包含发酵基因卡盒的自养生物进行光驱动的CO₂还原生成有机化合物以用作燃料或用作...的制作方法

专利名称：包含发酵基因卡盒的自养生物进行光驱动的CO₂还原生成有机化合物以用作燃料或用作 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过向蓝藻(cyanobacterial)细胞培养物供给二氧化碳并给予 光照而生产有机化合物和/或在产生所述有机化合物的途径中生成的中间化合物的方法， 其中所述细胞能够表达一种核酸分子，所述核酸分子的表达给予所述细胞将糖酵解的中间 体例如丙酮酸或3-磷酸甘油醛转化为所述有机化合物和/或所述中间化合物的能力，并且 其中所述核酸分子的表达受一种应答于所述培养物中营养素浓度改变的调控系统的控制。 本发明还涉及用于此方法的蓝藻细胞。
背景技术：
我们的经济是通过使用化石燃料而驱动的。由石油供应耗尽导致的短缺首先影响 我们社会的运输业和化学工业，继而影响人类活动的所有方面。另一个问题是，石油供应的 使用已导致大气中的高浓度CO2累积。能量从根本上是来自太阳，这种能量驱动植物和光合自养细菌的光合作用过程。 这一认知已引出合成生物燃料的新方法。大体上，这些方法使用植物和藻类以将CO2还原到 糖和细胞物质的水平上。采收后，通过酵母发酵将这些终产物转化为乙醇(对于作物)或 通过化学方法转化为生物燃料(对于藻类)。这些方法的总体能量守恒的效率非常低并因 此需要很大的表面积。此外，所述方法的劳动量很大、耗水量极高并且影响食品原料价格从 而对食品供应有不利后果。一种相似程度更小的方法基于将太阳能转化到氢中。此方法也 存在严重的效率低下的问题。多种生物技术方法利用遗传工程生物生产散装或精细化学品、蛋白或抗体。在许 多实例中，已通过提高基因表达和优化生长条件获得了生产增长。在我们知道的所有方法 中，起始碳前体一直是并且仍将是糖(主要是葡萄糖，也使用许多其他单糖和多糖)或相关 有机底物溶剂生产(包括丁醇和乙醇)和有机酸生产(例如乳酸、柠檬酸和琥珀酸)总是 起始于葡萄糖，这使得效率低下，因为所述生产方法使用高能起始化合物作为底物。US 6，699，696描述了 一种通过向蓝藻细胞——尤其是聚球藻 (Synechococcus)——供给二氧化碳而生产乙醇、给予所述蓝藻细胞日光照并收集乙醇的 方法，所述蓝藻细胞含有一种编码使细胞能将丙酮酸转化为乙醇的酶的核酸分子。这一系 统的几个缺点之一是所用的表达系统是温度敏感的，这要求使所述生产系统适于这种调 控。因此，仍然需要不具有现有方法全部缺点的替代甚至改进的有机化合物生产方 法。

发明内容
本发明涉及一种规模可变的生产适合作为化学原料或生物燃料的有机化合物的 方法。本发明结合了光合自养和有机化能营养原核生物的代谢特性并基于使用具有由卡尔文循环中间体转化为发酵终产物的高转化率的重组需氧光营养生物。其新颖性在于a)其 核心化学反应使用CO2作为唯一的含碳前体并使用光(优选日光)作为唯一的能源以驱动 CO2还原，b)多种终产物可以以相同的原理，即引入编码特异性发酵途径的核酸分子卡盒而 实现，以及c)生产受培养基成分的控制并在最合适的时间即细胞密度尽可能最高的时间 开始。然而，在目前燃料生产的应用中，生物体为底物(乙醇生产中的作物)或产物(作为 生物柴油的微藻类)，此处微生物用作将CO2作为底物转化为有用终产物的高度特异的催化 剂。这些催化剂可通过物理和化学系统_生物方法进行优化。实施例1更详尽地描述了本 发明的生物化学背景。下面更详尽地描述本发明的每个方面。
蓝藻在第一个方面，本发明提供能够表达一种核酸分子的蓝藻，其中所述核酸分子的 表达给予所述蓝藻将糖酵解中间体转化为有机化合物和/或转化为产生所述有机化合物 的途径中生成的中间化合物的能力，并且其中所述核酸分子受一种应答于培养所述蓝藻的 营养素的浓度变化的调控系统的控制。在本发明的上下文中，蓝藻或蓝藻细胞为光合单细胞原核生物的蓝绿藻。蓝 藻的实例包括隐球藻属(Aphanocapsa)、鱼腥藻属(Anabaena)、念珠藻属(Nostoc)、 颤藻属 (Oscillatoria)、聚球菌属 (Synechococcus)、球藻属(Gloeocapsa)、阿格藻(Agmmenellumm)、双歧藻属(Scytonema)、鞭枝藻属(Mastigocladus)、节旋藻属 (Arthrosprira)、软管藻属(Haplosiphon)。优选的属为聚球菌属。此属中更优选的种为 集胞藻(Synechocystis)。甚至更优选地，所述集胞藻是巴斯德菌种保藏中心(PCC)6083 集胞藻，其是一种可由公众例如经ATCC获得的菌株。所用的优选生物体为光营养集胞藻 PCC6083 这是一种没有特别营养需要的快速生长的蓝藻。其生理特性有翔实的记载其能 够在广泛条件下存活和生长。例如，如果提供合适的固定碳源例如葡萄糖，集胞藻种PCC 6083可不进行光合作用而生长。也许最重要的是，集胞藻种PCC 6083是第一种全基因组序 列被测定(可在http://www. kazusa. or. jp/cyano/cyano. html上获得)的光合生物。此 外，有一种有效的基因缺失方案(Shestakov SV et al, (2002) ,Photosynthesis Research, 73 :279-284and Nakamura Y et al, (1999)，Nucleic Acids Res. 27 :66_68)对于集胞藻种 PCC 6083是可行的，此外这种生物体还可容易地经同源重组转化(Grigirieva GA et al, (1982)，FEMS Microbiol. Lett. 13 :367_370)。本文定义的蓝藻能够将糖酵解中间体转化为有机化合物和/或转化为如本文所 定义的中间化合物。实施例1给出了本发明的蓝藻的生物化学背景。本文定义的蓝藻优选地包括编码一种酶的核酸分子，所述酶能够将糖酵解中间体 转化为有机化合物和/或转化为如本文所定义的中间化合物。有机化合物在本文中优选地 定义为还原程度比CO2更高的化合物。因此蓝藻能够表达如本文所定义的核酸分子，从而 如本文所定义的核酸分子的表达给予所述蓝藻将糖酵解中间体转化为如本文所定义的有 机化合物和/或中间化合物的能力。糖酵解中间体可为磷酸二羟丙酮、3-磷酸甘油醛、1， 3_ 二磷酸甘油酸、2-磷酸甘油酸、3-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸。优选的糖酵 解中间体为丙酮酸和3-磷酸甘油醛。本领域技术人员知晓，转化为要生产的有机产物的糖 酵解中间体的种类取决于要生产的有机产物的种类。优选的有机产物选自C1，C2，C3，C4，C5或C6烷醇、烷二醇、烷酮、烯烃或有机酸。优选的烷醇为C2、C3或C4烷醇。更优选的为乙醇、丙醇、丁醇。优选的烷二醇为1，3_丙二 醇。优选的烷酮为丙酮。优选的有机酸为D-乳酸。优选的烯烃为乙烯。优选的用于生产乙醇、丙醇、丁醇、丙酮或D-乳酸的糖酵解中间体为丙酮酸。优选 的用于生产1，3_丙二醇的糖酵解中间体为3-磷酸甘油醛。优选的用于生产乙烯的糖酵解 中间体为α-酮戊二酸。“将糖酵解中间体转化为有机化合物”优选地是指使用合适的用于所述有机化合 物的测定法在至少1天的时间内，在光和溶解的二氧化碳和/或碳酸氢根离子的存在下培 养的如本文所定义的蓝藻培养物中检测到可检测量的有机化合物。所述溶解的二氧化碳和 /或碳酸氢根离子的优选浓度至少为中性至碱性条件下(PH 7-8)的天然浓度，该浓度约为 ImM。二氧化碳和/或碳酸氢根离子的更优选的浓度为高于此天然浓度。增加溶液中的二 氧化碳和/或碳酸氢根离子的优选方法是通过对来自工厂中的二氧化碳废气进行富集。喷 入培养液中的气体中二氧化碳的浓度当量可从0.03% (空气)最高增加至0.2%。在另一个优选的实施方案中，蓝藻将糖酵解中间体转化为产生指定有机化合物的 途径中的中间成分。在此实施方案中，使用用于中间化合物的指定测定法在蓝藻和/或其 培养物中检测到可检测量的中间化合物，其中所述蓝藻在日光和二氧化碳的存在下培养至 少1天。根据所述有机化合物的种类，本领域技术人员会知晓可生产何种中间化合物。