因子7表达的调节的制作方法

专利名称：因子7表达的调节的制作方法
技术领域：
本发明的发明实施方案所属领域提供了动物体内减少因子7的mRNA和蛋白质的 表达的方法、化合物以及组合物。所述方法、化合物和组合物有益于治疗、预防或改善血栓 栓塞性并发症、过度增生病症和发炎症状。
背景技术：
循环系统需要防止血液流失，同时阻止不适当的血管内梗塞的机制。一般来说，凝 血包含终结于可溶性纤维蛋白原转变为不可溶性纤维蛋白凝胶的反应级联。所述级联的步 骤包括了非活性酶原转变为活性酶。然后，所述活性酶催化所述级联的后继步骤。凝血级联所述凝血级联可以通过两个支路而启动作为主要途径的组织因子通路(即“外 源通路”)，和接触活化通路(即“内源通路”)。组织因子通路由细胞表面受体组织因子(tissue factor, TF，即因子III)启动， 该因子由血管外细胞(周细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和角质形成细胞)组成性表达，并 在炎症细胞因子或内毒素诱导下由血管单核细胞和内皮细胞表达(Drake et al. , Am J Pathol 1989,134:1087-1097)。TF是凝血因子Vila，一种丝氨酸蛋白酶的高亲和性细胞 受体。在TF缺乏时，VIIa具有非常低的催化活性，并且与TF结合对通过一种变构机制来使 VIIa具有功能是必需的。(Drake et al. ,Am J Pathol 1989，134 1087-1097)。该 TF-VIIa 复合物把因子X活化为)(a。)(a随后结合其辅助因子因子Va以形成凝血酶原酶复合物并随 后活化凝血酶原(即因子II或因子幻成为凝血酶(即因子Ila，或因子加)。凝血酶活化 血小板，转变纤维蛋白原为纤维蛋白并促进纤维蛋白与活化因子VDI交联，从而在TF暴露于 血管外细胞的位置形成稳定的栓塞。另外，凝血酶通过活化因子V和VDI来增强凝血级联响 应。接触活化通路由因子ΧΠ活化为XIIa而触发。因子XIIa转变XI为XIa，然后XIa转 变IX为IXa。1 联合其辅助因子VIIIa并转变X为fe。因子fe联合因子Va以活化凝血 酶原(因子II )为凝血酶(因子IIa)，从而这两条通路在这里汇合。凝血的抑制至少三种机制保持了凝血级联在控制中，即活化的蛋白C、抗凝血酶和组织因子通 路抑制剂的作用。活化的蛋白C是能够降解辅助因子Va和VIIIa的丝氨酸蛋白酶。蛋白C 通过凝血酶与血栓调节蛋白而活化，并需要辅酶蛋白S以运行。抗凝血酶是一种丝氨酸蛋 白酶抑制剂(serpin)，能够抑制丝氨酸蛋白酶凝血酶，Xa, XIIa, XIa和IXa。组织因子通 路抑制剂抑制了 Xa 和 TF-VIIa 复合物的作用。Gchwartz AL et al. ,Trends CardiovascMed. 1997 ；7 :234-239.)疾病血栓症是血液凝块的病理性发展，当一个血液凝块迁移到机体的另一部分并干扰 了器官功能的时候栓塞就发生了。血栓栓塞可能引起深静脉血栓、肺血栓、心肌梗塞和中 风。值得注意的是，血栓栓塞是每年影响超过两百万美国人的病状的主要原因。(Adcock et al. , American Journal of Clinical Pathology, 1997 ； 108 :434-49)。大多情况下血栓 症是由于获得性的外源问题，例如外科手术、癌症、不移动，而有些情况是由于遗传体质，例 如抗磷脂综合症和常染色体显性遗传，因子V Leiden。(Bertina RM et al. Nature 1994 ； 369 :64-67.)治疗最常用的抗凝血剂，杀鼠灵、肝素和低分子量肝素(low molecularweight heparin, LMWH)都有重大的缺陷。杀鼠灵通常用于治疗心房纤维性颤动。该药物与诱导因子II、VIIa、IX和X的维生 素K依赖性凝血因子发生作用。抗凝血剂蛋白C和S也被杀鼠灵所抑制。用杀鼠灵进行药 物治疗法由于杀鼠灵与其它药物包括用于治疗心房纤维性颤动的药物例如胺碘酮发生作 用的事实而更加复杂。由于杀鼠灵的治疗难以预测，必须小心监控患者以检测反常流血的 任何信号。肝素通过活化抑制凝血酶和因子X的抗凝血酶而发挥功能。(Bjork I, Lindahl U. MoI Cell Biochem. 198248 161-182)用肝素进行治疗可能引起免疫反应，从而造成血小 板在血管内聚集并能导致血栓。这一副作用被认为是肝素诱导性血小板减少(heparin-ind ucedthrombocytopenia,HIT)，从而需要监控患者。用肝素进行长期的治疗可能导致骨质疏 松症。LMWH也能抑制因子2，但是相比普通肝素(unfractioned heparin, UFH)程度较低。 LMWH也牵涉于HIT的发展之内。因此，现有的抗凝血剂缺乏可预测性和特异性，并且，从而需要对患者的小心监控 以防止副作用例如流血并发症。目前尚没有只靶向内源或者外源通路的抗凝血剂。发明概述本发明提供用于治疗和预防凝血病症的反义化合物、组合物和方法。如本文所述的反义化合物可以包括由12-30个核苷组成的靶向因子7核 酸的寡核苷酸。在一种实施方式里，因子7核酸可以是GENBANK Accession No. NT_027140. 6 的核苷酸 1255000-1273000， GENBANK Accession No. NM_019616. 2 和 GENBANK AccessionNo. DB_184141. 1 所表示的序列的任意序 列。所述反义化合物可以是单链或者双链寡核苷酸。所述反义化合物可以与因子7核 酸具有 100，95，90，85，80，75，或 70%的互补。所述反义寡核苷酸可以是被修饰的，其中至少一个核苷间连接是修饰的核苷间连 接。所述核苷间连接可以是硫代磷酸酯核苷间连接。所述反义寡核苷酸可以是被修饰的，其中至少一个核苷包含修饰的糖。所述修饰 的糖可以是二环糖。所述修饰的糖可以包含2’ -0-甲氧基乙基。所述反义寡核苷酸可以是被修饰的，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。所述
5修饰的核碱基可以是5-甲基胞嘧啶。稀释剂。所述组合物可以是单链或双链的寡核苷酸。如本文所述的方法可以包括给药予动物以包含由12-30个连接的核苷组成并靶 向因子7核酸的寡核苷酸的化合物。施用所述化合物可以延缓或阻止凝血。所述化合物可以与阿司匹林、氯吡格雷、双 嘧达莫、肝素、来匹卢定、噻氯匹定和杀鼠灵中的任何联合施用。可以伴随施用所述化合物 和一个第二药物。所述化合物和/或所述第二药物的施用可以通过肠胃外给药。肠胃外给药可以是 皮下或静脉内给药的任何一种。在另一个实施方式中，如本文所述的方法也可以包括鉴别有血凝病症的人并给药 以治疗有效量的包含由12-30个连接的核苷组成并靶向因子7核酸的寡核苷酸的化合物。还描述了包含由12-30个连接的核苷组成的反义寡核苷酸的化合物，其可以与 编码因子 7 核酸的 SEQ ID NO 1 的第 1147-1227，9169-9278，10982-11058，11075-11117， 12084-12117，12387—13796，13847—13907，14017—14051，14093—14134，14172—14287， 14331-14402，14664-14746，15098-15570，15609-15819，15899-15905，或 15957-15982 位 核碱基范围相结合。所述反义聚核苷酸可以与编码因子7核酸的SEQ ID NO 1有90，95或100%互补。 所述反义寡核苷酸可以与SEQ ID NO :1完全互补。所述反义聚核苷酸可以专有地与编码因子7核酸的SEQ ID NO :1的第1147-1227， 9169-9278,10982-11058,11075-11117,12084-12117,12387-13796, 13847-13907, 14017-14051，14093-14134，14172-14287，14331-14402，14664-14746，15098-15570， 15609-15819，15899-15905 或 15957-15982 位核碱基范围相杂交。还描述了包含由12-30个相连核苷所组成的反义寡核苷酸的化合物，其结合编码 因子7核酸的SEQ ID NO 2的第102-131或652-682位核碱基范围。所述反义聚核苷酸可以与编码因子7核酸的SEQ ID NO :2有90，95，或100%互 补。所述反义寡核苷酸可以与SEQ ID NO :2完全互补。所述反义聚核苷酸可以专有地与编码因子7核酸的SEQ ID NO :2的第102-131或 652-682位核酸碱基范围相结合。本发明的实施方式提供了包含由包含碱基序列SEQ ID NO :4_159和168-611的至 少12个连续碱基的12-30个连接核苷组成的修饰的寡核苷酸的化合物。在某些实施方式中，所述碱基序列是SEQ ID NO :53。在某些实施方式中，所述修饰的寡核苷酸的碱基序列与SEQ IDNO :1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO :3、和SEQ ID NO :167的任何一个具有至少80%的互补。在某些实施方式中，所述修饰的寡核苷酸的碱基序列与SEQ IDNO :1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO :3、和SEQ ID NO :167的任何一个具有至少90%的互补。在某些实施方式中，所述修饰的寡核苷酸的碱基序列与SEQ IDNO :1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO :3、禾口 SEQ ID NO :167的任何一个具有100%的互补。在某些实施方式中，所述修饰的寡核苷酸包括
(i)由连接的脱氧核苷组成的间隙片段(gap segment)；(ii)由连接的核苷组成的5’侧翼片段(wing segment)；(iii)由连接的核苷组成的3’侧翼片段；其中，所述间隙片段直接相邻5’侧翼片 段和3’侧翼片段，并定位于5’侧翼片段和3’侧翼片段之间，并且其中每个侧翼片段的每 个核苷包含修饰的糖。在某些实施方式中，所述修饰的寡核苷酸包括(i)由10个连接的脱氧核苷组成的间隙片段；(ii)由5个连接的核苷组成的5’侧翼片段；(iii)由5个连接的核苷组成的3’侧翼片段；其中，所述间隙片段直接相邻5’侧 翼片段和3’侧翼片段，并定位于5’侧翼片段和3’侧翼片段之间，其中每个侧翼片段的每 个核苷包含2’ -0-甲氧乙基糖；并且其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接。在某些实施方式中，所述修饰的寡核苷酸包括(i)由14个连接的脱氧核苷组成的间隙片段；(ii)由3个连接的核苷组成的5’侧翼片段；(iii)由3个连接的核苷组成的3’侧翼片段；其中所述间隙片段直接相邻5’侧 翼片段和3’侧翼片段，并定位于5’侧翼片段和3’侧翼片段之间，其中每个侧翼片段的每 个核苷包含2’ -0-甲氧乙基糖；并且其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接。在某些实施方式中，所述修饰的寡核苷酸包括(i)由13个连接的脱氧核苷组成的间隙片段；(ii)由2个连接的核苷组成的5’侧翼片段；(iii)由5个连接的核苷组成的3’侧翼片段；其中所述间隙片段定位于5’侧翼 片段和3’侧翼片段之间，其中每个侧翼片段的每个核苷包含2’ -0-甲氧乙基糖；并且其中 每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接。在某些实施方式中，所述修饰的寡核苷酸包括(i)由12个连接的脱氧核苷组成的间隙片段；(ii)由2个连接的核苷组成的5’侧翼片段；(iii)由2个连接的核苷组成的3’侧翼片段；其中所述间隙片段定位于5’侧翼 片段和3’侧翼片段之间，其中每个侧翼片段的每个核苷包含2’ -0-甲氧乙基糖；并且其中 每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接。本发明的实施方式提供了包含由包含碱基序列SEQ ID NO :4_159和168-611的至 少12个连续碱基的12-30个连接核苷组成的修饰的寡核苷酸或其盐以及药学上可接受的 载体或稀释剂的组合物。在一些实施方式中，所述碱基序列是SEQ ID NO :53。本发明的实施方式提供了包括给药予动物以由包含碱基序列SEQ ID NO :4_159和 168-611的至少12个连续碱基的12-30个连接核苷组成的修饰的寡核苷酸的方法。在一些实施方式中，所述碱基序列是SEQ ID NO :53。在一些实施方式中，所述动物是人。在一些实施方式中，所述给药预防深静脉血栓。在一些实施方式中，所述给药预防肺栓塞。
