专利名称：自身活化淋巴细胞培养方法
技术领域：
本发明涉及一种用于恶性肿瘤治疗的自身活化淋巴细胞培养方
法，更具体地说，本发明涉及，在白细胞介素2 (IL-2)和抗CD3、 抗CD16、以及抗CD56抗体存在的条件下，培养从人外周血中分离 出的淋巴细胞，增加NK细胞在淋巴细胞中所占的比例，均匀活化 NK细胞、T细胞以及NKT细胞，有效地去除多种多样癌细胞的培养 方法。
背景技术：
发生于人体的恶性肿瘤的治疗方法一般有手术、放射治疗以及 化学疗法。但是，恶性肿瘤中也可能存在位于难以用这些方法治疗的 解剖部位的肿瘤，在这种情况下，必须采用有力的辅助疗法，以改善 患者的预后。
在辅助疗法中，自身活化免疫细胞的过继免疫疗法(adaptive immunotherapy)是一种将从患者的血液中分离而获得自然杀伤细胞 (natural killer cell; NK细胞)、树突状细胞(De) 、 B细胞、T细 胞等在治癌过程中最重要的免疫细胞，利用多种刺激剂，扩增出具有 高度抗肿瘤活性的免疫细胞，并回输患者体内的方法，该方法由于使 用患者自己的血液，与传统的化学疗法等治疗方法相比副作用少、给 药简便，因此，最近被广泛研究。
韩国专利第0735081号(发明名称活化CD4 T细胞的方法) 公开了在传统过继免疫疗法中所用的免疫细胞活化方法。根据上述的 活化CD4 T细胞的方法，从血液等生物试样分离CD4 T细胞之后， 在含有GM-CSF、 IFN-gamma、 TNF-alpha、 Lectin以及IL-4等细胞 因子的培养基中进行培养，并在试管中活化CD4 T细胞，从而获得 预防或治疗细菌感染的组合物。但是，上述活化CD4 T细胞的方法具有以下技术问题；因为该 方法只能选择性地激活免疫细胞中参与获得免疫的T细胞，所以当 使用该方法治疗肿瘤时，虽然通过大量被激活的T细胞可以有效地
攻击或杀伤已被记忆的癌细胞，但是在攻击未被记忆的各种癌细胞而 治疗恶性肿瘤方面，受到了限制。
发明内容
本发明的目的是解决上述现有技术中存在的问题。即，本发明
目的是提供在白细胞介素2(IL-2)和抗CD3、抗CD16、以及抗CD56
抗体存在的条件下，培养从人外周血中分离出的淋巴细胞，增加NK 细胞在淋巴细胞中所占的比例，均匀活化NK细胞、T细胞以及NKT (Natural Killer T)细胞，有效地去除多种多样的癌细胞的培养方法。
作为为了达到上述目的的技术思想的本发明提供自身活化淋巴 细胞的培养方法，其特征在于，该方法包括从人外周血中分离淋巴 细胞的步骤；在含有白细胞介素2 (IL-2) 、 L-谷氨酰胺(L-glutamin) 以及来源于自身的血浆的培养液中，在抗CD3、抗CD16、以及抗 CD56抗体存在的条件下，培养上述分离出的淋巴细胞的第一培养步 骤；将上述第一培养步骤中所培养完成的培养混合液与含有IL-2、 L-谷氨酰胺以及来源于自身的血浆的培养液混合，在抗CD3、抗 CD16、以及抗CD56抗体存在的条件下进行培养的第二培养步骤。
根据本发明的自身活化淋巴细胞的培养方法，可以大量激活对 不表达MHC (Major Histocompatibility Complex)的大部分癌细胞具 有较强杀伤活性的NK细胞，适用于副作用少、给药简便的过继免疫 疗法，为此，具有极大地改善因恶性肿瘤而受痛苦的癌患者的预后的 效果。
图1为表示根据本发明的培养方法而获得的活化淋巴细胞表型 变化的示意图。
图2为表示根据本发明的培养过程中的免疫细胞数变化的示意图。
图3为表示对根据本发明而获得的活化淋巴细胞进行细胞毒性 分析的结果的示意图。