生产的所有有机化合物或中间化合物都是在细胞内生产的并可自动扩散到培养 液中。用于所述中间体和烷醇、烷酮、烷二醇和有机酸的优选测定法为高效液相色谱法 (HPLC)。在所述培养条件下并使用所述测定法时，所述中间体和烷醇、烷酮、烷二醇和有 机酸的可检测量优选为至少0. ImM。优选地，可检测量为至少0. 2mM、0. 3mM、0. 4mM或至少 0. 5mM。乙醇作为有机化合物当要生产的有机产物为乙醇时，优选的核酸分子编码能够将丙酮酸转化为乙醇和 /或转化为在产生乙醇的途径中生成的中间化合物的酶，所述酶包括丙酮酸脱羧酶(Pdc) 和醇脱氢酶(adh)。所述中间化合物为乙醛。优选的乙醛测定法为HPLC。在如上文所定义 的培养条件下并使用所述测定法时，乙醛的可检测量优选为至少0. ImM。因此，在此优选实 施方案中，蓝藻包含编码Pdc的核酸分子和编码adh的另一核酸分子。因此，此优选实施方 案涉及能够表达如下由核苷酸序列表示的核酸分子的蓝藻，其中这些核苷酸序列的表达给 予蓝藻细胞将丙酮酸转化为乙醛和/或乙醇的能力(a)编码pdc的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码pdc的核苷酸序列，所述pdc包含与SEQ ID NO 1的氨基酸序列具有至少 40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 2的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸序 列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；和(b)编码adh的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码adh的核苷酸序列，所述adh包含与SEQ ID NO 3的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO :4的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸序 列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。丙醇作为有机化合物当要生产的有机产物为丙醇时，优选的核酸分子编码能够将丙酮酸转化为丙醇和 /或转化为在产生丙醇的途径中生成的中间化合物的酶，所述酶包括硫解酶、乙酰乙酰辅 酶A转移酶、乙酰乙酸脱羧酶和丙醇脱氢酶。所述中间化合物为丙酮。优选的丙酮测定法 为HPLC。在如上文所定义的培养条件下并使用所述测定法时，丙酮的可检测量优选为至少 0. ImM。因此在此优选实施方案中，蓝藻包括编码硫解酶、乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰乙酸 脱羧酶的核酸分子和编码丙醇脱氢酶的另一核酸分子。因此，此优选实施方案涉及能够表 达如下由核苷酸序列表示的核酸分子的蓝藻，其中这些核苷酸序列的表达给予蓝藻细胞将 丙酮酸转化为丙酮和/或丙醇的能力(a)编码硫解酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码硫解酶的核苷酸序列，所述硫解酶包含与SEQ ID NO 5的氨基酸序列具有 至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 6的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸序 列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；(b)编码乙酰乙酰辅酶A转移酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码乙酰乙酰辅酶A转移酶的核苷酸序列，所述乙酰乙酰辅酶A转移酶包含与 SEQ ID NO :95的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO 96 具有相同序列同一性的另一氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 97的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列以及与SEQ ID NO :98具有相同序列同一性的另一核苷酸序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；(c)编码乙酰乙酰辅酶A脱羧酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码乙酰乙酰辅酶A脱羧酶的核苷酸序列，所述乙酰乙酰辅酶A脱羧酶包含与 SEQ ID NO 7的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 8的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸序 列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；禾口(d)编码丙醇脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码丙醇脱氢酶的核苷酸序列，所述丙醇脱氢酶包含与SEQ IDNO :9的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 10的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。优选的乙酰乙酰辅酶A转移酶由两个亚基构成一个由SEQ IDNO :95表示，另一个 由EQ ID N0:96表示。相应的编码核苷酸序列优选地分别由SEQ ID NO :97、98表示。丁醇作为有机产物丁醇是一种优选的有机产物。本发明包括至少两条生产丁醇的途径。在第一条途径中，当要生产的有机产物为丁醇时，优选的核酸分子编码能够将丙 酮酸转化为丁醇和/或转化为在产生丁醇的途径中生成的中间化合物的酶，所述酶包括硫 解酶、羟丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶。优选 的中间化合物为丁醛。优选的丁醛测定法为HPLC。在如上文所定义的培养条件下并使用所 述测定法时，乙醛的可检测量为至少0. ImM。因此，在此优选实施方案中，蓝藻包括编码硫解 酶、羟丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶的核酸分 子。因此，此优选实施方案涉及能够表达如下由核苷酸序列表示的核苷酸分子的蓝藻，其中 这些核苷酸序列的表达给予蓝藻细胞将丙酮酸转化为丁醛和/或丁醇的能力(a)编码硫解酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码硫解酶的核苷酸序列，所述硫解酶包含与SEQ ID NO :11的氨基酸序列具 有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 12的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；(b)编码羟丁酰辅酶A脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码羟丁酰辅酶A脱氢酶的核苷酸序列，所述羟丁酰辅酶A脱氢酶包含与SEQ ID NO 13的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO :14的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；(c)编码巴豆酸酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码巴豆酸酶的核苷酸序列，所述巴豆酸酶包含与SEQ ID N0:15的氨基酸序 列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 16的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；(d)编码丁酰辅酶A脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自
