专利名称：通过4轮连续pcr或阻断pcr或其全基因合成的方法进行的含有基因特异的条形码的粟酒 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉 及系统地制备基因靶向的杂合缺失突变粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)菌株的方法。更具体地，本发明涉及通过用缺失盒(deletion cassette)转化粟酒裂殖酵母制备基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母的方法，该缺失盒由4 轮连续PCR、阻断PCR或全基因合成构建，含有同源重组位点。同时，本发明涉及由该 方法制备的基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母突变体，和基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖 酵母突变体的文库。此外，本发明与用于在文库中筛选药物作用方式的方法和试剂盒有 关。
背景技术：
在2006年，据报道全世界的药物市场价值为6430亿美元，韩国药物产品占该总 额中的11,4728亿韩元份额。全球药物市场预期在2007年增加到7350 7450亿美元。 据报道将新药带进市场需要1 6亿美元的平均成本，10至15年的开发期。尽管这样巨 大的时间和金钱的花费，但是据报道新药开发的成功率低，为万分之一。因此，新药的 成功开发必须应该从许多可能的作用方式中定义高度假定的在疾病的发生和治疗中起关 键作用的“药物的作用方式”；这通常是通过从复杂的实验数据中提取生物相关性的智 能生物信息学工具完成的。由此，系统地筛选直接涉及许多疾病的特异作用方式非常重 要。就这一点而论，筛选技术在鉴别药物发挥其治疗作用的靶标中是有用的，因此 非常有助于减少药物开发需要的时限。同时，筛选技术允许与药物的副作用相关的作用 方式的鉴别。因此，急需筛选药物作用方式的新颖的方法。粟酒裂殖酵母是本发明的优选实施方式中有用的裂殖酵母，它与芽殖酵母—— 酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在进化上不具有高度相关性，尽管它们都属于子囊 菌粟酒裂殖酵母(ascomycetes S.pombe) (Wood V.et al.，Nature.45 871-880，2002)， 在酿酒酵母以后被标记为第六模式真核生物，其基因组已被完全测序(Goffeau A.etal.， Science, 274 546-567，1996)。根据分析，在迄今其基因组已被测定的真核细胞中， 粟酒裂殖酵母具有有效的基因组结构，该结构具有最低的基因功能重复。还据报道粟酒 裂殖酵母含有4,824个蛋白编码基因，这是已被鉴定的真核生物的最小数目，但是约43% 的基因含有内含子。同时，发现粟酒裂殖酵母具有对包括细胞周期控制、蛋白水解、蛋 白磷酸化和RNA剪接需要的那些细胞构造在内的真核细胞构造重要的高度保守基因。此 夕卜，粟酒裂殖酵母的基因的31%被鉴定为与酿酒酵母的基因不同，而与人类同源。因 此，粟酒裂殖酵母和酿酒酵母之间的遗传功能的比较正显现为研究人类基因功能的有效 方法学。术语“基因打靶(基因寻靶)，，如本文所用以在药物作用方式的筛选中转化酵母菌株，意欲指使用同源重组来改变内源基因一诸如通过破坏基因(敲除)或通过导入基 因一的遗传技术。已使牵涉特异疾病的基因从其中去除或导入其中的转基因小鼠具有 其观察到的病理学，因此允许在功能上鉴别敲除基因。由于1989年转基因小鼠的产生，基因打靶已产生了巨大的技术进步。例如，靶 基因能在特定的发育阶段被导入或导入到已经长大的成体。同时，可能设计在发育过程 中的特定时间表达的突变基因。Martin J.Evans、Oliver Smithies和Mario R.Capecchi因他 们在基因打靶方面的工作而被宣布成为2007年生理学和医学诺贝尔奖获得者。
