能够增加表面上微生物种群的组合物及其应用的制作方法

专利名称：能够增加表面上微生物种群的组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，该组合物能够提高表面上微生物的生物活性或增加微生 物种群的密度。本发明的组合物可以用于保护植物免受植物病原体、有害昆虫或杂草样植 物的侵害，或促进植物的生长。
背景技术：
在植物的表面(包括叶、茎、枝、花或果实)、草地的土壤表面、动物(如蟑螂、蜗牛 或蚂蚁)的表面(下文统称为“表面”)上，生长有各种各样的天然微生物。这些微生物以 腐生、共生或寄生的关系出现。在植物表面，寄生性植物病原体通过在有利环境条件下的种 群增加引发植物疾病，并且有害昆虫也扩大种群导致植物受损。杂草样植物也会因与植物 间营养或空间的竞争引起耕种作物或植物生长的减少。植物病原体、有害昆虫和杂草(下 文统称为“有害生物”)对人们为寻求人类食物的稳定产量而付出的努力形成了威胁。现 在，人们主要依赖化学农药的使用来保护植物免受这些有害植物的伤害。迄今为止，化学农 药已被用为保护作物免受植物病原体、昆虫和杂草伤害的最有效办法。现在的市场规模在 世界范围内是约300亿美元，在韩国是10亿美元。但是，化学农药存在很多负面问题，在抑 制有害生物时也抑制了其他天然的有益生物，引起生态混乱。化学农药的残留和代谢物也 会对化学农药的制造者、农民或消费者产生毒性效果。此外，化学农药的反复使用会诱导植 物病原体、昆虫和杂草的抗性，导致它们对化学农药的敏感性降低。有时，化学农药的泄漏 会导致我们环境中空气、水或土壤的污染。人们已经致力于对具有上述潜在危险的化学农药进行补充和替代。另一选择是用 特定的微生物来控制有害生物。这些微生物(以下统称为“植物保护微生物”)具有在其生 长适宜的环境条件下抑制特定有害生物的生物活性。与化学农药相比，这种微生物方法主 要因为它对哺乳动物和环境的安全谱而顺应了社会需求。最近，许多国家，包括美国、欧洲 国家、日本和韩国已经启动规定，鼓励用“植物保护微生物”控制“有害生物”的工业产品的 研究、开发和注册。“植物保护微生物”通常按照从自然界中分离、在其特定的培养基中人工 培养和在使用前配置的方法来开发。尽管它们对人类和环境是安全的，但是，这种微生物方 法也有技术局限，并且因为技术局限，与化学农药相比，在工业角度上并不成功。该微生物 方法通常不足以保护植物免受“有害生物”的伤害，并且其功效因高度依赖于环境条件而差 异较大。其另外一个限制是微生物产品相对于化学农药具有更高的成本。“植物保护微生 物”通常需要严格的条件来维持它们在生产、运输、储存中和被农民使用于田间后的存活或 生物活性，而这些严格条件的要求经常会导致相对于化学农药更高的成本。特别地，依赖于 环境条件而不稳定或不可靠的功效通常需要栽培者承担“有害生物”带来的经济风险。这 些问题被认为是微生物方法尽管被公知为对人类和环境是安全的，但是没有在工业上被采 用的主要原因。人们将化学肥料用于农业生产已经有很长时间了。但是，化学肥料的重复使用已 经因为土壤中的盐分积累和其他负面问题如水污染，导致了农业用地的产量减少。为了克服这些问题，人们已经用天然有机物质替代化学肥料来试图恢复农业用地的产量。天然有 机物质因它们的代谢物，包括小分子有机物和矿物质而表现出肥料效果。这些有机物质主 要是被天然微生物降解的。这些微生物(以下统称为“植物生长促进微生物”)在天然界大 量存在，而且合理运用这些微生物就能替代或补充化学肥料。但是，“植物生长促进微生物” 在微生物方法上具有与“植物保护微生物”相似的技术局限，如低效、易受环境条件影响而 导致的功效不稳定和不可靠、比化学肥料更高的价格。这些技术局限也会导致微生物方法 在工业应用上的限制。上述基于“植物保护微生物”和“植物生长促进微生物”(以下统称为“有益微生 物”)的方法效果的不稳定或不足的原因，是植物表面的植物保护微生物或生长促进微生 物的生物活性通常很大程度上依赖于它们生长的环境条件这样一个事实引起的。更明确 地，植物表面上微生物的生物活性已知受到湿度、温度、紫外光、营养等因素的影响(Steven Ε. Lindow和MariaT. Brandl. 2003.叶环境微生物学.应用和环境卫生学69 1875到1883)。 为植物保护和植物生长促进而应用于植物表面的有益微生物，这些环境因素通常会影响这 些微生物的生存和生物活性。特别地，在引起叶片干燥并减少叶片营养可利用率或者直接 将叶片暴露于阳光的环境条件下，这些有益生物的种群明显地减少，或者它们的生物活性 明显降低。本发明聚焦于开发用于加强植物表面水分和微生物营养物的可利用率并因此导 致表面上微生物的种群和生物活性增加的组合物。植物表面的水分由天然降水或人工灌 溉提供，而且水量随时间和空间在植物表面变动。微生物的生物活性一般比植物对水更敏 感。更明确地，植物表面的水由重力作用从叶片上降落到地表，或者因为蒸发而从植物表面 消失。而且植物表面上保留的水也因为表面结构而在叶面上分布不同。例如，植物表面上 保留的水主要位于沿着叶脉或者毛状体周围的部分，从而导致水的不均勻分布，进一步导 致生于叶片上的微生物的水的有限可利用率。这可能是微生物位于沿着叶脉和毛状体周围 存在的原因之一。对植物表面微生物来说，有限的水的可 利用率(以下统称为“可用水”) 一般导致了微生物种群的降低或者生物活性的降低和转入孢子类的休眠结构。因此，“可用 水”被认为对增加或维持微生物种群或它们的生物活性非常重要。更多地，“可用水”对植 物表面上的微生物可接触到的表面上微生物营养物的可利用率也很重要。因此，有限的水 的可利用率也意味着溶解或悬浮于水的微生物营养物的有限的利用率。同样地，“可用水” 也在向植物表面上微生物传递微生物营养物中起到重要作用。在微生物营养物中，碳源和氮源对微生物维持它们的种群或者表现它们的生物活 性是非常重要的。一般地，在一个特定的空间和时间点，各种各样的天然微生物以巨大的 数量存在于植物表面。多种微生物的共存，导致了微生物之间对微生物营养物的高度竞争 (Steven Ε. Lindow和Maria Τ. Brandl. 2003.叶环境微生物学.应用和环境卫生学69 :1875 到1883)。