i.编码丁酰辅酶A脱氢酶的核苷酸序列，所述丁酰辅酶A脱氢酶包含与SEQ ID NO 17的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 18的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；(e)编码丁醛脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码丁醛脱氢酶的核苷酸序列，所述丁醛脱氢酶包含与SEQ IDNO 19的氨基酸 序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 20的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；和(f)编码丁醇脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码丁醇脱氢酶的核苷酸序列，所述丁醇脱氢酶包含与SEQ IDNO 21的氨基酸 序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 22的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。在第二条途径中，当要生产的有机产物为丁醇时，优选的核酸分子编码能够将丙 酮酸转化为丁醇和/或转化为在产生丁醇的途径中生成的中间化合物的酶，所述酶包括 2_乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脱羧酶、双乙酰还原酶、3-羟基丁酮还原酶、甘油脱水酶(其大、 中和小亚基)、1，3-丙二醇脱氢酶。优选的中间化合物为2，3- 丁二醇。优选的2，3- 丁二醇测定法为HPLC。在如上文 所定义的培养条件下并使用所述测定法时，2，3-丁二醇的可检测量为至少0. ImM。因此在 此优选实施方案中，蓝藻包括编码2-乙酰乳酸合酶、乙酰乳酸脱羧酶、双乙酰还原酶、3-羟 基丁酮还原酶、甘油脱水酶(其大、中和小亚基)、1，3_丙二醇脱氢酶的核酸分子。因此，此优选实施方案涉及能够表达如下由核苷酸序列表示的核苷酸分子的蓝 藻，其中这些核苷酸序列的表达给予蓝藻细胞将丙酮酸转化为2，3-丁二醇和/或丁醇的能 力(a)编码2-乙酰乳酸合酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码2-乙酰乳酸合酶的核苷酸序列，所述2-乙酰乳酸合酶包含与SEQ ID NO 75的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 76的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；
(b)编码乙酰乳酸脱羧酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码乙酰乳酸脱羧酶的核苷酸序列，所述乙酰乳酸脱羧酶包含与SEQ ID NO 77 的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 78的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；(c)编码双乙酰还原酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码双乙酰还原酶的核苷酸序列，所述双乙酰还原酶包含与SEQID NO 79的氨 基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 80的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；(d)编码3-羟基丁酮还原酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码3-羟基丁酮还原酶的核苷酸序列，所述3-羟基丁酮还原酶包含与SEQ ID NO 81的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 82的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；(e)编码甘油脱水酶(即其大、中和小亚基)的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列 选自i.编码甘油脱水酶的大、中和小亚基的核苷酸序列，所述甘油脱水酶的大、中和小 亚基包含分别与SEQ ID NO :83、84和85的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸 序列；ii.编码甘油脱水酶的大、中和小亚基的核苷酸序列，所述核酸序列包含分别与 SEQ ID NO :86、87和88的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；禾口(f)编码1，3_丙二醇脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码1，3-丙二醇脱氢酶的核苷酸序列，所述1，3-丙二醇脱氢酶包含与SEQ ID NO 89的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 90的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。丙酮作为有机产物
当要生产的有机产物为丙酮时，优选的核酸分子编码能够将丙酮酸转化为丙酮和 /或转化为在产生丙酮的途径中生成的中间化合物的酶，所述酶包括硫解酶、乙酰乙酰辅酶 A转移酶和乙酰乙酸脱羧酶。因此，在此优选实施方案中，蓝藻包括编码硫解酶、乙酰乙酰辅 酶A转移酶的核酸分子和编码乙酰乙酰辅酶A脱羧酶的另一核酸分子。因此，此优选实施 方案涉及能够表达如下由核苷酸序列表示的核酸分子的蓝藻，其中这些核苷酸序列的表达 给予蓝藻细胞将丙酮酸转化为丙酮的能力(a)编码硫解酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码硫解酶的核苷酸序列，所述硫解酶包含与SEQ ID NO :23的氨基酸序列具 有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO :24的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；(b)编码乙酰乙酰辅酶A转移酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码乙酰乙酰辅酶A转移酶的核苷酸序列，所述乙酰乙酰辅酶A转移酶包含与 SEQ ID NO :95的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列以及与SEQ ID NO 96 具有相同序列同一性的另一氨基酸序列。ii.