图4为将根据本发明而获得的活化淋巴细胞适用在老鼠模型中， 并观察其抗癌效果的照片。
具体实施例方式
本发明是在培养来源于人外周血的淋巴细胞时，添加白细胞介
素2 (IL-2)和抗CD3 (anti-CD3)、抗CD16 (anti-CD16)以及抗 CD56 (anti-CD56)抗体，均匀活化并培养NK细胞、NKT细胞以及 T细胞等免疫细胞，扩增出具有高度抗恶性肿瘤活性的自身活化淋巴 细胞的方法。在详细说明本发明之前，先探讨各种免疫细胞的特征以 及在免疫细胞的扩增以及活化中所使用的上述各种添加物的作用机 制.。
NK细胞是淋巴细胞中的一类细胞，是具有特征性形态的大颗粒 淋巴细胞(LGL， Large granular lymphocytes) 。 NK细胞可以杀伤病 毒感染细胞和肿瘤细胞，但对大部分的正常细胞无杀伤作用。这种 NK细胞在IL-2、 IL-12、干扰素(interferon)等细胞因子的存在下， 能提高细胞溶解(cytolytic)、分泌(secretory)以及增值(proliferative) 等功能，其抗肿瘤效果是由细胞坏死(necrosis)或细胞凋亡 (ap叩tosis)或这两种作用机制同时发生而产生。人的NK细胞的表 型(phenotype)为CD16 (FcrRIII)与CD56，其细胞表面无TRC (T 细胞受体复合体，T-cell receptor complex)，为此CD16与CD56作 为NK细胞的标志。
众所周知，这种NK细胞在初期机体防御机构和人体的肿瘤免 疫中起重要的作用。即，NK细胞是一种MHC非限制性杀伤细胞， 即使无致敏(sensitization)过程、也就是说，无由MHC表达而获得 的免疫过程，也可以杀伤特异性自身细胞、同种细胞以及异种癌细胞， 特别是优先杀伤很少表达或不表达Class 1 MHC的耙细胞。为此， NK细胞不仅可以有效的杀伤不表达MHC的大部分癌细胞，还可以杀伤某些病毒感染细胞和如伤寒沙门菌(salmonella typhi)等细菌。
一般认为NK细胞对癌细胞的作用机制是抗体依赖性细胞介导 的细胞毒性(Antibody-dependent cell mediated cytotoxicity; ADCC)， 其详细内容如以下所述。NK细胞表达免疫球蛋白G (IgG)的Fc受 体CD16，通过此受体可以进行MHC非限制性杀伤。即，NK细胞的 ADCC依赖于识别靶细胞的抗体，当抗体和抗原相结合时会暴露其抗 体的Fc区，并且，该暴露出的Fc区与NK细胞上的Fc受体结合形 成一个桥， 一旦此桥形成，根据受体接合时发生的信号传递，NK细 胞就产生细胞损伤物质，引起靶细胞的损伤。
但是，这种具有高度杀伤癌细胞功能的NK细胞只占正常外周 血淋巴细胞的5% 15%，特别是在癌患者的情况下，该比例下降到 不足1%，从而导致NK细胞数量不足而不能有效玫击癌细胞。
若在抗CD16抗体或抗原抗体复合体的存在下，培养淋巴细胞， 则CD16抗原被添加到NK细胞中而引起信号传递，NK细胞受到它 们的刺激之后，表达IL-2受体的a链等转铁蛋白(transferrin)受体 或产生肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor; tnf)或干扰素-y( IFN-7)。
CD56抗原(Leul9/NKH1)是一种分子量为180 200kDa的糖 蛋白，表达于所有NK细胞以及某些T细胞。CD56抗原与广泛分布 在人体神经组织中的NCAM-1 (神经细胞黏附分子-l， Neural Cell Adhesion Molecule-1)是同一种分子。众所周知，NCAM-1是一种在 神经和肌组织中参与细胞之间黏附的分子。由此推测，在NK细胞中 表达的CD56也可以起到细胞之间黏附作用。