特别地，由人们人工引入的用于植物保护或植物生长促进的“有益微生物”通常 位于不利于它们生存和生物活性的、已被具有更强的生态适应性的天然微生物占据了的叶 表面。大多数“有益微生物”先人工生长于培养基，以优化它们的最大种群生长，然后引入 天然的田间环境。由于这个原因，这些“有益微生物”不能认为是有竞争性地安置于自然生 态条件下的。此外，产生的这些“有益微生物”经常以孢子样的休眠结构存在的，与营养体 结构相比，休眠结构的生物活性更低。这些在人工培养基中生长，然后以休眠结构储存的生产过程，是植物表面的“有益微生物”与已在生态上适应生存的天然微生物相比竞争力低的 原因。生于植物表面的天然微生物与植物病原微生物竞争水、微生物营养物或空间，而 这种竞争会减少植物疾病的发生。因此，在天然腐生微生物和植物病原微生物之间的竞争， 被认为在保护植物免受植物病原体侵害方面是理想的。此外，为了保护特定植物免受特定 植物病原体的伤害，使用选自用于竞争的、并经过在培养基上人工培养而扩大了的种群的 特定微生物，比简单地增加天然腐生微生物更为理想。另一方面，用天然微生物保护植物免 受有害昆虫或杂草样植物的侵害非常困难，因为它们的种群密度或者生物活性不够高，不 能抑制有害昆虫或减少杂草样植物。在这种情况下，人工生长于培养基的有益微生物就更 加理想。因此，需要将能够特异性地抑制特定有害昆虫或特定有害杂草的特定有益微生物 引入到植物表面。为了通过应用有益微生物来提高植物的生长，人工引入比用天然腐生物 要更理想。目前还没有很好地建立技术，以提供能选择性地被有益微生物使用而不被天然微 生物种群使用的微生物营养物。实际上，植物表面的微生物在特定的时间和空间里持续地 改变着它们的种类和数量。在植物表面，已知同时存在着许多不同的微生物。例如在燕 麦、橄榄、甘蔗和小麦的叶环境中报导有37个属和85种微生物(Ching-Hong Yang, David Ε. Crowley, JamesBorneman和Noel Τ. Keen. 2001.微生物叶环境种群比先前认识的要复杂 的多.美国科学院院刊.卷98:3889到3894)。这种微生物的多样性也能相似地适用于它 植物。因此，当在植物表面人工引入有益微生物时，它们必须在多种环境条件下，在同样的 空间中与其它天然微生物竞争。这种动态竞争使有益微生物难以在特定空间中长期占据显 著位置。一种克服这种局限的方法是使用可以选择性地被特定有益微生物使用的微生物营 养物。例如，特定有益微生物可以使用油作为它们的碳源，然而大多数天然微生物不能使用 油作为营养。另外一种方法是使用不能抑制一种或一些有益微生物但能抑大多数天然微生 物的抗微生物药剂。用这种方法，有益微生物可以在它们的早期应用阶段，即天然微生物被 选择性控制的时候，安全地建立它们的种群。如果需要，可以使用在实验室被诱导产生对特 定抗微生物药剂具有抗性的有益微生物。一些化学杀细菌剂或杀真菌剂可作为抗微生物药 剂使用。但是，即使在这种情况下，因为它们使用的不同目的和低浓度，这些抗微生物药剂 的应用率比较低。本发明的关键点是使用超吸收聚合物(以下统称为“SAP”)来增加植物表面微生 物的种群密度和生物活性。本发明中的SAP被定义为具有亲水功能并能保持至少数十倍 于自身重量的自来水达到一段特定时间的所有聚合物。SAP在20世纪70年代被美国农业 部(USDA)引进，从80年代开始工业使用。SAP的主要应用是卫生目的，包括免洗尿布和女 用卫生巾。在农业和林业中，SAP也被用于干旱地区的土壤中，以向植物根部长期提供水分 或者增加土壤的透气性(Sang-Bum Park. 1994.超吸收聚合物的特征和应用现状.Mokchae Konghak 22(1) :91到112)。尽管SAP可以基于它的粗骨架材料被分为天然SAP和合成SAP， 但它们都是通过把可溶的粗聚合物交联为不可溶的形式而得到的，因此，它们可以以一种 凝胶形式保持自身重量数十倍的水(Sang-Bum Park. 1994.超吸收聚合物的特征和应用现 状· Mokchae Konghak 22(1) 91 到 112)。美国专利No. 9009020描述了农业 途的SAP的制作过程。该专利公开了 SAP可以被用于土壤中、种子上或根上，以增加土壤的透气性，从而提高种子的萌发和出土，以及 减少水灌溉的成本。为该目的，发明者描述了通过制造5-24目大小范围的SAP的方便用 法。韩国专利申请公开No. 2002-0002852描述了 SAP与外生菌根一起在制粒的种子上的用 途，该用途可以增加贮存期、帮助发芽的根长出制粒的种子表皮外和减少植物幼苗的水压 力。在韩国进行的另一项研究中，在盆栽土壤中用占土壤重量2 %的SAP来提高能有效抗土 生植物疾病的沙雷氏菌(Serratia plymuthica)A21-4的抑制活性。已有报导，通过这种应 用，辣椒苗的出苗和生长促进明显地增强了(Shun-Shan Shen, ffon-il Kim和Chang-Seuk Park, 2006.水凝胶对沙雷氏菌A21_4在土壤中的存活和植物疾病抑制上的效果.植物病理 杂志卷.22 364-368)。此外，已有报导，沙雷氏菌A21-4的种群密度在根和根环境中显著 地增加了，而辣椒疫霉(Phytophthora capsici)(—种辣椒枯萎病的致病病原体)的种群 密度呈现出了减少。但是，所有这些报导被定向到SAP在土壤中的使用，SAP在土壤表面下发挥作用。 没有关于SAP在植物表面上应用，以增加天然微生物或有益微生物的种群密度或生物活性 的报导。此外，也没有使用SAP来增加植物表面微生物的种群密度或生物活性、保护植物免 受有害微生物的伤害或促进植物生长的报导。

发明内容
