专利名称：研究v(d)j组合多样性的方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域。更具体地，本发明涉及体外分析个体中T和/或B淋巴 细胞库多样性的方法及其用途，特别是在治疗随访过程中或者对某些病理状况的诊断和/ 或预后过程中。
背景技术：
淋巴细胞要发挥功能必须具有抗原特异性识别系统。该因素很重要它决定了 T 或B细胞的特定功能。在T淋巴细胞分化的早期阶段，编码TCR受体克隆型链的位点发生 重排，使得能够表达功能性受体。类似地，在B淋巴细胞中，编码免疫球蛋白(Ig)链的位点 发生重排，使得能够表达功能性Ig。V(D) J重排机制对于T和B淋巴细胞而言是特异性的。编码TCR的V、D和J基因 沿不同TCR位点内的长胚系部分分布。为了表达蛋白，这些基因必须通过被称为V (D) J重 组的基因重排过程联合成外显子。重组的原理是基于对V(D) J基因特异性的RSS序列的识 别，以及对插入到两个重排基因间染色体区域的去除。每个V和J基因在其一端都具有重 组信号序列(RSS)。D基因则两端都有。RSS是被特异性表达于淋巴细胞中的特异性重组酶 RAG I和RAG II所识别的序列。这些蛋白是基因重排的主要参与者。一旦与HMG(高迁移 性基团)蛋白结合，RAG酶通过其同源异型结构域识别RSS九聚体，并诱导V、D、J基因片段 和七聚体之间的切割，从而产生编码末端和信号末端。重排在连接V和J编码末端后完成。 TdT酶和核酸酶作用于V-J连接处会使这一步骤提前发生。一旦发生重排，新生成的基因即 被转录，随后剪接成mRNA并被翻译成膜蛋白。给定的TCR特异性识别有限数量的不同抗原肽。因此，需要大量的受体库，以使个 体抵御其环境中可能遇到的多种感染。为此，免疫系统发展出了对基因组中不连续分布的 大量V、D、J基因片段进行组合的机制。该“组合”机制被称为V(D) J重组，其独立于各细胞 并且可以获得编码TCR的单个“片段”。该系统可以利用中等数量的基因产生大量不同的受 体。每个细胞依据精确的规则利用基因片段的组合，并获得潜在独特的TCR链。有四种主要机制有助于产生库多样性1)与V片段(D片段)和J片段间重排之 第一步相对应的组合多样性；幻经重排的基因片段间连接所产生的连接多样性；幻经重排 之V-J和V-D-J基因的体细胞超突变；4)蛋白二聚体TCRa XTCR^或TCR γ X TCR δ的配 对多样性。产生多样性的第一步是基于V(D)J基因重排原理(
图1)。固定数量的V、D和 J基因配对所产生的组合形成了组合多样性。该多样性的计算在于估计可能的组合数目 mVXnDXpJ。调节V(D) J重组的机制并非是随机的它在个体发生过程中受空间和时间上 的调节(Aude-Garcia 等，2001 Jouvin-Marche 等，1998 ；Pasqual 等，2002 ；Rytkonen 等， 1996)。因此，简单的乘法运算不足以估计预期基因组合的总数目。产生多样性的此第一步 决定了库的数量级。这是因为即使这一步仅产生中等的组合多样性(与所估计的最大理论 库值IO15相比仅几千个可能组合的数量级(Davis和Bjorkman，1988))，组合多样性的最大值也是与原始可获得的V、D和J基因的数目直接相关产生多样性的其他两个步骤使最初 库的多样性呈指数式增长。连接多样性可在与抗原肽接触的受体CDR3区域水平上产生大的可变性。两个机 制有助于增加连接多样性1)第一个机制是由于P(即回文)核苷酸的加入，其由经重排之 片段的发夹结构的解开而产生(Fugmarm等，2000)。所产生的多样性没有涉及末端脱氧核 苷酸转移酶(TdT)的第二个机制所产生的多样性那么多；2)TdT通过向每个编码片段的3， 端随机加入N核苷酸产生大量的多样性，而无需基因组模板的存在(Bogue等，199 。对 TdT-/-小鼠的研究可估计这些动物中TCRa β库仅占正常库的5%到10%，因此TdT负责 产生TCRa β全部多样性的90%。此外，这些结果表明，与TCRa转录体的⑶R3不同，TCR β 转录体中⑶R3的长度明显减少。