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在一些实施方式中，所述给药治疗过度增生病症。在一些实施方式中，所述给药治疗炎症症状。本发明的实施方式提供了包含鉴别动物处于血栓栓塞并发症危险中和给药予处 于危险中的动物以药学有效量的包含由12-30个连接核苷组成的修饰的寡核苷酸的化合 物的方法，其中所述修饰的寡核苷酸与因子7核酸互补。在一些实施方式中，所述血栓栓塞并发症是深静脉血栓、肺栓塞或其结合。本发明的实施方式提供了包含由12-30个连接核苷组成并具有碱基序列的修饰 的寡核苷酸的化合物，其中所述碱基序列包含至少12个与SEQ ID NO 1的第15U8-15223 位核苷酸的同样数目的碱基互补的连续碱基部分，其中所述修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO 1具有至少80%的互补。在一些实施方式中，所述修饰的寡核苷酸具有SEQ ID NO 53的碱基序列。发明详述应当理解，如上文的概括描述和如下的详细描述都仅仅是示范性和解释性的，而 不对本发明要求的范围构成限制。在本文中，所使用的单数也包括了复数，除非另外特别规 定。在本文中所用，使用“或”意味着“和/或”，除非另外规定。进一步，使用术语“包括”及 其它形式，例如“包括”和“包括于”，没有限制。同样，术语例如“元素”或“组分”包括了包 含一个单元的元素和组分以及包含多于一个的子单元的元素和组分，除非另外特别规定。如本文所用的段落标题仅仅是为了组织的目的，而不被解释为限制所描述的技术 方案。本申请中所引用的所有文献，或文献段落，包括但不限于专利、专利申请、论文、书籍 和协议，都以本文所述文献的段落或者文献整体在此明确地作为参考加以引用。定义除非提供了特别的定义，在本文所描述的用于与分析化学、合成有机化学和医学 以及药物化学相联系的、或其方法和技术的术语，都是在本领域众所周知和广泛使用的。标 准技术可被用于化学合成和化学分析。在允许的情况下，所有专利、申请、公开的申请和其 它出版物、GENBANK登记号及通过数据库例如美国国家生物技术信息中心(NCBI)所获得的 相关序列信息以及其它相关数据，贯穿全文都以本文所述文献的段落或者文献整体在此作 为参考加以引用。除非另外说明，下列术语具有如下的含义“2，-0-甲氧乙基，，(即 2，-MOE 和 2' -O(CH2)2-OCH3)指一个呋喃糖基(furosyl) 环的2’位置的0-甲氧基-乙基修饰。2’ -0-甲氧乙基修饰的糖是修饰的糖。“2’ -0-甲氧乙基核苷酸”是指含有2’ -0-甲氧乙基修饰的糖部分的核苷酸。“5-甲基胞嘧啶”是指胞嘧啶用甲基连接到其5’位置修饰。5-甲基胞嘧啶是修 饰的核碱基。“活性反义化合物”是指降低靶向核酸水平或蛋白质水平的反义化合物。“伴随给药”是指以任何方式共同施用两种药剂，其中两者的药理学效果在患者中 同时出现。伴随给药不需要所施用的两种药剂在单一的药物组合物内，以同样的剂量形式， 或者通过同样的给药途径。两种药剂的效果不需要各自同时表现。所述效果只需要在一段 时间内重叠，而不需要共同延续。“给药”意思是给一个个体提供药学试剂，并包括，但不限于医学专业人员给药或自我给药。“改善”指降低相关疾病、病症或状况的至少一个指标、标记或症状。所述指标的严 重性可以通过本领域技术人员所熟知的主观或客观测量方法来确定。“动物”指人或非人动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪和其它非人灵长 类，包括但不限于猴子和黑猩猩。“解毒剂化合物”指能够降低任何反义活性的强度或持续时间的化合物。“解毒剂寡核苷酸”是指包含与反义化合物互补并能与之杂交的寡核苷酸的解毒 剂化合物。“解毒剂蛋白质”是指包含肽的解毒剂化合物。“抗体”指表征为以某种方式特异性地与抗原反应的分子，其中所述抗体与抗原相 互定义。抗体可以指完整的抗体分子或其任何片段或区域，例如其重链、轻链、Fab区和Fc 区。“反义活性”是指反义化合物的归因于与其靶向核酸杂交的任何可检测或可测量 的活性。在一些实施例里，反义活性是指所述靶向核酸或由所述靶向核酸编码的蛋白质的 量或表达的降低。“反义化合物”是指能够通过氢键结合而与靶向核酸杂交的寡核苷酸化合物。“反义抑制”是指相比于反义化合物不存在时的靶向核酸的水平或靶向蛋白质的 水平，在与靶向核酸互补的反义化合物存在的情况下靶向核酸的水平和靶向蛋白质的水平 的降低。“反义寡核苷酸”是指具有允许与靶向核酸的相应区域或片段杂交的碱基序列的 单链寡核苷酸。“二环糖”是指呋喃糖环修饰以两个非成对环原子之间的桥连。二环糖是修饰的糖。“二环核酸”或“BNA”或“二环核苷”或“二环核苷酸”指这样的核苷或核苷酸，其 中所述核苷或核苷酸的呋喃糖部分包含连接呋喃糖环上的两个碳原子的桥连，从而形成一 个二环系统。如本文所用，除非另外声明，术语“亚甲氧基BNA”(methyleneoxy BNA)单独 指3-0-亚甲氧基8嫩。“帽子结构”或“端帽部分”是指是指与反义化合物的其中一个末端相结合的化学 修饰。“化学相异区域”是指这样的反义化合物的区域，其在某些方面与同样的反义化合 物的其它区域在化学上不同。例如，具有2’-0-甲氧乙基核苷酸的区域与具有没有2’-0-甲 氧乙基修饰的核苷酸的区域是化学相异的。“嵌合反义化合物”是指具有至少两个化学相异区域的反义化合物，其中每个位置 具有多个亚单元。“联合给药”是指给药两种或多种药学试剂于一个个体。所述两种或多种药学试剂 可以在一个单独的药物组合物里，或在不同的药物组合物里。所述两种或多种药学试剂的 每一种可以通过相同或不同的给药途径来给药。联合给药包括平行或顺序给药。“凝血因子”是指血液凝固级联中的因子ι、π、ιπ、ιν、ν、νπ、νπι、ιχ、χ、)α、)αι或 XIII。“凝血因子核酸”是指编码凝血因子的任何核酸。例如，在某些实施方式里，凝血因子核酸包括，但不限于，编码凝血因子的DNA序列(包括含内含子和外显子的基因组DNA)，由 编码凝血因子的DNA所转录的RNA序列，以及编码凝血因子的mRNA序列。“凝血因子mRNA” 是指编码凝血因子蛋白的mRNA。“互补性”是指第一核酸和第二核酸的碱基之间相配对的能力。“连续碱基”是指碱基相互之间直接相连。“稀释剂”是指组合物里的成分，其不具有药学活性，但是是药学上需要的或希望 的。例如，在注射药物里稀释剂可以是液体，例如盐溶液。“剂量”是指在一次给药中或特定的时间段内提供的特定量的药学试剂。在某些实 施方式中，一次剂量可以以一、二或多个药丸、药片或注射剂的形式给药。例如，在某些事实 方式中希望皮下给药，该希望的剂量难以通过单一的注射剂来提供，因此，可以使用两支或 三支注射剂以达到所希望的剂量。在某些实施方式中，所述药学试剂通过一段时间或持续 地注入来给药。剂量可以规定为每小时、每天、每星期或每月的药学试剂的量。“有效性”是指造成所希望的效果的能力。“有效量”是指在需要所述试剂的个体 内足够完成所希望的生理学结果的活性药学试剂的量。所述有效量在不同个体内可能由于 所治疗的个体的健康或生理状况、所治疗的个体的分类、组合物的配方、个体的药物状况的 评定和其它相关因素而有所不同。“因子7核酸”或“因子ΥΠ核酸”是指编码因子7的核酸。例如，在某些实施方式里， 因子7核酸包括，但不限于，编码因子7的DNA序列，由编码因子7的DNA序列所转录的RNA 序列(包括含内含子和外显子的基因组DNA)，和编码因子7的mRNA序列。“因子7mRNA”是 指编码因子7蛋白的mRNA。“因子7特异性抑制剂”是指能够在分子水平特异性抑制因子7mRNA和/或因子7 蛋白质表达的任何试剂。例如，因子7特异性抑制剂包括核酸(包括反义化合物)、肽、抗 体、小分子和能够抑制因子7mRNA和/或因子7蛋白表达的其它试剂。在某些实施方式里， 通过特异性调节因子7mRNA表达和/或因子蛋白表达，因子7特异性抑制剂可以影响凝血 级联中的其它成分，包括下游成分。相似的，在某些实施方式里，因子7特异性抑制剂可以 影响动物内的其它分子过程。“因子7特异性抑制剂解毒剂”是指能够降低因子7特异性抑制剂的效果的化合 物。在某些实施方式里，因子7特异性抑制剂解毒剂选自因子7肽；因子7解毒剂寡核苷酸； 包括互补于因子7反义化合物的因子7解毒剂化合物；以及影响内源或外源凝血通路的任 何化合物或蛋白。“完全互补”或“100%互补”是指第一核酸的每个碱基都具有在第二核酸内的互补 碱基。在某些实施方式里，第一核酸是反义化合物，而靶向核酸是第二核酸。在某些这样的 实施方式里，反义寡核苷酸是第一核酸，而靶向核酸是第二核酸。“Gapmer”是指这样的反义化合物，其中具有支持RNaseH裂解的多个核苷酸的中 间位置位于延伸区域之间，所述延伸区域具有与中间区域的核苷化学相异的一个或多个核 苷酸。“间隙片段”是指gapmer中构成所述中间区域的多个核苷酸。“侧翼片段”是指gapmer 的延伸区域。“扩展间隙”是指具有位于含1-6个核苷的5’和3’侧翼片段之间、并与之直接相 连的12个或更多连续2’ -脱氧核糖核苷的间隙片段的嵌合反义化合物。
“杂交”是指互补核酸分子的退火。在某些实施方式里，杂交核酸分子包括，但不限 于，反义化合物和靶向核酸。在某些这样的实施方式里，互补核酸分子包括，但不限于，反义 寡核苷酸和核酸靶。“过度增生病症”是指表征为细胞的不正常的或病态的增殖，例如癌症、牛皮癣、增