本发明基于结合用SAP增加表面上微生物的水可利用率，通过增加植物上腐生微 生物或有益微生物的种群密度或生物活性来保护植物免受有害生物的伤害或促进植物生 长的想法。因此，本发明提供了含有SAP的组合物(以下统称为“SAP组合物”)，可以用于 增加表面上微生物的种群密度或生物活性，还可用于保护植物免受有害生物的伤害，促进 植物生长等。本发明提供了 SAP组合物来增加植物表面的微生物种群或生物活性。本发明也描 述了 SAP组合物在植物表面(包括叶、茎、枝、花和果)、草本生长的土壤表面，或者蜗牛、蟑 螂或蚂蚁的动物表面上的应用。使用SAP组合物，本发明描述了有效的SAP组合物能够保 护植物免受有害生物伤害或促进植物生长。本发明所述的SAP组合物可以为生长在植物、土壤和动物表面天然微生物或有益 微生物额外地提供水或微生物营养物。这种额外的水或微生物营养物可以增加表面上的微 生物种群并提高微生物的生物活性。更详细地，本发明的SAP组合物能够提供额外的水或 微生物营养物，延长了水和微生物营养物的供应时间，从而增加了表面上的微生物种群。添 加了微生物营养物的SAP组合物对增加表面上微生物种群更加有效。制备了含有SAP、微生 物营养物和特定的有益微生物的本发明SAP组合物，以用于增加人工引入的有益微生物的 种群，而不是天然腐生有益微生物的种群。当SAP组合物含有抑制天然腐生微生物的有益 微生物时，该SAP组合物可以抑制天然微生物，从而导致天然微生物的种群密度的减少。此 外，通过在SAP组合物中加入能够在特定的微生物营养物中选择性生长的一些特定的有益 微生物，或对特定抗微生物药剂具有抗性的有益微生物，本发明所述的SAP组合物可以用 于增加特定有益微生物而不是天然有益微生物。综上所述，通过在所述SAP组合物中加入的有益微生物或选择性加入的抗微生物 制剂抑制了次级代谢产物的活性，本发明的SAP组合物可以用于增加天然腐生微生物或加入的有益微生物，以减少天然微生物种群的密度。通过本发明所述的SAP组合物的使用，在 种群上增加了的天然腐生微生物或加入的有益微生物，能够更有效地与植物病原体微生物 竞争微生物营养物和空间，从而减少疾病的发生。当SAP组合物中加入有具有杀虫活性的 特定微生物时，该杀虫微生物在植物表面合理使用的情况下，可以以更高的机率来抑制表 面上的有害昆虫。当该SAP组合物中加入有除草微生物时，该除草微生物在杂草样植物的 表面合理使用的情况下，可以以更高的机率通过选择性的方式来抑制杂草样植物。当SAP 组合物中加入有能抑制蜗牛、蟑螂或蚂蚁的生长的特定有益微生物时，该有益微生物在动 物表面合理使用的情况下，也可以以更高的机率来抑制或消灭有害动物。
具体实施例方式为实现上述发明目的，本发明提供了含有SAP的组合物，以增加植物、土壤或动物 表面的有益微生物的微生物种群或生物活性。本发明所述的SAP组合物还可以含有至少一种营养物，该营养物可被天然腐生微 生物或加入的有益微生物利用。本发明所述的SAP组合物还可以含有至少一种有益微生物，该有益微生物能够抑 制植物病原体、有害昆虫或杂草样植物，或者能够促进植物的生长。本发明所述的SAP组合物还可以含有至少一种有益微生物，该有益微生物能够抑 制有害动物。本发明所述的SAP组合物还可以含有至少一种表面活性剂，以使所述组合物能够 在表面均勻分布。本发明所述的SAP组合物还可以含有至少一种简单的或复合的矿物盐，以提高所 述组合物在水中的润湿性。本发明所述的SAP组合物的特征在于，所述SAP为淀粉基的SAP。本发明所述的SAP组合物的特征在于，所述SAP的含量为20_95重量％。本发明所述的SAP组合物的特征在于，当用水稀释所述SAP组合物时，SAP的含量 为给定水量的0. 02-1. 0重量％。本发明所述的SAP组合物的特征在于，所述表面为包括叶、茎、枝、花或果实的表 面在内的植物表面，土壤表面或者动物表面。本发明所述的SAP组合物的特征在于，所述微生物营养物为肉汤培养基的PLNT粉 末，所述肉汤培养基由等重量的马铃薯葡萄糖肉汤、Luria肉汤基础、营养肉汤和胰酶大豆 肉汤组成。本发明所述的SAP组合物的特征在于，所述植物为黄瓜、辣椒、马铃薯、水稻、番 茄、大麦、小麦、梨或玫瑰。本发明所述的SAP组合物的特征在于，所述微生物为选自芽孢杆菌属(Genus Bacillus)、类芽孢杆菌属(Genus Paenibacillus)或链霉菌属(GenusStreptomyces)的细 菌菌属，选自木霉属(Genus Trichoderma)、白粉菌寄生菌属(Genus Ampelomyces)或支顶 抱属(Genus Acremonium)中的真菌菌属。本发明所述的SAP组合物的特征在于，所述植物病原体选自稻瘟病 胃(Magnaporthe grisea)、/R t 胃胃(Thanatephorus cucumeris) > M β lif(Phytophthora capsici) ^MMM (Botrytis cinerea)、禾柄f秀菌(Pucciniagraminis)、白 粉菌(Blumeria graminis 艮口 Erysiphe graminis)或掠丝单囊壳(Sphaerotheca fusca)。本发明所述的SAP组合物的特征在于，所述有害昆虫为菜蛾属(Plutella)。本发明所述的SAP组合物的特征在于，所述杂草是指种植者不期望的、在特定时 间及空间内生长于田间的植物。本发明所述的SAP组合物的特征在于，所述有害动物为蟑螂、蚂蚁或蜗牛。本发明提供了 SAP组合物在抑制表面上的有害生物或促进植物生长中的应用。下面，对本发明进行进一步详细的描述。本发明涉及能够增加表面上天然腐生微生物或加入的有益微生物的生物活性或 种群密度的组合物及其应用。本发明所述的组合物含有作为水的超吸收聚合物的SAP。根 据应用和需要，本发明所述的组合物可以含有微生物营养物或有益微生物。此外，可分别加入润湿剂或表面活性剂来提高水中的润湿性和表面上的铺展性 (spreadability)。在本发明中，所用的用于增加微生物可用水的量和延长水供给时间饿关 键材料是超吸收聚合物(以下统称为“SAP”)。微生物营养物由微生物学家在实验室广泛 用于研究的液体培养基组成。有益微生物来自商业提供者或者研究相应微生物的研究者。 本发明所述的组合物中，分别选择和合理使用矿物盐和表面活性剂，以提高水中的润湿性 和表面上的铺展性。1.SAP (超吸收聚合物)本发明中主要用到的SAP是淀粉基的，特别是Zeba(产品商标名)，含有吸收 技术有限公司(Absorbent Technologies, Inc)生产的淀粉-接枝-多聚(2_丙烯酰 胺-共-2-丙烯酸)钾盐(CAS注册号No. 107830-79-5)。