如所预期地那样，这一观察结果证实了 TdT对V-D-J重组 的贡献比对V-J重排的贡献要大(Cabaniols等，2001)。第二次重排的机制有助于“保留”多样性连接多样性是增加库多样性的最重要因 素，但是如果没有第二次重排机制拯救2/3的读码框已中断之淋巴细胞，则其多样性方面 的益处将意味着机体的巨大代价，甚至是在阳性选择步骤前情况也如此。这些非增殖性重 排不能产生功能性TCR蛋白。细胞随后有可能尝试基因座位上仍然存在的V(D) J基因的第 二次重排。由于细胞进行的第一次重排发生在彼此靠近的V-J基因对之间，因此TRAD座位 集中开放的特性促进此过程，使细胞有最可能完成重排的机会(Huang和Kanagawa，2001 ； Pasqual等，2002 ；Wang等，1998)。如果第一次重排是无效重排，则细胞有可能尝试其第二 染色体上的重排，或者利用第一次重排任意一侧可获得的V和J基因。因此，第二次重排使 大量在第一次无效重排结束时本应被清除的细胞存活下来。体细胞超突变(SHM)在有抗原接触时淋巴结中B细胞分化过程中发生(Berek等， 1985)。SHM位于免疫球蛋白经重排之V-J和V(D) J基因的“热点基序”中(Chaudhuri等， 2003 ；Oprea和Kepler, 1999)，但在某些情况下也位于TCR经重排之V-J和V (D) J基因中 (Kotani等，2005)。如果T淋巴细胞过表达通常B细胞特有的AID (活化诱导胞嘧啶核苷脱 氨酶，activation-induced cytidine diaminase)酶，那么 TCR 可以是可变基因中 SHM 的 靶位点。正常情况下，TCR不经历SHM，因为T淋巴细胞并不合成AID。但是，如果T淋巴细 胞开始表达AID，则由于TCR含有该酶作用的所有序列，TCR对该酶与对BCR—样敏感。总 之，文献表明这一机制诱导产生了为目标1000倍的额外多样性，以增加识别抗原的机会。由TCRa链和TCRii链之间配对所产生的多样性可以通过将TCRa链的不同组合 数乘以TCRii链的可能组合数而进行估算。这一机制所产生的多样性直接取决于重排过 程中所获得的原始组合的数目。具体而言，如果计算小鼠中原始TCRy δ组合数时没有将 连接多样性计算在内，那么结果仅仅是40TCR δ (= IOV * 2D * 2J) X28TCRy ( = 7V * 4J) = 1120种不同组合，而对TCRa β进行相同计算得到了 5.6Χ106种组合(计算如下 102Va * 60Ja * 33Vβ * 2D β * 14J3)。最近，对人类基因组和小鼠的完全测序使得可以获得每个TCR座位的确切图谱， 因此有可能产生揭示调节重组机制的新的遗传学方法。每个细胞有4个能够重排TCR基因 的座位。在人和小鼠中，TCRa和TCR δ链在相同的14号染色体的两个相关联座位上发生 重排。人的TCRy和TCRii座位分别在7号染色体(或在小鼠中为13号染色体)和7号 染色体(或在小鼠中为6号染色体)上(见表1)。
权利要求
1.一种体外分析个体中T和/或B淋巴细胞库多样性的方法，其对来源于所述个体之 生物样品的基因组DNA进行分析，包括以下步骤A)利用多重聚合酶链式反应(PCR)扩增所述基因组DNA的片段，其中所述多重聚合酶 链式反应中至少之一是η > 2的η重PCR，其使用至少3种引物的组合，组成具有以下特性 的至少2对引物(i)每对引物由与给定V或D基因的上游和/或内部特异性杂交的引物以及与给定J 基因的下游和/或内部特异性杂交的引物组成，从而允许扩增以两种不同V(D) J或D-J重 排为特征的至少两个片段；( )所述引物是热力学相容的；(iii)对引物进行选择，使得所述第一对引物扩增的片段与所述第二对引物扩增的片 段能区分开；B)检测步骤A)中得到的扩增产物；C)解释结果。
