共同培养脐带血衍生细胞与月经血干细胞的方法

专利名称：共同培养脐带血衍生细胞与月经血干细胞的方法
技术领域：
本申请主张2007年10月31日申请的名称为“Methods for Co-CulturingCord Blood Derived Cells with Menstrual Stem Cells”的美国临时专利申请第61/001456号 的优先权，该美国临时专利申请的全文以引用的方式而被并入本文中。本发明总的来说是关于人类细胞培养以及通过共同培养来增强经分离的细胞群 体的方法。更特别的，本发明涉及关于共同培养脐带血衍生细胞和月经血干细胞以获得经 扩增的表达CD34的脐带血衍生细胞的改良细胞群体。
背景技术：
脐带血为具有治疗人体多种病症的能力的干细胞的公认来源。脐带血为包括含有 CD34细胞的单核细胞的造血祖细胞的丰富来源。家族可决定收集脐带血，因为在儿童或家 族成员有医学需要的情况之下，具有经储存的干细胞的丰富来源存在潜在益处。脐带血(cord blood，也称为umbilical cord blood)为分娩时保留于脐带及胎盘 中的血液。此血液为干细胞的丰富来源，可将其收集、处理且低温保藏以用于潜在的未来用 途。脐带血干细胞为有益的，因为其具有高植入率，较能耐受组织失配，具有较低比率的严 重移植物抗宿主疾病(在干细胞移植中的主要并发症)，且极少被潜伏性病毒污染。可以脐带血治疗的人类缺乏症的数目在过去十年中已显著增长。例如，已使用 脐带血细胞来治疗各种形式的癌症、与骨髓衰竭(bone marrow failure)相关的症候群、 血液病症、代谢病症、免疫缺乏病症及其它疾病病况中的至少70种形式。举例而言，已使 用脐带血细胞来治疗以下疾病急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、伯 基特淋巴瘤(Burkitt’ s lymphoma)、慢性骨髓白血病(CML)、青少年骨髓单核细胞性白 血病(JMML)、噬血细胞淋巴组织细胞增生症(Hemophagocytic lymphohistiocytosis)、 非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin ‘ s lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤、郎格罕细胞 (Langerhan' scell)组织细胞增生症、淋巴瘤样肉芽肿病、骨髓发育不良症候群(MDS)、 慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、无巨核细胞小土血小板减少症(Amegarakyocytic thrombocytopenia)、自体免疫嗜中性球减少症(严重)、先天性红细胞生成不良性贫血、 周期性嗜中性球减少症、戴布二氏(Diamond-Blackfan)贫血、埃文氏症候群(Evan' s syndrome)、范可尼贫血(Fanconi anemia)、格兰茨曼疾病(Glanzman，s disease)、青少 年皮肌炎、科斯特曼症候群(Kostmarm’ s Syndrome)、红血球发育不全、斯沃奇曼症候群 (Schwachman syndrome)、严重再生不全性贫血、先天性含铁胚血球贫血、桡骨缺失性血小 板减少症(TAR症候群)、先天性角化不全、镰状细胞性贫血(血色素SS)、HbSC疾病、镰状
地中海贫血、严重a-地中海贫血(胎儿水肿)、严重地中海贫血(库利氏贫血 (Cooley’ s anomia))、中间型地中海贫血、地中海贫血、E_0 +地中海贫血、肾上 腺脑白质营春不良、高雪氏病(Gaucher、disease)(婴儿)、异染性脑白质营养不良、克拉 贝疾病(Krabbedisease)(球状细胞脑白质营养不良)、贡特尔疾病(Gunther disease)、哈 布二氏症候群(Hermansky-Pudlak syndrome)、胡尔勒症候群(Hurler syndrome)、胡-射
