人非抗体肽或蛋白质噬菌体文库的制作方法

专利名称：人非抗体肽或蛋白质噬菌体文库的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用源自M13噬菌体的PlX的工程化杂交噬菌体载体来生成Pix噬菌 体展示文库并使用该文库来产生一种或多种非抗体肽或蛋白质的组合物和方法。
背景技术：
噬菌体展示是基于亲和力的多肽选择的一种成熟工具。在典型的噬菌体展示选择 中，将多肽文库经基因工程融合至丝状噬菌体M13外壳蛋白其中之一的末端。噬菌体颗粒 提供所述文库的每个多肽成员与其编码基因之间的物理关联。接着可针对与所需靶分子结 合的文库成员，对噬菌体文库进行亲和选择即淘选。将文库与靶分子混合，洗掉未结合的噬 菌体颗粒，洗脱剩下的噬菌体并通过在大肠杆菌细胞中培养而扩增。尽管已经用M13的每种外壳蛋白实现了外源多肽的展示，然而pill和pVIII仍是 目前最常用的融合伙伴。pill是42kD的次要外壳蛋白，其负责噬菌体感染进入大肠杆菌。 每个噬菌体颗粒在其表面含有最多五个拷贝的pill蛋白，聚集在噬菌体的一端。PVIII是 噬菌体的主要外壳蛋白；数千个拷贝的PVIII (分子量为5kD)在单链病毒基因组周围以有 序的方式排列而构成噬菌体衣壳。除了 ΡΙΠ，Μ13还有三种其他次要外壳蛋白PVI(12kD 的蛋白)以及PVII和pIX，其中pVII和pIX是涉及装配起始和稳定性维持的短蛋白质(分 别具有33和32个氨基酸)。五个拷贝的pVI蛋白位于噬菌体的与pill相同的一端，而五 个拷贝的PVII和pIX的每一者均位于噬菌体的相对两端。虽然已证实在许多情况下可产生与pill和pVIII融合的噬菌体文库展示融合物， 但由噬菌体展示的多肽却受到某些生物学约束。例如，大多数长度为八个或更多个氨基酸 的肽不能很好地展示为与pVIII的融合物。此外，与噬菌体蛋白自身相互作用或以其他方 式影响PlII或pVIII的表达、整合或活性的多肽将在文库中递呈效率低，因为展示它们的 噬菌体生长不良。最后，因为PlII是相当大的蛋白，PlII展示的多肽通往某些靶位点的通 路(例如，蛋白表面的深而窄的缝隙)或以多聚体形式时发挥最佳功能的多肽的正确装配 可能会将在空间上受到阻碍。因此，根据利用其他外壳蛋白(其具有不同结构和生物学功 能，因此可预计会对所展示的多肽施加不同的约束)的噬菌体文库选择将有助于确保搜寻 最大量的序列多样性。在概念验证实验中，已证实PVII和PlX可用于展示抗体片段和肽。 这些结果是特别值得注意的，因为早期研究表明将多肽融合至PVII和pIX的N末端使得这 些外壳蛋白失去功能。可通过使用噬菌体、噬菌粒或杂交载体实现在噬菌体上展示外源多肽。通过使用 噬菌体载体，所关注的基因可被引入噬菌体基因组中作为与天然外壳蛋白基因的框内融合 物。这些载体作为全功能噬菌体独立地繁殖并展示多拷贝的外源多肽。相反，噬菌粒载体 是除细菌复制起点之外还含有噬菌体复制起点和包装信号的质粒。噬菌粒携带融合到外 壳蛋白基因的重组拷贝中的所关注的基因，并且一旦用辅助噬菌体救援，噬菌粒即被包装 进子代病毒中，其中展示的多肽整合在噬菌体外壳中。对辅助噬菌体的需要导致噬菌粒载 体比噬菌体载体劳动强度更大，并且使定量任何指定样品中所存在噬菌体数量的工作复杂
3化。此外，由于噬菌体颗粒可同时利用野生型外壳蛋白和融合外壳蛋白进行装配，因此所得 噬菌体的某些部分将不展示所关注的多肽序列，从而导致较低的展示效率。杂交载体类似 于噬菌体载体，因为噬菌体基因组中携带有融合蛋白并且不需要辅助噬菌体，杂交载体还 类似于噬菌粒系统，因为基因组也携带有融合蛋白的野生型拷贝。关于PlX噬菌体展示的 先前报道描述了在噬菌粒载体环境中的融合；关于在来自杂交载体或噬菌体载体的PlX上 展示多肽尚未见报道。最近已报道了多肽在来自噬菌体载体的PVII上的展示。需要提供合成的非抗体肽或蛋白质文库，和同时提供人治疗性肽和蛋白质的高亲 和力和活性、高产率、良好的溶解性质以及在人中施用时低免疫反应倾向这些关键要素的 方法。相对于现有的方法，还需要提高从合成文库中分离非抗体肽或蛋白质的效率，以减少 发现非抗体肽或蛋白质的资源耗费以及加速提供非抗体肽或蛋白质用于生物学评价。通过 将综合设计、装配技术以及噬菌体Pix肽或蛋白质展示加以结合，本发明的文库和方法满 足了这些需求。

发明内容