生等等。“鉴定动物的血栓并发症的风险”是指鉴定已经被诊断为具有血栓并发症的动物， 或鉴定倾向于发展血栓并发症的动物。倾向于发展血栓并发症的个体包括具有一个或多个 血栓并发症的风险因子的个体，包括不移动、外科手术(尤其是整形外科手术)、恶性肿瘤、 怀孕、高龄、使用口服避孕药以及遗传或获得性血栓形成性凝血病症。这种检定可以通过任 何方法完成，包括评估个体的药物史和标准化临床测试或评估。“直接连接”是指在直接连接元素之间没有其它介入元素。“个体”是指选择处理或治疗的人或非人动物。“有需要的个体”是指选择处理或治疗的人或非人动物，其需要进行所述处理或治疗。“发炎症状”是指导致炎症的疾病、疾病状态、综合症或其它状况。例如，风湿性关 节炎和肝纤维化是发炎症状。发炎症状其它实施例包括脓血症、心肌缺血/再灌注伤害、成 人呼吸窘迫综合症、肾炎、移植排斥、肠炎疾病、多发性硬化、动脉硬化和血管炎。“核苷间连接”是指核苷之间的化学键。“相连核苷”是指键合在一起的相连核苷。“不匹配”或“非互补碱基”是指第一核酸的不与第二或靶向核酸的对应碱基相配 对的碱基。“修饰的核苷间连接”是指自然生成的核苷间键的取代和/或任何改变(例如硫代 磷酸酯核苷间键)。“修饰的碱基”指除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之外的其它任何碱 基。“未修饰的碱基”是指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、 胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。“修饰的核苷酸”是指独立地具有修饰的糖片段、修饰的核苷间连接或修饰的碱基 的核苷酸。“修饰的核苷”是指独立地具有修饰的糖片段或修饰的碱基的核苷。“修饰的寡核苷酸”是指包含修饰的核苷间连接、修饰的糖和/或修饰的碱基的寡 核苷酸。“修饰的糖”是指天然糖的取代和/或任何改变。“修饰的糖片段”是指来自天然 糖片段并具有任何取代和/或改变的糖片段。“基序”是指在反义化合物中未修饰的或修饰的核苷的样式，例如，在反义化合物 中化学相异区域的样式。“天然存在的核苷间连接”是指3’到5’磷酸二酯键连接。“天然糖片段”是指在DNA(2’ -H)或RNA(2’ -OH)中存在的糖。“核酸”是指由核苷酸单体组成分子。核算包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸 (DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)和microRNA(miRNA)。“碱基”是指能与另一个核酸的碱基相配对的杂环片段。
“碱基序列”是指不依赖于任何糖、连接和/或碱基修饰的连续碱基的顺序。“核苷”是指与糖连接的碱基。“核苷酸”是指核苷具有磷酸基团共价连接于该核苷的糖部分。“寡聚化合物”或“寡聚物”是指由连接的单体子单元组成的聚合物，其能够与核酸 分子的至少一个区域杂交。“寡核苷酸”是指连接核苷的聚合物，其中每个所述核苷可以相互独立地是修饰的 或未修饰的。“肠胃外给药”是指通过注射或输液来给药。肠胃外给药包括，但不限于，皮下给 药，静脉内给药，肌肉内给药，动脉内给药，腹腔给药或颅内给药，例如鞘内或脑室内给药。 “皮下给药”是指仅在皮肤之下给药。“静脉内给药”是指向静脉给药。“肽”是指由通过酰胺键连接至少两个氨基酸形成的分子。肽也指多肽和蛋白质。“药学试剂”是指施用于个体时提供治疗利益的物质。例如，在某些实施方式里，靶 向于因子7的反义寡核苷酸是药学试剂。“活性药学试剂”是指药物组合物里提供所希望的 效果的物质。“药物组合物”是指适合给药于个体的物质的混合物。例如，药物组合物可以包含 一种或多种反义寡核苷酸和无菌水溶液。“药学上可接受的盐”是指生理上和药学上可接受的反义化合物的盐，例如，保留 了寡核苷酸母体的所希望的生物活性并且不带来不希望的毒物学效果的盐。“硫代磷酸酯连接”是指核苷间的磷酸二酯键经过一个非桥连氧原子用硫原子取 代来修饰的连接。硫代磷酸酯连接时修饰的核苷间连接。“部分”是指核酸的确定数量的连续(也就是连接的)碱基。在某些实施方式里， 部分是靶向核酸的确定数量的连续碱基。在某些实施方式里，部分是反义化合物的确定数 量的连续碱基。“预防”是指延缓或阻止疾病、病症或症状的发作或发展以从几分钟到不限期的一 段时间。“预防”也指降低疾病、病症或症状发展的风险。“前药”是指以非活性形式制备的治疗试剂，其在体内或细胞内通过内源性酶或其 它化学物质或条件而转变为活性形式(即，药)。“副作用”是指归因于治疗的除所希望的效果之外的生理反应。在某些实施方式 里，副作用包括，但不限于，注射位置反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝脏毒性、肾脏毒 性、中枢神经系统异常、肌病和不适感。例如，血清中转氨酶水平升高可以指示肝毒性或肝 功能异常。例如，胆红素增加可以指示肝毒性或肝功能异常。“单链寡核苷酸”是指不与互补链杂交的寡核苷酸。“修饰的单链寡核苷酸”是指 不与互补链杂交的修饰的寡核苷酸。“特异性杂交”是指反义化合物与靶向核酸杂交而诱导所希望的效果，同时对非靶 向核酸展示最小或没有效果。例如，特异性杂交指在希望进行特异性结合的条件下，例如在 体内检测和治疗处理的生理条件下，反义化合物具有与靶向化合物完全程度的互补性以诱 导所希望的效果，同时对非靶向核酸展现最小或没有效果。“严格杂交条件”是指在这样的条件下核酸分子，例如反义化合物，将与靶向核酸 序列杂交，而与其它序列以最小数量杂交。严格条件是序列依赖性的并在不同环境中有所
12不同。在本发明的文本中，寡聚化合物与靶向序列杂交的严格条件通过寡聚化合物的组分 和本性以及它们用于研究的试验来确定。“靶向”或“靶向于，，是指具有允许反义化合物特异性杂交靶向核酸以诱导所希望 的效果的碱基序列。在某些实施方式里，所希望的效果是减少靶向核酸。在某些实施方式 里，所希望的效果是降低因子7mRNA。“靶向”是指设计和选择将特异性与靶向核酸杂交并诱导所希望的效果的反义化 合物。“靶向核酸”，“靶向RNA”，“靶向RNA转录物”和“核酸靶”都是指反义化合物能够 靶向的核酸。“靶向片段”是指反义化合物能够靶向结合的靶向核酸的核苷酸序列。“5’靶向位 点”是指靶向片段的最5’端核苷酸，“3’靶向位点”是指靶向片段的最3’端核苷酸。“靶向区域”或“活性靶向区域”是指一个或多个反义化合物靶向的靶向核酸的部 分。“治疗有效量”是指能给个体提供治疗利益的药学试剂的量。“血栓并发症”是指包括由血栓引起的栓塞的任何疾病、病症或症状。这样的疾病、 病症和症状包括血栓症类、栓塞和血栓栓塞。在某些实施方式里，这些疾病、病症和症状包 括深静脉血栓、肺栓塞、心肌梗塞和中风。“治疗”是指给药以药物组合物以影响疾病、病症或症状的改变或改进。“未修饰的核苷酸”是指由天然存在的碱基、糖片段和核苷间连接组成的核苷酸。 在某些实施方式里，未修饰的核苷酸是RNA核苷酸(即β-D-核糖核苷)或DNA核苷酸(即 β -D-脱氧核糖核苷)。特定实施方式本发明的实施方式提供了调节因子7mRNA和蛋白的表达的方法、化合物和组合 物。在某些实施方式里，因子7mRNA和蛋白的表达被降低。在某些实施方式里，因子7特异 性抑制剂调节因子7mRNA和蛋白的表达。在某些实施方式里，因子7特异性抑制剂是核酸、 蛋白或小分子。在某些实施方式里，调节可以发生在细胞或组织里。在某些实施方式里，所述细胞 和组织是在动物里的。在某些实施方式里，所述动物是人。在某些实施方式里，因子7mRNA 水平被降低。在某些实施方式里，因子7蛋白水平被降低。这种降低可以以时间依赖性方 式或剂量依赖性方式发生。本发明的实施方式提供了对有需要的个体进行治疗、预防或改善与因子7相关联 的疾病、病症或症状的方法、化合物和组合物。在某些实施方式里，所述疾病、病症和症状是 血栓并发症。所述血栓并发症包括血栓症、栓塞和血栓栓塞等种类。在某些实施方式里所 述血栓并发症包括深静脉血栓、肺栓塞、心肌梗塞和中风。这些疾病、病症和症状可以具有一个或多个共有的风险因子、起因或结果。某些 血栓并发症发展的风险因子和起因包括不移动、外科手术、外科手术(尤其是整形外科手 术)、恶性肿瘤、怀孕、高龄、使用口服避孕药、心室纤维性颤动、前述血栓并发症、慢性发炎 疾病和遗传或获得性血栓形成性凝血病症。某些与血栓并发症的发展相关联的结果包括 通过受影响的血管的血液流动减少、组织死亡和个体死亡。过度增生病症发展的某些风险因子和起因包括遗传因子，例如可以或不可以遗传的基因突变和染色体畸变；以及环境因 子，包括但不限于，暴露于已知的诱变剂，例如来自放射性元素的高能量辐射、X射线、伽马 射线、微波和紫外线；某些工业化学物质；污染物例如香烟的烟尘；某些杀虫剂；药物；和病 毒。与过度增生病症的发展相关联的某些结果包括个体内的非恶性肿瘤、前恶性肿瘤和恶 性组织。某些发炎病症的风险因子和起因包括引起对潜在的病理性症状的细胞反应的有害 刺激，包括但不限于细菌和病毒感染以及过敏原。炎症通过由宿主巨噬细胞、T-淋巴细胞、 内皮细胞分泌的细胞因子介导。与发炎症状相关联的某些结果包括感染区域的发红、疼痛、 肿胀、个体失去功能、发病和死亡。在某些实施方式里，治疗方法包括给药因子7特异性抑制剂于所需要的个体。在某些实施方式里，本发明提供了制备用于治疗、预防或改善与因子7相关的疾 病、病症和症状的药物的方法和化合物。因子7相关的疾病、病症和症状包括血栓并发症、 过度增生病症和发炎症状。血栓并发症包括血栓症、栓塞、血栓栓塞、深静脉血栓、肺栓塞、 心肌梗塞和中风。过度增生病症包括癌症。发炎症状包括风湿性关节炎和纤维化。本发明的实施方式提供了用于治疗、预防或改善因子7相关疾病的因子7特异性 抑制剂。在某些实施方式里，因子7特异性抑制剂是核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小 分子和能够抑制因子7mRNA和/或因子7蛋白的表达的其它试剂。本发明的实施方式提供了因子7特异性抑制剂，如本文所述，用于治疗、预防或改 善血栓并发症例如血栓症、栓塞、血栓栓塞、深静脉血栓、肺栓塞、心肌梗塞和中风。本发明的实施方式提供了因子7特异性抑制剂，如本文所述，用于治疗、预防或改 善血栓并发症，如本文所述，通过与另外的试剂或疗法结合治疗，如本文所述。试剂或疗法 可以共同给药或者伴随给药。本发明的实施方式提供了因子7特异性抑制剂的应用，如本文所述，用于制备治 疗、预防或改善血栓并发症的药物，如本文所述，通过与另外的试剂或疗法结合治疗，如本 文所述。试剂或疗法可以共同给药或者伴随给药。本发明的实施例提供了因子7抑制剂的应用，如本文所述，用于制备治疗、预防或 改善血栓并发症的药物，如本文所述，用于患者并随后给药以另外的试剂或治疗，如本文所 述。本发明的实施方式提供了用于治疗、预防或改善血栓并发症的试剂盒，如本文所 述，其中所述试剂盒包括(i)如本文所述的因子7特异性抑制剂；和可选择地(ii)如本文 所述的另外的试剂或疗法。本发明的试剂盒可以进一步包括使用所述试剂盒用于治疗、预防或改善血栓并发 症的说明书，如本文所述，通过联合治疗，如本文所述。本发明的实施方式提供了靶向于因子7核酸的反义化合物。在某些实施方式 里，所述人因子7核酸是下列序列的任意一个GENBANKAccession No. NT_027140. 6，截取 1255000-1273000(本文引用作为 SEQ ID NO 1) ,GENBANK Accession No. ΝΜ_019616· 2 (本 文引用作为 SEQ ID NO 2), GENBANK Accession No. DB184141. 1 (本文引用作为 SEQ ID N0:3)，和 GENBANK Accession No. NM_000131. 3 (本文引用作为 SEQ ID NO: 167)。在某些实施方式里，恒河猴因子7核酸是下列序列的任意一个GENBANK Accession NoNW_001104507. 1，截取核苷酸 69IOOO-7O6OOO (本文引用作为 SEQ IDNO 162)和GENBANK Accession No. 3360_061_B (本文引用作为 SEQ ID N0:163)。在某些实施方 式里，小鼠因子7核酸是下列序列GENBANK Accession No. NT_039455. 6，截取核苷酸 10024000-10037000(本文引用作为 SEQ ID NO :160)。反义化合物寡聚化合物包含，但不限于，寡核苷酸，寡核苷，寡核苷酸类似物，寡核苷酸模拟物 (mimetics)，反义化合物，反义寡核苷酸和siRNA。寡聚化合物可以与靶向核酸“反义”，意 思是它能够通过氢键与靶向核酸杂交。在某些实施方式里，反义化合物具有这样的碱基序列，当其以5’到3’方向书写的 时候，包含其靶向的靶向核酸的靶向片段的反向互补物。在某些所述实施方式里，反义寡核 苷酸具有这样的碱基序列，当其以5’到3’方向书写的时候，包含其靶向的靶向核酸的靶向 片段的反向互补物。