4二氏症候群(Hurler-Scheie syndrome)、亨特症候群(Hunter syndrome)、山菲立普症候 群(Sanfilippo syndrome)、马拉二氏症候群(Maroteaux-Lamysyndrome)、II型、III型黏脂 质症(Mucolipidosis)、a甘露糖症(Alphamannosidosis)、A型及B型纽匹二氏症候群 (Neumann Pick Syndrome)、山朵夫症候群(Sandoff Syndrome)、泰萨二 氏疾病(Tay Sachs Disease)、巴滕疾病(Batten disease)(遗传性神经原腊球脂褐质化)、雷-纳二氏疾病 (Lesch-Nyhan disease)、共济失调性毛细血管扩张症(Ataxia telangeotasia)、慢性肉 芽肿病、迪乔治症候群(DiGeorge syndrome), IKK y缺乏症、免疫调节异常多内分泌病x 染色体相关(Immune dysregulation polyendocrineopathyX-linked)、II 型黍占月旨质症、先 天但.骨髓粒细胞缺乏症(Myelokathesis^X染色体相关的免疫缺乏、严重联合免疫缺 乏、腺普去胶腌缺乏症、维_奥二氏症候群、X染色体相关的无、球蛋白血症、X染色体相 关的淋巴增生性疾病、欧曼症候群(Omerm’ s syndrome)、网状细胞发育异常(Reticular dysplasia)、胸腺发育异常(Thymic dysplasia)、白血球黏着性缺乏症及骨石化病。存在关于脐带血细胞收集及在人类病症治疗中的用途的限制。首先，脐带血细胞 仅可在出生之后立即收集。此对脐带血的可收集次数造成显著限制。其次，以含有有限量 的干细胞的小体积收集脐带血。某些病症需要输注或移植大量干细胞。少量可收集的脐带 血细胞使得将此等细胞用于需要大量细胞的疗法并不可行。正进行研究来发展进步以克服脐带血细胞的限制。已开发了组合多个脐带血单位 或在移植之前在单一脐带血单位中扩增干细胞的技术。开发此等技术以解决因具有过少干 细胞群体而无法治疗病症的问题。即使存在发展，也证明脐带血干细胞在细胞培养物中难 以扩增。丰富但受限的干细胞来源对病症治疗而言仍具有限制。已开发活体外检定系统以对红血球、粒细胞、单核细胞_巨噬细胞及巨核细胞骨 髓细胞系的多潜能祖细胞及系受限祖细胞定量。当在合适半固体基质中培养时，称为群落 形成细胞(CFC)的个别祖细胞增殖以形成离散细胞族或群落。藉由将细胞悬浮液置于半固 体培养基(诸如补充有营养素及细胞活素的甲基纤维素或胶原蛋白)中、接着培育来进行 CFC检定。接着，基于群落内之一或多类造血系细胞的形态学识别来对CFC分类且计数。可 籍由光显微术或藉由采集个别群落且接着使用细胞化学及免疫细胞化学方法将细胞染色 来当场进行群落评估及计数。已将包括甲基纤维素的各种胶凝剂用于CFC检定。甲基纤维素为形成具有良好光 学透明度的稳定凝胶的相对惰性的聚合物。其通常用于补充有包括胎牛血清(FBS)、牛血清 白蛋白(BSA)、2-巯基乙醇、胰岛素、运铁蛋白及重组细胞活素的化合物的培养基中或作为 群落刺激因子来源的改良性培养基(conditioned medium)中。与其它类型的半固体基质 相比，基于甲基纤维素的培养基允许红血球系细胞的较佳生长，因此允许在相同培养物内 检定红血球、粒.细胞、单核细胞及多潜能CFC。此培养基允许侦测人类群落形成单位-红 血球(CFU-E)、爆式形成单位-红血球(BFU-E)、CFU-粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)及CFU-粒 细胞、红血球、巨噬细胞、巨核细胞(CFUGEMM)且对其计数。尽管已产生进步，但仍需要改良脐带干细胞扩增以制造较多用于治疗人类病症的 干细胞的方法。本发明为关于满足此需要。

发明内容
本发明基于以下发现，即来自脐带血的干细胞在与月经血细胞群体共同培养时以 足够大的数目增殖。该发现已展示月经血干细胞在具有脐带血干细胞的培养物中提供支持 功能以增强脐带血细胞增殖。根据用于收集、低温保藏(cryopreservation)及储存的目前 行业标准来收集脐带血细胞。可根据美国专利公开案第20080241113号的教示来收集用于 与脐带血干细胞共同培养的月经血干细胞。脐带血细胞与月经血细胞的共同培养产生促进 表达⑶34、SSEA4及HLA- II的细胞扩增的培养环境。美国专利公开案第20080241113号的教示提供多种用于收集适用于本发明中的 月经血干细胞群体的方法。用于共同培养的月经血干细胞可自新鲜或经极冷保藏的月经血 干细胞获得。月经血干细胞可关于CD117或其它细胞表面标记经分离且亦可经由细胞培养 来扩增。月经血干细胞亦可关于某些细胞标记经分离且接着经培养以便扩增。美国专利公开 案第20080241113号中所述的月经血干细胞的任何群体均可用于本发明的共同培养方法中。因此，本发明提供共同培养脐带血细胞与月经血细胞以改良脐带血细胞的增殖的 方法。在一相关方面，本发明提供表达CD34的人类细胞的群体，其获自人类脐带血细胞 在具有促进人类脐带血细胞群体倍增的人类月经血细胞的合适培养条件中的扩增。细胞的 群体表达SSEA4及HLA- II。本发明的细胞的群体可悬浮于冷冻保藏剂、培养基、生长培养基或分化培养基中 的任一中。