本发明提供可与PVII和PlX噬菌体展示一起使用的工程化Pix噬菌体载体，用于 利用M13噬菌体的PlX生成肽或蛋白质文库，如使用诱变或其他多样性产生技术，可选地使 用同步成熟(in line maturation)，从而为肽或蛋白质及非抗体肽或蛋白质片段的生成以 及治疗性非抗体肽或蛋白质的选择提供有效快速的平台。根据本发明，提供了杂交噬菌体 载体，其已经工程改造而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组PlX编码区。本发明提供将肽和蛋白质展示为与pIX或pVII噬菌体蛋白的融合物的噬菌体载 体，以用于将此类肽或蛋白质表达为肽或蛋白质文库，所述文库用于例如(但不限于)筛 选、选择、工程改造、成熟或其他用途，例如提供潜在的治疗性或诊断性肽或蛋白质。因为天 然基因IX的调控区和编码区与PVII和pVIII的调控区和编码区重叠，简单融合至该基因 的末端可能造成噬菌体失活(Hill和Petersen, J. of Virol. 44 =32-46,1982)。本发明的 载体包括该融合体而同时保留天然外壳蛋白的调控区。该载体(而不是噬菌粒)的使用不 需要辅助噬菌体并显著减少在选择和分析期间培养噬菌体所花费的时间和工作量。此外， 这些展示系统的多价特性使得它更容易检测低亲和力结合物。因此本发明提供了新型载体构建体，其用于以PlX噬菌体展示形式表达肽或蛋白 质，以构建多肽阵列。具体地讲，本发明描述了包含编码融合多肽的第二重组PlX编码序列 的工程化PlX噬菌体载体，其中所述融合多肽包含融合至丝状噬菌体PVII或PlX蛋白的氨 基末端的外源多肽。优选地，所述噬菌体颗粒在其表面包含表达的融合蛋白。在一方面，本发明提供了工程化的重组核酸噬菌体载体，其用于表达结合至所选 生物活性配体上的噬菌体展示融合肽或蛋白质，该载体包含(a)编码重组噬菌体前导序列 的核酸序列；可操作地连接至(b)重组标签、启动子或选择编码核酸序列；可操作地连接 至(c)重组PlX或PVII编码核酸序列；可操作地连接至(d)重组限制位点；可操作地连 接至(e)编码肽接头的核酸序列；可操作地连接至(f)选择性地结合至生物活性配体上 的第一外源肽或蛋白质编码序列；(g)pVII编码核酸序列；(h)编码天然pIX的核酸序列； (i)pIII编码核酸序列；以及(j)pVI编码核酸序列。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述噬菌体前导编码序列为pelB序列。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中重组标签或选择序列为FLAG标签序列。这 种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中重组标签或选择序列选自SEQ ID N0:3、4、5或6。 这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述FLAG标签序列包含SEQ ID NO :2。这种工 程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述启动子为诱导型启动子。这种工程化的核酸噬菌体 载体可包括其中所述诱导型启动子为Iac启动子。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其 中所述肽接头选自SEQ ID N0:7和8。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中所述第一 外源肽或蛋白质是推定的生物活性蛋白质或肽。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中 所述生物活性配体介导至少一种生物体内活性。这种工程化的核酸噬菌体载体可包括其中 所述载体编码融合至至少一种噬菌体外壳蛋白上的第二外源肽或蛋白质。本发明还包括包含工程化的核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞。该宿主细胞可表达 生物活性融合蛋白。本发明还涉及由根据本发明的细菌宿主细胞表达的生物活性融合蛋白。本发明还 涉及源自所述融合蛋白的生物活性外源肽或蛋白质。本发明还涉及包含复数种根据本发明的工程化核酸噬菌体载体的细菌宿主细胞 的噬菌体文库。所述噬菌体文库可包括其中所述第一外源肽或蛋白质的变体被表达。本发明还提供针对具有所需生物活性的外源肽或蛋白质对噬菌体肽或蛋白质文 库进行筛选的方法，所述方法包括(a)由噬菌体文库表达外源肽或蛋白质，以及(b)选择 表达具有所述所需生物活性的外源肽或蛋白质的细菌细胞。本发明还提供根据此方法获得 的外源肽或蛋白质编码核酸。在一个实施例中，噬菌体载体还编码第二融合多肽，其中所述第二融合多肽包含 融合至PlX或PVII蛋白的氨基末端的第二外源多肽，并且第一融合多肽中的第一外源多肽 融合至PlX或PVII蛋白的氨基末端。在一个实施例中，第一和第二融合多肽可联合形成异 型二聚体蛋白质复合物，例如靶标蛋白质、受体、核酸结合蛋白或酶。在另一个实施例中，本发明描述了用于在丝状噬菌体表面表达融合蛋白的载体， 所述载体具有用于表达所述融合蛋白的表达盒。该表达盒包含上游和下游可翻译DNA序 列，该DNA序列通过适于插入DNA定向连接的核苷酸序列(即多位点接头)可操作地连接， 其中上游序列编码原核分泌信号，下游序列编码PVII或pIX丝状噬菌体蛋白。