2.根据权利要求1的方法，其用于分析至少一个基因座位上V(D)J重排的组合多样性， 所述基因座位选自TRA、TRB、TRG、TRD、IgH, IgK和IgL座位。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中每对引物中的至少1条引物被标记。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤B)包括对DNA片段的扩增进行实时测 定的步骤；且步骤C)按照以下方式进行(i)如果数量少于曲线总数一半的一条或几条曲线与其他曲线相比表现出偏移，以至 于其他曲线在第一条曲线的拐点后至少2个循环、优选至少3或4个循环才出现拐点，或者 显示为无扩增，那么该结果表明存在克隆性或寡克隆性淋巴细胞增殖；( )相反地，如果所有曲线在同一循环出现拐点，或者最多偏移2或3个扩增循环，那 么该结果可以排除由与所扩增片段相对应的重排之一而致的克隆淋巴细胞增殖的假设。
5.根据权利要求4的方法，其还包括确认淋巴细胞增殖的步骤，其中在温度从40°C上 升至95°C的过程中对每个管中的荧光进行连续测定，若观察到优势峰则表示存在优势扩增 子并因此存在淋巴细胞增殖，而相反地，若观察到相似大小的几个峰则表示存在淋巴细胞 多样性。
6.根据权利要求4或权利要求5的方法，其还包括通过以下方式测定所述扩增子的分 子多样性而对所观察之重排片段的分子多样性进行测定的步骤(i)在扩增子95°C去杂交后，使扩增产物的温度快速降回到30°C或以下；( )重杂交过程中定期、优选连续地测定荧光；(iii)快速的重杂交表示存在优势扩增子并因此存在克隆性或寡克隆性淋巴细胞增 殖，而较慢的重杂交则表示有更好的分子多样性。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中检测所述扩增产物的步骤B)包括将所述 产物根据其大小进行分离的步骤。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中选择每个η> 2的η重PCR反应中使用的 引物对，使得一对引物扩增得到的至少一些产物与其他引物对扩增得到的产物大小不同。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中利用至少3条引物的组合进行至少一个 η彡2的η重PCR反应，所述引物的组合组成至少2对引物，其包含与给定V基因的上游和/或内部特异性杂交的共用正义引物，且每对引物还包含与给定J基因的下游和/或内部特 异性杂交的反义引物。
10.根据权利要求9的方法，其中利用多个三联引物进行几个2重PCRs，所述每组三联 引物均由与给定V基因的上游和/或内部特异性杂交的正义引物以及与两个不同J基因的 下游和/或内部特异性杂交的两条反义引物组成。
11.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中利用至少3条引物的组合进行至少一 个η > 2的η重PCR反应，所述引物的组合组成至少2对引物，其包含与给定J基因的下游 和/或内部特异性杂交的共用反义引物，且每对引物还包含与给定V基因的上游和/或内 部特异性杂交的正义引物。
12.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中进行至少一个η彡2的η重PCR反应， 以分析TRB座位的特定重排，其中利用至少3条引物的组合组成至少2对具有以下特征的 引物(i)这2对引物包含与给定V基因的上游和/或内部特异性杂交的共用正义引物，且每 对引物还包含与给定J基因的下游和/或内部特异性杂交的反义引物；( )所述2条反义引物与Jy和Jz两个基因的下游和/或内部特异性杂交，所述两个 基因属于TRB座位上J基因的两个不同的组；和(iii)所述Jy基因特异性反义引物的杂交区与所述Jy基因起始点之间的距离大于所 述Jz基因特异性反义引物的杂交区与所述Jz基因所属组中所述第一 J基因起始点之间的 距离。
13.根据权利要求12的方法，其中利用至少3条引物的组合进行至少一个η> 2的η 重PCR反应，以分析人TRB座位的特定重排，所述引物的组合包含引物hTRBJl. 6 (CTTGGTGC ATGGCTATGTAATCCTG, SEQID No 1)、hTRBJ2. 7 (CTCGCCCTCTGCTCAGCTTTCC, SEQ ID No 2)以 及与给定V基因的上游和/或内部特异性杂交的正义引物。