本发明的表达⑶34的人类细胞的群体是由至少两次或两次以上群体倍增而产生 的。本发明的细胞的群体能够产生以下任一者群落形成单位、群落形成单位粒细胞 (CFU-GM)巨噬细胞、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬 细胞巨核细胞(CFU-GEMM)血液系前驱体细胞。在另一方面中，本发明还提供藉由以下方法获得的表达CD34的人类脐带血细胞 的群体，该方法包含在适用于脐带血细胞扩增的条件下共同培养足量脐带血干细胞与足量 月经血干细胞，且接着经由至少两次群体倍增使足量脐带血细胞在培养物中增殖。使足量 脐带血细胞在培养物中增殖的步骤包含使脐带血细胞生长以产生以下任一者群落形成单 位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形 成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。在一实施例中，本发明的方法可包含使足量脐带血细胞在培养物中生长以产生以 下任一者之步骤群落形成单位(CFU)、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系 爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体 细胞(CFU-GEMM)。在又一实施例中，本发明的方法可包含在使足量脐带血细胞在培养物中增殖之后 分离表现CD34的脐带血细胞的步骤。在另一实施例中，本发明的方法可包含在使足量脐带血细胞在培养物中增殖之后 极冷保藏表现CD34的人类脐带血细胞的群体的步骤。藉由本发明的方法获得的表现CD34的人类脐带血细胞的群体在使足量脐带血细胞在合适培养条件下增殖之后亦可表现⑶34、SSEA4及HLA- II中的至少一者。在又一方面中，本发明提供获得经扩增的表现CD34的人类脐带血细胞的方法。本 发明的方法包含以下步骤在适于促进脐带血细胞扩增的共同培养条件下以足量月经血细 胞接种足量脐带血细胞，且在支持脐带血细胞的至少两次或两次以上群体倍增的培养条件 下共同培养脐带血细胞与月经血细胞。在一实施例中，共同培养表现CD34的人类脐带血细胞包含扩增脐带血细胞以表 现SSEA4及HLA- II中的至少一或多者。在另一实施例中，本发明的经扩增人类脐带血细胞表现高含量的CD34。另外，本发 明的脐带血细胞的共同培养包含扩增脐带血细胞以产生以下任一者群落形成单位、粒细 胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒 细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。在替代性实施例中，本发明的方法可包含以下其它步骤中的至少一者关于⑶34 免疫选择经扩增人类脐带血细胞，自培养物分离经扩增人类脐带血细胞以便输注于人类 中，极冷保藏经扩增人类脐带血细胞或使经扩增脐带血细胞分化为细胞系。在又一实施例中，本发明的方法包含使经扩增人类脐带血细胞生长以产生以下任 一者的步骤群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生 成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞(CFU-GEMM)血液系前驱 体细胞。


图1展示本发明的示意性流程图。图2a及2b为对于实例1中所述的造血群落形成细胞而言，在解冻之后经涂铺且 在Methocult 4053半固体甲基纤维素培养基中培养的脐带871R细胞的细胞培养物的相 片。脐带871R细胞以每孔50000个细胞涂铺于每孔lml培养基中。图2a为在细胞培养8 天后的细胞相片(200X)。图2b为在细胞培养9天后的细胞相片(40X)。图2a及2b说 明在无群落形成单位(CFU)生长的情况下在半固体培养基中存在游离细胞。图3a_31为对于实例2中所述的CFIJ而言，在甲基纤维素培养基中培养的 M28100RM月经血细胞的相片。图3a为展示BFU-E的培养物中细胞的相片(100X)，其说明 在每孔涂铺10000个细胞且细胞培养8天之后由于血色素产生而引起的红色调。图3b为 对于群落形成单位而言，在培养8天之后甲基纤维素培养基中的游离细胞的相片(100 X)。 图3c及3d为展示BFU-E的培养物中细胞的相片(200X)，其说明在以每孔21600个细胞 涂铺细胞且在细胞培养物中8天之后由于血色素产生而引起的红色调。图3e为在以每孔 5000掴细胞涂铺细胞且培养8天之后展示初始BFU-E产生的培养物中细胞的相片(40X)。 