专利名称：：编码β-半乳糖苷酶的基因及其表达和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种编码P-半乳糖苷酶的基因，尤其涉及一种编码P_半乳糖香酶基因的克隆、表达及酶学性质研究，属于酶的基因工程领域。
背景技术：
：牛乳与乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，尤其是其钓含量高且4丐磷比例适当，易被人体消化吸收，还含有免疫球蛋白等抗病因子，是人类增强体质的理想食品。乳糖是牛奶和乳清中的主要成分，乳糖约占牛奶干物质的30%，但溶解度低，在20。C水中溶解度仅为20%，而其甜度仅及蔗糖的16%，久贮的乳制品由于乳糖析出，呈砂样感觉，影响风味。此外，许多成人，特别是婴儿(因人种而异，西欧占2-8%,亚洲、非洲占60-90%)由于体内缺乏P-半乳糖苦酶，因此他们很难消化牛奶，饮用牛奶后，乳糖到了肠里，被肠道细菌分解发酵，产生大量二氧化碳气体，使肠道膨胀，并兴奋肠道蠕动，使收缩加强，造成肠鸣和腹泻，这种疾病称作乳糖不耐受症(BerkaRandyM.,Hucul,JohnA.，Ward,Michael.Increasedproductionofbeta-galactosidaseinA/ergz7/z^USpatent,5736374,1998,47)。利用外源性P-半乳糖苷酶将乳糖降解为易被人体吸收利用的单糖，水解条件温和、产物简单、口感好，且不会破坏牛乳中其他营养成分，是目前在低乳糖乳品加工中所釆用的最好方法。P-半乳糖苷酶(I3-D半乳糖苷半乳糖水解酶，P-D-galactosidegalactohydrolase,EC3.2.1.23)通常被称为乳糖酶(Lactase)。|3-半乳糖苷酶能将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖，同时具有半乳糖苷的转移作用(张树政主编.酶制剂工业下册.北京科学出版社，1984,818-819),可用来生产低聚半乳糖。葡萄糖是人体各部分代谢的能量来源，半乳糖则是人大脑和粘膜组织代谢时所必需的结构糖，是婴儿大脑发育的必要组织，与婴儿大脑迅速生长有着密切的联系。通过转糖苷作用生成的低聚糖，是一种低分子量，不粘稠的水溶性膳食纤维，它在人体肠道内作为益菌增殖因子仅能被双歧杆4菌所利用，却不被腐败细菌所利用，如此可大大地减少肠道内有害毒素物质的产生，对预防便秘和腹泻有很好的作用(秦立虎，韩启文，张洪颖.P-半乳糖苷酶的作用及其在乳品工业中的应用.中国奶牛，2007，6:46~48)，可广泛应用在食品、医药、饲料等领域，目前已成为P-半乳糖苷酶应用研究的另一热点。目前，商品化的半乳糖苷酶主要来源于微生物湘尺孝亮等著，酶应用手册，上海科学技术出版社，1989，407~414)。例如来源于大肠杆菌(丑scijeric/3iaco』i)、黑曲霉C4spergi〃us/n'ger)、克鲁维斯酵母(Uuyrero/nyces2actis)及臭曲霉Usperg川i;sfoet油s)等。在研究蛋白质合成及遗传因子抑制的关系中，广泛应用的大肠杆菌P-半乳糖苷酶是第一个被结晶的P-半乳糖苷酶，分子量为850,OOODa。大肠杆菌的酶最适pH为7.0,但在Na+存在下最适pH变为6.6。在乳品及其他食品工业中获得有效应用的P-半乳糖苷酶主要是由克鲁维斯氏酵母(inuj^erofflycesia"is)和曲霉中得到的。克鲁维斯氏酵母是从牛乳中分离到的，其产生的13-半乳糖苷酶最适pH与新鲜牛乳的天然pH(6.6~6.8)相近，主要适用于分解牛乳及脱脂奶粉中的乳糖。该酶在pH6.2~7.0稳定，6.2-7.0以上或以下酶活迅速下降。最适温度为35~40°C。分子量为135000Da。40。C处理lhr,pH在6.5~8.5之间稳定，即使处理3hr也同样稳定，处理24hrpH78稳定。40。C以上就急剧失活。Ca2+、Cu2+、Fe2+可以使酶失活，Mn2+、Mg2+可恢复Ca2+对酶的抑制，K+单独存在就可以大大提高酶的热稳定性(谢毅等，复旦学报(自然科学版)，1999，Vo1.38,No.5:523-528)。以0NPG(邻硝基苯酚-P-D半乳糖苦)为底物，40。