该可翻译DNA 序列可操作地连接至一组DNA表达信号上，以将该可翻译DNA序列表达为融合多肽的一些 部分。在一个优选变型中，该载体任选还包含第二表达盒，用于在丝状噬菌体表面上表达第 二融合蛋白，其中该第二表达盒具有第一表达盒的结构，前提条件是第一融合蛋白表达盒 编码pIX或pVII蛋白和/或第二融合蛋白表达盒编码pIX或pVII蛋白。该载体被用作噬 菌体基因组来在噬菌体颗粒表面上表达异型二聚体蛋白质复合物，其中该异型二聚体的两 种外源多肽通过融合至第一和第二噬菌体蛋白(pVII和/或pIX)而锚定在噬菌体颗粒上。在另一个实施例中，基于所述工程化的pIX噬菌体载体，本发明设想了根据本发 明的噬菌体颗粒文库(即组合文库)，其中该文库中的代表性颗粒各自展示不同的融合蛋 白。在颗粒展示异型二聚体蛋白质复合物时，该文库包含异型二聚体的组合文库，例如Fv 分子文库形式的非抗体肽或蛋白质。优选的文库具有至少103、104、105、106、107、108、109、 101(1、1011、1012、IO13(或其中任何范围或数值)种融合肽或蛋白的组合多样性。一个相关的实施例描述了包含由本发明的工程化PlX噬菌体载体表达的第一和第二多肽的融合蛋白，其中第一多肽是外源蛋白而第二多肽是丝状噬菌体PVII或pIX蛋 白，其中外源蛋白融合至丝状噬菌体蛋白的氨基末端上。另外，本发明还设想了多种从本发明的工程化pIX噬菌体载体表达蛋白质或肽的 方法，用于产生噬菌体的组合文库，包括将编码外源多肽的全套基因克隆到本发明的载体 中、通过诱变来修饰文库中外源多肽的结构、随机组合第一和第二融合蛋白文库的群体、通 过靶向及亲和筛选(“淘选”)来改变文库的多样性等等。设计具有改进的或新颖的功能的蛋白质是一个具有多种医学、工业、环境以及基 础研究应用的重要目标。在用工程化PlX噬菌体载体开发非抗体肽或蛋白质组合文库后， 强有力的下一步骤是朝着人造非抗体肽或蛋白质构建体以及其他蛋白质基序推进，所述人 造抗体构建体以及其他蛋白质基序中二聚物是天然的或可能是功能性的。本发明通过将工程化的pIX噬菌体载体用于构建多肽组合阵列而提供噬菌体展 示形式来应对这些挑战，所述多肽组合阵列中pVII和/或pIX用来展示表达单体或二聚体 的肽或蛋白质种类的融合蛋白。该技术的范围和能力所固有的是能够展示可参与单体或二聚相互作用的各种蛋 白质。这些蛋白质不仅包括非抗体肽或蛋白质，还包括某些酶、激素和激素受体以及DNA结 合蛋白。本文所述的展示技术可用于非抗体肽或蛋白质框架区的组合改变，以及改组并微 型化非抗体肽或蛋白质结构，或将DNA结合蛋白(例如阻遏蛋白)展示为异型二聚体文库， 供选择具有临床和治疗价值的特定DNA序列。因此，本技术提供了肽或蛋白质文库以及其中成员由单体、同型二聚体或异型二 聚体阵列组成的组合文库的展示和选择。应当理解，以上一般性的描述和以下详细的描述都仅出于示例性和说明性目的， 不应限制受权利要求书保护的本发明。


图1A-D. Ml3-9载体中的用于表达重组ΗΑ-ρΙΧ融合蛋白的合成DNA插入序列。图2.pM0M 60的图谱，示出了天然噬菌体外壳蛋白基因以及插入的重组pIX基因 的位置。图3. M13-9的图谱，示出了天然噬菌体外壳蛋白基因以及插入的pelB信号序列和 HA表位的位置。图 4A-E. ELISA 示出各抗体与 ΗΑ-ρΙΧ 融合物(a)、FLAG_pIX 融合物(b)、His_6-pIX 融合物(c)的特异性结合，以及sEGFR-模拟体与M13-9噬菌体上的PHPEP 190-pIX融合物 (d)和EGF-pIX融合物(e)的特异性结合。
具体实施例方式本发明提供可与pVII和pIX噬菌体展示一起使用的工程化pIX噬菌体载体，用于 利用M13噬菌体的pIX生成肽或蛋白质文库，如使用诱变或其他多样性产生技术，可选地使 用同步成熟，从而为肽或蛋白质及非抗体肽或蛋白质片段的生成以及治疗性非抗体肽或蛋 白质的筛选提供有效快速的平台。根据本发明，提供了杂交噬菌体载体，其已经工程改造而 包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重组PlX编码区。