在用水稀释前，组合物中的SAP 含量是50重量％，用水稀释时，在给定量水中的SAP含量是0. 02-1. O重量％。在所述SAP 组合物和实施例中的SAP含量，SAP的含量是给定量水的0.5重量％。作为对照，用产自 Kolon工业有限公司(Kolon Industries Inc.)的丙烯酰胺基的SAP (GS-3000)替代Zeba， 在黄瓜叶上测试时，该物质表现出相似的增加微生物种群的效果。在本发明中，SAP被碾磨 为直径0. 1毫米及以下的精细粉末。SAP颗粒越小，溶解后悬浮的SAP在宽范围植物表面散 布地越好。但是，上述SAP的种类、含量和直径仅用于举例说明本发明，而不限制制备本发 明所述组合物中所含SAP的种类和方法。2.微生物营养物在本发明中，使用了一种名为PLNT粉末培养基的微生物营养物。PLNT粉末培养 基由全部产自美国Difco实验室的马铃薯葡萄糖肉汤、Luria肉汤基础、营养肉汤和胰酶大 豆肉汤组成。推荐等量地合并使用四种培养基，以制得PLNT培养基。已确认多种微生物在 PLNT琼脂培养基上生长良好。使用的PLNT粉末培养基的量为本发明组合物的5重量％。 但是，PLNT粉末培养基只作为本发明中的例子，微生物营养物的种类和含量不受另外限制。 更确切地说，也可以使用其它能够提供微生物生长所需的碳、氮、氨基酸、矿物质或维生素 的微生物营养物。3.有益微生物本发明中用到的所有有益微生物都来自商业提供者或研究人员。用于保护 植物免受植物病原体伤害的有益微生物属于芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)或链霉菌属(Sti^ptomyces)中的细菌菌属,或者木霉属(Trichoderma)、 白粉菌寄生菌属(Ampelomyces)或支顶孢属(Acremonium)中的真菌菌属。用于保护植物免 受有害昆虫伤害的有益微生物属于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中的细菌 菌属，用于保护植物免受杂草样植物伤害的有益微生物属于灰霉菌(Botrytis cinerea)中 的细菌菌属。用于促进植物生长的有益微生物属于花域芽孢杆菌(Bacillusvallismortis) 中的细菌菌属。每种有益微生物的参考文献如下〈有益微生物的参考文献〉1.用于保护植物免受植物病原体伤害的有益微生物(1)类芽孢杆菌(Paenibacillus elgii) (SD17)A. Kim, D. S.，Bae, C. Y.，Jeon, J. J.，Chun, S. J.，Oh, H. W.，Hong, S. G.，Baek, K. S.， Moon, Ε. Y. , and Bae, K. S. 2004. Paenibacillus elgii sp.nov., a novel species with broad antimicrobial activity. International Journal of Systemic and Evolutionary Microbiology54 :2031-2035.B. Kim, D. S.，Bae, C. Y.，Kim, D. H, Chun, S. J.，Choi, S. W.，and Choi, K. H. 2005. Paenibacillus elgii SD17 as a biocontrol agent against soil一borne turf diseases. Plant Pathology Journal 21 :328-333.C.韩国专利 No. 0457025(2)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is) (QST713)Α.美国专利 No. 6060051(3)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) (GB-0365)Α·韩国专利 No. 294023(4)链霉菌(Str印tomyces sp. ) (A020645)A. Lee, H. B.，Cho, J. W.，Park, D. J. , Li，C. Τ.，Ko, Y. H.，Song, J. H.，Koh, J. S.， Kim, B. J. Kim, C. J. 2004. In vivo screening for biocontrol agents (BCAs) against Streptomyces scabiei causing potato common scab. Plant Pathology Journal 20 110-114.B.韩国专利 No. 0563298(5)哈栖木霉(Trichoderma harzianum) (YC459)A. Lee, S. K.，Sohn, H. B.，Kim, G.G.and Chung, Y. R. 2006.Enhancement of biological control of Botrytis cinerea on cucumber by foliar sprays and bed potting mixes of Trichoderma harzianum YC459 and its application on tomato in the greenhouse. Plant Pathology Journal 22 :283-288.B.韩国专利 No. 0417632(6)白粉菌寄生菌(Ampelomyces quisqualis) (AQ94013)B.韩国专利 No. 0332480(7)直立顶孢霉(Acremonium s trie turn) (BCP)A. Kim, J. C.，Choi, G. J.，Kim, H. J.，Kim, H. T.，Ahn, J. W. and Cho, K. Y. 2002. Verlamelin, an antifungal compound produced by a mycoparasite, Acremonium strictum. Plant Pathology Journal 18:102—105.