C反应3min，Km为2.78mmol/L，最大反应速度为0.lumol/min，酶的水解产物半乳糖对酶的活性有强烈的抑制作用，值得注意的是，核糖的抑制作用也极为强烈，但其机理尚不清楚(沈为群等，生物工程学报，1993，9(4):348354;DicksonRCetal.，JournalofBacteriology,1980,142(3):777785)。从黑曲霉所得的P-半乳糖苷酶pH较低，而且在高温下有活性。分子量为1060G0Da,最适温度60°C，最适pH在3.5~4.0。精制酶在pH4~8稳定，粗酶在pH2.2~8稳定，以ONPG和乳糖为底物，Km分别为7.2X10-4M,1.8X10-2M，最大反应速度分别为86.7umol/min/mg和121.9咖ol/min/mg(LEEetal.,ArchivesofBiochemistryandBiophysics,1970,138:264271;AKASAKIM,etal.,J.Biochem,1976,80:11951200)。酶的稳定与激活，均不需要金属离子。Mg2+能抑制活性。螯合剂使酶钝化，对微量的重金属离子也不显示敏感。硝基酚疏基半乳糖苷(半乳糖酸内酯)(TANAKA，etal.，J.Biochem,1975，77:241-247)及半乳糖是强抑制剂。从霉菌来的P-半乳糖苷酶的最大特点是热稳定性高，最适pH值低，这样在食品工业上就不容易受到微生物的污染，更具有应用价值。基因工程技术的发展为用微生物合成、生产和改造外源蛋白展示出广阔的前景。利用基因工程技术，我们可以从自然界丰富微生物资源中筛选获得目的菌抹，克隆获得P-半乳糖苷酶基因，特别是可以通过建立基因组文库的方法克隆获得实验室环境不能培养的微生物的P-半乳糖苷酶基因，将有优良酶学性质的不同来源的P-半乳糖苷酶异源表达或对(3-半乳糖苷酶在分子水平进行改造，则可进一步推动P-半乳糖苷酶制剂的生产和应用。1998年，Berka将产P-半乳糖苷酶的AoiyazeCCC28通过紫外诱变、NTG诱变处理获得半乳糖苷酶表达量较高的突变林CCC161(ATCC74285)(亲本|3-半乳糖苦酶分泌量为5U/ml,突变抹分泌量为50U/ml)，以其为受体，将其自身的P-半乳糖苷酶基因至于Ga〃启动子之下，导入其中，阳性克隆子中的P-半乳糖苷酶蛋白表达量为lmg/ml发酵液，p-半乳糖苷酶活性达500U/ml以上，比原始菌提高了IOO倍(BerkaRandyM.，Hucul，JohnA.,Ward，Michael.Increasedproductionofbeta-galactosidaseinAspergillusoryzae.USpatent,5736374，1998,47)。1997年，M.Becerra利用受体菌的特殊性质来提高胞内P-半乳糖苷酶的提取率或简化分离纯化工艺。他利用热敏型自溶酵母突变体(蛋白酶缺陷)S.cereWsiae异源表达(_/actis的|3-半乳糖苷酶，转化子首先在25。C下培养，然后再转入37。C培养，因该热敏型酵母突变体在高温下细胞壁发生变化，在高温下用lmol/L的山梨醇对细胞进行渗透处理，该细胞就会发生自溶，使胞内95%的p-半乳糖苷酶都释放出来，活性可达75U/ml(水解ljimoL0NPG)(M.Becerra,E.Cerdan，M.I.GonzalezSiso.HeterologousA7wjveramyces/acf/csP-galactosidaseproductionandreleasedby/Sacc/wramjcescereWw'aeosmotic-remedialthermosensitiveautolyticmutants.5—戸.c"cto,1997,1335:235241)。2001年，PETERL.M0LLER/人不同的两种双歧杆菌^ndoba"eri咖bi/7du/nDSM20215和5indo^"eriwni;]/"ai!"sDSM20088中通过建立基因组文库分别获得三个P-半乳糖苷酶基因BIFl,BIF2，BIF3和一个P-半乳糖苷酶基因INFl,并且进行了异源表达及酶学性质分析。