另一方面，T细胞是指细胞表面具有抗原受体(T cell antigen receptor; TCR)的细胞。TCR与a链和卩链的二聚体CD3抗原形成 异二聚体。 一部分T细胞(外周血T细胞的5%左右)是由Y链和5 链的二聚体形成，而不是ap链。TCR与CD3抗原(Y、 5、 ￡、；、； 或il)形成复合体，若TCR识别抗原，则CD3抗原向细胞内传递其 信号。
一般地，促进癌细胞免疫反应的辅助性T细胞分泌多种细胞因 子，并活化杀伤T细胞、B细胞以及巨噬细胞等。细胞因子的种类繁多，如细胞和细胞之间的信息传递物质即白细胞介素1、 2、 3， TNF-a 以及干扰素-y等。根据本发明，在培养液中添加IL-2，活化杀伤T 细胞、B细胞、巨噬细胞等免疫细胞。
IL-2是当T细胞识别抗原而被活化时产生的、分子量为14 17kDa的糖蛋白(glycoprotein) 。 IL-2被分泌到T细胞外之后，与 产生IL-2的T细胞自身进行反应，促进该T细胞的增殖。IL-2还可 以促进NK细胞的增殖并增强NK细胞的杀伤活性，亦可促进B细胞 的增殖。
NKT细胞是固有免疫的成员，是T细胞的一种，其功能近年来 逐渐被阐明。从名称可知，它表达T细胞的受体和NK细胞的特异性 细胞表面标志(surface marker) 。 NKT细胞的一种惊人的特征是， 它被洁化之后，能在短时间内分泌IL-4、 IL-IO、 IL-13、 IFN-y、 TNF-a
等多种细胞因子。这种特征暗示着NKT细胞对适应性免疫应答产生 重大影响。
因此，在本发明中，为了均匀活化从人外周血分离出的NK细 胞、T细胞以及NKT细胞，培养时使用了 IL-2和抗CD3、抗CD16 以及抗CD-56单克隆抗体。IL-2对T细胞和NK细胞的增殖起作用； 各单克隆抗体使免疫细胞表达CD3、 CD16、以及CD56而起到抗原 的功能。
以下，具体地说明本发明中的自身活化淋巴细胞培养方法。 本发明中的自身活化淋巴细胞培养方法大体由分离淋巴细胞的 步骤、第一培养步骤、第二培养步骤以及第三培养步骤构成。
分离淋巴细胞的步骤
人淋巴细胞或单核球等单核细胞的比重低于1.077，利用这一特 性，将治疗对象患者的血液与比重为1.077的Ficoll-Paque Plus溶液 (淋巴细胞分离液)相混合，并以一定的离心力进行离心，使之沉淀。 根据比重的差异，比重大于1.0777的红细胞和颗粒细胞沉淀于底层， 比重小于1.0777的单核细胞层和血小板等离心后悬浮于上层液中， 由此获得包含淋巴细胞的单核细胞层，并从该单核细胞层单离出淋巴 细胞。第一培养步骤
将通过上述分离淋巴细胞的步骤而获得的淋巴细胞，在添加有
IL-2、 L-谷氨酰胺(L-glutamine)和来源于自身的血浆(plasma)的 培养液中，在抗CD3、抗CD16以及抗CD56的存在下，培养3 4 天。在这些过程中，优选先在添加有IL-2、 L-谷氨酰胺和来源于自身 的血浆的培养液中、在抗CD3存在的条件下，进行培养，然后在分 别存在抗CD16以及抗CD56的环境下，依次进行培养，其具体过程 如下。
首先，将获得的淋巴细胞混悬在3ml的培养液之后，加入到75 cn^的固相包被抗CD3的培养板中，该培养板中添加有50 100ul含 有17X 106 19X 106 IU(International Unit)/ml的IL-2稀释液、100 250ul L-谷氨酰胺以及2 4ml来源于自身的血浆以及25 33ml培养 液，然后在37'C的C02培养箱中培养12 18小时。如上所述，首先 将淋巴细胞混悬在少量培养液中，并在添加有IL-2、 L-谷氨酰胺以及 来源于自身的血浆的培养液中培养，这不仅可以减少淋巴细胞的损 失，也可以防止添加量很少的IL-2、 L-谷氨酰胺以及来源于自身的血 浆的损失。