在某些实施方式里，靶向于因子7核酸的反义化合物是12-30亚单元长度。也就 是说，反义化合物是12-30个连接的亚单元。在其它实施方式里，所述反义化合物是8-80， 12-50，15-30，18-24，19-22，或20个连接的亚单元。在某些所述实施方式里，所述反义化合 物是 8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32， 33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57， 58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，或 80 个连接 的亚单元长度，或由以上值的任意两个所确定的范围内。在某些实施方式里所述反义化合 物是反义寡核苷酸，而所述连接的亚单元是核苷酸。在某些实施方式里，缩短的或截断的靶向因子7核酸的反义化合物具有从5’端删 除的单一亚单元(5’截断)，或可选地从3’端(3’截断)。缩短的或截断的靶向因子7核 酸的反义化合物可以具有从5’端删除的2个亚单元，或可选地可以具有从3’端删除的2 个亚单元。可选地，所述删除的核苷可以通过散布贯穿所述反义化合物；例如，具有从5’端 删除的一个核苷和从3’端删除的一个核苷的反义化合物。当单一的添加的亚单元出现在延长的反义化合物中时，所述添加的亚单元可以位 于所述反义化合物的5’或3’末端。当存在两个或更多添加的亚单元时，所述添加的亚单 元可以彼此相临；例如，在具有添加于5’端(5’添加)或可选地于3’端(3’添加)的2个 亚单元的反义化合物中。可选地，所述添加的亚单元可以散布贯穿所述反义化合物，例如， 在具有一个添加到5’端的亚单元和一个添加到3’端的亚单元的反义化合物中。可以增加或减少反义化合物例如反义寡核苷酸的长度和/或引入不匹配碱基而 不消除其活性。例如，在Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :7305_7309，1992)中， 测试了一系列13-25个碱基长度的反义寡核苷酸在卵母细胞注射模型中诱导靶向RNA断裂 的能力。25个碱基长度并在反义寡核苷酸末端具有8或11个不匹配碱基的反义寡核苷酸 能够指导靶向mRNA的特异性断裂，虽然是以相比不含有不匹配碱基的反义寡核苷酸较小 的程度。相似的，使用13个碱基并具有1或3个不匹配碱基的反义寡核苷酸也达到了靶向 特异性断裂。Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93 :463-471, March 2001)证明了具有与 bcl-2mRNA 100%互补性而与bcl_xL mRNA具有3个不匹配碱基的寡核苷酸能够在体内和 体外降低bcl-2和bcl-xL两者的表达。进一步，所述寡核苷酸证明了有效的体内抗肿瘤活性。Maher and Dolnick(Nuc. Acid. Res. 16 :3341-3358,1988)分别测试了一系列串联 14个碱基的反义寡核苷酸，以及由2或3个所述串联寡核苷酸的序列组成的28和42个碱 基的反义寡核苷酸，测试了其在兔网状细胞检验中阻止人DHFR翻译的能力。所述3个14 碱基的反义寡核苷酸的每个单独都能够抑制翻译，虽然相比所述观或42碱基的反义寡核 苷酸以更小的水平。反义化合物基序在某些实施方式里，靶向因子7核酸的反义化合物具有以某种模式或基序排列的 化学修饰的亚单元，以授予反义化合物的性质，例如增强的抑制活性，增加的对靶向核酸的 结合亲和力，或在体内对核酸酶降解的抗性。嵌合反义化合物典型地含有至少一个修饰的区域以授予增加的对核酸酶降解的 抗性，增加的细胞吸收，增加的对靶向核酸的结合亲和力，和/或增加的抑制活性。嵌合反 义化合物的第二区域可以任选地作为细胞的核酸内切酶RNase H的底物，该RNase H切断 RNA =DNA双链体的RNA链。具有gapmer基序的反义化合物被认为是嵌合反义化合物。在gapmer中，具有多 个核苷酸的中间区域支持RNaseH切断，该区域位于具有与所述中间区域的核苷酸化学相 异的多个核苷酸的延长区域之间。在这种具有gapmer基序的反义寡核苷酸中，间隙片段支 持靶核酸的切断，而侧翼片段包含修饰的核苷以增强稳定性、亲和力和核酸外切酶抗性。在 某些实施方式里，gapmer的各区域通过包含每个不同区域的糖片段来区分。在某些实施方 式里，用于区分gapmer的区域的糖基团类型可以包括β-D-核糖核苷、β-D-脱氧核糖核 苷、2’ -修饰的核苷(这种2’ -修饰的核苷可以包括2’ -Μ0Ε，和2’ -O-CH3，以及其它)和 二环糖修饰的核苷(这种二环糖修饰的核苷可以包括具有4’ -(CH2) η-0-2’桥连的核苷， 其中11 = 1或11 = 2)。优选地，每个相异区域包含统一的糖片段。所述侧翼-间隙-侧翼 基序经常被表示为“Χ-Υ-Ζ”，其中“X”代表5’侧翼区域的长度，“Y”代表间隙区域的长度， “Ζ”代表3’侧翼区域的长度。如本文所用，表示为“Χ-Υ-Ζ”的gapmer具有这样的结构，其 中所述间隙片段位于与5’侧翼片段和3’侧翼片段的每一个直接相邻。从而，在5’侧翼片 段与间隙片段之间，或间隙片段与3’侧翼片段之间，都不存在插入的核苷酸。本文所描述 的任何反义化合物都可以具有gapmer基序。在某些实施方式里，X和Z是相同的，而在其 它实施方式里他们是不同的。在优选的实施方式里，Y是8-15的核苷酸。X、Y或Z可以是 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，25，30 或更多核苷酸的任意。因 此，本发明的 gapmer 包括但不限于，例如，5-10-5，4-8-4，4-12-3，4-12-4，3-14-3，2-13-5， 2-16-2，1-18-1，3-10-3，2-10-2，1-10-1 或 2-8-2。在某些实施方式里，所述反义化合物具有“wingmer”基序，具有侧翼-间隙或间 隙-侧翼结构，即X-Y或Y-Z结构，如上所述，作为gapmer结构。因此，本发明的wingmer 结构包括但不限于，例如，5-10，8-4，4-12，12-4，3-14,16-2,18-1,10-3, 2-10,1-10,8-2, 2-13，或 5-13。在某些实施方式里，靶向因子7核酸的反义化合物拥有5-10-5gapmer基序。在某些实施方式里，靶向因子7核酸的反义化合物拥有3-14-3gapmer基序。在某些实施方式里，靶向因子7核酸的反义化合物拥有2-13-5gapmer基序。
在某些实施方式里，靶向因子7核酸的反义化合物拥有2-12-2gapmer基序。在某些实施方式里，靶向因子7核酸的反义化合物具有间隙扩展(gap-widened) 的基序。在某些实施方式里，靶向因子7核酸的间隙扩展反义寡核苷酸具有14个2 ’ -脱氧 核糖核苷的间隙片段位于3个化学修饰的核苷的侧翼片段之间并与之直接相邻。在某些实 施方式里，所述化学修饰包括2’-糖修饰。在另一种实施方式里，所述化学修饰包括2’_M0E 糖修饰。在某些实施方式里，靶向因子7核酸的间隙扩展反义寡核苷酸具有13个2’ -脱 氧核糖核苷的间隙片段位于2个化学修饰的核苷的5’侧翼片段和5个化学修饰的核苷的 3’侧翼片段之间并与之直接相邻。在某些实施方式里，所述化学修饰包括2’-糖修饰。在 另一种实施方式里，所述化学修饰包括2’ -MOE糖修饰。靶核酸、靶向区域和核苷酸序列编码因子7基因序列的核苷酸序列包括，但不限于，下列GENBANK Accession No. NT_027140. 6，截取 1255000-1273000，由 GENBANK 于 2001 年 7 月 12 日首次保存，本文引用作为 SEQ ID NO 1 ；GENBANK Accession No. NM_019616. 2, 由GENBANK 于2000年10月3日首次保存，本文引用作为SEQ ID no :2 ； GENBANK Accession No. DB184141. 1，由 GENBANK 于 2005 年 12 月 11 日首次保存，本文引用作为 SEQ ID NO 3 ；GENBANK Accession No. NM_000131. 3，由 GENBANK 于1999年3月M日首次保存，本文引用作为SEQ ID NO :167 ；GENBANK Accession No. NT_039455. 6，截取 10024000-10037000，由 GENBANK 于 2003 年 2 月 24 曰首次保存，本文引用作为 SEQ ID NO :160 ；GENBANK Accession No. NW_00104507. 1，本 文引用作为 SEQ ID NO :162 ；以及GENBANKAccession No. 3360_061_B，本文引用作为 SEQ ID NO :163。应当理解，本文的实施例里所列的每个SEQ ID NO的序列都与糖片段、核苷间连接 或碱基的任何修饰无关。同样的，由SEQ ID NO所定义的反义化合物可以独立地包含一个 或多个糖片段、核苷间连接或碱基的修饰。以Isis号码(Isis No.)标记的反义化合物指 示了碱基序列和基序的结合。在某些实施方式里，靶向区域是靶向核酸的结构性确定区域。例如，靶向区域可以 包含3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接头、编码区域、翻译起始区域、翻译终 止区域或其它确定的核酸区域。因子7基因序列的结构性确定区域可以通过序列数据库例 如NCBI的登记号来获得，这些信息本文引入作为参考。在某些实施方式里，靶向区域可以 包含从靶向区域内的一个靶向片段的5’靶向位点到靶向区域内的另一个靶向片段的3’靶 向位点的序列。靶向包括确定至少一个反义化合物杂交的靶向片段，从而产生所希望的效果。在 某些实施方式里，所述所希望的效果是降低mRNA靶核酸水平。在某些实施方式里，所述所 希望的效果是降低由所述靶向核酸编码的蛋白的水平，或与靶向核酸相关联的表型的改变。靶向区域可以包含一个或多个靶向片段。靶向区域内的多个靶向片段可以是相互 重叠的。可选地，它们可以是不重叠的。在某些实施方式里，靶向区域内的靶向片段由不