在对构建好的大肠杆菌重组质粒的开;^丈阅读框进行比4交分析发现，pINFl相对于同一分支的pBIFl,pBIF2，pBIF3三个重组质粒及大肠杆菌的L4Zgene的亲^^关系4交远，且同一FLEMMINGJ0RGENSEN，OLEC.HANSEN,S0RENM.MADSEN.ANDPETERSTOUGAARD.Intra-andExtracellular卩-Galactosidasesfrom5zycfoZjacten'wmZ)(/(iw/wand万.Z/^/^w/^:MolecularCloning,HeterologousExpression,andComparativeCharacterizatio.^4pp/zWa"(i￡>m>ow,"ta/M/cra6油gy,May2001,67(5):2276~2283)。JamesA.Coker等从来源于南极干谷的土壤中筛选获得产p-半乳糖苷酶的一林嗜低温的节杆菌。序列分析表明，其P-半乳糖苷酶基因&aSDNA序列有3159bp，编码1053个氨基酸，(G+CV/。含量为67。/。，属于糖苷水解酶家族2。其最适温度为18°C，且在0°C时仍能保持50%的活力(JamesA.Coker，PeterP.Sheridan,JenniferLoveland-Curtze,KevinR.Gutshall,BiochemicalCharacterizationofaP-GalactosidasewithaLowTemperatureOptimumObtainedfromanAntarcticJW/zroftac&rIsolate.JOURNALOFBACTERIOLOGY,2003，185(18):5473—5482);2006年，TomoyukiNakagawa等将来源于4r^Lrobacterpsyc/2ro2actop/n'2iiSstrainF2的P-半乳糖苦酶纯化并进4亍分子7jc平的研究。该酶最适温度为10。C，最适pH为8.0,在7.0和9.0时还有90。/。的相对活力，在pH6.0-10.0之间稳定，该酶在0。C时也具有较高酶活力，在45。C处理5min,酶快速失活。克隆获得酶基因6g",由3084bp组成，编码1028个氨基酸，通过衍生的氨基酸序列分析属于糖基水解酶家族2的新成员(TomoyukiNakagawa，YujiFujimoto,RyokoIkehata，TatsuroMiyaji,NoboruTomizuka.Purificationandmolecularcharacterizationofcold-activeP-galactosidasefrom^W/zra6ac^戸yc/2r0/actopMwsstrainF2々//跑ec/wo/.2006，72:720725)。2008年,W.Chen等克隆并在5aciHus.s的-"h'sWB600菌抹中表达来自于5aciJusstearo^enn叩in'"s的耐热的|3-半乳糖苷酶基因(bga5)。经纯化的p-半乳糖苷酶分子量约为70kDa,等电点接近5.1，酶活性最大的温度是70°C,最优pH为7.0。结果表明这种重組热稳定酶可能适宜应用于乳处理过程中的乳糖水解和低聚半乳糖的生产(W.Chen,H.Chen,Y.Xia，J.Zhao:F.TianandH.Zhang.Production,Purification,andCharacterizationofaPotentialThermostableGalactosidaseforMilkLactoseHydrolysisfrom5ac/〃usWe<arof/zermc>;/H7^s./Daz>ySb/.2008，91:175.11758)。在特殊的环境下长期生活的微生物可能具有特殊的生理机能和遗传基因，是重要的极端微生物资源，因此，对其p-半乳糖苷酶基因的克隆、表达及酶学性质分析，不仅可以丰富生物多样性的研究内容，为生物演化和系统发育提供有价值的资料，同时也为研究P-半乳糖苷酶结构与功能的关系提供更多的信息，为进一步获得高效表达菌抹奠定了基础，为开发多功能用途的P-半乳糖苷酶产品提供技术保障。