14.根据权利要求12和权利要求13的方法，其用于分析人TRB座位的V(D)J重排，其 中利用至少3条引物的组合进行M个η > 2的η重PCR反应，每个引物组合包含如权利要 求13定义的hTRBJl. 6和hTRBJ2. 7引物，以及至少1条选自以下表2所定义之引物的hTRBV 引物表2
15.根据权利要求1的方法，其用于体外检测基因座位中的不完全D-J重排，所述基因 座位选自TRB和IgH座位。
16.根据权利要求15的方法，其中进行至少一个η彡2的η重PCR反应，以分析人TRB 座位的不完全DJ重排，其中利用至少3条引物的组合组成至少2对具有以下特征的引物(i)所述2对引物包含与给定D基因的上游和/或内部特异性杂交的共用正义引物，且 每对引物还包含与给定J基因的下游和/或内部特异性杂交的反义引物；(ii)所述2条反义引物与Jy和Jz两个基因的下游和/或内部特异性杂交，其中所述 两个基因属于TRB座位上J基因的两个不同组；和(iii)所述Jy基因特异性反 义引物的杂交区与所述Jy基因起始点之间的距离大于所 述Jz基因特异性反义引物的杂交区与所述Jz基因所属组中所述第一 J基因起始点之间的距离。
17.根据权利要求16的方法，其中利用至少3条引物的组合进行至少1个η> 2的η 重PCR反应，以分析TRB座位的不完全重排，所述引物组合包含与给定D基因的上游和/或 内部特异性杂交的正义引物，以及如权利要求13所定义的hTRBJl. 6和hTRBJ2. 7引物。
18.根据权利要求16和权利要求17的方法，其用于分析人TRB座位的所有不完全重 排，其通过以下进行⑴利用由hTRBJl. 6和hTRBJ2. 7和hTRBDl引物组成的3联引物组 进行2重PCR ；以及(ii)利用由hTRBJ2. 7和hTRBD2引物组成的引物对进行简单多重PCR， 其中所述hTRBDl和hTRBD2引物选自下表3所定义的引物
19.一种分析个体中TRB座位上重排之组合多样性的方法，其利用权利要求12至14中 任一项的方法分析该座位的V(D) J重排，并联合利用权利要求16至18中任一项的方法分 析该座位的不完全重排。
20.根据权利要求1至10中任一项的方法，其用于分析在人TRA座位上95%的J基因 和同一座位上给定V基因之间的重排，其中在步骤A)中利用引物组合进行6个2重PCR或3 个4重PCR反应，所述每个引物组合由与所述V基因的上游和/或内部杂交的引物以及1对 或2对反义引物组成，所述反义引物选自引物对(hTRAJ56，hTRAJ41)、(hTRAJ37, hTRAJ33)、 (hTRAJ48, hTRAJ29)、(hTRAJ24, hTRAJ18)、(hTRAJ53, hTRAJll)和(hTRAJ7, hTRAJ3)，所述 引物如下表4定义表4
21.一种分析TRA座位上VJ重排多样性的方法，其中利用至少3条引物进行权利要求 20的方法，所述引物与位于该座位上不同区域的3种不同V基因的上游和/或内部杂交。
22.根据权利要求20或权利要求21的方法，其中与所述TRA座位上V基因的上游和/ 或其内部杂交的至少1条引物选自下表5中所定义的引物表5
23.根据权利要 求1至8和权利要求11中任一项的方法，其用于分析人TRG座位上所 有J基因与同一座位上至少2个给定基因Vx和Vy的重排，其中在步骤A)中利用3联引物 进行至少1个2重PCR，所述引物由2条与所述Vx和Vy基因的上游和/或内部杂交的正义 引物以及1条与所述人TRG座位上J2基因杂交的反义引物hTRGJdo2 (ACATATGAGCCCTTTAT GGAAGTCCG, SEQ ID No. 62)组成。
24.根据权利要求23的方法，其中与人TRG座位上V基因的上游或内部杂交的至少1 条引物选自如下表6中定义的引物表6
25.根据权利要求1至10中任一项的方法，其用于分析人TRD座位上所有J基因与同 一座位上给定V基因的重排，其中在步骤A)中利用3联引物进行2重PCR，所述引物由与所 述V基因的上游和/或内部杂交的引物以及反义引物hTRDJldo5 (TGCCTCCTTAGATGGAGGATG CC, SEQ ID No. 67)和 hTRDJ3do2 (GCAAGGAGGCACGCATACTAGTTAGC, SEQ ID No. 68)组成。