本发明提供将肽和蛋白质展示为与pIX或pVII噬菌体蛋白的融合物的杂交载体， 以用于将此类肽或蛋白质表达为肽或蛋白质文库，所述文库用于例如(但不限于)筛选、选 择、工程改造、成熟或其他用途，例如提供潜在的治疗性或诊断性肽或蛋白质。因为天然基 因IX的调控区和编码区与PVII和pVIII的调控区和编码区重叠，简单融合至该基因的末 端可能造成噬菌体失活(Hill和Petersen, J. of Virol. 44 =32-46,1982) (8)。作为替代， 已将M13mpl9的衍生物进行工程改造而包含连接至上游信号肽和诱导型启动子的第二重 组PlX编码区。该载体(而不是噬菌粒)的使用不需要辅助噬菌体并显著减少在选择和分 析期间培养噬菌体所花费的时间和工作量。此外，携带该载体的生长噬菌体的数量比携带 噬菌粒的生长噬菌体的数量更容易确定。因此本发明提供了新型载体构建体，其用于以PlX噬菌体展示形式表达肽或蛋白 质，以构建多肽阵列。具体地讲，本发明描述了包含编码融合多肽的第二重组PlX编码序列 的工程化PlX噬菌体载体，其中所述融合多肽包含融合至丝状噬菌体PVII或PlX蛋白的氨 基末端的外源多肽。优选地，噬菌体颗粒包含在噬菌体颗粒表面上表达的融合蛋白质。利用本文所述的这种工程化pIX噬菌体载体生成的人肽或蛋白质从头文库与现 有的非抗体肽或蛋白质文库技术现状不同之处在于它是通过M13噬菌体的pIX基因来展
7J\ ο丝状噬菌体本发明设想将本文所述的工程化PlX噬菌体载体与编码至少一个重组融合肽或 蛋白质的Pix或PVII噬菌体一起使用。该融合蛋白包括融合至丝状噬菌体PVII或PlX蛋 白的氨基末端的外源多肽部分。所谓“外源的”意指融合至噬菌体蛋白的多肽通常不与丝状噬菌体的野生型种类 中的噬菌体PVII或pIX蛋白相缔合，而是对于正常噬菌体蛋白而言是外来的。在一个优选实施例中，丝状噬菌体封装有编码第一和/或第二融合蛋白的基因 组，其中第一融合蛋白包含融合至PVII或pIX上的第一外源多肽，第二融合蛋白包含融合 至pIX或pIX上的第二外源多肽。如本文所述，丝状噬菌体还包含展示于噬菌体颗粒表面上的一种或多种融合蛋 白。因此，如果存在至少第一和第二融合蛋白，则噬菌体可以功能性方式展示这些蛋白，使 得第一和第二外源多肽可相互作用成为异型二聚体，从而在噬菌体表面上形成功能性双链 蛋白质复合物。在存在于本发明噬菌体上的融合蛋白中，外源多肽和丝状噬菌体pVII或pIX蛋白 之间的“融合”可包含典型的酰胺键，或可如实例中所述包含连接多肽(即“接头”)。可使 用多种接头中的任何一种，所述接头通常为一段长度为约5至50个氨基酸的序列。尤其优 选的接头可在靠近接头处给融合蛋白提供高度的活动性。文库设计以前的合成文库并入了以下内容的一部分，但没有一个全面地包括以 下全部内容。序列多样性的位置和性质。序列多样性是如何内源提供具有高亲和力、选择性结 合实体的人体蛋白质的标志。这种序列多样性的产生和积累不是随机的。基因组序列的核 苷酸突变的位点和类型因DNA序列和机理而具有偏向性，但是只有提供结合和功能优势的 突变才被选择和储存，并且通常伴随中性置换。虽然不易从机理预测，但已知的人肽或蛋白
7质序列和结构功能分析的数据库能鉴定在很多情况下与所需靶标或抗原的识别(包括蛋 白质、肽和小分子抗原之间的区分)相关的位置和氨基置换。本发明的文库通过利用设计 的简并寡核苷酸来在推定的结合区及功能区整合进置换，从而提供这种天然的人多样性。表达、生物化学和生物物理特性。优选的人非抗体肽或蛋白质不仅具有所需生物 活性和结合活性，而且可由多种宿主高效生产，并且具有稳定性和良好的溶解特性。高频率 种系基因用法(Id)也表明在哺乳动物系统中的良好表达。此外，通过选择或筛选的细菌噬 菌体展示方法来从文库回收的非抗体肽或蛋白质应在细菌宿主中表达良好。本发明的文库 是基于人种系衍生的模板，所述模板是从标准的重组哺乳动物宿主(例如HEK 293和CHO 细胞)以及细菌宿主良好表达和纯化的，并具有高稳定性和良好的溶解特性。文库组装技术。优选的从头非抗体肽或蛋白质文库具有高的多样性(> IOlt1)，易 于改变，容易组装，并且不需要的序列的背景低。这些背景序列包括亲代模板和低定向多样 性。结合以下方法可加速文库组装并产生低的背景(a)基于Kimkle的单链诱变；(b)具有 限制性位点的回文环；(C)大引物pIX肽或蛋白质噬菌体展示。所有以前的丝状噬菌体从头人非抗体肽或蛋白质文 库均利用PlII或PVIII噬菌体外壳蛋白来进行展示。pIX与选定的肽或蛋白质模板的组合 是用于回收非抗体肽或蛋白质的更有效的选择系统，所回收的非抗体肽或蛋白质在转化为 单克隆抗体及其他相关分子时保留它们的选定特性。肽或蛋白质展示。肽或蛋白质是人非抗体肽或蛋白质的天然片段，当它们通过基 因工程引入至完全非抗体肽或蛋白质中时可更好地重演它们的活性。肽或蛋白质的有效丝 状展示除要求在细菌宿主良好表达这个特性之外还要求其他特性。本发明的文库中所用的 肽序列被选择用于通过Pix在丝状噬菌体上有效展示。噬菌粒展示。肽或蛋白质相对于噬菌体PlX外壳蛋白而言可能较大，因此如果连 接至在细菌细胞中产生的所有PlX蛋白的话，则可能干扰重组噬菌体颗粒的装配。规避该 干扰的一种方法为使用PlX噬菌粒系统，凭此野生型PlX蛋白和肽或蛋白质连接的PlX蛋 白都可整合进重组噬菌体颗粒中。在一个优选的应用中，本发明的文库是通过PlX在噬菌 粒系统中展示。用于展示的噬菌体外壳蛋白pIX。类似于pIII，pIX以较低的拷贝数存在于噬菌 体上，并适于对展示的肽或蛋白质进行亲和选择。