包含一个与SEQ ID NO 97的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列以及与SEQ ID NO :98具有相同序列同一性的另一核苷酸序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；和(c)编码乙酰乙酰辅酶A脱羧酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码乙酰乙酰辅酶A脱羧酶的核苷酸序列，所述乙酰乙酰辅酶A脱羧酶包含与 SEQ ID N0:25的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 26的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。1，3-丙二醇作为有机产物当要生产的有机产物为1，3_丙二醇时，优选的核酸分子编码能够将3-磷酸甘油 醛转化为丙二醇和/或转化为在产生1，3-丙二醇的途径中生成的中间化合物的酶，所述酶 包括3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油磷酸酶、甘油脱水酶和氧化还原酶。第一种中间产物 为甘油。优选的甘油测定法为HPLC。在如上文所定义的培养条件下并使用所述测定法时， 甘油的可检测量优选为至少0. ImM。第二种中间产物为羟基丙醛。优选的羟基丙醛测定法 为HPLC。在如上文所定义的培养条件下并使用所述测定法时，羟基丙醛的可检测量优选为 至少0. ImM0或者，细胞可生产上面定义的第一种和第二种中间产物的结合物。在这种情况 下，上面定义的第一种和第二种中间产物的可检测量为每种中间产物至少0. ImM。因此，在 此优选实施方案中，蓝藻包括编码3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油磷酸酶、甘油脱水酶和氧化还原酶的核酸分子。因此，此优选实施方案涉及能够表达如下由核苷酸序列表示的核 酸分子的蓝藻，其中这些核苷酸序列的表达给予蓝藻细胞将3-磷酸甘油醛转化为甘油、羟 基丙醛和/或1，3-丙二醇的能力(a)编码3-磷酸甘油脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码3-磷酸甘油脱氢酶的核苷酸序列，所述3-磷酸甘油脱氢酶包含与SEQ ID NO 27的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 28的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；(b)编码3_磷酸甘油磷酸酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码3-磷酸甘油磷酸酶的核苷酸序列，所述3-磷酸甘油磷酸酶包含与SEQ ID NO 29的氨基酸序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 30的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；(c)编码甘油脱水酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码甘油脱水酶的核苷酸序列，所述甘油脱水酶包含与SEQ IDNO 31的氨基酸 序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 32的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列；和(d)编码氧化还原酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码氧化还原酶的核苷酸序列，所述氧化还原酶包含与SEQ IDNO 33的氨基酸 序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO :34的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。D-乳酸作为有机产物当要生成的有机产物为D-乳酸时，优选的核酸分子编码能够将丙酮酸转化为 D-乳酸的酶，所述酶包括乳酸脱氢酶。优选的D-乳酸测定法为HPLC和酶测定法。在如上 文所定义的培养条件下并使用所述测定法时，D-乳酸的HPLC可检测量优选为至少0. ImM0 在如上文所定义的培养条件下并使用所述测定法时，D-乳酸的酶测定法可检测量优选为至 少0. 2mg/l。因此，在此优选实施方案中，蓝藻包括编码乳酸脱氢酶的核酸分子。因此，此优选实施方案涉及能够表达至少一种核酸分子的蓝藻，所述核酸分子由核苷酸序列表示，其中此核苷酸序列的表达给予蓝藻细胞将丙酮酸转化为D-乳酸的能力(a)编码乳酸脱氢酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码乳酸脱氢酶的核苷酸序列，所述乳酸脱氢酶包含与SEQ IDNO 35的氨基酸 序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 36的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。乙烯作为有机产物当要生成的有机产物为乙烯时，优选的核酸分子编码能够将2_酮戊二酸转化为 乙烯和琥珀酸的酶，所述酶包括乙烯合成酶(2-酮戊二酸依赖的乙烯合成酶)。在如上文所 定义的培养条件下并使用所述测定法时，优选的乙烯测定法为GC (气相色谱法)。如Pirkov I et al, (2008) ,Metabolic Engineering，10 :276_280 所述。乙烯的可检测量优选为至少 10yg/lh。因此，在此优选实施方案中，蓝藻包括编码乙烯合成酶的核酸分子。因此，此优 选实施方案涉及能够表达至少一种核酸分子的蓝藻，所述核酸分子由核苷酸序列表示，其 中此核苷酸序列的表达给予蓝藻细胞将2-酮戊二酸转化为乙烯和琥珀酸的能力(a)编码乙烯合成酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自i.编码乙烯合成酶的核苷酸序列，所述乙烯合成酶包含与SEQ IDNO 91的氨基酸 序列具有至少40%序列同一性的氨基酸序列；ii.包含一个与SEQ ID NO 92的核苷酸序列具有至少40%序列同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列；iii.其互补链可与序列(i)或(ii)的核酸分子杂交的核苷酸序列；iv.其序列因遗传密码的简并性而不同于(iii)的核酸分子序列的核苷酸序列。本文借助分别与指定核苷酸序列或氨基酸序列的同一性百分比(至少40% )描述 的每一核苷酸序列或氨基酸序列在更优选的实施方案中与所述指定核苷酸序列或氨基酸 序列分别具有至少 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、 99%或更高的同一性。在一个优选实施方案中，序列同一性是通过比较本文所确认的序列 的全长而确定。编码本文所述的酶的每一核苷酸序列都可编码原核或真核生物的酶，即氨基酸序 列与原核或真核生物中天然存在的酶的氨基酸序列相同的酶。发明人已发现，本文所定义 的特定酶或特定酶的组合给予蓝藻细胞的将糖酵解中间体转化为有机产物和/或转化为 在产生所述有机化合物的途径中生成的中间化合物的能力，并不太取决于所述酶是原核还 是真核来源。这更取决于所述酶的氨基酸序列或对应核苷酸序列与相应的确定序列(SEQID NO)的氨基酸序列或对应核苷酸序列的关联性(同一性百分比)。作为前述优选实施方案的替代或与之结合，本发明还涉及更优选的实施方案，其 中至少一种如本文所定义的酶对氧钝化基本不敏感。“对氧钝化基本不敏感”优选地是指， 当这种酶在本文所述的蓝藻中表达并当此蓝藻以本发明的方法培养时，使用本领域技术人 员已知的特定测定法可检测到所述酶的显著活性。更优选地，所述酶的显著活性为在无氧 条件下培养的相同蓝藻中表达的相同酶的活性的至少20%。甚至更优选地，可检测到所