17多于约300个核苷酸分开。在某些实施方式里，靶向区域内的靶向片段由所述靶向核酸的 一定数目的核苷酸分开，所述的数目约为，或不多于，或不多于约250，200，150，100，90，80， 70，60，50，40，30，20，或10个核苷酸，或者上述数值的任意两个所确定的范围。在某些实施 方式里，靶向区域内的靶向片段由靶向核酸的不多于，或不多于约，5个核苷酸分开。在某些 实施方式里，靶向片段是相连的。预期的靶向区域由本文所列的任何5’靶向位点或3’靶 向位点为开始核酸的范围来确定。可以从5’ UTR、编码区域、3’ UTR、内含子、外显子或内含子/外显子接头内找到合 适的靶向片段。包含起始密码子或终止密码子的靶向片段也是合适的靶向片段。合适的靶 向片段可以特异性包含某种结构性确定区域，例如所述起始密码子或终止密码子。合适的靶向区域的确定可以包括靶向核酸序列与贯穿基因组的其它序列相比较。 例如，BLAST算法可以用于鉴别不同核酸之间的相似性区域。这种比较可以防止选择与所 选择的靶向核酸之外的序列(即非靶向或脱离靶向序列)以非特异的方式杂交的反义化合 物序列。在活性靶向区域内的反义化合物可以具有多种活性(例如，通过靶向核酸水平的 降低百分比来确定)。在某些实施方式里，因子7mRNA水平的降低指示了因子7表达的抑 制。因子7蛋白水平的降低也指示了靶向mRNA表达的抑制。进一步，表现型的改变也指示 了因子7表达的抑制。例如，延长的PT时间可以指示因子7表达的抑制。在另一个实施 例里，延长的aPTT时间同延长的PT时间一起指示因子7表达的抑制。在另一个实施例里， 血小板因子4(PF-4)表达水平的降低指示因子7表达的抑制。在另一个实施例里，血栓形 成的减少或血栓形成时间的增加能够指示因子7表达的抑制。杂交在某些实施方式里，杂交发生在本文所公开的反义化合物与因子7核酸之间。 杂交最通常的机制涉及所述核酸分子的互补碱基之间的氢键(例如，Watson-Crick, Hoogsteen 或反 Hoogsteen 氧键)0杂交可以在多种条件下发生。严格条件是序列依赖性的并由用于杂交的核酸分子 的特征和组成决定。确定序列是否特异性杂交于靶向核酸的方法是本领域所熟知的。在某些实施方式 里，本文提供的反义化合物特异性杂交于因子7核酸。互补性当反义化合物的足够数量的碱基能够通过氢键与靶向核酸的对应碱基相结合，从 而导致发生所希望的效果(例如，靶向核酸例如因子7核酸的反义抑制)的时候，反义化合 物与靶向核酸是相互互补的。假如所述反义化合物仍然能够特异性杂交于靶向核酸的话，反义化合物与因子7 核酸之间的非互补碱基也是可以容忍的。进一步，反义化合物可以杂交于因子7核酸的一 个或多个片段从而插入或相邻片段不干涉杂交(例如，环结构，不匹配或发夹结构)在某些实施方式里，本文提供的反义化合物，或其特定的部分，是，或者至少是， 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98%，99%，或100%互补于因子7核酸，靶向区域，靶向片段，或其特定的部分。反义化合物 与靶向核酸的互补百分比可以用常规方法确定。
例如，如果反义化合物的20个碱基中的18个与靶向区域互补并因此能够特异性 杂交，则该反义化合物展现90%互补。在这个实例里，其余的非互补碱基可以是聚集的或 分散于互补核苷酸的并且不需要相互连续或与互补碱基连续。因此，18个核苷酸长度并具 有侧面与两个与靶向核酸完全互补的区域相连接的4个非互补碱基的反义化合物总体上 与所述靶向核酸具有77. 8 %互补，并从而落入本发明的范围。反义化合物与靶向核酸区域 的互补百分比可以用本领域公知的BLAST程序(基本局域线性搜索工具)和PowerBLAST 程序常规地确定(Altschul et al. , J. MoI. Biol. ,1990,215,403410 ；Zhang andMadden, Genome Res.，1997，7，649656)。同源百分比、序列同一性或互补性可以通过例如Gap程序 (Wisconsin Sequence AnalysisPackage,Version 8for Unix,Genetics Computer Group, UniversityResearch Park, Madison Wis.)确定，使用默认设置，采用 Smith 和 Waterman 的 算法(Adv. App 1. Math.，1981，2，482489)。在某些实施方式里，本文提供的反义化合物，或其特定部分，与靶向核酸或其特定 部分完全互补(即100%互补)。例如，反义化合物可以完全互补于因子7核酸，或靶向区 域，或其靶向片段或靶向序列。如本文所用，“完全互补”意思是反义化合物的每个碱基都 能够与靶向核酸的对应碱基精确配对。例如，20个碱基的反义化合物与400个碱基长度的 靶向序列完全互补，只要靶向核酸中有与所述反义化合物完全互补的对应的20个碱基部 分。完全互补也可以用于第一和/或第二核酸的特定部分。例如，30个碱基的反义化合物 的20个碱基部分可以与400个碱基长度的靶向序列“完全互补”。如果靶向序列具有对应 的20个碱基部分，其中每个碱基与所述反义化合物的20个碱基部分的每个碱基互补，则所 述30个碱基的寡核苷酸的20个碱基部分与所属靶向序列完全互补。这时候，该整个30个 碱基的反义化合物可以或可以不与所述靶向序列完全互补，取决于所述反义化合物的其余 10个碱基是否也与靶向序列互补。非互补碱基的位置可以在反义化合物的5’端或3’端。可选地，所述非互补碱基 可以在反义化合物的内部位置。当两个或多个非互补碱基存在时，它们可以是连续的(也 就是相连的)或不连续的。在一个实施方式里，非互补碱基位于gapmer反义寡核苷酸的 侧翼片段。在某些实施方式里，具有或达到12，13，14，15，16，17，18，19，或20个碱基长度的
反义化合物包含不多于4个，不多于3个，不多于2个，或不多于1个非互补碱基，相对于靶 向核酸，例如因子7核酸，或其特定部分。在某些实施方式里，具有或达到12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25， 沈，27，观，29，或30个碱基长度的反义化合物包含不多于6个，不多于5个，不多于4个，不 多于3个，不多于2个，或不多于1个非互补碱基，相对于靶向核酸，例如因子7核酸，或其 特定部分。本文提供的反义化合物也包括与靶向核酸的部分相互补的反义化合物。如本文所 用，“部分”是指靶向核酸的区域或片段内的确定数目的连续(也就是连接的)碱基。“部 分”也可以指反义化合物的确定数目的连续碱基。在某些实施方式里，所述反义化合物与靶 向片段的至少8个碱基的部分互补。在某些实施方式里，所述反义化合物与靶向片段的至 少12个碱基的部分互补。在某些实施方式里，所述反义化合物与靶向片段的至少15个碱 基的部分互补。也预期了与靶向片段的至少9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或更
19多，或由这些数值的任意两个所确定的范围的碱基的部分互补的反义化合物。同一性本文提供的反义化合物相对于特定核苷酸序列，SEQ ID N0，或由特定的Isis号表 示的化合物，或其部分也具有确定的同一性百分比。如本文所用，如果反义化合物具有相同 碱基配对能力，则该反义化合物与本文公开的序列是同一的。例如，在公开的DNA序列里的 胸腺嘧啶用尿嘧啶取代所得到的RNA，被认为与所述DNA序列是同一的，因为尿嘧啶和胸腺 嘧啶都与腺嘌呤配对。也预期了本发明所描述的反义化合物的缩短或延长的形式，以及具 有非同一碱基的与本文提供的反义化合物相关的化合物。所述非同一碱基可以相互相邻 或分散于反义化合物中。反义化合物的同一性百分比根据具有与对比序列同一的碱基配对 的碱基数目来确定。在某些实施方式里，所述反义化合物，或其部分，与一个或多个本文描述的反义化 合物或SEQ ID NO或其部分相比具有至少70%，75%，80%，85%，90%，95%，96%，97%， 98%，99% 或 100% 的同一性。修饰核苷是碱基-糖结合物。核苷的核碱基(即碱基)部分通常是杂环碱基片段。核 苷酸是进一步包含共价连接于核苷的糖部分上的磷酸基团的核苷。对含有戊呋喃糖基糖 (pentofuranosyl sugar)的核苷，所述磷酸基团可以连接于糖的2’、3’或5’羟基片段上。 寡核苷酸是通过相邻核苷之间的共价连接而形成的线性聚合寡核苷酸。在寡核苷酸结构 内，所述磷酸基团通常用于形成寡核苷酸的核苷间连接。反义化合物的修饰包含核苷间连接、糖片段或碱基的取代或改变。修饰的反义化 合物通常优选天然形式，这是为了所希望的性质，例如，增强的细胞吸收，增强的核酸目标 亲和力，在核酸酶存在下增加的稳定性，或增加的抑制活性。化学修饰的核苷也可以用于增加缩短的或截取的反义寡核苷酸与其靶向核酸的 结合亲和力。从而，可以经常从具有这些化学修饰的核苷的缩短的反义化合物中获得比较结果。修饰的核苷间连接自然存在的RNAse和DNA的核苷间连接时3’到5’磷酸二酯键连接。经常通过 具有天然存在的核苷间连接的反义化合物来选择具有一或多个修饰的，也就是非天然存在 的，核苷间连接的反义化合物，这是为了其所希望的特性，例如，增强的细胞吸收，增强的靶 向核酸亲和力，在核酸酶存在下增加的稳定性。具有修饰的核苷间连接的寡核苷酸包括保留了磷原子和核苷间连接和没有磷原 子的核苷间连接。典型的含磷核苷间连接包括，但不限于，磷酸二酯，磷酸三酯，磷酸甲酯， 磷酸酯酰胺，和硫代磷酸酯。制备含磷和不含磷连接的方法是公知的。在某些实施方式里，靶向因子7核酸的反义化合物包含一或多个修饰的核苷间连 接。在某些实施方式里，所述修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯连接。在某些实施方式里，反 义化合物的每个核苷间连接都是硫代磷酸酯核酸间连接。修饰的糖片段本发明的反义化合物可以典型地包含糖基团被修饰的一或多个核苷。这种糖修饰 的核苷可以给予反义化合物以增强的核酸酶稳定性，增强的结合亲和力或某些其它有益的生物学性质。在某些实施方式里，核苷包含化学修饰的呋喃核糖环片段。化学修饰的呋喃核 糖环的实例包括，但不限于，增加取代基团(包括5’和2’取代基团)，非成对环原子之间的 桥连以形成二环核酸(BNA)，核糖基环的氧原子用S、N(R)或C(Rl) (R) 2 (R = H，C1-C12烷基 或保护基团)及其结合所替换。化学修饰的糖的实例包括2’ -F-5’ -甲基取代的核苷(见 PCT国际申请W02008/101157，2008年8月21日公开，公开了 5，，2，-双取代核苷)或核糖 基环的氧原子用“S”代替并进一步在2’ -位置有取代(见美国专利申请US2005-0130923， 公开于2005年6月16日)或可选地BNA的5，-取代(见PCT国际申请W02007/i;34181， 公开于2007年11月22日，其中LNA用例如5’ -甲基或5’ -乙烯基取代)。具有修饰的糖片段的核苷的实例包括，但不限于，包含5’-乙烯基、5’-甲基(R或 S)、4’ -S、2’ -F、2’ -OCH3和2’ -0 (CH2) 20CH3取代基团的核苷。该2，位置的取代也可以选自烯 丙基、氨基、叠氮基、硫代基、0-烯丙基、0-C1-C10 烷基、0CF3、0 (CH2) 2SCH3、0 (CH2) 2-0-N(Rm) (Rn)和O-CH2-C ( = 0) -N(Rm) (Rn)，其中Rm和foi分别独立地是H或取代或未取代的Cl-ClO 焼基。二环核酸(BNA)的实施例包括，但不限于，包含4’和2’核糖基环原子之间的桥连 的核苷。在某些实施方式里，本文提供的反义化合物包括一个或多个BNA核苷，其中所述 桥连包含下式之一 4' -(CH2)-0-2' (LNA) ；4' -(CH2)-S-2' ；4' -(CH2)-0-2' (LNA)； 4 ‘ - (CH2) 2-0-2 ‘ (ENA) ；4 ‘ -C (CH3) 2~0~2 ‘(参见 PCT/US2008/068922)； 4' -CH(CH3) -0-2'和 4' -C-H(CH2OCH3)-0-2'(参见美国专利 7，399，845，公告于 2008 年 7 月 15 日)；4' -CH2-N(OCH3)-2'(参见 PCT/US2008/064591) ;4' -CH2-O-N(CH3)-2‘(参 见美国专利申请US2004-0171570，公开于2004年9月2日)；4' -CH2-N(R)-0-2‘(参见 美国专利 7，427，672，公告于 2008 年 9 月 23 日)；4' -CH2-C(CH3)-2‘禾口 4‘ -CH2-C-(= CH2) -2'(参见PCT/US2008/066154)；其中R独立地是H、C1_C12烷基或保护集团。前述每 一个BNA都包含多种立体化学糖构象，包括，例如，α -L-呋喃核糖和β -D-呋喃核糖(参 见 PCT 国际申请 PCT/DK98/00393，于 1999 年 3 月 25 日以 WO 99/14226 公开)。在某些实施方式里，核苷通过核糖基环以糖替代物取代来修饰。