但是，PlII蛋白质参与侵染过程并起着 关键作用，展示在该PlII蛋白质上的蛋白质可能干扰侵染效率。此外，重链Fd或轻链片段 都可与PlX融合以进行展示。预计展示在PlX蛋白上的本发明文库可被有效复制和递呈， 以进行选择和/或筛选。肽或蛋白质-pIX表达。筛查从噬菌体文库中回收的肽或蛋白质的一种方法是去 除连接至用来展示的肽或蛋白质分子的噬菌体外壳蛋白。PlX蛋白的小尺寸提供了无需这 个步骤而直接筛选肽或蛋白质的生产选择。噬菌体构造。合适的M13或类似类型的噬菌体载体可用作根据本发明的工程化载 体。可根据已知技术对具有合适的调节、选择、限制性酶切以及其他所需位点和序列(如启 动子、信号序列、前导序列(如PelB)、核糖体结合位点(如Shine-Delgano)、标签(如FLAG 标签)、转录终止子(如trpA)、选择序列(如LACZ)、限制性位点(如HindIII, EcoRI)、肽 接头等等)的编码PlX或PVII融合蛋白的这种载体进行修饰，使其还包含连接至上游信号
8肽编码序列和诱导型启动子(如LacZa)的第二 pIX和/或pVII编码序列。这会消除了对 辅助噬菌体的需要，并且还显著减少了在选择和/或分析步骤期间培养噬菌体所需的时间 和精力。另外，与使用其他载体相比，可更容易地确定需要培养的噬菌体数量。举以非限制性的例子，源自M13mpl9的M13KE是已知的可通过插入重组pIX基因 来提供本发明的工程化Pix噬菌体载体的噬菌体载体。可将重组区插入(例如)M13mpl9 的IacZ α区，位于噬菌体基因组基因间区域中，因此Iac启动子可驱动重组基因IX融合物 的转录。插入序列(图1)可包含Shine-Delgarno序列(核糖体结合位点)、来自果胶裂 解酶B的信号序列(pelB)、用于后续克隆的双BbsI限制酶识别位点、pIX编码区以及trpA 转录终止子。FLAG标签肽DYKDDDDK以及五氨基酸接头(M13-99 =GGTKT)或九氨基酸接头 (M13-99L :SGGSGGTKT)包含在 pelB 与 IX 基因之间。可用九氨基酸接头将具有各种长度和电荷的另外的肽(例如，但不限于表1中的 那些)展示于PlX的氨基末端，以确定最适合表达特定多肽的接头。此外，将一种或多种外 源融合肽展示于PlX或pVII上。可针对肽标签的展示分析最终噬菌体载体是否含有重组pIX基因，例如在ELISA 实验中进行分析。可用抗M13/靶标缀合物或任何其他表达外源肽的检测方法来检测结合 至固定化的靶标肽或蛋白质上的噬菌体。皿。用于在pIX上展示肽和蛋白质的噬菌体系统与以前开发的噬菌粒系统相 比，在亲合力、速度和方便性方面更有优势。由于亲合力的影响，与噬菌粒或杂交系统相比， 其结合信号显著增加。因此，该系统可作为从大的集合中鉴别出弱的结合物的理想系统。结 合信号的这种放大对往往内在亲和力弱而不具备亲和力成熟的肽来说至关重要。具有不同 长度、电荷、线性和环状的肽和小的球形蛋白质已成功展示于Pix上，并在本文公开。该噬 菌体载体所节省的时间也是明显的。噬菌体可感染进入宿主细胞并且扩增一个下午，基本 上在一个步骤中进行。相反，噬菌粒的扩增需要进行噬菌粒感染和长出、用辅助噬菌体以确 定的培养物浓度进行超感染以及对所救援的噬菌体进行扩增。因此该过程必需要额外的步 骤和操作者输入，并且(至少)要过夜培养。相对于典型选择实验中涉及的重复选择循环 和多轮筛选过程，噬菌体系统的时间节省可十分明显。此外，噬菌体系统不需辅助噬菌体感 染，仅存在一种类型的噬菌体基因组可包装进噬菌体颗粒中。这生成了均一的噬菌体群体， 使得能精确测量含有融合基因组的病毒颗粒。虽然已概括地描述了本发明，但是本发明的实施例还将在以下的实例中进一步公 开，所述实例不应理解为限制权利要求的范围。实例1 示例性的工程化噬菌体载体的构建9型噬菌体载体的构建原型M13-9载体(PHPEP208)被构建成含有来自果胶 裂解酶B的信号序列(pelB)和双BbsI限制性酶识别位点，该位点用于在噬菌体基因组 M13KE (M13mpl9的衍生物)中的pVII和pIX基因之间插入后续克隆。在未经修饰的M13KE 噬菌体基因组中，PVII基因的最后一个氨基酸密码子的末端核苷酸碱基为pIX基因的ATG 起始密码子的第一个核苷酸碱基。在PHPEP 208中在pVII基因和pelB信号序列的ATG起 始密码子之间保留PVII和pIX基因之间共用的该最后一个和第一个核苷酸。在elB信号 序列和基因PlX之间包含流感血凝素(HA)肽YPYDVPDYA和九-氨基酸接头SGGSGGTKT。将 具有各种长度、电荷的三种其他肽(表1)和小的球形蛋白质表皮生长因子(EGF) (SEQ ID