13述活性的至少 30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%。最优选地，在本文所述的蓝藻中表达并当此蓝藻以本发明的方法培养时，所述酶的活 性与在与本文所述相同的蓝藻中但该蓝藻在无氧条件下培养时所表达的相同酶的活性相 等。本发明的一个优点是这样得到的蓝藻优选地用于生成氧气的本发明的方法中，因为氧 气基本不影响本文所用的酶的活性。作为前述优选实施方案的替代或与之结合，本发明还涉及更优选的实施方案，其 中如本文所定义的蓝藻为被一种核酸构建体转化的蓝藻，所述核酸构建体根据要生产的有 机产物包含编码如上面所定义的酶的核苷酸序列。包含编码如本文所定义的指定酶的核酸 分子的核酸构建体将确保所指定核酸分子和对应的酶在蓝藻中的表达。在更优选的实施方 案中，核酸构建体包含多种核酸分子，每种核酸分子都编码一种指定的酶。在甚至更优选的 实施方案中，核酸构建体包含两种、三种、四种核酸分子，每种核酸分子都编码一种指定的 酶。在最优选的实施方案中，核酸分子构建体包含将糖酵解中间体转化为有机产物和/或 中间化合物所需的全部核酸分子，每种核酸分子都编码一种指定的酶。实施例2举例说明 了这种最优选的实施方案。在这种最优选的实施方案中，核酸构建体包含一个表达盒，所述 表达盒包含每种所需的核酸分子。每种核酸分子都与存在的其他核酸分子可操作地连接。 最优选地，合适的启动子与所述表达盒可操作地连接以确保核酸分子在如下文所定义的蓝 藻中表达。为此，可如例如US 6，699，696或US 4，778，759中所述构建核酸构建体。蓝藻可 包含每种核酸构建体的一个拷贝，但优选地包含多个拷贝。核酸构建体可位于附加体中并 因此包含自主复制的序列例如ARS序列。合适的附加体核酸构建体可例如基于酵母2 μ或 pKDl (Fleer et al. , 1991, Biotechnology 9:968-975)质粒。然而，优选地，每种核酸构建 体都以一个或多个拷贝整合到蓝藻细胞的基因组中。向蓝藻细胞的基因组中的整合可通过 非常规重组随机发生，但核酸构建体优选地通过同源重组整合到蓝藻细胞的基因组中，同 源重组本领域中所熟知的(US 4，778，759)。同源重组优选地发生在中性整合位点上。中 性整合位点是一种未被预期是本发明的生产方法——即如本发明所定义的有机化合物和/ 或中间化合物的生长和/或生产——所必需的整合。优选的整合位点为如在实施例中所说 明的 nrt 操纵子(Osanai, T. , Imamura, S. , Asayama, M. , Shirai, Μ. , Suzuki, I. , Murata, N. , Tanaka, K, (2006)Nitrogen induction of sugar catabolic gene expression in Synechocystis sp. PCC 6803. DNA Research 13，185_19)。因此，在更优选的实施方案中， 本发明的蓝藻细胞包含含有一种核酸分子的核酸构建体，所述核酸分子由核苷酸序列表 示，所述核苷酸序列为如本文所确定的酶的编码序列。所述蓝藻细胞能够表达这些酶。在 甚至更优选的实施方案中，编码酶的核酸分子与使相应核酸分子在蓝藻中充分表达的启动 子可操作地连接，以给予蓝藻将糖酵解中间体转化为指定有机产物和/或在产生所述有机 产物的途径中生成的中间化合物的能力。对于上文定义的表达盒，启动子位于所述表达盒 的上游。因此，在另一方面，本发明还包括如上文所述的核酸构建体。优选地，核酸构建体 包括编码如上文所述的酶的核酸分子。编码酶的核酸分子均已在上文中定义。可用于实现编码本文所定义酶的核酸分子的表达的启动子对于编码要表达的酶 的核酸分子可以不是天然的，即启动子对于与其可操作地连接的核酸分子(编码序列)是 异源的。尽管启动子优选地对于与其可操作地连接的编码序列是异源的，然而蓝藻的同源即内源启动子也是优选的。优选地，(对所述核苷酸序列)异源的启动子与编码序列的天 然启动子相比能够产生更高稳定态水平的包含编码序列的转录物(或每单位时间能够产 生更多的转录物分子，即mRNA分子)，优选地在存在日照和二氧化碳的条件下。在本说明 书上下文中，这种合适的启动子包括组成型和诱导型天然启动子以及经改造的启动子。如 果需要，本发明的蓝藻细胞中所用的启动子可被修饰以影响其控制特性。一种优选的启动 子是集胞藻PCC 6083的甘油醛脱氢酶基因的SigE控制的启动子，如SEQ ID NO 74所确 定的(Takashi Osanai, et al. , Positive Regulation of Sugar Catabolic Pathways in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803by the Group 2 sigmaFactor SigE. J. Biol. Chem. (2005)35 :30653_30659)。这种启动子非常有利地按照下段中所述加以使用。作为前述优选实施方案的替代或与之结合，本发明还涉及一个更优选的实施方 案，其中如本文所定义的核酸分子的表达被调控从而应答于营养素例如铵的浓度变化 (Osanai, T. , Imamura, S. , Asayama, M. , Shirai, Μ. , Suzuki, I. , Murata, N. , Tanaka, K, (2006)Nitrogen induction of sugarcatabolic gene expression in Synechocystis sp. PCC 6803. DNA Researchl3，185-195)。在一个更优选的实施方案中，当铵的浓度低于指 定值时，核酸分子的表达被诱导。如在实施例2中所举例说明的，这优选地通过在包含如本 文所定义的核酸分子的核酸构建体中使用SigE启动子而实现。这种启动子在所述方法的 第一阶段，当铵以约大于ImM的浓度存在时是失活的。在此第一阶段，蓝藻会生长并且不生 产任何如本文所定义的有机化合物和/或中间化合物。当铵源用于生长并且其浓度大约低 于ImM时，SigE启动子被诱导。因此，所述方法分为2个阶段，细胞数量增长的第一阶段和 本发明生产过程的第二阶段，第二阶段的特征在于如本文所定义的有机化合物和/或中间 化合物的生产。此两阶段生产方法与一阶段生产方法相比具有若干优点a)所述生长阶段 与所述生产阶段分开并因此可在短时间内获得高细胞密度；b)由于在第二阶段中无生长 碳通量，因此如本文所定义的有机化合物和/或中间化合物的产量会提高。本领域技术人 员知晓如何评估培养物中营养素例如铵的浓度。在第二个方面中，本发明涉及通过向蓝藻细胞培养物供给二氧化碳并给予培养物 光照而生产如本文所定义的有机化合物和/或中间化合物的方法，其中所述细胞能够表达 一种核酸分子，所述核酸分子的表达给予所述细胞将糖酵解的中间体例转化为有机化合物 和/或在产生所述有机化合物的途径中生成的中间化合物的能力，并且其中所述核酸分子 受一种响应于所述培养物中营养素浓度改变的调控系统的控制。蓝藻、糖酵解中间体、有机化合物、中间化合物、核酸分子和调控系统都已在上文 进行了定义。在本发明的方法中，将二氧化碳供给蓝藻的培养液。本领域技术人员知晓二氧化 碳浓度取决于温度、PH和所用空气中的二氧化碳的浓度。因此，评估所使用的二氧化碳的 浓度是相当困难的。下面，我们对优选的使用浓度进行评估。优选的二氧化碳供给浓度为 富集至5%二氧化碳的空气。优选的二氧化碳来源可为来自工厂的废气。通常，方法开始于在660nm下测量时光密度为约0. 2-2. O (OD600 = 0. 2-2)的蓝藻培 养物(也称为培养液)，所述测量可在任何常规分光光度计中以Icm的测量光程进行。通常 所述培养物中的细胞数量每20小时增加一倍。优选的方法是在日光照射的深度为30-50cm的罐中进行。在一种优选的方法中，直至铵源耗尽或低于上文所述的指定值时，细胞数量 才停止增加，继而所述产物和/或中间体的生产将开始。在一个优选的实施方案中，所用的 光为自然光。优选地自然光为日光。日光的强度可介于约1000和约1500yEinstein/m7 s之间。在另一优选实施方案中，所用的光为人造光。