B.韩国专利 No. 02997682.用于保护植物免受有害昆虫伤害的有益微生物(8)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis subsp. aizawai) (NT0423)Α.韩国专利 No. 02803803.用于促进植物生长的有益微生物(9)花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis) (EXTN-I)A. Park, K. S. , Paul, D. and Yeh, W. H. 2006a. Bacillus vallismortis EXTN-l-mediatedgrowth promotion and disease suppression in rice(Oryza sativa L·)· Plant Pathology Journal 22:278-282.B. Park, K. S. ， Paul, D. ， Ryu, K. R. ， Kim, E. Y, and Kim, Y. K. 2006b. Bacillus vallismortis strain EXTN-Imediated systemicresistance against Potato Virus X and Y(PVX & PVY)in the field. Plant Pathology Journal 22 :360-363.C. Park, K. S.，Paul, D.，Kim, Y. K.，Nam, K. W.，Lee, Y. K.，Choi, H. W. and Sang Y. L. 2007. Induced systemic resistance by Bacillus vallismortis EXTN-I suppressed bacterial wilt in tomato caused by Ralstonia solanacearum. Plant Pathology Journal 23 :22_25.D.韩国专利 No. 0379022本发明中，为了实验目的，微生物按如下方法获得在250毫升的锥形瓶中使100 克取自成体黄瓜植株的黄瓜叶片与1升水剧烈震荡，静置30分钟后，再剧烈震荡后，用消过 毒的双层粗滤布过滤(以下统称为“叶片洗脱水”)。在本发明中，植物病原体为人工收集 的。由于植物病原体因其固有的专有寄生状态而不可培养，种菌是从感染病原体并表现出 典型感染症状的植株上取得的。在本发明中，所涉及的有害昆虫是菜蛾的幼虫。理论上， BCPC于2004年出版的《生物防治药剂手册》(The manual of biocontrol agent)中列出 的大部分细菌和真菌都可考虑作为有益微生物。在该手册中，在植物病原体到达前，定植于 植物表面或土壤表面的有益微生物与病原体竞争营养物或空间，从而进行植物保护。在保 护植物免受有害昆虫伤害的情形中，有益微生物被摄入有害昆虫的内部，进而导致有害昆 虫的死亡或失活。在保护植物免受杂草样植物伤害的情形中，特异致病的有益微生物只对 杂草样植物引发疾病。因此，本发明中的实验只是为了阐明本发明，并不限制有益微生物或 有害生物的种类。4.微生物组合物的制备本发明所述的微生物组合物是将各种成分研磨和混合为平均颗粒大小等于或小 于0.1毫米的粉末来制备的。在本发明所述的成分中，SAP是淀粉基的SAP。微生物营养物 是PLNT。有益微生物通过商业购买或者在实验室分离并纯化培养得到后，经过培养，再通过 冻干技术制成粉末。此外，用5%的粉末形式的表面活性剂来实现该组合物在植物表面的 均勻分布。在本发明中，表面活性剂为产自英国Ineos Oxide有限公司的Softanol (CAS注 册号No. 68131-40-8)。用由韩国Jimgwoo化学公司提供的白碳墨，以1 1的重量比吸收 Softanol。更详细地说，Softanol是在具有12-14烷基碳的线形仲醇上加上环氧乙烷得到 的非离子表面活性剂。在微生物组合物中，用复合矿物盐来提高该组合物在水中的润湿性。 Mirigun粉末，产自韩国Daeyoo，以30重量％作为湿润剂加入到微生物组合物。Mirigun是提供植物生长所需矿物质的肥料。在本发明中，Mirigim被用作载体，基于它在水中的高可 溶性和高比重可以提高水中的润湿性。简单矿物盐，比如氯化钙也可用于本发明所述的微 生物组合物。对不含有益微生物的组合物，Mirigim粉末以40重量％使用。表1描述了在 100克组合物中各成分的含量。表 1组合物 A)以每克粉末集落形成单位的对数值(即log集落形成单位)表示微生物种群密 度β)表面活性剂以1 1重量比吸收Softanol的白碳墨粉末
。)载体Mirigun粉末这些组合物只是例子，并不限制可用于本发明所述组合物的SAP、有益微生物、微 生物营养物、表面活性剂或载体的种类。现参照以下实施例更详细地描述本发明。但是，这只是举例地详细说明本发明，绝 不是用这些实施例来限制本发明的范围。实施例1 微生物种群的动态在本实施例中，监测了每种组合物对出现于植物表面的、天然微生物或加入的有 益微生物的种群密度的效果。为了实验的目的，天然微生物被定义为按如下步骤获得的微 生物在250毫升的锥形瓶中使100克取自成体黄瓜植株的黄瓜叶片与1升水剧烈震荡， 静置30分钟后，再剧烈震荡后，用消过毒的双层粗滤布过滤(以下统称为“叶片洗脱水”)。 当在LB琼脂培养基上培养时，检测到了大约2X IO5集落形成单位/毫升(cfu/ml)(等于 5.31og集落形成单位/毫升)的天然微生物。这其中，细菌在总种群中占到了 90%的优势 数量。本发明中的各个组合物以0. 5重量％的量加入叶片洗脱水，使总体积达到10毫升。 将7个直径3厘米的黄瓜叶圆片在浸泡30分钟后，在室温下置于有盖培养皿中。此外，作为 对照，以如上相同的比例和方法，分别将每一种有益微生物加入10毫升叶片洗脱水中。还 制备了不含微生物营养物或有益微生物的组合物作为对照。