然后，将固相包被抗CD3的培养板中的培养混合液移到75 cm2 固相包被抗CD56的培养板中，置于37"的C02培养箱中，培养12 18小时。接着，再将固相包被抗CD56的培养板中的培养混合液移 到75 cn^固相包被抗CD16的培养板中，置于37'C的C02培养箱中， 培养48 60小时。
第二培养步骤
将在上述第一培养步骤中培养完成的培养混合液加入到添加有 IL-2、 L-谷氨酰胺以及来源于自身的血桨的培养液中，在抗CD3、抗 CD16以及抗CD56存在的条件下，继续培养2 3天。
第二培养步骤也是像前述的第一培养步骤一样，将经过第一培 养步骤的培养混合液首先在添加有IL-2、L-谷氨酰胺以及来源于自身 的血浆的培养液中、在抗CD3存在的条件下培养，然后在抗CD16 以及抗CD56分别存在的条件下依次培养，该具体过程如下。首先，将上述第一培养步骤中培养完成的培养混合液加入到225 cm2的固相包被抗CD3的培养板中，该培养板中添加有50 200ul 含有17X 106 19X 106 IU(International Unit)/ml的IL-2稀释液、l 1.5ml L-谷氨酰胺、5 10ml来源于自身的血浆以及50 67ml培养液， 然后在37'C的C02培养箱中培养8 12小时。
然后，将固相包被抗CD3的培养板中的培养混合液移到225 cm2 固相包被抗CD56的培养板中，置于37"C的C02培养箱中，培养8 12小时。接着，再将固相包被抗CD56的培养板中的培养混合液移 到75cr^固相包被抗CD16的培养板中，置于37°C的C02培养箱中， 培养24 56小时。
在上述第一和第二培养步骤中所用的培养液可以使用含有氨基 酸、维生素、有机化合物和无机化合物以及蛋白质等细胞生长和生存 所必需的.营养成分的多种培养液，优选使用含有800 1200 IU/ml IL-2的培养液。而且，在第一和第二培养步骤中，使用固相包被抗 CD3、抗CD16、抗CD56等单克隆抗体的培养板，在这些各单克隆 抗体的存在下进行培养过程，由此可以调节在最终培养物中使NK细 胞(CD56, CD16) 、 NKT细胞(CD56， CD16)以及T细胞(CD3) 均匀地分布。
第三培养步骤
向上述经过第二培养步骤的培养混合液(86 119ml)中添加来 源于自身的血浆(5 10ml)，把这些新添加了来源于自身的血浆的 培养混合液注入到含有1L培养液的透气性培养袋中，继续培养7 9天，使细胞大量增殖。
在第三培养步骤中所用的培养液如前两个步骤一样，可以使用 含有氨基酸、维生素、有机化合物和无机化合物以及蛋白质等细胞生 长和生存所必需的营养成分的多种培养液，优选使用含有100 200 IU/ml IL-2的培养液。
经过如上所述的第一、第二和第三培养步骤，NK细胞、T细胞 以及NKT细胞的数量大量增加，而且各细胞的大小也增大。实际培 养实验的结果表明，从60cc血液中分离淋巴细胞时的总细胞数为2.0X 106 4.0X 107，但是最后增加到2.0X 109 1.0X 1010。
以下，通过具体的实施例进一步详细说明本发明。但是，下述 实施例仅用于例示本发明，本发明的范围不受这些实施例的限定。
实施例1:自身活化淋巴细胞的制备