这种修饰包括，但 不限于，所述核糖基环用替代环系(有时指DNA类似物)取代，例如吗啉环，环己烯基环，环 己基环或四氢吡喃环，每一种具有下列化学式之一很多其它二环和三环糖替代环系统也为本领域所公知能用于修饰核苷以整合并 入反义化合物(例如参见综述文章=Leumarm, ChristianJ.)。这种环系统可以经过多种另 外的取代来增强活性。制备修饰的糖的方法对本领域技术人员来说是熟知的。在具有修饰的糖片段的核苷酸中，保留了碱基片段(天然的、修饰的或其结合)以 与适当的核酸靶相杂交。在某些实施方式里，靶向因子7核酸的反义化合物包含一或多个具有修饰的糖 片段的核苷酸。在某些实施方式里，所述修饰的糖片段是2’-Μ0Ε。在某些实施方式里，所 述2’ -MOE修饰的核苷酸排列于gapmer基序内。修饰的碱基碱基修饰或取代在结构上区别于、但是功能上可互换于自然存在或人工合成的未 修饰的碱基。天然的和修饰的碱基都能参与氢键结合。这种碱基修饰可以给反义化合物带来核酸酶稳定性、结合亲和力或其它有益的生物学性质。修饰的碱基包括合成的或天然 的碱基，例如，5-甲基胞嘧啶(5-me-C)。某些碱基取代，包括5-甲基胞嘧啶取代，对增加反 义化合物与靶向核酸的结合亲和力尤其有用。例如，5-甲基胞嘧啶取代显示出增加了核酸 双链体稳定性 0. 6-1. 20C (Sanghvi, Y. S.，Crooke, S. T. and Lebleu, B.，eds.，Antisense Research andApplications, CRC Press, Boca Raton,1993, pp.276-278)。其它未修饰的碱基包括5-羟基甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、 6-甲基和其它烷基取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、2-丙基和其它烷基取代的鸟氨酸、2-硫代尿嘧 啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C ε C-CH3) 尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其它炔烃基衍生物、6-氮杂尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、 5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫烷基、8-羟基和其 它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代尤其是5-溴代、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶 和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和 8-氮杂腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤和7-去氮腺嘌呤、以及3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤。杂环碱基片段也可以包括嘌呤或嘧啶碱基用其它杂环取代的碱基，例如7-去氮 腺嘌呤、7-去氮鸟嘌呤核苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。对增加反义化合物的结合亲和力尤 其有用的碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2，N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨 基丙基腺嘌呤、5-丙炔基鸟嘌呤和5-丙炔基胞嘧啶。在某些实施方式里，靶向因子7的反义化合物包含一或多个修饰的碱基。在某些 实施方式里，靶向因子7核酸的间隙扩展的反义寡核苷酸包含一或多个修饰的碱基。在某 些实施方式里，所述修饰的碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施方式里，每个胞嘧啶都是 5-甲基胞嘧啶。配制药物组合物的组合物和方法反义寡核苷酸可以与药学上可接受的活性或惰性物质混合以制备药物组合物或 配方。配制药物组合物的组合物和方法依赖于很多条件，包括，但不限于，给药途径、疾病范 围或给药剂量。靶向因子7核酸的反义化合物可以通过与合适的药学上可接受的稀释剂或载体 联合而用于药物组合物。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲液(PBS)。PBS是适用于 肠胃给药的组合物的稀释剂。从而，本文描述的方法的一个实施方式是包含靶向因子7核 酸的反义化合物和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方式里，所述药学上 可接受的稀释剂是PBS。在某些实施方式里，所述反义化合物是反义寡核苷酸。包含反义化合物的药物组合物含有任何药学上可接受的盐，酯或所述酯的盐，或 在给药于动物包括人之后能够提供(直接或间接地)生物活性代谢物或残余物的其它任何 寡核苷酸。因此，例如，也公开了反义化合物的药学上可接受的盐，前药，前药的药学上可接 受的盐，和其它生物等价物。合适的药学上可接受的盐包括，但不限于，钠盐和钾盐。前药包括反义化合物的一端或两端合并了另外的核苷，其在体内被内源核酸酶切 断，以形成活性反义化合物。结合反义化合物反义化合物可以共价连接于一或多个片段或结合物，后者增强所形成的反义寡核 苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收。典型的结合集团包括胆固醇片段和脂片段。其它的结合集团包括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲唆、蒽醌、吖唆、荧光素、罗丹明、香豆 素和染料。反义化合物也可以被修饰以具有一或多个稳定基团，它们通常结合于反义化合物 的一端或两端以增强例如核酸酶稳定性等性质。稳定基团包括帽子结构。这些末端修饰 能保护具有末端核酸的反义化合物以防止核酸外切酶降解，并能帮助细胞内递送和/或定 位。所述帽子可以出现在5’ -末端(5’ -帽)或3’ -末端(3’ -帽)，或者出现于两个末 端。帽子结构是本领域公知的，包括例如反向脱氧无碱基帽子。进一步可用做反义化合物 的一端或两端的帽子的3’和5’ -稳定基团能够给予核酸酶稳定性，包括如公开于2003年 1月16日的W003/004602所公开的内容。细胞培养和反义化合物处理反义化合物对因子7核酸的水平、活性或表达的效果可以用多种细胞类型在体 外检测。用于这些分析的细胞类型可以来自商业厂家(例如American Type Culture Collection, Manassus, VA ；Zen—Bio, Inc. , Research Triangle Park, NC ；Clonetics Corporation, ffalkersville, MD)，细胞根据厂家的说明书使用商业上可获得的试剂(例如 Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)来培养。示例性的细胞类型包括 IfepG2 细 胞、H印B3细胞和原代肝细胞。反义寡核苷酸的体内测试本文描述了用反义寡核苷酸处理细胞的方法，可以合理的修饰以用其它反义化合 物进行处理。总体来说，当细胞在培养基中达到约60-80%融合的时候用反义寡核苷酸处理。通常用于介导反义寡核苷酸进入培养的细胞的一种试剂包括阳离子脂 转染试剂 LIPOFECTIN (Invitrogen，Carlsbad, CA)。反义寡核苷酸与 LIPOFECTIN 在 OPTI- MEM ianvitr0gen，CarlSl3ad，CA)中混合以达到所希 望的反义寡核苷酸终浓度和LIPOFECTIN 浓度，代表性的在2-12ug/mL每IOOnM反 义寡核苷酸的范围。用于介导反义寡核苷酸进入培养的细胞的其它试剂包括 LIPOFECTAMINE (Invitrogen，Carlsbad, CA)。反义寡核苷酸与 LIPOFECTAMINE 在 ΟΡΤΙ- MEM ι 减少的血清培养基(Invitrogen， Carlsbad,CA)中混合以达到所希望的反义寡核苷酸终浓度和UPOFECTAMINE 浓度，代表性的在2-12ug/mL每IOOnM反义寡核苷酸的范围。用于介导反义寡核苷酸进入培养的细胞的另一种技术包括电穿孔。以通用方法用反义寡核苷酸处理细胞。细胞代表性地在反义寡核苷酸处理16- 小时之后收获，这时候靶核酸的RNA或蛋白水平通过本领域公知的和本文描述的方法测 量。通常来说，当进行多次重复处理时，数据用重复处理的平均值来表示。反义寡核苷酸的浓度对不同的细胞系有所不同。确定对特定细胞系的最佳反义 寡核苷酸浓度的方法是本领域熟知的。当用LIPOFECTIN 转染的时候，反义寡 核苷酸典型地使用从InM到300nM的浓度范围。用电穿孔转染的时候反义寡核苷酸使用 625-20, OOOnM范围的更高浓度。RNA 分离
RNA分析可以通过总细胞RNA或poly (A) +mRNA来进行。RNA分离的方法是本领域 熟知的。RNA通过本领域熟知的方法来制备，例如，使用TRIZOL 试剂(Invitrogen， Carlsbad, CA)，根据生产商推荐的步骤。靶水平或表达的抑制的分析因子7核酸的水平或表达的抑制可以以本领域所熟知的多种途径来分析。例 如，靶向核酸水平可以可以通过例如Northern杂交分析、竞争性反转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)或定量实时RT-PCR来定量测量。RNA分析可以通过总细胞RNA或poly (A) +mRNA进 行。RNA分离的方法是本领域熟知的。Northern杂交分析也是本领域通用的。实时RT-PCR 可以用商业上允许的ABI PRISM 7600，7700，或7900序列探测系统来方便地完成，所 述序列探测系统可以来自PE-Applied Biosystems,Foster City，CA，并根据生产商的说明 书来使用。靶向RNA水平的定量实时RT-PCR分析靶向RNA水平的定量可以通过定量实时RT-PCR来进行，使用ABI PRISM 7600，7700，或 7900 序列探测系统(PE-AppliedBiosystems, Foster City, CA)根据生产商 的说明书来进行。实时RT-PCR的方法是本领域所熟知的。在实时PCR之前，分离的RNA用于反转录酶(RT)反应，产生互补DNA (cDNA)，之后 其被用作实时PCR放大的底物。所述RT和实时PCR反应在同一个样品孔内顺序进行。RT 和实时PCR试剂从hvitroger^Carlskid，CA)获得，实时PCR反应通过本领域技术人员熟 知的方法来完成。由实施RT-PCR获得的基因(或RNA)靶的量用表达量是常数的基因例如亲环素 A(cyclophilin Α)的表达水平来标准化，或通过使用RIBOGREEN (Invitrogen， Inc. Carlsbad, CA)定量化总RNA。亲环素A的表达用实时RT-PCR来定量，与目标混合 起来或分开同时进行。总RNA用RIBOGREEN RNA定量化试剂(Invitrogen， Inc. Eugene, OR)。用 RIBOGREEN 定量化 RNA 的方法由 Jones，L. J.等人教导 (Analytical Biochemistry, 1998，265, 368-374)。 CYTOFLUOR 4000 设备(ΡΕ Applied Biosystems)用于测量 RIBOGREEN 荧光。设计了与因子7核酸杂交的探针和引物。