图3f、3g及3h为展示BFU-E的培养物中细胞的相片(分别为100X、100X及40X)，其说 明在每孔涂铺10000个细胞且细胞培养9天之后由于血色素产生而引起的红色调。图3i、 3j及3k为展示BFU-E的细胞培养物的相片(分别为100X、100X及40X)，其说明在每孔 涂铺21600个细胞且培养9天之后由于血色素产生而引起的红色调。图31为在此浓度下 无群落形成可能的情况下，培养基中游离细胞的相片。图4a-4d为每孔涂铺5000、10000及21600个细胞的M28101R月经血细胞的相片。图4a为在以每孔10000个细胞涂铺M28101R月经血细胞且细胞培养8天之后，展示CFU-GM 的培养物中细胞的相片(40X)。图4b为在以每孔10000个细胞涂铺细胞且培养9天之后 展示CFU-GM产生的培养物中细胞的相片(40X)。图4c为在以每孔21600个细胞涂铺细胞 且细胞培养数天之后展示BFU-E产生的培养物中细胞的相片(100X)。图4d为在以每孔 5000个细胞涂铺细胞且细胞培养9天之后游离细胞的相片(40X)。图5a_5g为实例4中所述的M28100RM月经血细胞与脐带871R细胞的共同培养相 片。图5d为具有以每孔5000个细胞涂铺的月经血细胞及以每孔50000个细胞涂铺的脐带 血细胞的部分CFU-GM在培养9天后的相片(40X)。图5a、5e及5g展示以每孔10000个 细胞涂铺的M28100RM月经血细胞及以每孔50000个细胞涂铺的脐带871R细胞在培养8天 (图5a及5e)及培养9天(图5g)之后的相片(100X)。图5a及5e说明CFU-GM群落形 成。图5g说明BFU-E群落形成。图513、5(及5€为以每孔21600个细胞涂铺的1128100冊 月经血细胞及以每孔50000个细胞涂铺的脐带871R细胞在细胞培养8天(图5b及5c)及 培养9天(图5f)之后的相片(分别为200X、100X及100X)。图6a_6c为实例5中所述的M28101R月经血细胞与脐带871R细胞的共同培养相 片。图6a、6b及6c说明甲基纤维素半固体造血培养基中的游离细胞。单独培养的M28101R 月经血细胞在以不同浓度涂铺时能够产生CFU-GM及BFU-E。
具体实施例方式参考图1-6，本发明提供共同培养脐带血细胞与月经血细胞以扩增表现⑶34的细 胞的数目的方法。还提供藉由本发明的方法获得的经扩增的表现CD34的人类细胞的组合 物。全脐带血为包括含有⑶34+细胞的单核细胞的造血祖细胞的丰富来源。脐带血干 细胞包含包括CD34+细胞的单核细胞。脐带血干细胞获自在分娩婴儿后但一般在已分娩胎 盘之前自脐带立即提取的全脐带血。分娩之时为收集新生儿干细胞的唯一机会。且，收集对 于阴道分娩及剖腹分娩均为安全的。为收集脐带血，将脐带血自脐带吸取至血液收集袋中。 将脐带血封装于运送材料中且运送至实睑室中以便在收集的36至48小时内加以处理。在婴儿出生之后，在夹掉脐带后自脐带收集全血。全脐带血的体积可为约110ml。 在行业标准下将所收集的脐带血样品运送至实验室以进行处理。在无菌条件下使用密度梯度分离(Fiooll/Hypaque)来处理脐带血以分离含有表 现⑶34的细胞群体的单核细胞。将脐带血等分至无菌50ml管中。在470g下将管离心约 15分钟。在离心之后，压紧细胞(packed cell)应在每体积1 3比率下。可在离心之后 自管移除血浆，或可将DPBS添加至管中以达成1 3的压紧细胞与体积的比率。各管应具 有不大于约35ml的体积，各管下方置放有10ml LSM。将各管在400g下离心约30分钟。移 除血浆顶层。移除含有单核细胞及血浆之下一层且将其转移至另一 50ml管中。应使用含有L-谷氨酰胺的RPMI01640 IX使50ml管中的细胞悬浮直至约45ml的 体积，其中RPMI与细胞混合物的比率为约1 2。可在470g下将具有细胞悬浮液的管离心 约15分钟。在离心之后，移除上清液。添加少量RPMI以使小球再悬浮。将细胞悬浮液转 移至15ml管中。在15ml管中将细胞悬浮液在400g下离心约15分钟。倾析上清液且使用 RPMI使小球再悬浮直至5ml。逐滴添加5ml DMS0/自体血浆(1ml DMS0及4ml自体血浆)。