每种制备物在LB琼脂培养基 上处理后，在室温下培养0、1、2、3、5和7天。培养后的3-7天内，用稀释铺板方法合理计数 微生物种群。有益微生物通过它们在培养基上特有的集落形式区分，而其它都被认为是土 壤微生物。这些结果汇总在表2中。表 2黄瓜叶圆片上有益微生物或天然微生物的种群动态 a)在集落形成单位的基础上转化为对数值来计数微生物种群密度b)匪表示天然微生物c0BM表示有益微生物d)WLW 表示叶洗脱水(leafwash water)如表2所示，大多数有益微生物或天然微生物的种群都在合理使用本发明所述组 合物的时候增加了。对一些组合物，天然微生物的种群密度在特定时间点增加了近100倍。 但是，在含有有益微生物ι的组合物3情况下,或在含有有益微生物2的组合物4情况下，天 然微生物的密度降低了，或其增长速率减小了。这种现象的可能原因是通过产生次级代谢 物而具有抗微生物活性的有益微生物3和4的抗菌作用。例如有报导的类芽孢杆菌SD17的 广谱抗菌活性(Kim, D. S.，Bae，C. Y.，Kim, D. H，Chun, S. J.，Choi, S. W.，和 Choi, K. H. 2005. 类芽孢杆菌SD17作为抗土传草皮病的生物防治剂·植物病理学杂志21 =328-333)。基于表 1的结果，可以发现，本发明所述的组合物向黄瓜叶片上的微生物种群提供了更多的水和微 生物营养物，从而导致天然微生物或有益微生物种群密度的增加。此外，在使用具有抗微生 物活性的有益微生物情况下，应用本发明所述的组合物，通过减少天然微生物的种群密度， 或者通过减小天然微生物种群密度的增加，使得有益微生物能够良好地定植。实施例2 组合物保护植物幼苗免受植物病原体伤害的活性
在本实施例中，在生长间测试本发明所述组合物抗植物病原体(稻瘟病 胃(Magnaporthe grisea)、/R t 胃胃(Thanatephorus cucumeris) > M β lif (Phytophthora capsici) > MMM (Botrytis cinerea)、禾柄f秀菌(Pucciniagraminis) > 白粉菌(Blumeria graminis 即 Erysiphe graminis)的保护活性(Choi, G. j, Kim, J. -C.， Lee, S. -W.，Jang, K. S.，Kim, J. -S.，和Cho，K. Y. 2002.几种植物提取物抗小麦锈病的抗真 菌活性.韩国杀虫科学杂志6(2) =87-95.韩语)。主要区别是在用每种组合物200倍稀 释喷雾于植物表面处理植物3天后，接种分别接种植物病原体。处理后的植物按常规操作 维持，通过对照值来估计植物保护活性。对照值(Control value, CV)用下列计算式估计 CV(% ) = {1_(处理组疾病面积比/非处理组疾病面积比)} X 100表 3.各个组合物和有益微生物抗植物疾病的保护活性 RLBa)稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)引起的水稻枯萎病RSBb)瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)引起的水稻叶鞘枯萎病TGM0灰霉菌(Botrytis cinerea)引起的番茄灰霉TLBd)致病疫霉菌(Phytophthora infestans)引起的番茄晚疫WLRe)小麦叶锈菌(Puccinia recondita)引起的小麦叶片锈病BPMf)白粉菌(Blumeria graminis f. sp. Hordei)引起的大麦白粉病
在表3中，增加的对照值显示，本发明所述的SAP组合物总体上表现出抗植物疾病 的保护活性。详细地说，组合物1对所有疾病的对照值都有总体增加。组合物2显示出比 组合物1略高的对照值。从组合物3到组合物11的对照值总体上均有增加。特别是，表现 出抗植物疾病保护活性的组合物只有与各种有益微生物结合，才能提高对照值。有益微生 物1单独表现出抗番茄晚疫(TLB)和番茄灰霉(TGM)的保护活性，然而，含有有益微生物1 的组合物3表现出增强了的抗相同疾病的保护活性，并且进一步地表现出一定的抗水稻枯 萎病(RCB)、水稻叶鞘枯萎病(RSB)、小麦叶片锈病(WLR)和大麦白粉病(BPM)的保护活性。 有益微生物2单独表现出抗TLB和BPM的保护活性，然而，含有有益微生物2的组合物4表 现出增强了的抗TLB和BPM的保护活性，并且进一步地表现出一定的抗其它疾病的保护活 性。有益微生物3单独表现出抗RCB、RSB、TGM和TLB的保护活性，然而，含有有益微生物3 的组合物5表现出增强了的抗RCB、RSB、TGM和TLB的保护活性，并且进一步地表现出一定 的抗其它疾病的保护活性。有益微生物4单独表现出抗WLR和BPM的保护活性，然而，含有 有益微生物4的组合物6表现出增强了的抗WLR和BPM的保护活性，并且进一步地表现出 一定的抗其它疾病的保护活性。有益微生物5单独表现出抗TGM和RSB的保护活性，然而， 含有有益微生物5的组合物7表现出增强了的抗TGM和RSB的保护活性，并且进一步地表 现出一定的抗其它疾病的保护活性。有益微生物6单独表现出抗BPM和WLR的保护活性， 然而，含有有益微生物6的组合物8表现出增强了的抗BPM和WLR的保护活性，并且进一步 地表现出一定的抗其它疾病的保护活性。有益微生物7单独表现出抗TLB和RSB的保护活 性，然而，含有有益微生物7的组合物9表现出增强了的抗TLB和RSB的保护活性，并且进 一步地表现出一定的抗其它疾病的保护活性。有益微生物8单独表现出抗菜蛾类幼虫的保 护活性但没有抗其它抗植物疾病的保护活性，然而，含有有益微生物8的组合物10表现出 一定的与组合物2相似的抗其它疾病的保护活性。有益微生物9单独表现出抗BPM和WLR 的保护活性，然而，含有有益微生物9的组合物11表现出增强了的抗BPM和WLR的保护活 性，并且进一步地表现出一定的抗其它疾病的保护活性。