将从患者的60cc外周血中获得的淋巴细胞混悬在3ml的培养液 之后，混合在添加有70ulIL-2、 200ulL-谷氨酰胺以及3ml来源于自 身的血浆的33ml培养液中，在抗CD3、抗CD16以及抗CD56存在 的条件下，培养4天(第一培养步骤)，然后，混合在添加有100ul IL-2、 lmlL-谷氨酰胺以及7ml来源于自身的血浆的60ml培养液中， 继续培养3天(第二培养步骤)，接着向经过第二培养步骤的培养混 合液中添加7ml来源于自身的血浆，并注入到含有1L培养液的透气 性培养袋中，再培养7天(第三培养步骤)。
实施例2:观察培养前后的表型以及细胞数的变化
图1为培养前后活化淋巴细胞的表型变化示意图，Hl区域表示 NK细胞、H4区域表示T细胞、H2区域表示NKT细胞、H3区域表 示其它免疫细胞的分布，图2为根据本发明培养过程中的免疫细胞数 的变化示意图。
将采用与实施例1相同的方法进行培养的活化淋巴细胞，利用 流式细胞仪(floweytometry)分析表面抗原，用图l进行说明其结果， 如图(a)所示，培养前表面抗原的分布主要在H4区域，而如图(b) 所示，培养后表面抗原的分布主要在Hl区域，实际计算CD3阳性 (Positive) T细胞和CD16+CD56阳性(positive) NK细胞的比率 的结果，由培养前的53.60%: 12.74%变成培养后的39.74%: 69.03%，从而可以确认NK细胞的比率明显上升。
另一方面，如图2所示，在采用与实施例1相同的方法培养活 化淋巴细胞的过程中，每天按细胞种类观察免疫细胞数的变化的结果 表明，在培养前所占的比率不足20。/o的NK细胞经过12天的培养， 此比率接近50%，超越了T细胞的比率。经过14天的培养之后，最 终获得的各免疫细胞的比率是NK/NKT细胞为60±10%， T细胞为 40±10%， B细胞为1.5。/。以下。实施例3:对各种癌细胞的细胞毒性(cytotoxicity)分析
图3为对根据本发明而获得的活化淋巴细胞进行细胞毒性分析 的结果示意图。
在将采用实施例1的方法进行培养的活化淋巴细胞用作效应细 胞、将血癌细胞株(K562)用作靶细胞、设定癌细胞对比活化淋巴 细胞的比率为10 : 1时，测定活化淋巴细胞对血癌细胞株的杀伤能力 而进行细胞毒性分析，其结果如图3所示，活化淋巴细胞的细胞毒性 与从一般血液中分离的淋巴细胞相比增加了 6.8 16.4倍。
实施例4:在老鼠模型中的活化淋巴细胞的抗癌效果实验
图4为将根据本发明而获得的活化淋巴细胞适用在老鼠模型中， 并观察其抗癌效果的照片。
将.Raji细胞移植于3周龄的BALB/c裸鼠之后，经过2周，从 而构建肿瘤模型，然后将采用实施例1的方法进行培养的活化淋巴细 胞和从一般血液中分离的淋巴细胞分别注入到己准备好的裸鼠肿瘤 模型组中，评价肿块的縮小效果和生存效果。
在将淋巴细胞注入到裸鼠之后，经过10天，可以以肉眼观察到 在注入从一般血液中分离的淋巴细胞的情况下，如图4 (a)所示， 肿块生长到相当大的大小，另一方面，在注入根据本发明培养的活化 淋巴细胞的情况下，如图4 (b)所示，肿块明显縮小。从而可以确 认，注入到裸鼠的活化淋巴细胞诱导Raji细胞的凋亡(apoptosis)等， 发挥有效的抗癌功能。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本 发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应 包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种自身活化淋巴细胞培养方法，其特征在于，该方法包括从人外周血中分离淋巴细胞的步骤；第一培养步骤，其在添加有白细胞介素2、L-谷氨酰胺以及来源于自身的血浆的培养液中，在抗CD3、抗CD16、以及抗CD56抗体存在的条件下，培养上述分离出的淋巴细胞；以及第二培养步骤，其将上述第一培养步骤中所培养完成的培养混合液与添加有白细胞介素2、L-谷氨酰胺以及来源于自身的血浆的培养液混合，在抗CD3、抗CD16、以及抗CD56抗体存在的条件下进行培养。