8在控制速率冷冻器中将DMS0/自体血浆中的细胞悬浮液的温度降至约_85°C。将管置于在 约-185°C或_185°C以下的液氮槽中。参考根据美国专利公开案第20080241113号的任一方法自月经收集的细胞来使 用短语“月经血细胞”。月经血细胞包含表现包括(但不限于)⑶9、⑶10、⑶13、⑶29、⑶44、 ⑶49e、⑶49f、⑶59、⑶81、⑶105、⑶166及I类HLA的细胞标记或细胞内标记中的至少一 者，同时以低含量表现或不表现CD3及MHC II的细胞。尽管将细胞的上述特征提供为例 示性特征，但在美国专利公开案第20080241113号的整个揭示案中提供月经血细胞的额外 及替代性细胞表面特征，包括(但不限于)其中任何表及图中所提供的特征(在极冷保藏 之前及之后、在CD 117选择之前及之后、在细胞培养之前及之后)或美国专利公开案第 20080241113号中所揭示的任何组合。另外，美国专利公开案第20080241113号以全文引用 的方式并入本文中，且提供关于本发明的月经血细胞的其它揭示内容。根据美国专利公开 案第20080241113号的教示，用于与脐带血干细胞共同培养的月经血细胞可自月经收集， 浓缩且极冷保藏，且稍后根据本发明的方法来解冻。或者，美国专利公开案第20080241113 号的教示提供获得适用于本发明中的月经血细胞的多种方法。尽管术语“细胞”在本申请案中可以单数含义使用，但术语“细胞”亦可用以指用 于本发明的一个以上细胞。认识到由于某些细胞分化为多种独特细胞类型之能力，该等细胞在本质上为多能 的。多能细胞具有分化为多种不同哺乳动物细胞类型的能力。举例而言，用于本发明中的 月经血细胞展示分化为各种细胞系的潜力，该等细胞系诸如神经系、心脏生成系、软骨生成 系、脂肪生成系及成骨系。本发明的方法及组合物出于多种原因，将经扩增⑶34细胞用于治疗用途可为有益的。详言之，经扩增 CD34细胞(a)与其它脐带血细胞扩增方法相比需要使用较少脐带血细胞来增殖，(b)在与 月经血细胞的共同培养中增殖，(c)能够自体应用，(d)能够同种异体应用，及(e)可用作定 制的再生保健溶液的来源。本发明提供表现CD34的人类细胞的群体，其获自人类脐带血细胞在具有促进人 类脐带血细胞群体倍增的人类月经血细胞的合适培养条件中的扩增。细胞的群体亦表现 SSEA4 及 HLA- II。本发明的细胞的群体可悬浮于冷冻保藏剂、培养基、生长培养基或分化培养基的 任一者中。本发明的表现CD34的人类细胞的群体是由于至少两次或两次以上群体倍增而产 生的。本发明的细胞的群体能够产生以下任一者群落形成单位、群落形成单位粒细胞 (CFU-GM)巨噬细胞、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬 细胞巨核细胞(CFU-GEMM)血液系前驱体细胞。本发明还提供藉由以下方法获得的表现CD34的人类脐带血细胞的群体，该方法 包含在适用于脐带血细胞扩增的条件下共同培养足量脐带血干细胞与足量月经血细胞，且 接着经由至少两次群体倍增使足量脐带血细胞在培养物中增殖。使足量脐带血细胞在培养 物中增殖的步骤包含使脐带血细胞生长以产生以下任一者群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BHU-E)及群落形成单位粒细胞红血 球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。本发明的方法可包含使足量脐带血细胞在培养物中生长以产生以下任一者的 步骤群落形成单位(CFU)、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样 生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞 (CFU-GEMM)。本发明的方法可包含在使足量脐带血细胞在培养物中增殖之后分离表现CD34的 脐带血细胞的步骤。本发明的方法可包含在使足量脐带血细胞在培养物中增殖之后极冷保藏表现 CD34的人类脐带血细胞的群体的步骤。藉由本发明的方法获得的表现CD34的人类脐带血细胞的群体在足量脐带血细胞 在合适培养条件下增殖之后也可表现⑶34、SSEA4及HLA- II中的至少一者。本发明提供获得经扩增的表现CD34的人类脐带血细胞的方法。本发明的方法包 含以下步骤在适于促进脐带血细胞扩增的共同培养条件下以足量月经血细胞接种足量脐 带血细胞，且在支持脐带血细胞的至少两次或两次以上群体倍增的培养条件下共同培养脐 带血细胞与月经血细胞。共同培养表现⑶34的人类脐带血细胞包含扩增脐带血细胞以表现SSEA4及 HLA- II中的至少一或多者。本发明的经扩增人类脐带血细胞表现高含量的⑶34。本发明的脐带血细胞的共同培养包含扩增脐带血细胞以产生以下任一者群落形 成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群 落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。本发明的方法可包含以下其它步骤中的至少一个关于⑶34免疫选择经扩增人 类脐带血细胞，自培养物分离经扩增人类脐带血细胞以输注于人类中，极冷保藏经扩增人 类脐带血细胞，或使经扩增脐带血细胞分化为细胞系。