这种人造光的强度可介于约70和约 800μ Einstein/m2/s ；tl、§]。在一种优选的方法中，将生产的有机化合物和/或中间化合物与所述培养液分 离。这可在随生产过程连续进行或在所述生产过程之后进行。分离可基于膜技术和/或蒸 发法。根据生产的有机化合物/或中间化合物的种类，本领域技术人员会知晓何种分离方 法最为合适。一般定义序列同一性和相似性序列同一性在本文中被定义为两种或多种氨基酸(多肽或蛋白)序列或两种或多 种核酸(多核苷酸)序列之间的关系，这是通过比较所述序列而确定的。通常，序列同一性 或相似性在所比较序列的全长上进行比较。在本领域中，根据具体情况，“同一性”也指氨 基酸或核酸序列之间由这些序列串之间的匹配而确定的序列关联性。两个氨基酸序列之间 的“相似性”是通过比较一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸置换与另一个多肽的序列 而确定。“同一性”和“相似性”可通过为本领域技术人员所知的各种方法容易地计算。在 一个优选实施方案中，序列同一性是通过比较本文所确认的序列的全长而确定。确定同一性的优选方法旨在得出测试序列之间的最大匹配。在公众可以获得的 计算机程序中编码了确定同一性的方法。优选的确定两序列之间同一性和相似性的计 算机程序方法包括，例如 BestFit、BLASTP,、BLASTN 和 FASTA(Altschul，S. F. et al.， J. Mol. Biol. 215 :403_410 (1990))，这些可从 NCBI 和其他来源公开获得(BLAST Manual, Altschul，S.，et al. , NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894)。所用的最优选的算法是 EMBOSS(http//www. ebi. ac. uk/emboss/align)。使用 EMBOSS 进行氨基酸序列比较的 优选参数为空位开放(gap open) 10. 0、空位延伸(gap extend)0. 5、Blosum 62矩阵。使 用EMBOSS进行核酸序列比较的优选参数为空位开放(gap open) 10. 0、空位延伸(gap extend) 0. 5、DNA全矩阵(DNA同一性矩阵)。任选地，在确定氨基酸相似性程度时，本领域技术人员也可考虑本领域技术人员 所明了的所谓“保守性”氨基酸置换。保守性氨基酸置换是指具有相似侧链的残基的可交 换性。例如，具有脂肪烃侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸； 具有脂肪烃_羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺的侧链的一组氨基 酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸； 具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸为半 胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸置换组为缬氨酸_亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨 酸_酪氨酸、赖氨酸_精氨酸，丙氨酸_缬氨酸，以及天冬酰胺_谷氨酰胺。本文所公开的 氨基酸序列的置换变体是其中所公开序列中至少一个残基已经被除去且在该位置上插入 一个不同的残基的那些变体。优选地，氨基酸变化是保守的。对于每种天然存在的氨基 酸，优选的保守性置换如下:Ala->ser ；Arg->lys ；Asn_>gln 或 his ；Asp->glu ；Cys->ser 或 ala ；Gln->asn ；Glu_>asp ；Gly->pro ；His_>asn 或 gin ；Ile_>leu 或 val ；Leu_>ile 或
16val ；Lys->arg> gin 或 glu ；Met->leu 或 ile ；Phe_>met、Ieu 或 tyr ；Ser->thr ；Thr->ser ； Trp->tyr ；Tyr>trp 或 phe ；以及，Val->ile 或 Ieu0杂交核酸序列编码在本发明细胞中表达的酶的核苷酸序列也可通过它们在温和的杂交条件下 或优选地在严格的杂交条件下分别与SEQ ID NO. 2、4、6、8、16、18、20、22、24、26、28、30、32、 34、36、76、78、80、82、86、87、88、90、92、96的核苷酸序列杂交的能力定义。严格杂交条件在 本文中被定义为以下条件允许至少约25个，优选地约50、75或100个核苷酸，最优选地约 200或更多个核苷酸的核酸序列在约65°C的温度下并且在含有约IM盐(优选6x SSC)的 溶液或在任何其他具有相当的离子强度的溶液中杂交，并在65°C下在含有约0. IM或更少 的盐(优选0. 2xSSC)的溶液中或在任何其他具有类似离子强度的溶液中洗涤。优选地，所 述杂交过夜进行，即至少10个小时，并且优选地，洗涤进行至少1个小时并至少更换两次洗 涤溶液。这些条件通常允许具有约90%或更高序列同一性的序列进行特异性杂交。温和杂交条件在本文中被定义为以下条件允许至少约50个，优选地约200个或 更多个核苷酸的核酸序列在约45°C下并且在含有约IM盐(优选6x SSC)的溶液或在任何 其他具有相当的离子强度的溶液中杂交，并在室温下在含有约IM盐(优选6x SSC)的溶液 或在任何其他具有类似离子强度的溶液中洗涤。优选地，所述杂交过夜进行，即至少10个 小时，并且优选地，洗涤进行至少1个小时并至少更换两次洗涤溶液。这些条件通常允许具 有最多至50%序列同一性的序列进行特异性杂交。本领域技术人员能够改变这些杂交条件 以特异性地识别同一性在50%和90%之间变动的序列。同源当术语“同源”用于指给定(重组)核酸或多肽分子与给定宿主生物体或宿主细 胞之间的关系时，应被理解为是指在自然界中所述核酸或多肽分子是由相同物种(优选相 同品种或株系)的宿主细胞或生物体生产的。如果与宿主细胞同源，那么编码多肽的核酸 序列通常会与不同于其天然环境中的另一启动子序列可操作地连接。当用于指两个核酸序 列的关联性时，术语“同源”是指一个单链核酸序列可与互补单链核酸序列杂交。杂交程度 可取决于若干因素，包括所述序列之间的同一性程度和杂交条件例如上文给出的温度和盐 浓度。优选地，具有同一性的区域大于约5bp，更优选的同一性的区域大于10bp。优选地， 当两个核酸或多肽序列的同一性大于80%时，就称它们为同源的。异源当术语“异源”用于核酸(DNA和RNA)或蛋白时，是指并非天然作为其所在的生物 体、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分存在的核酸或蛋白(也称为多肽或酶)，或者存 在于与其在天然状态下不同的细胞或者基因组或DNA或RNA序列中的位置中。异源核酸或 蛋白对于引入其的细胞不是内源的，而是从其他细胞获得或通过合成或重组产生的。通常， 尽管不是必须，这些核酸编码在正常情况下不由转录或表达该DNA的细胞产生的蛋白。类 似地，外源RNA编码在正常情况下不在该外源RNA所在的细胞中表达的蛋白。异源核酸和 蛋白也可称为外来核酸或蛋白。术语异源核酸或蛋白在本文中包括任何本领域技术人员认 为相对于表达其的细胞异源或外来的核酸或蛋白。术语异源也用于核酸或氨基酸序列的非 天然结合物，即其中至少两种结合序列相对于彼此为外来的结合物。可操作地连接