设计实时RT-PCR探针和引物的方法 是本领域熟知的，并且可以包括使用软件例如I3RIMER EXPRESS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA)。蛋白质水平分析因子7核酸的反义抑制可以通过测量因子7蛋白水平来评估。因子7的蛋白水平 可以用本领域熟知的多种途径来评价和定量，例如免疫沉淀反应、Western杂交分析(免疫 杂交)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、定量蛋白质分析、蛋白质活性分析(例如，半胱氨酸蛋 白酶活性分析)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光激活细胞分类(FACS)。定向于目标的 抗体可以通过多种途径来获得，例如抗体的MSRS目录(Aerie Corporation, Birmingham, MI)，或者可以通过本领域所熟知的常规的单克隆或多克隆抗体制备方法来制备。用于探测 人或小鼠的因子7的抗体也是商业上可获得的。反义化合物的体内测试反义化合物，例如，反义寡核苷酸，用于动物内测试以评估其抑制因子7表达和产生表现型改变的能力，例如，延长的PT，延长的aPTT时间，血小板因子4 (PF-4)数量的减少， 血栓形成的减少或血栓形成时间的增加，以及细胞增殖的减少。测试可以在常规动物或实 验性疾病模型动物内进行。为了给药于动物，反义寡核苷酸以药学上可接受的稀释剂例如 磷酸盐缓冲液配制。给药包括肠胃外给药途径，例如腹腔、静脉内和皮下。反义寡核苷酸的 剂量和剂量频率的计算在本领域技术人员的能力之内，并依赖于例如给药途径和动物体重 等因素。反义寡核苷酸处理一段时间之后，从肝脏组织分离RNA，测量因子7核酸表达的改 变。因子7蛋白水平的改变也用血栓生成分析来测量。另外，凝结时间的效果，例如PT和 aPTT，用所处理的动物的血浆来测定。一些指标在某些实施方式里，本发明提供了包括给药以一种或多种本发明的药物组合物以 治疗个体的方法。在某些实施方式里，所述个体患有血栓并发症。在某些实施方式里，所述 个体处于血液凝集症状的风险之中，包括，但不限于，梗死形成、血栓症、栓塞、血栓栓塞，例 如深静脉血栓、肺栓塞、心肌梗塞和中风。也包括患有导致血栓风险的获得性问题、疾病或 病症的个体，例如，外科手术、癌症、不移动、败血症、动脉硬化症、心室纤维性颤动，以及遗 传性因素，例如，抗磷脂综合症和常染色体显性遗传，因子V Leiden。在某些实施方式里，所 述个体被鉴定为需要抗血凝治疗。这样的个体的实例包括，但不限于，正在进行重要的整形 外科手术(例如，臀部/膝盖替换或臀部骨折治疗)的患者和需要慢性治疗的患者例如正 在遭受心室纤维性颤动以阻止中风的患者。在某些实施方式里，本发明提供了在个体内预 防性地减少因子7表达的方法。某些实施方式包括对有需要的个体通过给药以治疗有效量 的靶向因子7核酸的反义化合物来治疗。在某些实施方式里，包含靶向因子7的反义化合物的药物组合物被用于制备治疗 正遭受或易患血栓并发症的患者的药物。在某些实施方式里，因子7与组织因子的结合以形成组织因子-因子7a复合物可 以导致发炎症状，例如肝纤维化、风湿性关节炎、肿瘤生长和转移。在某些实施方式里，所述个体患有导致纤维化并发症的发炎症状。在某些实施 方式里，所述个体处于过分的胶原沉积和纤维化病症的风险中，包括，但不限于，肝纤维 化、动脉硬化、慢性肾小球性肾炎、皮肤瘢痕疙瘩形成、进行性系统性硬化症(PSQ、肝纤维 化、肺栓塞、囊性纤维化、慢性移植性抗宿主病、硬皮病(局部的或系统性的)、派罗尼病 (Peyronie' s disease)、阴茎纤维化、膀胱内部检验镜之后的尿道狭窄、治疗后的内增长、 骨髓纤维化、先天性腹膜后纤维化。在某些实施方式里，所述个体被鉴定需要抗纤维化治 疗。这包括具有导致纤维化风险的遗传的或获得性问题、疾病或病症的个体，例如，α -抗 胰蛋白酶缺乏症、铜累计病(威尔逊病，Welson’ s disease)、果糖血症、半乳糖血症、糖原 贮积症(例如，II、IV、VI、IX和X型)、铁过量综合症(例如，血色素沉着病)、脂质异常症 (例如，高雪氏病Gaucher’ s disease)、过氧化物病症(例如，Zellweger综合症)、酪氨酸 血症、先天性肝纤维化、细菌感染(例如，布氏菌病)、寄生虫感染(例如，包虫病)、病毒感 染(例如，慢性肝炎B、C)、影响肝脏血液流动的病症(例如，布-加氏综合症Budd Chiari综 合症、心力衰竭、肝小静脉闭塞症和门静脉血栓)、乙醇和药物(例如乙胺碘呋酮、氯丙嗪、 异烟胼、甲氨蝶呤、甲基多巴、酚丁和甲苯磺丁脲)。在某些实施方式里，所述个体被确定需 要抗纤维化治疗。在这些实施方式里，确定了组织因子-因子7a (TF/F7a)复合物在纤维化
25中具有主要的促血凝活性。在某些实施方式里，本发明提供了在个体内预防性地减少因子 7表达的方法。某些实施方式包括对需要的个体给药以治疗有效量的靶向因子7核酸的反 义化合物以治疗。在某些实施方式里，含有靶向因子7的反义化合物的药物组合物用于制备治疗正 遭受或易感纤维化并发症的患者的药物。在某些实施方式里，所述个体患有发炎性的风湿性关节炎并发症。在某些实施方 式里，所述个体处于关节部位发炎和风湿性关节炎的风险中。在这些实施方式里，所述个体 遭受疼痛、关节肿胀和压痛、疲劳、食欲不振、低度发烧、肌肉疼痛和僵硬。在某些实施方式 里，所述个体被确定需要抗炎症治疗。这包括遭受风湿性关节炎、反应性关节炎、Reiter综 合症、牛皮癣关节炎、强直性脊椎炎和伴随肠炎疾病的关节炎。在某些实施方式里，所述个 体被确定需要抗炎症治疗。在这些实施方式里，确定了所述组织因子-因子7a(TF/F7a)复 合物在诱导关节炎时具有主要的促凝血活性。在某些实施方式里，本发明提供了在个体内 预防性地减少因子7表达的方法。某些实施方式包括对需要的个体给药以治疗有效量的靶 向因子7核酸的反义化合物以治疗。在某些实施方式里，含有靶向因子7的反义化合物的药物组合物用于制备治疗正 遭受或易感炎症并发症的患者的药物。在某些实施方式里，所述个体患有恶性并发症。在某些实施方式里，所述个体处于 肿瘤生长、血管生成和转移的风险中。在这些实施方式里，遭受止血异常，例如扩散性血管 内血凝固和静脉血栓的个体，可能遭受其它并发症，例如原始的和转移的肿瘤生长。在这些 实施方式里，肿瘤转移的定位是血凝依赖性过程。在这些实施方式里，确定了所述组织因 子-因子7a(TF/F7a)复合物在癌症中具有主要的促凝血活性。在某些实施方式里，所述个 体被确定需要抗TF/F7a治疗。在某些实施方式里，本发明提供了在个体内预防性地减少因 子7表达的方法。某些实施方式包括对需要的个体给药以治疗有效量的靶向因子7核酸的 反义化合物以治疗。在某些实施方式里，含有靶向因子7的反义化合物的药物组合物用于制备治疗正 遭受或易感恶性并发症的患者的药物。在某些实施方式里，对个体给药以治疗有效量的靶向因子7核酸的反义化合物伴 随着监控其血清内因子7的水平，以确定个体对给药反义化合物的反应。个体对给药反义 化合物的反应由医师用于确定治疗性干涉的用量和持续时间。在某些实施方式里，给药以靶向因子7核酸的反义化合物导致了因子7表达减少 至少 15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95 或 99%，或由这些值的任 意两个所确定的范围。在某些实施方式里，给药以靶向因子7核酸的反义化合物导致了血 液凝集的测量的改变，通过标准方法测量，例如，但不限于，活性部分血凝固时间(aPTT)测 试和凝血酶原时间(PT)测试，凝血酶时间(TCT)，出血时间，或D-二聚物。在某些实施方 式里，给药以因子7反义化合物增加了所述测量以至少15，20，25，30，35，40，45，50，55，60， 65，70，75，80，85，90，95或99 %，或由这些值的任意两个所确定的范围。在某些实施方式 里，给药以因子7反义化合物降低了所述测量的至少15，20，25，30，35，40，45，50，55，60， 65，70，75，80，85，90，95或99%，或由这些值的任意两个所确定的范围。在某些实施方式里，包含靶向因子7的反义化合物的药物组合物用于制备治疗遭受或易感血凝固并发症的患者的药物。特定联合治疗在某些实施方式里，本发明的一种或多种药物组合物与一种或多种其它药物试剂 联合给药。在某些实施方式里，这些一种或多种其它药物试剂是用于治疗与本发明的一种 或多种药物组合物相同的疾病、病症或症状。在某些实施方式里，这些一种或多种其它药物 试剂是用于治疗与本发明的一种或多种药物组合物不同的疾病、病症或症状。在某些实施 方式里，这些一种或多种其它药物试剂是用于治疗由本发明的一种或多种药物组合物引起 的不希望的副所用。在某些实施方式里，本发明的一种或多种药物组合物与另一种药物试 剂联合给药以治疗其它药物试剂引起的不希望的效果。在某些实施方式里，本发明的一种 或多种药物组合物与另一种药物试剂联合给药以产生联合效果。在某些实施方式里，本发 明的一种或多种药物组合物与另一种药物试剂联合给药以产生协同效应。在某些实施方式里，本发明的一种或多种药物组合物和一种或多种其它药物试剂 同时给药。在某些实施方式里，本发明的一种或多种药物组合物和一种或多种其它药物试 剂在不同时间给药。在某些实施方式里，本发明的一种或多种药物组合物和一种或多种其 它药物试剂配制在同一个配方里。在某些实施方式里，本发明的一种或多种药物组合物和 一种或多种其它药物试剂分开配制。在某些实施方式里，可以与本发明的药物组合物联合给药的药物试剂包括抗凝血 剂或抗血小板试剂。在某些实施方式里，可以与本发明的药物组合物联合给药的药物试剂 包括，但不限于阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、噻氯匹定、杀鼠灵(和相关的香豆素)、肝 素、直接的凝血酶抑制剂(例如来匹卢定、比伐卢定)、阿哌沙班、依诺肝素以及直接干扰特 定凝血因子的酶活性的小分子化合物(例如利伐沙班，其干扰因子叙)。在某些实施方式 里，所述抗凝血酶或抗血小板试剂在给药本发明的药物组合物之前给药。在某些实施方式 里，所述抗凝血酶或抗血小板试剂在给药本发明的药物组合物之后给药。在某些实施方式 里，所述抗凝血酶或抗血小板试剂与本发明的药物组合物同时给药。在某些实施方式里，联 合给药的抗凝血剂或抗血小板试剂的剂量与所述抗凝血剂或抗血小板试剂单独给药时的 剂量相同。在某些实施方式里，联合给药的抗凝血剂或抗血小板试剂的剂量低于所述抗凝 血剂或抗血小板试剂单独给药时的剂量。在某些实施方式里，联合给药的抗凝血剂或抗血 小板试剂的剂量高于所述抗凝血剂或抗血小板试剂单独给药时的剂量。在某些实施方式里，第二化合物的联合给药增强了第一化合物的抗凝血剂效果， 从而所述化合物的联合给药导致抗凝血效果比单独给药第一化合物时的效果更好。在其它 实施方式里，所述联合给药导致了单独给药所述化合物的效果的附加抗凝血效果。在某些 实施方式里，所述联合给药导致了单独给药所述化合物的效果的上述附加抗凝血效果。在 某些实施方式里，所述第一化合物是反义化合物。在某些实施方式里，所述第二化合物是反 义化合物。在某些实施方式里，解毒剂在因子7特异性抑制剂给药任意时间之后给药。在某 些实施方式里，解毒剂在靶向因子7的反义化合物给药任意时间之后给药。在某些实施方 式里，解毒剂在靶向因子7的反义化合物给药几分钟、几小时、几天、几星期或几个月之后 给药。在某些实施方式里，所述解毒剂是与靶向因子7的反义化合物互补的(例如正义链)。 在某些实施方式里，所述解毒剂是因子7或因子7a蛋白质。在某些实施方式里，所述因子7或因子7a蛋白质是人因子7或人因子7a蛋白质。 