本发明的方法包含使经扩增人类脐带血细胞生长以产生以下任一者的步骤群落 形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及 群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞(CFU-GEMM)血液系前驱体细胞。制备用于培养的细胞脐带血细胞样品及月经血细胞样品可在储存中经极冷保藏。或者，脐带血细胞样 品及月经血细胞样品中任一者或两者在自所收集的原始血液样品处理之后可为新鲜的。在 极冷保藏脐带血细胞样品及月经血细胞样品中任一者或两者的情况下，必须使经极冷保藏 的脐带血细胞和/或月经血细胞解冻以为培养作准备。在脐带血细胞样品及月经血细胞样 品中任一者或两者新鲜的情况下，可制备细胞以进行培养。使经极冷保藏的细胞解冻的方法包含使经极冷保藏的细胞解冻且接着经由离心 来洗涤该等细胞的步骤。自极冷保藏移除一小瓶细胞且在约37-40°C水浴中搅拌该小瓶直 至剩余几片冷冻样品，藉此使经极冷保藏的细胞解冻。经极冷保藏的细胞不应完全解冻。 将部分解冻的细胞转移至具有DNase (每lOOmllO滴)的冷冻Chang氏完全培养基中且通 过倒置使其轻微混合。Chang氏完全培养基应以5 1的比率与部分解冻细胞混合。举例 而言，使25ml Chang氏完全培养基与5ml解冻细胞混合。此时，可移除约100-200 u 1的Chong氏完全培养基及解冻细胞样品以用于下文进一步详细描述的流式细胞仪分析。悬浮解冻细胞的Chang氏完全培养基溶液可接着经受在约环境温度下在约120g 下离心约5分钟的第一步。一旦离心完成，即移除上清液且通过温和倒置使细胞小球及可 能存在的其它碎片再悬浮于无DNase的Chang氏完全培养基中。悬浮于Chang氏完全培养 基中的细胞可接着经受在约环境温度下在约120g下离心约5分钟的第二步。一旦第二离心 步骤完成，即移除上清液且使细胞小球再悬浮于7ml的15% FBS Chang氏生长培养基中。Chang氏完全培养基包含MEM a培养基、Chang B、Chang C、盘尼西林/链霉素 (Penicillin/Streptomycin)、L_ 谷氨酰胺及 ES-FBS。藉由组合 650mlMEM a 培养基、180ml Chang B(基础培养基)(18% v/v)、20ml Chang C(2% v/v)、10ml 盘尼西林/链霉素(10000 单位/ml盘尼西林G钠及10000 ii g/ml链霉素硫酸盐)、10ml L-谷氨酰胺200mM(100X) 及150ml ES-FBS(19% v/v)来制备Chang氏完全培养塞。可使用解冻及洗涤经极冷保藏的细胞的方法来制备经极冷保藏的脐带血细胞及 月经血细胞以进行培养。经由在烧瓶中培养来扩增细胞将经解冻或新鲜月经血细胞涂铺于经解冻或新鲜脐带血细胞上以在烧瓶中共同 培养细胞。可在T-25非经组织培养物处理的烧瓶中共同培养脐带血细胞与月经血细胞。细 胞不应超过每个烧瓶约10000000个细胞。将足够数目化脐带血细胞与足够数目的月经血 细胞在烧瓶中共同培养。在一实施例中，脐带血细胞可介于约1000个细胞至约10000个细 胞的范围内，而月经血细胞可介于约10000个细胞至约50000个细胞的范围内。其它量的 脐带血细胞及月经血细胞亦可为足够的，只要月经血细胞提供促进脐带血细胞扩增的支持 功能即可。先前培养的脐带血细胞及月经血细胞可以约2000个/cm2经涂铺，具有约48小时 的继代时间。若涂铺更多细胞，则细胞可在约24小时内经历继代。脐带血细胞及月经血细 胞可涂铺于分别具有约7ml、约15ml及约30ml Chang氏完全培养基的T_25、T_75及T-175 非经组织培养物处理的烧瓶中。脐带血细胞与月经血细胞的共同培养可在C02培育箱中在约36°C至约38°C下培 育，直至细胞以约70-80%融合。可藉由胰蛋白酶化(trypsinizing)步骤使脐带血细胞与月经血细胞的共同培养 物与烧瓶分离。当显而易见共同培养的脐带血与月经血细胞准备分离时，应吸出烧瓶中的 培养基且接着以对于T-25烧瓶而言体积为约5ml、对于T-75烧瓶而言体积为约10ml或对 于T-157烧瓶而言体积为约25ml的无钙或镁的DPBS洗涤非组织培养烧瓶。在洗涤之后， 可以TrypLE酶在约36°C至约38°C下对于T-25烧瓶而言以约1. 5ml的体积、对于T-75烧 瓶而言以约3ml的体积且对于175烧瓶而言以约6ml的体积来涂布细胞。TrypLE酶可与细 胞一起在C02培育箱中在约36°C至约38°C下培育约5分钟。在培育之后，可移出细胞且可 以相同体积的首先用于涂布细胞的TrypLE酶来稀释烧瓶的内容物。