本文中所用的术语“可操作地连接”是指多核苷酸元件(或编码序列或核酸序列 或核酸分子)在功能关系上的连接。当一段核酸序列的位置与另一段核酸序列处于功能相 关时，它就是“可操作地连接”的。例如，如果一个启动子或增强子影响一段编码序列的转 录，那么所述启动子或增强子就是与所述编码序列可操作地连接的。可操作地连接意味着， 被连接的核酸序列通常是相邻的，并在必要时将两段蛋白编码区域相邻地连接起来并处于 阅读框中。启动子本文所用的术语“启动子”或是指一段这样的核酸片段，即其功能是用于控制一种 或多种核酸分子的转录；并位于所述核酸分子的转录起始位点的转录方向上游；并在结构 上可通过DNA依赖的RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点以及任何如下的其他DNA序列 的存在来标识，所述DNA序列包括但不限于转录因子结合位点、抑制蛋白和激活蛋白结合 位点，以及任何其他为本领域技术人员所知的直接或间接作用以调控通过所述启动子转录 的量的核苷酸序列。“组成型”启动子是一种在大多数环境条件和发育条件下具有活性的启 动子。“诱导型”启动子是一种在环境和发育调控下具有活性的启动子。遗传修饰为了使酶在上述本发明的宿主细胞中过表达，以及对宿主细胞(优选蓝藻)进 行其他遗传修饰，通过本领域熟知的方法用本发明的多种核酸构建体转化宿主细胞。这 些方法可例如从标准手册例如 Sambrook and Russel (2001) " Molecular Cloning :A Laboratory Manual(3rdedition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor Laboratory Press 或者 F. Ausubel et al, eds. , " Current protocols in molecular biology" , Green Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)中知晓。蓝藻 细胞的转化和遗传修饰的方法可从例如US 6，699，696或US 4，778，759知晓。用于在本发明的蓝藻细胞中进行酶的过表达的核酸构建体中所用的启动子已在 上面进行了描述。任选地，核酸构建体中可存在可选择的标记。本文所用的术语“标记”是指编码一种特性或一种表型的基因，所述特性或表型 使得可对含有所述标记的蓝藻细胞进行选择或筛选。标记基因可为抗生素耐性基因，籍此 合适的抗生素可用于从未被转化的细胞中选择出被转化的细胞。然而，优选地使用非抗生 素耐性基因，例如营养缺陷标记(URA3、TRP1、LEU2)。在一个优选实施方案中，用核酸构 建体转化的蓝藻细胞不含标记基因。构建不含重组标记基因的微生物宿主细胞的方法在 EP-A-0635574中公开并基于双向标记的使用。或者，本发明的核酸构建体可包含可筛选标 记例如绿色荧光蛋白、lacZ、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、β葡糖醛酸糖苷酶从而可筛选 被转化的细胞。可存在于本发明的核酸构建体中的任选的其他元件包括但不限于一种或多 种前导序列、增强子、整合因子和/或报告基因、内含子序列、中心体、端粒和/或基质结 合(MAR)序列。本发明的核酸构建体可以以本领域已知的方法提供，所述方法通常包括 诸如限制性和连接性核酸/核酸序列的技术，所述技术可参见标准手册例如Sambrook and Russel (2001) “ Molecular Cloning :A Laboratory Manual (3rd edition)，Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press0用于蓝藻细胞中失活和基因中断的方法是本领域所熟知的(参见例如Shestakov
18SV et al, (2002), Photosynthesis Research, 73 :279_284 and Nakamura Y et al, (1999)，Nucleic Acids Res. 27 :66_68)。在本说明书及其权利要求中，动词“包含”及其各种变形以其非限制性的意义使
用，表示包括该词之后的项，但不排除未具体提到的项。此外，动词“由......组成”可替
换为“基本由......组成”，是指如本文所定义的肽或组合物可包含具体确定的组分以外
的其他组分，所述其他组分不改变本发明的独特性。除非上下文明确要求有且只有一个该 要素，用不定冠词“一”或“一个”提及的要素不排除存在多个该要素的可能性。因此不定 冠词“一”或“一个”通常是指“至少一个”。本说明书中引用的全部专利和参考文献都以引用的方式全文纳入本文中。给出以 下实施例只是出于说明的目的，而并非意图以任何方式限制本发明的范围。


图 1 从 Berg, Tymoczko and Stryer ,Biochemistry，，WH Freemanand Co, New York, 2006复制的光反应。图 2 从 Berg, Tymoczko and Stryer ,Biochemistry，，WH Freemanand Co, New York, 2006复制的卡尔文循环。图3 重组菌株的构建将所述卡盒通过同源重组引入并定位到集胞藻PCC 6803 的SigE控制的启动子的下游。黑色圆环表示不能在集胞藻PCC 6803中复制的自杀质粒 (例如pBluescript)。通过遗传工程使目标卡盒(在图中示为箭头“χ”)的侧翼为与nrt 操纵子中的非编码DNA区(在图中示为虚线条块)同源的DNA序列。通过双交换事件—— 在图中示为虚线交叉线——目标卡盒被整合到集胞藻基因组中。或者，可将所述构建体插 入到中性停泊位点。图4 通过NtcA转录调控因子的铵控制的生产。可进行生长的条件抑制生产，铵 消耗促进生产。图5 耐醇性。5天后，每份培养物取100 μ 1进行稀释并转移到由BG-Il培养基制 备的固体培养基上。使用两组不作任何添加(对照)或添加有丁醇的TL试管，在持续光照 (70yEinstein/m2/s)下并且在30°C培养箱中培养固体培养物，在两组试管中分别以不同 浓度加入乙醇。一周后，观察单集落并计数。将集落的数量与对照样品对比。
实施例实施例1 本发明蓝藻的生化背景以ATP形式存在的能量以及以NADPH形式存在的还原能量对于驱动随后的光合作 用高吸能暗反应都是需要的，这些能量被按照广为人知的ζ图式排布的两种有氧光合成的 光系统PS-II和PS-I，加上膜结合的ATP酶所催化(图1)。在光营养生物体例如蓝藻中，CO2在所谓的卡尔文循环中被固定。这是一个还原步 骤的循环系列，其导致CO2到C3化合物例如3-磷酸甘油醛、磷酸甘油酸和丙酮酸的净转化 (图 2)。此途径基本是吸能的并在自然界中为日光所驱动。其消耗CO2和水并产生C3化合 物(例如丙酮酸)和氧气
CO2+水+太阳能一C3化合物+O2(1)此反应不能自发进行其由在光合作用的“光”反应中生成的ATP和NADPH的消耗 所驱动。此后，C3化合物在自然界中(即在光营养生物如植物和蓝藻中)用作基础要素以 构建新细胞和/或植物。这需要额外量的还原能量(如NADPH)和在光捕获反应过程中保 存的能量(如ATP)，并也可使所述生物体增殖(生长和存活)。自然界还存在一种完全不同的(微生物)生命模式许多细菌和真菌物种能够通 过发酵保存足够的能量(如ATP)以增殖，在发酵中它们使用所谓的底物水平磷酸化以生产 它们的能量。这种不依赖呼吸的能量保存模式倚赖于导致对能源的氧化还原中性异化的代 谢途径。绝大多数途径都进化成以糖(例如葡萄糖)作为能源，因此全部都具有共同的糖 酵解葡萄糖一磷酸甘油醛一丙酮酸+还原能量(2)氧化还原中性(redox neutrality)通过下面的通式反应保持丙酮酸+还原能一发酵产物(3)因此，其包含将上述中间体还原为终产物的功能性生物化学并分别将⑴和(3) 的结合作为其生物催化输入和输出C02+H20+太阳能一有机产物+O2实施例2 所用表汰系统的描述遗传卡盒在本发明的方法中形成(并且分泌到环境中)何种有机产物取决于编码对应生化 途径的物种特异性基因卡盒(即由核苷酸序列表示的核酸分子)(参见表1)。优选的由核 酸分子编码的酶基本为氧不敏感的。寺引入蓝藻中的核酸分子或基因的优选供体生物体的实例，所述蓝藻具有 由所述核酸分子或基因的产物催化的途径。对于例如乙醇和丙二醇的生产，可采用多种可 替代的供体生物体。
表2中给出了表达盒的优选设计。表2 表汰盒的设计