实施例非限制性声明及参考引用当本文所述的某些化合物、组合物和方法依照某些实施方式特别地描述的时候， 下列的实施例仅用于举例说明本文所述的化合物而并不有意对其进行限制。在本申请中 引用的每个参考文献都在本文中以整体引用作为参考。实施例1 :!fepB3细胞内人因子7mRNA的反义抑制测试了靶向于因子7核酸的反义寡核苷酸在体外对因子7mRNA的影响。培养好的 密度为每孔4，000细胞的HepB3细胞用含50nM的反义寡核苷酸的脂质体试剂进行转染。在 处理大约M小时后，从细胞分离RNA，用实时RT-PCR测量因子7mRNA的水平，如本文所述。 因子7mRNA的水平根据由RIBOGREEN 测量的总RNA含量进行调整。结果以相对 于未处理的对照细胞的因子7的抑制百分比的形式表示。表1中的嵌合反义寡核苷酸设计为5-10-5M0E gapmer。所述gapmer为20核苷酸 长度，其中中间的间隙片段由10个2’ -脱氧核苷酸组成并在两侧(在5’和3’方向)与 分别由5个核苷酸组成的侧翼片段相连。5’侧翼片段的每个核苷酸和3’侧翼片段的每个 核苷酸都具有2’ -MOE修饰。贯穿每个gapmer的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P = S)连 接。贯穿每个gapmer的所有胞嘧啶核苷残基都是5-甲基胞嘧啶核苷。表1中所列的每 个 gapmer 都靴向于人基因序列 SEQ ID NO 1 (GENBANK Accession No. ΝΤ_027140· 6 的第 1255000-1273000 位核苷酸)、SEQ ID NO 2 (GENBANK Accession No. NM_019616. 2)或 SEQ ID NO 3 (GENBANK Accession No. DB184141. 1)。“人靶起始位点”表示所指定的人基因序 列中所述gapmer靶向的最5’端位置。“人靶终止位点”表示所指定的人基因序列中所述 gapmer靶向的最3’端位置。表 1通过具有5-10-5M0E侧翼片段和脱氧间隙片段、靶向于SEQ ID NO :1，SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的嵌合反义寡核苷酸来抑制 人因子^iRNA水平
寡核苷酸ID靶序列ID号靶起始位点靶终止位点序列(5'至3')% 抑制序列ID号40309011401714036AGTCCTGGGTCATCAGCCGG69440309311423114250GAGACCCTGGTGTACACCCC755407594112081227CCTGCAGCCAGGCAGCCCTG876407595121692188TCCTGAGGCCTTAGCGACCC717407596122062225GAGGCCCCGGCTTCCACGGC618407597111141133TGTTGACATTCCCCATGGGA399407598111471166CCATGATGAAATCTCTGCAG7210407599111561175CCTGGGAGACCATGATGAAA7311407600111901209TGAAGCCCAAGCAGAAGGCA6112407601111961215CAGCCCTGAAGCCCAAGCAG5213407602112071226CTGCAGCCAGGCAGCCCTGA8114407603190739092TAAGAAATCCAGAACAGCTT5415407605191699188TTGAGGCACACTGGTCCCCA5816407606192049223CTGGTCCTTGCAGGAGCCCC8917407607192099228TGGAGCTGGTCCTTGCAGGA7618407608192179236TATAGGACTGGAGCTGGTCC1319407609192269245AGAAGCAGATATAGGACTGG3520407610192349253AGGGAGGCAGAAGCAGATAT3121407611192599278TCTCACAGTTCCGGCCCTCG822权利要求
1.包含由12-30个连接的碱基组成的修饰的寡核苷酸并具有碱基序列的化合物，其 中，所述碱基序列包含至少12个连续碱基部分互补于SEQ ID NO 1的15U8-15233位核苷 酸的同等数目的碱基，其中所述修饰的寡核苷酸至少80%互补于SEQ ID NO :1。
2.如权利要求1所述的化合物，其由修饰的单链寡核苷酸组成。
3.如权利要求2所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸具有SEQID N0:53的碱基 序列。
4.如权利要求2所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸的碱基序列至少80%互补 于 SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、或 SEQ ID NO :167 中任意一个的碱基序列。
5.如权利要求2所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸的碱基序列至少90%互补 于 SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、或 SEQ ID NO :167 中任意一个的碱基序列。
6.如权利要求2所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸的碱基序列100%互补于 SEQ ID NO =USEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、或 SEQ ID NO :167 中任意一个的碱基序列。
7.如权利要求2所述的化合物，其中，至少一个核苷间连接是修饰的核苷间连接。
8.如权利要求7所述的化合物，其中，每个核苷间连接都是硫代磷酸酯核苷间连接。
9.如权利要求2所述的化合物，其中，至少一个核苷含有修饰的糖。
10.如权利要求9所述的化合物，其中，至少一个修饰的糖是二环糖。
11.如权利要求9所述的化合物，其中，至少一个修饰的糖含有2’-0-甲氧乙基。
12.如权利要求2所述的化合物，其中，至少一个核苷包含修饰的碱基。
13.如权利要求12所述的化合物，其中，所述修饰的碱基是5-甲基胞嘧啶。
14.如权利要求2所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸包含由连接的脱氧核苷组成的间隙片段；由连接的核苷组成的5’侧翼片段；由连接的核苷组成的3’侧翼片段；其中，所述间隙片段与所述5’侧翼片段和所述3’侧翼片段直接相连，并位于所述5’ 侧翼片段和所述3’侧翼片段之间；并且每个侧翼片段的每个核苷包含修饰的糖。
15.如权利要求14所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸包含由10个连接的脱氧核苷组成的间隙片段；由5个连接的核苷组成的5’侧翼片段；由5个连接的核苷组成的3’侧翼片段；其中，所述间隙片段与所述5’侧翼片段和所述3’侧翼片段直接相连，并位于所述5’ 侧翼片段和所述3’侧翼片段之间；每个侧翼片段的每个核苷包含2’ -0-甲氧乙基糖；并且 每个核苷间连接是硫代磷酸酯连接。
16.如权利要求14所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸包含由14个连接的脱氧核苷组成的间隙片段；由3个连接的核苷组成的5’侧翼片段；由3个连接的核苷组成的3’侧翼片段；其中，所述间隙片段与所述5’侧翼片段和所述3’侧翼片段直接相连，并位于所述5’ 侧翼片段和所述3’侧翼片段之间；每个侧翼片段的每个核苷包含2’ -0-甲氧乙基糖；并且 每个核苷间连接是硫代磷酸酯连接。
17.如权利要求14所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸包含由13个连接的脱氧核苷组成的间隙片段；由2个连接的核苷组成的5’侧翼片段；由5个连接的核苷组成的3’侧翼片段；其中，所述间隙片段位于所述5’侧翼片段和所述3’侧翼片段之间；每个侧翼片段的每 个核苷包含2’ -0-甲氧乙基糖；并且每个核苷间连接是硫代磷酸酯连接。
18.如权利要求13所述的化合物，其中，所述修饰的寡核苷酸包含由12个连接的脱氧核苷组成的间隙片段；由2个连接的核苷组成的5’侧翼片段；由2个连接的核苷组成的3’侧翼片段；其中，所述间隙片段位于所述5’侧翼片段和所述3’侧翼片段之间；每个侧翼片段的每 个核苷包含2’ -0-甲氧乙基糖；并且每个核苷间连接是硫代磷酸酯连接。
19.组合物，包含修饰的寡核苷酸或其盐以及药学上可接受的载体或稀释剂，其中，所 述修饰的寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，所述12-30个连接核苷包含碱基序列，该碱基 序列包含SEQ ID NO 53的碱基序列的至少12个连续碱基。
20.如权利要求19所述的组合物，其中，所述修饰的寡核苷酸由单链的修饰的寡核苷 酸组成。
21.如权利要求19所述的组合物，其中，所述修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。
22.—种方法，包含以修饰的寡核苷酸给药于动物，所述的修饰的寡核苷酸由12-30个 连续核苷组成，该12-30个连续核苷包含碱基序列，该碱基序列包含SEQ ID NO 53的碱基 序列的至少12个连续碱基。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述动物是人。
24.如权利要求23所述的方法，其中，给药预防深静脉血栓。
25.如权利要求23所述的方法，其中，给药预防肺栓塞。
26.如权利要求23所述的方法，其中，给药治疗过度增生病症。
27.如权利要求23所述的方法，其中，给药治疗发炎症状。
28.如权利要求23所述的方法，包含联合给药以所述化合物和选自下列的任意化合 物阿司匹林、氯吡格雷、双嘧达莫、肝素、来匹卢定、噻氯匹定、杀鼠灵、阿哌沙班、利伐沙 班、和依诺肝素。
29.如权利要求23所述的方法，其中，所述化合物和选自下列的任意化合物阿司匹 林、氯吡格雷、双嘧达莫、肝素、来匹卢定、噻氯匹定、杀鼠灵、阿哌沙班、利伐沙班、和依诺肝 素是伴随给药的。
30.如权利要求23所述的方法，其中，所述给药是肠胃外给药。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述肠胃外给药是皮下或静脉内给药的任意一种。
32.—种方法，包含鉴定动物发生血栓并发症的风险；以及以治疗有效量的化合物给药于具有所述风险的动物，所述化合物包含由12-30个连接 核苷组成的修饰的寡核苷酸，其中，所述修饰的寡核苷酸与因子9核酸互补。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所述血栓并发症是深静脉血栓、肺栓塞、或其结合。
全文摘要
本文公开了用于对有需要的个体减少因子7和治疗或预防血栓并发症、过度增生病症或发炎症状的反义化合物和方法。可以通过给药以靶向因子7的反义化合物来改善的疾病症状包括血栓症、栓塞和血栓栓塞，例如，深静脉血栓、肺栓塞、心肌梗塞、中风、癌症、风湿性关节炎和纤维化。
文档编号C12N15/113GK102076852SQ200880124444
公开日2011年5月25日 申请日期2008年11月5日 优先权日2007年11月9日
发明者布雷特·P·莫尼亚, 张宏, 杰弗里·R·克罗斯比, 苏珊·M·弗赖尔, 赵晨光 申请人:Isis药物公司