接着，可将含有悬浮细 胞内容物的TrypLE酶的溶液转移至50ml离心管中。可使用无钙或镁的DPBS来洗涤烧瓶 的内容物，对于T-25烧瓶而言以约5ml的体积、对于T-75烧瓶而言以约10ml的体积且对 于T-175烧瓶而言以约25ml的体积进行洗涤。用于本发明实践中的烧瓶可为非经组织培 养物处理的烧瓶。可将约50ml DPBS添加至含有TryPLE酶及悬浮细胞内容物的50ml离心管中。可将50ml离心管在环境温度下在约120g下离心约5分钟。可移除小球的少量等 分试样(诸如20iU)以用血球计手动地或用自动化装置进行细胞计数。在离心之后，移除 且丢弃上清液，且使剩余小球悬浮于约7ml Chang氏完全培养基中。悬浮于Chang氏完全培养基中的经共同培养且经扩增的细胞可为极冷保藏而作 准备，经受关于CD34细胞的免疫选择，为输注于人类中而作准备或为沿任何数目的细胞路 径进行细胞分化而作准备。在细胞培养的过程期间，可获得共同培养信息。每隔约3天或3天以上可更换培 养基。若共同培养物含有10000000个以上细胞，则可移除共同培养物中的细胞以在相同培 养条件下继代培养或者根据本申请案中所述的极冷保藏方法进行极冷保藏。经由在培养盘上培养来扩增细胞可在无菌条件下使用涂铺技术来共同培养细胞。用于本发明的方法中的培养基 可为含有 hSCF、hGM-CSF、hIL_3、hG-CSF、hEPO 的 Methocult 4034 以侦测 CB 中的 BFU-E、 CFU-GM、CFU-GEMM。在约2_8°C下或在室温下，使储存在_80°C下的培养基(MethoCult #4034)解冻。在涂铺之前将用于共同培养的经解冻培养基及细胞置于冰上历时约15分钟。 将约0. 3ml细胞悬浮液添加至含有培养基的管中，涡动且使其在冰上培育约30分钟。使用 注射器将培养基均勻分布于四孔培养盘的三个孔中，每孔约lml。将约lml DPBS添加至培 养盘的第四孔中。应在无菌条件下在约37°C下将培养盘培育约14至约21天。流式细胞仪分析可分析经共同培养的脐带血细胞及月经血细胞的任何样品(无论是否经扩增)的 总细胞计数、细胞生存力(藉由锥虫蓝，经由染料排除)及细胞表面标记的表现。经扩增的共同培养的脐带血细胞及月经血细胞的总细胞计数及细胞生存力可 藉由用血球计进行的手动计数、流式细胞仪或其它适用于获得细胞计数的构件(诸如 ViCell(Beckman Coulter)或适于计数显示于显微影像上的细胞的软件)来定量。经扩增的共同培养的脐带血细胞及月经血细胞可籍由流式细胞仪来进行分析。可 根据StomKit藉由将约36ml蒸馏水及4ml 10X溶解溶液添加至50ml管中来制备IX NH4CL 溶解溶液。可将约50 yl细胞样品添加至两个管中以进行分析。一个管用于CD34+/生 存力分析且第二个管用于等纯系对照(isocloniccontrol)。可将约10 yl 7-AAD生存力 染料添加至各管中。可将约lOiil⑶45-FITC/⑶34-PE添加至第一个管中。可将约10 yl CD45-FITC/CTRL-PE添加至第二个管中。可将混合物涡动且接着在约15°C至约30°C下培 育至少20分钟，同时使其避光。接着，可将约lml lx NH4CL溶解溶液添加至各管中且涡 动。可将混合物在约15°C至约30°C下培育约20分钟。可将约100 ill的干细胞计数荧光 球(stem-Count Fluorosphere)添加至各管中且涡动。接着，应使样品在流式细胞仪上运 行以进行分析。经扩增的共同培养的脐带血细胞及月经血细胞亦可藉由流式细胞仪来进行分析 以分析细胞表面标记、细胞生存力及其它细胞特征。在细胞溶解之后亦可根据以下方案来 分析细胞的新鲜样品。可在约2000rPm下将经扩增的共同培养的脐带血细胞及月经血细胞的样品离心 约7分钟。可移除上清液且使细胞再悬浮于约100 yl洗涤培养基(25% HSA、DNAse、肝素及HBSS w/Ca+及Mg+)中。接着，可在Blood Bank Serofuge中将再悬浮细胞离心约1分 钟。可倾析上清液且使细胞再悬浮于约1. 2ml鞘液(Sheath fluid)中且涡动。可分析鞘液中的细胞的任何数目的细胞表面标记。举例而言，且并非为限制，可将 鞘液中的细胞的约100 iil样品添加至含有以下试剂(在各管中每个试剂的体积为10 iil 或20iU)的各管中且接着将管涡动以混合如表A中所述的试剂与样品。表A 流式细胞仪负载概略
权利要求
一种表现CD34的人类细胞的群体，其获自人类脐带血细胞在用以促进人类脐带血细胞群体倍增的具有人类月经血细胞的合适培养条件下的扩增。
2.如权利要求1所述的人类细胞的群体，其中该人类细胞的群体还表现SSEA4。
3.