21 同源整合和铵控制的表达优选地将对集胞藻中不同途径和相应有机产物必需的基因/卡盒通过染色体 整合引入到集胞藻中。这可通过能够精确确定染色体插入位点的同源重组实现。已 知为此目的可用于集胞藻PCC 6830的合适质粒为pBluescript(Stratagene，USA)或 pGEM-T(Promega,USA)。关于所述构建体的方法在图3中举例说明，但会考虑用于整合的其 他(中性)停泊位点。我们将利用若干集胞藻糖酵解基因的表达受2类ο因子ο 控制的事实。转 而，编码此因子SigE的基因的表达是通过转录调控因子NtcA1’3开启的。除了其他未确定 的信号，此开关通过α-酮戊二酸/谷氨酸的比例而取决于胞外氮的可利用性在培养基的 铵消耗至小于ImM2的条件下，NtcA结合于α -酮戊二酸，且所产生的NtcA- α -酮戊二酸复 合体对SigE启动子具有高亲和性并正向控制SigE启动子。因此，受SigE控制的基因卡盒 会在铵消耗后表达。因此，在铵过量的条件下，碳通量会流向生物合成而在稳定期此通量会 流向生产(见图4)。对于聚球藻属，开启oE合成的外部铵阈值被发现处于亚毫摩尔2的 范围内。实施例3 耐醇件使用两组TL试管，在持续光照下，在30°C下，在定轨摇床中，在BG-Il培养基 (Stanier RY, et al. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales) · Bacteriol. Rev. (1971) 35 :171-205)上培养集胞藻 PCC 6803菌株，这提供约70μ E · m_2 · s—1的平均光强度。为定量醇对净生长速率的影响，在不 作任何添加(对照)或添加丁醇的条件下培养细胞，分别以不同浓度加入乙醇。5天后，每份培养物取100 μ 1进行合适的稀释，转移至由BG-Il制备的固体培养 基上，所述培养基添加有0. 3%硫代硫酸钠、IOmM ρΗ 8. 2的N-三[羟甲基]_2_氨基乙磺酸(TES)、5mM葡萄糖和1. 5%细菌琼脂粉。固体培养物在持续光照下在30°C的培养箱中培 养。一周后，观察单集落并计数。将集落的数量与对照样品对比。从图5所示的下述结果可得出如下结论净比生长速率随着醇浓度的增加而线性 下降，并且所述生长速率在丁醇浓度约为0. 17M、乙醇浓度约为0. 29M时降低了 50%。因此， 可预计本发明的两阶段生产方法比一阶段生产方法有效得多。表3 所用的全部引物的列表 参考文献1Aichi, Μ. , Takatani N. , Omata T. (2001) Role of NtcB in activation of Nitrate ssimilation Genes in the Cyanobacterium Synechocystis sp.Strain PCC6803. J. Bacteriol. 183,5840-58472Gillor, 0. ， Harush, Α. ， Post, A. F. ， Belkin, S. (2003)A Synechococcus PglnA::IuxAB fusion for estimation of nitrogen bioavailability to freshwatercyanobacteria. Appl. Environm. Microbiol. 69,1465-1474 3Osanai, Τ. , Imamura, S. , Asayama, Μ. , Shirai, Μ. , Suzuki, I. , Murata, N., Tanaka, K, (2006)Nitrogen induction of sugar catabolic gene expression in Synechocystis sp. PCC 6803. DNAResearch 13,185—19权利要求
一种通过向蓝藻(cyanobacterial)细胞培养物供给二氧化碳并给予光照而生产有机化合物和/或在产生所述有机化合物的途径中生成的中间化合物的方法，其中所述细胞能够表达一种核酸分子，所述核酸分子的表达给予所述细胞将糖酵解的中间体转化为所述有机化合物和/或所述中间化合物的能力，并且其中所述核酸分子受到一种应答于所述培养物中营养素浓度改变的调控系统的控制。
2.权利要求1的方法，其中所述酶基本对氧钝化不敏感。
3.权利要求1或2的方法，其中所述有机产物为丁醇，所述中间产物为丁醛，并且所 述核酸分子编码能够将丙酮酸转化为丁醇的酶，包括硫解酶、羟丁酰辅酶A脱氢酶、巴豆酸 酶、丁酰辅酶A脱氢酶、丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶。
4.权利要求1或2的方法，其中所述有机产物为丁醇，所述中间化合物是在产生丁醇 的途径中生成的，并且所述核酸分子编码能够将丙酮酸转化为丁醇的酶，包括2-乙酰乳酸 合酶、乙酰乳酸脱羧酶、二乙酰还原酶、3-羟基丁酮还原酶、甘油脱水酶和1，3-丙二醇脱氢 酶。
5.权利要求1或2的方法，其中所述有机产物为乙醇，所述中间化合物为乙醛，并且所 述核酸分子编码能够将丙酮酸转化为乙醇的酶，包括Pdc和醇脱氢酶。
6.权利要求1或2的方法，其中所述有机产物为丙醇，所述中间化合物为丙酮，并且所 述核酸分子编码能够将丙酮酸转化为丙醇的酶，包括硫解酶、乙酰乙酰辅酶A转移酶、乙酰 乙酰辅酶A脱羧酶和丙醇脱氢酶。
7.权利要求1或2的方法，其中所述有机产物为丙醇并且所述核酸分子编码能够将丙 酮酸转化为丙酮的酶，包括硫解酶、乙酰乙酰辅酶A转移酶和乙酰乙酰辅酶A脱羧酶。
8.权利要求1或2的方法，其中所述有机产物为1，3-丙二醇，所述中间化合物为甘 油和/或羟基丙醛并且所述核酸分子编码能够将3-磷酸甘油醛转化为丙二醇的酶，包括 3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油磷酸酶、甘油脱水酶和氧化还原酶。
9.权利要求1或2的方法，其中所述有机产物为D-乳酸并且所述核酸分子编码能够将 丙酮酸转化为D-乳酸的酶，包括乳酸脱氢酶。
10.权利要求1或2的方法，其中所述有机产物为乙烯并且所述核酸分子编码能够将 2_酮戊二酸转化为乙烯和琥珀酸的酶。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述调控系统应答于所述培养物中营养素铵 浓度的改变，和/或其中所述细胞中包含的核酸分子整合到其基因组中，优选地通过同源 重组整合，和/或其中所述蓝藻细胞来源于集胞藻(Synechocystis)细胞，优选集胞藻PCC 6083细胞。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中从所述培养物分离出所述有机产物和/或中间 化合物。
13.—种能够表达一种核酸分子的蓝藻，其中所述核酸分子的表达给予所述蓝藻将糖 酵解中间体转化为有机化合物和/或转化为产生所述有机产物的途径中生成的中间化合 物，并且其中在培养所述蓝藻时，所述核酸分子受一种应答于营养素的浓度变化的调控系 统的控制。
14.权利要求13的蓝藻，其中所述糖酵解中间体、所述有机化合物、所述中间产物和所 述酶如权利要求2-10任一项所定义。2
15.权利要求13或14的蓝藻，其中所述调控系统应答于所述培养物中营养素铵浓度的 改变，和/或其中所述蓝藻中包含的核酸分子被整合到其基因组中，优选地通过同源重组 整合，和/或其中所述蓝藻来源于集胞藻，优选集胞藻PCC 6083。
全文摘要
一种通过向蓝藻(cyanobacterial)细胞培养物供给二氧化碳并给予光照而生产如本文所定义的有机化合物和/或中间化合物的方法，其中所述细胞能够表达一种核酸分子，所述核酸分子的表达给予所述细胞将糖酵解中间体转化为所述有机化合物和/或所述中间化合物的能力，并且所述核酸分子受到一种应答于所述培养物中营养素浓度改变的调控系统的控制。
文档编号C12P7/16GK101918539SQ200880125047
公开日2010年12月15日 申请日期2008年12月17日 优先权日2007年12月17日
发明者K·J·黑林卫尔夫, M·J·泰克塞拉德马托斯 申请人:阿姆斯特丹大学