2. 如权利要求1所述的自身活化淋巴细胞培养方法，其特征在于，在上述第一培养步骤中，将上述分离出的淋巴细胞，在添加有 白细胞介素2、 L-谷氨酰胺以及来源于自身的血浆的培养液中，首先 在抗CD3抗体存在的条件下进行培养，然后在抗CD16以及抗CD56 抗体分别存在的条件下，依次进行培养。
3. 如权利要求2所述的自身活化淋巴细胞培养方法，其特征在于，在上述第一培养步骤中，将上述分离出的淋巴细胞，在添加有 白细胞介素2、 L-谷氨酰胺以及来源于自身的血浆的培养液的固相包 被抗CD3的培养板中，培养12 18小时，然后，将上述固相包被抗 CD3的培养板中的培养混合液移到固相包被抗CD56的培养板中，培 养12 18小时，接着，再将上述固相包被抗CD56的培养板中的培 养混合液移到固相包被抗CD16的培养板中，培养48 60小时。
4. 如权利要求1所述的自身活化淋巴细胞培养方法，其特征在于，在上述第二培养步骤中，将经过上述第一培养步骤的淋巴细胞，在添加有白细胞介素2、 L-谷氨酰胺以及来源于自身的血浆的培养液 中，首先在抗CD3抗体存在的条件下进行培养，然后在抗CD16以 及抗CD56抗体分别存在的条件下，依次进行培养。
5. 如权利要求4所述的自身活化淋巴细胞培养方法，其特征在于，在上述第二培养步骤中，将经过上述第一培养步骤的培养混合 液，加入到添加有白细胞介素2、 L-谷氨酰胺以及来源于自身的血浆 的培养液的固相包被抗CD3的培养板中，培养8 12小时，然后， 将上述固相包被抗CD3的培养板中的培养混合液移到固相包被抗 CD56的培养板中，培养8 12小时，接着，再将上述固相包被抗CD56 的培养板中的培养混合液移到固相包被抗CD16的培养板中，培养 24 56小曰寸。
6. 如权利要求1所述的自身活化淋巴细胞培养方法，其特征在于，在上述第一和第二培养步骤中所使用的培养液含有800 1200 IU/ml的白细胞介素2。
7. 如权利要求1所述的自身活化淋巴细胞培养方法，其特征在 于，该方法还包括第三培养步骤，其在经过上述第二培养步骤的培养混合液中添 加来源于自身的血衆，并将上述添加有来源于自身的血浆的培养混合 液注入到含有培养液的透气性培养袋中，进行培养。
8. 如权利要求7所述的自身活化淋巴细胞培养方法，其特征在于，在上述第三培养步骤中所使用的培养液含有100 200 IU/ml的 白细胞介素2。
全文摘要
本发明涉及一种用于恶性肿瘤治疗的自身活化淋巴细胞培养方法。根据本发明的自身活化淋巴细胞的培养方法，其特征在于，该方法包括从人外周血中分离淋巴细胞的步骤；在添加有白细胞介素2、L-谷氨酰胺、以及来源于自身的血浆的培养液中，在抗CD3、抗CD16、以及抗CD56抗体存在的条件下，培养上述分离出的淋巴细胞的第一培养步骤；以及将上述第一培养步骤中所培养完成的培养混合液与含有白细胞介素2、L-谷氨酰胺以及来源于自身的血浆的培养液混合，在抗CD3、抗CD16、以及抗CD56抗体存在的条件下，进行培养的第二培养步骤。
文档编号C12N5/0783GK101603029SQ200910000408
公开日2009年12月16日 申请日期2009年1月6日 优先权日2008年6月10日
发明者崔炳仁, 李东旭, 洪藓旼 申请人:株式会社Nkbio