4.如权利要求1所述的人类细胞的群体，其中该人类细胞的群体还表现HLA-II。
5.如权利要求1所述的人类细胞的群体，其中该表现CD34的人类细胞的群体悬浮于冷 冻保藏剂、培养基、生长培养基或分化培养基中的任一中。
6.如权利要求1所述的人类细胞的群体，其中该表现CD34的人类细胞的群体为至少两 次或两次以上群体倍增的结果。
7.如权利要求1所述的人类细胞的群体，其中该人类细胞的群体能够产生以下任一 者群落形成单位、群落形成单位粒细胞(CFU-GM)巨噬细胞、红细胞系爆裂样生成单位、和 粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞群落形成单位(CFU-GEMM)。
8.一种表现⑶34的人类脐带血细胞的群体，其通过包含以下的方法而获得在适于脐带血干细胞扩增的条件下共同培养足量的脐带血干细胞与足量月经血干细胞；及经由至少两次群体倍增使足量脐带血细胞在培养物中增殖。
9.如权利要求8所述的方法，其中该方法进一步包含使足量脐带血细胞在培养物 中生长以产生以下任一者的步骤群落形成单位(CFU)、粒细胞巨噬细胞群落形成单位 (CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核 细胞血液系前驱体细胞(CFU-GEMM)。
10.如权利要求8所述的方法，其中该方法进一步包含在使足量脐带血细胞在培养物 中增殖之后，分离表现CD34的脐带血细胞的步骤。
11.如权利要求8所述的方法，其中该方法进一步包含在使足量脐带血细胞在培养物 中增殖之后，冷冻保藏该表现CD34的人类脐带血细胞的群体的步骤。
12.如权利要求8所述的方法，其中，在使足量脐带血细胞在合适的培养条件下增殖之 后，该表现⑶34的人类脐带血细胞的群体还表现HLA-II。
13.如权利要求8所述的方法，其中，在使足量脐带血细胞在合适的培养条件下增殖之 后，该表现⑶34的人类脐带血细胞的群体还表现SSEA4。
14.如权利要求8所述的方法，其中该使足量脐带血细胞在培养物中增殖包含使脐带 血细胞生长以产生以下任一者群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、 红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液 系前驱体细胞(CFU-GEMM)。
15.一种获得经扩增的表现CD34的人类脐带血细胞的方法，该方法包含在适于促进脐带血细胞扩增的共同培养条件下以足量月经血细胞接种足量的脐带血 细胞；及在支持脐带血细胞的至少两次或两次以上群体倍增的培养条件下共同培养脐带血细 胞与月经血细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中，表现CD34的人类脐带血细胞的共同培养包含扩 增脐带血细胞以表现SSEA-4及HLA-II中的至少一种或多种。
17.如权利要求16所述的方法，其中，经扩增人类脐带血细胞表现高含量的CD34。
18.如权利要求15所述的方法，其中，脐带血细胞的共同培养包含扩增脐带血细胞以 产生以下任一者群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂 样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细胞 (CFU-GEMM)。
19.如权利要求15所述的方法，其中，该方法进一步包含以下步骤中的至少一种免疫 选择关于CD34的经扩增人类脐带血细胞；自培养物分离经扩增人类脐带血细胞以用于输 注于人类中；极冷保藏经扩增人类脐带血细胞；或将经扩增脐带血细胞分化为细胞系。
20.如权利要求15所述的方法，其中该方法包含使经扩增人类脐带血细胞生长以产生 以下任一者的步骤群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆 裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞血液系前驱体细 胞(CFU"GEMM)。
全文摘要
本发明提供获得经扩增的表现CD34的人类脐带血细胞的方法。该方法包括在适于促进脐带血细胞扩增的共同培养条件下以足量月经血细胞接种足量脐带血细胞，且在支持脐带血细胞的至少两次或两次以上群体倍增的培养条件下共同培养脐带血细胞与月经血细胞。还提供使经扩增人类脐带血细胞生长以产生以下任一的方法群落形成单位、粒细胞巨噬细胞群落形成单位(CFU-GM)、红细胞系爆裂样生成单位(BFU-E)及群落形成单位粒细胞红血球巨噬细胞巨核细胞(CFU-GEMM)血液系前驱体细胞。该经扩增细胞可表现CD34、SSEA-4及HLA-Ⅱ。还提供经扩增细胞的组合物。
文档编号C12N5/0789GK101952416SQ200880122741
公开日2011年1月19日 申请日期2008年10月31日 优先权日2007年10月31日
发明者朱莉·G·阿利克逊, 默西迪丝·A·沃尔顿 申请人:干细胞国际公司