9NO 6)亚克隆至PHPEP208中，并用所述九氨基酸接头使它们展示于pIX的氨基端。方法。通过对含有HA盒(MOM 60)的M13-99噬菌体基因组进行两个系列的PCR 而产生编码pVII-PelB-HA-pIX盒的DNA (图ld，该DNA的两侧为BsrGI和BspHI酶识别位 点)，以获得N端和C端片段。然后，通过重叠PCR重组反应将这两个片段连接在一起。MOM 60含有插入噬菌体基因组M13KE(M13mpl9的衍生物)中的重组pIX基因(图2)。重组区 已插入M13mpl9的IacZa区，位于噬菌体基因组基因间区中，因此Iac启动子可驱动该重 组基因IX融合物的转录。插入序列包含Shine-Delgarno序列(核糖体结合位点)、来自果胶裂解酶B的 信号序列(pelB)、用于后续克隆的双BbsI限制性酶识别位点、pIX编码区以及trpA转录 终止子。在pelB和基因IX之间包含HA肽YPYDVPDYA(SEQ ID NO :2)和九-氨基酸接头 SGGSGGTKT (SEQ ID NO :7)。为了产生N端片段，从M0M60基因组PCR扩增出一段包含BsrGI 位点和PVII基因的DNA (图la)。然后，通过PCR扩增将pelB信号序列的一部分添加至其C 端末端，以提供18bp的互补碱基配对位点，用于与C端片段进行后续的重组反应(图lb)。 C端片段通过PCR扩增一段DNA来产生，该段DNA含有pelB信号序列、HA表位和来自M0M60 噬菌体基因组的HA盒的pIX基因的重组拷贝(图lc)。反向寡核苷酸引物含有BspHI限制 性位点。让所述N端和C端PCR片段在互补区退火在一起，并通过PCR进行扩增(图Id)。 将该表达盒用BsrGI和BspHI酶进行限制性酶切消化，并连接至已用BsrGI和BspHI消化的 M13KE RF DNA中。最终的噬菌体载体M13-9 (SEQ ID NO 1)的图解见图3。对于其他的肽， 其互的补寡核苷酸退火到一起而生成适当的DNA序列。退火的寡核苷酸含有与BbsI消化 的M13-9载体对应的相容悬突，使得肽标签DNA和载体能连接。PHPEP 190为对可溶性EGFR 受体具有亲和力的肽。其氨基酸残基中的八个位于由二硫键限定的环中。对EGF进行PCR 扩增，用BbsI限制性内切酶进行消化，然后连接至BbsI消化的M13-9中。接种重组噬菌体 以在XL-I蓝宿主大肠杆菌细胞(Stratagene)的菌苔上分离出单个菌斑。将噬菌斑重新悬 浮于介质中，并让其在琼脂上扩散。将噬菌体感染进XL-I蓝大肠杆菌细胞中并在37°C下 培养4. 5小时。在噬菌体生长和诱导之后，通过离心移除细菌，用4% PEG-8000、0. 5M NaCl 将噬菌体从培养上清液中沉淀出来，并在4°C下孵育过夜。通过离心回收噬菌体颗粒，并将 噬菌体粒料重新悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)中。展示的肽的分析。在ELISA实验中针对展示对含有肽或蛋白质的噬菌体进行检 测。用抗M13/HRP缀合物检测结合至固定化的单克隆抗体或可溶性EGFR-模拟体的噬菌体。 发现具有HA插入序列的M13-9特异性地结合至抗HA抗体而非抗flag抗体上，表示HA标 签在重组PlX上得到了成功展示(图4a)。其他肽和EGF的ELISA数据在图4b、4c、4d和 4e中示出。抗his和抗flag抗体用作适当的噬菌体的靶标。将可溶性EGFR-模拟体用于 检测PHPEP 190肽和EGF蛋白的展示。将人IgGl Fc支架用作PHPEP 190和EGF噬菌体 ELISA的阴性对照。这些结果表明，这些肽和EGF蛋白也成功地展示在重组pIX上。方法。将Maxisorp ELISA板(NUNC)的各孔用500ng单克隆抗体或可溶性EGFR-模 拟体(PBS中5 μ g/mL)包被，4°C下过夜。用含有0. 1 % Tween-20的Tris缓冲盐水(TBS-T) 冲洗各孔两次，然后用Starting Block(Pierce)在室温下封闭1小时。再次冲洗小孔。将 稀释于Starting Block中的PEG沉淀的噬菌体(IO8 I(Tpfu)加入小孔中并在室温下振荡孵育1小时。用TBS-T冲洗小孔三次，将抗M13/辣根过氧化物酶缀合物(GE Healthcare)(在Starting Block中以1 5000稀释)加入小孔中，并在室温下振荡孵育1小时。用 PBS-T冲洗小孔三次，然后加入POD化学发光底物(Roche)，并在Tecan读板器上检测。表1.克降讲DIX杂夺表汰裁体中的flt序歹U。