如上所述本发明所述的各种组合 物总体上表现出比每个微生物更高的对照值。不含有益微生物的组合物1或组合物2也表 现出一定水平的增加的对照值。但是，考虑到实施例2是在一个具有适合疾病发展或昆虫生长的包括温度、湿度 和光线在内的稳定条件的、通常用于短期内评价化学杀虫剂的生长室系统中进行的，在确 定保护活性上有一定的局限。因此，为了确定本发明所述的组合物的抗植物疾病的保护活 性，由于植物表面暴露于变化的湿度、温度和昼夜光照下，因此还需要考虑自然条件。植物 也可以生长更长的时间。因此，为了更好的确定本发明的效果，通过使用在一般种植条件或 相似条件下的成体植物(adult plants)，进一步重复进行了一项实验，以确定本发明所述 组合物的功效。实施例3 抗黄瓜白粉病的保护活性和微生物种群的动态在本发明所述的组合物中，一些组合物被用于确定其抗黄瓜白粉病的保护活性， 抗黄瓜白粉病由棕丝单囊壳(Sphaerotheca fusca)引起，自然发生于温室中的成体植物 上。将播种1个月后的黄瓜幼苗移植到装有产自韩国Biomedia的培养土(Bimong Sangto 5号)的罐(直径15厘米，深20厘米)中，在温室中按常规操作，使其进一步生长，到黄瓜植 株长至第5或第6叶期。然后分别以7天的应用间隔，将组合物1、2、3和4、有益微生物1和2、以及含有活性成分嘧菌酯(azoxystrobin)的化学杀真菌剂的悬浮液喷雾到黄瓜表面和 叶片上，作对比研究。实验按照3次重复的随机完全区组设计(randomized complete block design) 0每个重复包含4个黄瓜植株。喷雾悬浮液含有200倍稀释的本发明所述的各种 组合物或有益微生物。在用等量的水稀释时，每种有益微生物具有相似的有益微生物数量。 用手动喷雾器在黄瓜叶片和表面施用足够的喷雾悬液直到悬浮液滴下为止。引入黄瓜白粉 病，以在温室中的一些黄瓜植株上自然发病。事实上，在黄瓜长至第5或第6叶期时可以观 察到该疾病的发生。按照韩国《农村发展管理指南》(RuralDevelopment Administration)， 在每次施用当天评估保护活性。在处理3后的第七和第十四天(7DAT 3和14DAT 3)进行 进一步评估。表4显示抗黄瓜白粉病的保护活性。表 4抗黄瓜白粉病的保护活性 A)以嘧菌酯(azoxystrobin)为活性成分的化学杀真菌剂β)每列中字母相同的两个值之间的差异不明显(P = 0.05时Ducan’ s多范围检 验)如表4所示，组合物1和2表现出一定水平的保护活性。组合物3和4与每个有 益微生物相比有提高了的保护活性。化学杀真菌剂，嘧菌酯(azoxystrobin)，在本测试中没 有表现出良好的保护功能。这被认为是由于病原体对化学杀真菌剂嘧菌酯(azoxystrobin) 的抗性所致。平行地，也监测了黄瓜叶片上的微生物种群。在每次施用前的当天，每次处理用穿 孔器在黄瓜第三叶上取得3个叶圆片(直径3厘米)。将收集的黄瓜叶圆片放入10毫升无 菌水中30分钟，用手剧烈震荡，制得叶片冲洗水。用10倍稀释涂板法或用LB琼脂培养基 测量微生物种群。基于它们在LB琼脂培养基上的独有集落形式，计数有益微生物。结果见 表5。表5黄瓜叶表面的微生物群落动态 A)在集落形成单位的基础上转化为对数值来计数微生物种群密度β)匪表示天然微生物G)BM表示有益微生物在表5中，当用组合物处理时，微生物种群密度与单独用每种有益微生物相比，有 明显的增加。详细地说，组合物2与未处理的相比，天然微生物种群密度增加了 100倍。组 合物2的微生物种群也总体上高于组合物1。此外，含有有益微生物1的组合物3和含有有 益微生物2的组合物4表现出一定的减少天然微生物种群密度的活性。这种趋势表明表4 中的保护活性是由每种有益微生物的种群增加而造成的。该实验也确定了表5中所示的微 生物种群动态在温室中的成体黄瓜植株上具有相似的重现。实施例4 针对有害昆虫的防治在实验室中评价了本发明所述的组合物10对危害十字花科植物的菱斑蛾 (Plutella xylostella)的杀虫活性。卷心菜幼苗生长于温室中，制备其叶圆片(直径5厘 米)样品，并在2000倍稀释的组合物10的悬浮液中浸泡30秒。取出这些叶片，在通风罩 下干燥。将10条长至第3幼虫阶段的菱斑蛾幼虫置于叶圆片上，在放置后的24、48、72、96 和120小时检测杀虫活性。该实验按照3次重复的随机完全区组设计。按照韩国《农村发 展管理指南》(Rural Development Administration)评估杀虫活性。结果在表6中给出。表6抗菱斑蛾(Plutella xylostella)的杀虫活性 A)杀虫活性(％ )为每次死亡幼虫的百分率β)放置于叶圆片上以后的小时数c)每列中字母相同的两个值之间的差异不明显(P = 0.05时Ducan’ s多范围检验)如表6所示，本发明所述的组合物10在处理后72小时具有100%的杀虫活性。该 杀虫活性显著高于单独使用有益微生物8的情况，使用组合物8达到100%杀虫活性的时间 也比单独使用有益微生物8的时间短。该实施例表明，本发明所述的组合物不仅可用于抗植物病原体的植物保护，也可 以用于抗有害昆虫的植物保护。通过相似的方法，可以认为，本发明所述的组合物通过增加 有益微生物的种群来抑制有害生物如蟑螂、蚂蚁、蜗牛等的拓展用途。实施例5:除草活性当一些植物病原体特异地感染限定数量的杂草样植物时，含有这些植物病原体的 本发明所述的组合物可用于抑制或控制杂草样植物。在本实施例中，以番茄作为杂草样植 物的实例。含有8. OOlog集落形成单位/毫升的灰霉菌(Botrytis cinerea)孢子的本发明 所述的组合物1和2分别被稀释200倍后，用50毫升足量喷雾于每个番茄幼苗直到滴下。 用类似于实施例2中所用的方法评估除草活性。基于感染叶片的面积百分比，在接种后的 3天和7天(3DAI和7DAI)评估除草活性。结果在表7中给出。表7抗番茄幼苗的除草活性 如表7所示，本发明所述的组合物可用于抑制杂草样植物。更详细地说，组合物 1和2的处理，与单独用灰霉菌(Botrytis cinerea)处理相比，导致了番茄幼苗的更严重 的疾病发生。但是，在使用杂草病原体的情况下，杂草样植物需要特别地定义，杂草病原 体需要具有致病上的高度选择性。否则，因为杂草也是植物，杂草的病原体可能会导致作 物或植物的疾病。Lee等人报导了相似的结果(Boyoung Lee, Dalsoo Kim，和Choong-Min Ryu. 2008.不依赖附植群落促进细菌攻击性的一种超吸收聚合物.植物病理学杂志24 283-288)。本发明的发明者展示了本发明所述的组合物可以提高针对番茄幼苗一种细菌植 物病原体的攻击性。工业适用性本发明具有工业价值，因为它提供了一种能够补充或替代化学杀虫剂或化学肥料 的组合物及其应用。
