix挑取A. niger转化体并转移至含有选择性培养基的MTP' s上。在30°C 孵育7天后，用手或菌落采集器将生物质转移至含PDA的MTP' S。在30°C孵育7天后，生物 质形成孢子。使用Multimek 96 (Beckman)将这些孢子重悬于100微升含10%葡萄糖的最小 富集的Aspergillus培养基中。随后用30微升孢子悬浮液接种两个MTP' s，所述MTP' s 中有含有10%葡萄糖和CaCO3的170微升最小富集的Aspergillus培养基。类似地在 MTP' s 中接种 dSDHA 和对照 A. niger 菌株 CBS513. 88。将这些 MTP' s 在 34°C、550rpm 和 80%湿度下孵育5天。5天后使用Multimek 96 (Beckman)收获160微升。如实施例1. 4中 所述通过HPLC测量培养基中的琥珀酸。结果展示于表3中。表4.在A. niger中缺失琥珀酸脱氢酶(SDHA)和插入PCKa与PCKm对琥珀酸生产 水平的影响 表4中的结果显示插入来自A. succinogenes或来自M. succiniciproducens 二者 的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶提高A. niger的琥珀酸生产水平。
权利要求
包含下述核苷酸序列的重组真核微生物细胞，所述核苷酸序列编码催化磷酸烯醇丙酮酸转化成为草酰乙酸从而产生ATP的酶，其中所述酶包含与SEQ ID NO1、SEQ ID NO3和/或SEQ ID NO5的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1的细胞，其中所述酶是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。
3.根据权利要求1或2的细胞，其中所述酶是异源酶，优选地来自于细菌。
4.根据权利要求1到3中任一项的细胞，其中所述核苷酸序列在胞质溶胶中表达。
5.根据权利要求1到4中任一项的细胞，其中所述细胞是酵母，优选地为 Saccharomyces cerevsiae， 或是丝状真菌如Aspergillus niger0
6.根据权利要求1到5中任一项的细胞，其中所述细胞过表达编码丙酮酸羧化酶的核 苷酸序列。
7.根据权利要求1到6中任一项的细胞，其中所述细胞还包含编码苹果酸脱氢酶的核 苷酸序列，其中在编码苹果酸脱氢酶的核苷酸序列表达后，所述苹果酸脱氢酶在胞质溶胶 中有活性。
8.根据权利要求1到7中任一项的细胞，其中所述细胞还包含编码下述酶的核苷酸序 列，在编码催化苹果酸转化成为富马酸的酶的核苷酸序列表达后，所述酶在胞质溶胶中催 化苹果酸转化成为富马酸。
9.根据权利要求1到8中任一项的细胞，其中至少一个编码琥珀酸脱氢酶的基因是无 功能的。
10.根据权利要求1到9中任一项的细胞，其为包含编码SEQID NO :7和/或SEQ ID NO 8的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核苷酸序列的Aspergillusniger。
11.根据权利要求1到9中任一项的细胞，其为包含编码SEQID NO :9和/或SEQ ID NO 10的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的核苷酸序列的Saccharomyces Cerevisiae0
12.用于制备二羧酸的方法，包括在合适的发酵培养基中发酵根据权利要求1到12中 任一项的真核微生物细胞，并制备所述二羧酸。
13.根据权利要求12的方法，其中所述二羧酸是琥珀酸、富马酸或苹果酸。
14.根据权利要求12或13的方法，其中所述二羧酸被进一步转化为药物、化妆品、食 物、饲料或化学产物。
15.包含能够通过根据权利要求12或13的方法获得的二羧酸的发酵液。
全文摘要
本发明涉及包含下述核苷酸序列的重组真核微生物细胞，所述核苷酸序列编码能催化磷酸烯醇丙酮酸转化为草酰乙酸从而产生ATP的异源酶。本发明还涉及制备二羧酸(例如琥珀酸和富马酸)的方法，包括在合适的发酵培养基中发酵根据本发明的真核微生物细胞。
文档编号C12N9/88GK101903522SQ200880117105
公开日2010年12月1日 申请日期2008年11月14日 优先权日2007年11月20日
发明者吴亮, 瑞内·维尔瓦尔, 科尼利斯·玛丽亚·雅各布斯·沙吉, 罗波图斯·安东尼厄斯·戴维尔德 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司