—肽标签 象基酸序列 — FLAG — DYKDDDDK (SEQ ID NO: 3) “ HA — YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 2) “ HIS HHHHHH (SEQ ID NO: 4) PHPEP 190— GGDPCTWEVWGRECLQGG (SEQ ID NO: 5) “ EGF MAVFNSDSECPLSHDGYCLHDGVCMYIEALDKYACNCVVGYIGERCQYRDLKWWELR~ __(SEQ ID NO: 6)_参考文献1. Kehoe, J. W.禾口 B. K. Kay. 2005. Filamentous phage display in the new millennium. Chem Rev 105 :4056o2. Iannolo, G. , 0. Minenkova, R. Petruzzelli 禾口 G. Cesareni. 1995. Modifying filamentous phage capsid :limits in the size of the major capsid protein,J Mol Biol 248 :835o3. Gao，C. ，S. Mao，C. H. Lo, P. ffirsching, R. A. Lerner 禾口 K. D. Janda. 1999. Making artificial antibodies -.a format for phage display of combinatorial heterodimeric arrays. Proc Natl Acad Sci USA 96 :6025o4. Gao, C. ， S. Mao, G. Kaufmann, P. ffirsching, R. A. Lerner 禾口 K. D. Janda. 2002. A method for the generation of combinatorial antibody libraries using pIX phage display. Proc Natl Acad Sci USA 99:12612。5. Gao, C. , S. Mao, H. J. Ditzel, L. Farnaes, P. ffirsching, R. A. Lerner 禾口 K. D. Janda. 2002. A cell-penetrating peptide from a novel pVII-pIX phage-displayed random peptide library. Bioorg Med Chem 10:4057。6. Endemann, H.禾口 P. Model. 1995. Location of filamentous phage minor coat proteins in phage and in infected cells. J Mol Biol 250 :496。7. Hill, D. F.禾口 G. B. Petersen. 1982. Nucleotide Sequence of Bacteriophage fl DNA. Journal of Virology 44:32。序列表SEQ ID NO : 1Ml3-9 (HA)的序列aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgccccaaatgaaaat 60atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaactaaatctact 120cgttcgcaga attgggaatc aactgttaca tggaatgaaa cttccagaca
ccgtacttta 180gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag caccagattc agcaattaagctctaagcca 240 tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaatcctgacctg 300ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcgatatttgaag 360tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctgactataatagt 420cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaactgtttaaagca 480tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgctatccagtct 540aaacatttta ctattacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctctcgctatttt 600ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttactatgcctcgt 660aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaaatctcaactg 720atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagattt780tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaatta840caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgt tctggtgtt900ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgatttgggtaatg960aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctatgcgcctggtc 1020tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttcccttatgattgacc 1080gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcgacacaatttat 1140caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataatcgctgggggt 1200caaagatgaa atacctattg cctacggcag ccgctggatt gttattactcgcggcccagc 1260cggcgatggc tgtcttctat ccatacgatg ttcctgacta tgctagcggtggcagcggcg 1320
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权利要求
一种工程化重组核酸噬菌体载体，其用于表达结合至选定的生物活性配体的噬菌体展示融合肽或蛋白质，所述载体包含a.编码重组pVII噬菌体的核酸序列；其可操作地连接至b.编码重组噬菌体前导序列的核酸序列；其可操作地连接至c.重组限制性位点；其可操作地连接至d.编码肽接头的核酸序列；其可操作地连接至ae.编码选择性结合至生物活性配体的第一外源肽或蛋白质的序列；f.编码天然pIX的核酸序列；g.编码成熟pVIII的核酸序列；以及h.编码成熟pIII的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中所述编码噬菌体前导序列的序 列为peIB序列。
3.根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中重组标签或选择序列为HA标签 序列。
4.根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中重组标签或选择序列选自SEQ ID NO :3、4。
5.根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中所述肽接头选自SEQID NO :6、 7 禾口 8。
6.根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中所述第一外源肽或蛋白质是推 定的生物活性蛋白质或肽。
7.根据权利要求7所述的工程化核酸噬菌体载体，其中所述生物活性配体介导至少一 种体内生物活性。
8.根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌体载体，其中所述载体编码融合至至少一种 噬菌体外壳蛋白的第二外源肽或蛋白质。
9.一种细菌宿主细胞，所述细菌宿主细胞包含根据权利要求1所述的工程化核酸噬菌 体载体。
10.一种生物活性融合蛋白，所述生物活性融合蛋白由根据权利要求9所述的细菌宿 主细胞表达。
11.一种生物活性外源肽或蛋白质，所述外源肽或蛋白质源自根据权利要求10所述的融合蛋白。
12.—种细菌宿主细胞的噬菌体文库，所述噬菌体文库包含复数种根据权利要求1所 述的工程化核酸噬菌体载体。
13.根据权利要求12所述的噬菌体文库，其中所述第一外源肽或蛋白质的变体被表达。
14.一种针对具有所需生物活性的外源肽或蛋白质对噬菌体肽或蛋白质文库进行筛选 的方法，所述方法包括(a)由根据权利要求13所述的噬菌体文库表达外源肽或蛋白质，以 及(b)选择表达具有所述所需生物活性的外源肽或蛋白质的细菌细胞。
15.一种编码外源肽或蛋白质的核酸，所述核酸从根据权利要求14所述的方法获得。
全文摘要
本发明涉及使用源自M13噬菌体的pIX的工程化杂交噬菌体载体来生成pIX噬菌体展示文库并使用该文库来产生一种或多种非抗体肽或蛋白质的组合物和方法。
文档编号C12Q1/68GK101970691SQ200880127065
公开日2011年2月9日 申请日期2008年11月21日 优先权日2007年12月19日
发明者C·黄, K·奥奈尔, L·尹 申请人:森托科尔奥索生物科技公司