19
权利要求
一种组合物，其中，该组合物含有超吸收聚合物，以提高存在于表面的微生物的生物活性或增加所述微生物的种群。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，该组合物还含有至少一种能够被所述 微生物利用的微生物营养物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，该组合物还含有至少一种能够抑制植 物病原体、有害昆虫或杂草样植物生长的或者能促进植物生长的有益微生物。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，该组合物还含有至少一种能抑制有害 动物生长的有益微生物。
5.根据权利要求1-4中的任意一项所述的组合物，其特征在于，该组合物还含有至少 一种表面活性剂，以增加所述组合物在表面上的铺展性。
6.根据权利要求1-4中的任意一项所述的组合物，其特征在于，该组合物还含有至少 一种单一的或复合的矿物盐，以增加所述组合物在水中的润湿性。
7.根据权利要求1-4中的任意一项所述的组合物，其特征在于，所述超吸收聚合物为 由淀粉制备的超吸收聚合物。
8.根据权利要求1-4中的任意一项所述的组合物，其特征在于，所述超吸收聚合物的 含量为所述组合物的20-95重量％。
9.根据权利要求1-4中的任意一项所述的组合物，其特征在于，在用水稀释所述组合 物时，所述超吸收聚合物的含量为单位水量的0. 02-1. 0重量％。
10.根据权利要求1-4中的任意一项所述的组合物，其特征在于，所述表面选自植物表 面、土壤表面或者动物皮肤表面，所述植物表面例如叶、茎、枝、花或果实的表面。
11.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述微生物营养物含有PLNT培养基， 所述PLNT培养基包括以标准使用量为基准，各占25重量％的马铃薯葡萄糖肉汤、Luria 肉汤基础、营养肉汤和胰酶大豆肉汤。
12.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述植物选自由黄瓜、辣椒、马铃薯、 水稻、番茄、大麦、小麦、梨和玫瑰所组成的组中。
13.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述有益微生物选自由芽孢杆 菌属(Genus Bacillus)、类芽抱杆菌属(Genus Paenibacillus)、链霉菌属(Genus Streptomyces)、木霉属(Genus Trichoderma)、白粉菌寄生菌属(Genus Ampelomyces)禾口支 顶孢属(Genus Acremonium)所组成的组中。
14.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述植物病原体选自由稻瘟 病菌(Magnaporthe grisea)、瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)、辣椒疫霉菌 (Phytophthora capsici)、灰毒菌(Botrytis cinerea)、禾柄f秀菌(Puccinia graminis)、 白粉菌(Blumeria graminis 艮口 Erysiphe gramini s)禾口 ■冑(Sphaerotheca fusca) 所组成的组中。
15.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述有害昆虫选自菜蛾属 (Plutella)。
16.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述杂草样植物是指在种植者不期望 的时间及空间生长的植物。
17.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述有害动物选自由蟑螂、蚂蚁和蜗牛所组成的组中。
18.权利要求1-4中的任意一项所述的组合物在包括叶、茎、枝、花或果实在内的植物 表面或生长有草坪草的土壤表面上的应用。
19.权利要求1-4中的任意一项所述的组合物在抑制表面上的有害生物或促进植物生 长中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种组合物，该组合物能够提高表面上天然微生物或有益微生物的生物活性或能够增加微生物种群的密度。通过适当使用所述组合物，本发明提供了保护植物免受植物病原体、有害昆虫或杂草样植物侵害或促进植物生长的应用。通过适当使用本发明的组合物，可以增加天然微生物或有益微生物的生物活性或种群密度，并且提高后的微生物生物活性或种群密度可以保护植物免受有害生物(如植物病原体、有害昆虫或杂草样植物)的侵害，或者可以促进植物的生长。
文档编号C12N11/00GK101883849SQ200880118881
公开日2010年11月10日 申请日期2008年9月26日 优先权日2007年10月5日
发明者金达洙 申请人:金达洙