26.根据权利要求25的方法，用于分析所述TRD座位上的VJ重排，其中利用至少3条引 物的组合进行M个η彡2的η重PCR，每个引物组合包含反义引物hTRDJldo5和hTRDJ3do2 以及选自如下表7定义之引物的至少1条hTRDV或hTRAV 表7
27.根据权利要求1至8和权利要求11中任一项的方法，其用于分析人IgH座位上所 有J基因与同一座位上至少2个给定基因Vx和Vy的重排，其中在步骤A)中利用3联引物 进行至少1个2重PCR，所述引物由2条与所述Vx和Vy基因的上游和/或内部杂交的正义 引物以及与所述IgHJ6基因的下游和/或内部杂交的反义引物组成。
28.根据权利要求27的方法，其中所述反义引物是hIgHJ6do2引物 (GATCTTGCAGTCCTACAGACACCGC, SEQ ID No. 85)。
29.根据权利要求27或权利要求观的方法，其中与人IgH座位上V基因的上游或内部 杂交的至少1条引物选自如下表8中定义的引物表8
30.根据权利要求15的方法，其中利用至少3条引物的组合进行至少1个η> 2的η 重PCR反应，以分析人IgH座位上特定的不完全重排，所述引物组合构成至少2对引物，其 包含与给定J基因的下游和/或内部特异性杂交的共用反义引物，且每对引物还包含与给 定D基因的上游和/或内部特异性杂交的正义引物。
31.根据权利要求30的方法，其中所述共用反义引物是权利要求观中所定义的 HgHJ6do2 引物。
32.根据权利要求30或权利要求31的方法，其中与人IgH座位上D基因的上游或内部 杂交的至少1条引物选自如下表9中定义的引物
33.一种分析个体中IgH座位上重排之组合多样性的方法，其利用权利要求27至四中 任一项的方法分析该座位的V(D) J重排，并联合利用权利要求30至32中任一项的方法分 析该座位的不完全重排。
34.根据前述权利要求中任一项的方法，其用于分析至少2个基因座位上V(D)J重排的 组合多样性，所述基因座位选自TRA、TRB、TRG、TRD、IgH、IgK和IgL座位。
35.根据权利要求34的方法，其用于分析TRB座位上V(D) J重排的组合多样性以及TRG 座位或TRD座位上VJ重排的组合多样性。
36.根据权利要求34或权利要求35的方法，其还用于分析IgH座位上V⑶J重排的组合多样性。
37.根据前述权利要求中任一项的方法，其中利用聚合酶进行η重PCR反应，所述聚合 酶具有以下特性(i)其能够扩增几十1Λ的片段；( )其延伸速度为至少1 /分钟；(iii)其稳健性为平均每1Λ引入的错误不多于1个。
38.根据权利要求7至36中任一项的方法，其中步骤C)包括对根据扩增子大小将其分 离而获得的数据进行加工的步骤，所述数据加工通过计算机实施进行，并且使得有可能将 相应V(D) J重排的名字指派给每个所观察到的扩增子。
39.根据权利要求38的方法，其中所述数据加工还包括所观察到的每个扩增子的信号 强度，以便对相应V(D) J重排的相对频率进行定量。
40.根据权利要求38或权利要求39的方法，其中步骤B)包括获得有关扩增子大小以 及每个扩增子相应信号强度的数据，并且步骤C)包括以下步骤(i)通过确定每个扩增子所对应的作为其大小之函数的V(D) J重排而对每个扩增子进 行鉴定；( )根据每个扩增子的信号强度确定具有相应V(D)J重排之起始基因组DNA的比例； (iii)以三维图形的形式显示结果，所述图形在一个轴上显示Vx基因或Vx基因家族， 在另一个轴上显示Jy基因，在第三个轴上显示VxJy重排的频率。
41.一种体外确定个体免疫缺陷程度的方法，其包括以下步骤A)利用来自所述个体的生物样品，对淋巴细胞进行计数；B)利用同一样品或同时取自同一个体的另一样品，通过实施前述权利要求中任一项的 方法，确定所述个体之淋巴细胞库的组合多样性程度；C)将步骤A)和B)中获得的数据组合。