PCR(聚合酶链反应)是用于复制和扩增DNA的分子生物学技术(美国专 利号 4,683,195、4,683,202 和 4,800,159 ；欧洲专利号 0200362、0201184 和 0229701 ； Methods in Enzymology, Volume 155, 1987, pp.335-350, Murakawa et al.，DNA 7 ； 287-295(1988))。这个技术典型地由30至40个变性、退火和延伸的循环组成，并允许感 兴趣的基因区段选择性地扩增，甚至从DNA库中的痕量扩增。现在，已发展了基本PCR 技术的变化，包括多重PCR、巢式PCR、定量PCR、实时PCR、逆转录(RT-PCR)、递 降PCR等。实时PCR是建立的用于DNA定量的工具，因为荧光探针与引物一起使用，基于 PCR产物扩增期间按比例产生的荧光信号的检测，它测量每轮PCR扩增之后DNA产物的 积累。实时PCR能快速并方便地获得PCR结果，因为它不需要电泳测定。同时，实时 PCR具有污染风险低的优势。由于这些理由，实时PCR作为典型PCR的替代享有广泛 的使用。转化是缘于外源DNA的摄取、基因组整合和表达的细胞遗传变化。实际上， 用选择性标记来标记外源DNA以容易地选择外源DNA已被成功导入的细胞。选择性标 记的典型例子包括氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因和卡那霉素抗性基因。转化之 后，在相关抗生素存在下的培养允许成功转化的细菌的选择。在本发明中，通过将抗生 素抗性基因导入到相应的同源重组位点的转化来敲除裂殖酵母中的特定基因。基因合成是公知技术，自从20世纪90年代早期基于PCR的寡聚体连接的发展 后，已发表了约200篇关于基因合成的文章(Edgeet al.，Nature.292 756-62、Roufflardet al., NAR.32 176—80、Smithetal., NAR. 10 4467—82、Dillon etal.，Biotechniques.9 298-300、Ciccarelli et al.，Nucleic Acid Research.21 6007-13、Prodromou et al., ProteinEngineering. 5 827-29、Stemmer et al.，Gene. 164 49-53、Lin etal.，Gene.288 85-94、Venter et al., Proceedings National Academy of Science. 100 15440-45)。原则 上，将20bp至60bp长的寡核苷酸退火并相互连接以产生双链DNA片段，该片段然后被 用作通过PCR的期望DNA扩增的模板。可以通过基因合成获得的DNA片段通常小于 l,000bp。对于较长的基因，通过PCR连接获得的小于IOOObp的DNA片段。在2003 年，Craig Venter博士以这样的方式成功地建立φΧ174噬菌体(phiX174噬菌体)全部的 5,386-bp基因组。关于药物作用方式的筛选，最广泛使用的是体外的方法。例如，将细胞蛋 白的混合物通过具有药物附着的树脂的亲和柱，纯化因此结合到药物上的蛋白并用 MALDI-TOF 分析(Schreiber et al.，Bioorg.Med.Chem.6 1127-1152)。可选的是将人 类蛋白质噬菌体文库通过含有药物附着的树脂的亲和柱，在该文库中人类蛋白质表达在膜上，接下来选择和分析结合到药物的噬菌体以推论药物的靶蛋白(Scheetal.，Chem. Biol.6 707-716)。最近，已经对与上面的两种方法完全不同的体内筛选方法进行了尝试(Lutnet alCell.116 121-37)。尽管与筛选人类蛋白的体外方法相比，这种方法因为筛选酵母蛋 白是不利的，但是它具有快速(100个药物/周)、方便和高成功率的优点。在2004年， Merck的Shoemaker和Lum博士的研究小组筛选了针对80个预先存在药物的作用方式， 成功率从25%增加到70%。被称作药物诱导的单倍性不足的筛选策略是基于降低药物靶 标的基因剂量增加对药物的敏感性的事实。在大多数情况下，一个等位基因足以允许细 胞正常地工作，但是当正常的表型需要两个等位基因的蛋白产物时，50%的基因功能的 重建导致异常的表型，这被称作单倍性不足。据报道，芽殖酵母的180个基因，相当于 约6,000个基因的3%，牵涉单倍性不足，因此与野生型相比，突变体甚至在充足的营养 培养基中生长差(Deutschbauer etal.，Genetics. 169 1915-25)。这种单倍性不足是在杂 合突变体酵母菌株中筛选药物作用方式的基础。例如，假定药物‘a’靶向蛋白‘A’， IC5tl剂量的药物‘a’的治疗导致在基因靶向的杂合菌株中蛋白‘A’的100%抑制(击 倒)，IC5tl是抑制蛋白‘A’ 一半的浓度。相应地，药物治疗的菌株以比未治疗的菌株 低的速度生长。根据本发明，提供在单倍性不足的基础上筛选药物作用方式的方法。构建基因靶向菌株的成功依赖菌株的性质，因为它由同源重组效率决定，一个 菌株与另一个菌株的同源重组效率不同。然而，在相同的菌株中同源重组效率与基因组 同源位点的长度成比例。因此，对应于基因组同源位点的较长DNA片段允许基因靶向 的菌株以更有效的速度构建。被概述在下面表1中的试验已在芽殖酵母上进行，但是在 裂殖酵母上没有这样高成功率的先例(Palaniyandi et al.，Nud Acid Res.3 2799-2800 ； Michael etal., Gene. 158 113-17 ； Kauretal, NudAddRes.25 1080-81)。表 权利要求
1.构建基因靶向的杂合裂殖酵母突变体的方法，包括将用于基因打靶的缺失盒导入 到裂殖酵母菌株中，所述缺失盒包括选择性标记基因；用于微点阵的、分别定位于所述 选择性标记基因两侧的一对基因特异的条形码碱基序列；和被分别分配到定位在所述选 择性标记基因的上游和下游的所述条形码碱基序列侧面的一对同源重组区，其中每个同 源重组区的长度大于150bp。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述每个同源重组区的长度范围是150bp至 450bp。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述每个同源重组区的长度范围是250bp至 450bp。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述缺失盒是通过四轮连续PCR、阻断PCR或 基因合成构建的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述每个条形码碱基序列的长度范围是20至 30bp。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述条形码碱基序列选自图7至55显示的碱基 序列，所述条形码碱基序列中的两个被分别分配在所述选择性标记基因的上游和下游。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性标记基因是卡那霉素抗性基因。
8.被缺失盒转化的、基因靶向的杂合裂殖酵母菌株，所述缺失盒包括选择性标记基 因；用于微点阵的、分别定位于所述选择性标记基因两侧的一对基因特异的条形码碱基 序列；和被分配到各自的条形码碱基序列侧面的一对同源重组区，所述条形码碱基序列 选自图7至55显示的碱基序列，其中两个被分别分配在所述选择性标记基因的上游和下 游。
9.根据权利要求8所述的基因靶向的杂合裂殖酵母菌株，其中所述选择性标记基因是 卡那霉素抗性基因。
10.将缺失盒导入到裂殖酵母每个基因的基因靶向的杂合裂殖酵母突变体文库，其中 所述缺失盒包括选择性标记基因和分别定位于裂殖酵母每个基因的所述选择性标记基因 两侧的一对基因特异的条形码碱基序列，所述基因特异的条形码碱基序列选自图7至55 显示的碱基序列。
11.根据权利要求10所述的基因靶向的杂合裂殖酵母突变体文库，其中所述选择性标 记基因是卡那霉素抗性基因。
12.筛选药物作用方式的方法，包括1)用化学药品处理权利要求10或11所述的基因靶向的杂合裂殖酵母突变体文库；2)培养所述化学处理的裂殖酵母突变体文库；3)从所述培养的文库中分离基因组DNA;和4)利用施加到微点阵基因芯片上的所述分离的基因组DNA测量和分析所述突变体的 生长速度，以检测相对生长被抑制的菌株。
13.筛选药物作用方式的方法，包括1)用化学药品处理权利要求10或11所述的基因靶向的杂合裂殖酵母突变体文库；2)培养所述化学处理的裂殖酵母突变体文库；3)从所述培养的文库中分离基因组DNA;和4)利用所述分离的基因组DNA通过定量实时PCR测量和分析所述突变体的生长速 度，以检测相对生长被抑制的菌株。
14.用于药物作用方式的筛选试剂盒，包括权利要求10所述的基因靶向的杂合裂殖酵 母突变体文库。
全文摘要
提供用于制备基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母的方法，包括用缺失盒转化粟酒裂殖酵母，该缺失盒由4轮连续PCR、阻断PCR或全基因合成构建，含有同源重组位点。还提供了由该方法制备的基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母突变体，和基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母突变体文库。此外，该文库在构建用于筛选药物作用方式的方法和试剂盒中有用。
文档编号C12N15/00GK102016022SQ200880128751
公开日2011年4月13日 申请日期2008年8月27日 优先权日2008年4月22日
发明者俞香淑, 元美善, 南美英, 崔信正, 张荣珠, 朴助英, 朴翰浯, 李惠美, 李慜镐, 白昇泰, 许京善, 许光来, 郑璟淑, 金东旭, 金东燮, 金炯培, 韩尚助 申请人:韩国生命工学研究院