42.根据权利要求41的方法，其还包括从图形观点对步骤C)所获得之组合进行解释的 步骤，所述图形将风险水平至少划分为以下4个区域(i)计数低(< 1000淋巴细胞/y L)，V-J组合多样性低(< 40% ):高感染风险，以 及由感染引起的高死亡风险；( )计数低(< 1000淋巴细胞/yL)，但V-J组合多样性正常(>65%)低感染风险；(iii)计数正常(1000-3200淋巴细胞/μL)，V-J组合多样性低(<40%)中等感染 风险；(iv)计数正常(1000-3200淋巴细胞/yL)，V-J组合多样性正常(> 65% )免疫库正常。
43.根据权利要求42的方法，其中所述图形还包括以下2个区域(ν)计数高于正常(> 3200淋巴细胞/μ L)，V-J组合多样性低(<40%)高淋巴细 胞增殖风险；(vi)计数高于正常(> 3200淋巴细胞/μ L)，V-J组合多样性正常(>65%)中等 淋巴细胞增殖风险。
44.根据权利要求41至43中任一项的方法，其中步骤B)包括确定所述个体中T淋巴 细胞和B淋巴细胞库的组合多样性程度。
45.根据权利要求44的方法，其中在步骤C)中通过三维图形来检验数据，所述图形在 一条轴上显示免疫球蛋白多样性程度，在另一条轴上显示TCR多样性程度，在第三条轴上 显示淋巴细胞计数。
46.一种监测个体中T和/或B淋巴细胞库多样性变化的方法，其包括以下步骤A)利用在两个不同日期取自所述个体的两个样品，通过权利要求38至45中任一项的 方法测定所述个体中淋巴细胞库的多样性；B)通过以下评价比较所述两个样品(i)在所述两个样品中观察到的重排的数目S ；( )在较晚样品中观察到但在较早样品中未观察到的重排的数目A ；(iii)在较早样品中观察到但在较晚样品中未观察到的重排的数目D；(iv)在所述两个样品中均未观察到的重排的数目Z。
47.实施前述权利要求中任一项之方法的试剂盒，其包含前述权利要求中任一项所定 义的引物组合，以及用于进行PCR的试剂。
48.根据权利要求47的试剂盒，其包含具有下列特性的聚合酶(i)其能够扩增几十1Λ的片段；( )其延伸速度为至少1 /分钟；(iii)其稳健性为平均每1Λ引入的错误不多于1个。
49.根据权利要求47或权利要求48的试剂盒，其包含多孔板，其中每个孔含有不同的 引物组合。
50.根据权利要求49的方法，其中所述多孔板包含扩增至少一个座位上至少50%的 V-J重排所必需的所有引物组合，所述至少一个座位选自TRA、TRB、TRG、TRD和IgH座位。
51.前述权利要求中任一项的方法或试剂盒的用途，用于研究人源化转基因动物和/ 或淋巴细胞培养物中TCR和/或IgH库的建立和质量。
52.权利要求1至48中任一项的方法或试剂盒用于体外筛选治疗性分子的用途。
53.一种评估疫苗接种方案之效力的方法，包括以下步骤A)利用权利要求1至48中任一项的方法或试剂盒测定进行该方案之前和之后淋巴细 胞的数量和多样性；B)比较步骤A)中的测定结果；和C)对结果进行解释，接种后淋巴细胞多样性减少至少10%、优选至少15%表明该疫苗 接种方案是有效的。
54.根据权利要求53的方法，其中在步骤A)中还测定接种前和接种后调节性T淋巴细胞 的数量，并且在步骤C)中接种后调节性T淋巴细胞的数量减少> 2倍表明该方案是有效的。
55.一种比较两种疫苗接种方案之效力的方法，包括以下步骤A)测定两个组接种前和接种后调节性T淋巴细胞的数量和免疫多样性；B)比较组与组之间的结果，其中最有效的方案是诱导调节性T淋巴细胞减少最多和/或淋巴细胞多样性降低最多 的方案。
全文摘要
本发明涉及一种分析个体中T和/或淋巴细胞库多样性的方法，其基于通过n重PCR(n≥2)从样品中扩增基因组DNA片段，其中利用至少3条引物的组合组成至少2对引物，每对引物包括与给定V或D基因的上游和/或内部特异性杂交的引物以及与给定J基因的下游和/或内部特异性杂交的引物，以扩增每个引物对的以两种不同V-J或D-J重排为特征的至少2个片段。本发明还涉及该方法的用途，特别是其在某些疾病的治疗随访或者诊断和/或预后中的用途。
文档编号C12Q1/68GK102083999SQ200880125800
公开日2011年6月1日 申请日期2008年11月25日 优先权日2007年11月26日
发明者塞巴斯蒂安·韦斯布赫, 尼古拉斯·贝吕耶 申请人:免疫技术有限公司, 原子能与替代能源委员会