发明内容本发明的目的之一是"R供一种来源于纤维单胞菌属(Cenu2offlO朋ssp.)的p-半乳糖苷酶新基因；本发明的目的之二是构建一种含有上述P-半乳糖苷酶新基因的表达载体；本发明的目的之三是提供一种制备0-半乳糖苷酶的方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种编码p-半乳糖苷酶的基因(gak基因)，该基因选自(a)、(b)、(c)或(d)所示的核苷酸序列(a)SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；或(b)在严谨条件下能与(a)所示的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，且该核苷酸序列编码具有e-半乳糖苷酶活性的蛋白；或(c)编码SEQIDNO:2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(d)编码具有p-半乳糖苦酶功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过将SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得。优选的，本发明编码半乳糖苷酶的基因是SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。所述的"多个"通常意味着2~60个，优选为2~15个，这些取决于p-半乳糖苷酶的三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的"替换"是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的"缺失"是指氨基酸序列的改变，其中分别缺少一个或多个氨基酸残基；所述的"插入"是指氨基酸序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基；所述的"严谨杂交条件，，是指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针将杂交到核酸的复合混合物中的其目标子序列上，但并不杂交到复合混合物中的其它序列上。严谨条件是序列依赖性的并且在不同环境中将有所不同。严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10。C。L为在平衡状态下50%与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)。严谨条件可为以下条件其中在pH7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言至少约30°C,而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言至少约60°C。严谨条件也可通过加入诸如曱酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。一种例示性严谨杂交条件可如下50%曱酰胺，5xSSC和1%SDS，在42。C下培养；或5xSSC,1%SDS，在65。C下培养，在0.2xSSC中洗涤和在65。C下于0.1%SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。本发明从采自新疆的土壤中筛选克隆了一个来源于纤维单胞菌属(CenWo顯assp.)的p-半乳糖苦酶新基因(g"c)。该P-半乳糖苷酶基因组DNA全长2076bp,(G+C)°/含量72.9%,推导其编码692个氨基酸。将该基因的M酸序列在NCBI的GENBANK中搜索比较发现，该P-半乳糖苷酶与来源于节杆菌属(^^robaWersp.FB24)的p-半乳糖苷酶相似性最高，为59%，且这一p-半乳糖苦酶序列为该菌抹全基因组测序结果，未看到其酶蛋白性质与表达的相关研究。含有本发明p-半乳糖苷酶基因(gak基因)的重组表达质粒可通过本领域的常规方法构建而成，例如，可以将SEQIDNO.1所示的核苷酸序列插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使SEQIDNO:1所示的核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个具体的实施方案，可以是将SEQIDNO:l所示的核苷酸序列插入到用￡coRI、iVo"双酶切原核表达载体pET-30a(+)的酶切位点之间，得到重组表达质粒pET-galc。选择合适的宿主细胞用于表达p-半乳糖普酶是所属领域的普通技术人员的常规技术。该宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌细胞)，也可以是真核细胞(例如可以为酵母细胞)；例如，可以为大肠冲干菌(五sci2erici]iaco2i)、毕赤酵母细月包(Picin'apastoris)、p卑酒酵母细月包(Saccharo/nycescerevisiae)或乳酉吏酵母纟田月包(/fansenuJapoJ戸orpAa)等。可以将含有本发明p-半乳糖苦酶基因的重组表达质粒通过常规的方法转化宿主细胞，获得重组菌林；培养该重组菌抹，诱导重组p-半乳糖苷酶的表达，回收并纯化所表达的蛋白，即得p-半乳糖苷酶；例如可以将本发明所构建的重组表达质粒pET-gale转化大肠杆菌，诱导，收集所表达的蛋白，纯化，即得到重组p-半乳糖苷酶。将本发明原核表达的P-半乳糖苷酶进行酶学性质，分析结果如下(1)P-半乳糖苷酶比活的测定酶活力为98.309U/ml，酶蛋白样品比活为188.30u/mg;(2)P-半乳糖苷酶的最适pH:pH6.4时酶活性最高，并且在pH5.8~7.6之间，该|3-半乳糖苦酶均保持约76%以上的活性；(3)(3-半乳糖苦酶的pH稳定性P-半乳糖苷酶在较宽的pH范围内较稳定，pH5.8~9范围内其相对酶活达到60%以上，尤其在pH6.4~9范围内其相对酶活更在90%以上。在pH8和pH9时，其相对酶活在95°/。以上；(4)P-半乳糖苦酶的热稳定性该酶在经过热处理后，酶活有所下降。47。C处理2min,酶活没有多大变化，而在处理4min后，相对酶活4妄近于70%，在处理20min后，相对酶活只有2%。而在55。C处理lmin后，相对酶活^f又存留l.78%。^f旦在37。C处理70min后，相对酶活仍存留40%以上；(5)金属离子和相关化学试剂对半乳糖苷酶活性影响K+、Pb2+、Fe2+、Cu2+、EDTA对p-半乳糖苷酶有明显的激活作用，其中以Pb2+为最；Mn2+、Mg2+、Zn2+、SDS对酶有抑制作用,SDS的影响最大,对酶活抑制作用才妻近20%;其他的离子影响不大；EDTA对酶的影响不大，说明该酶对金属离子的依赖性不强；(6)本发明(3-半乳糖苷酶的Km和Vmax值分别为fm=19.33mmol/L;Kmx=416.67nmol/min。酶学性质测定表明，本发明P-半乳糖苷酶为中性常温酶。文献净艮道的其他节杆菌属(Jr"ro&aWersp.)的P-半乳糖苦酶大多属低温适冷酶，在酶学性质上与本发明的半乳糖苷酶存在着显著差异。图116Sr腿的PCR产物电泳图，获得的16SrDNA条带大小为1.6kb。图2pTl-gak重组质粒的构建图。图3与gak基因相关的p-半乳糖苷酶系统进化树分析结果。图4pET-ga1c在BL21中诱导后表达的P-半乳糖苷酶及纯化后的|3-半乳糖苷酶SDS-PAGE电泳图；1:28°C，含重组质粒pET-gale未经IPTG诱导的大肠杆菌裂解液；2:28°C,经0.4MmIPTG诱导4h后含重组质粒pET-galc的大肠杆菌裂解液；3.:28°C，经0.4mMIPTG诱导4h后超声波破碎后离心含重组质粒pET-galc的沉淀；4:28°C,经0.4mMIPTG诱导4h,超声波破碎后离心，含重组质粒pET-galc的上清；5.:含重组质粒pET-galc的破碎后上清液经NTA-6Q(含60mM/L咪唑)洗脱收集液；6.:含重组质粒pET-galc的破碎后上清液经NTA-80(含80mM/L咪唑)洗脱收集液；7.:含重组质粒pET-gale的破碎后上清液经NTA-100(含100mM/L咪唑)洗脱收集液；M.:蛋白分子量标准DMIOI。图5p-半乳糖苷酶酶活标准曲线；图6蛋白含量标准曲线；图7P-半乳糖苦酶的pH曲线；图8P-半乳糖苷酶的pH稳定性曲线；图9P-半乳糖香酶的温度曲线；图10半乳糖苦酶的热稳定性曲线；图11金属离子和相关化学试剂对p-半乳糖苷酶活性的影响；图12|3-半乳糖苦酶水解ONPG的动力学曲线；具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例l产|3-半乳糖苷酶的纤维单胞菌的筛选、分离和鉴定1.1材料1.1.1样品从新疆采集的土样，共计12种。1.1.2工具酶和试剂Pfu高保真DNA聚合酶购自奇华盛生物公司；限制性内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa及NEB公司；RNase购自北京华美/>司；DNA纯化试剂盒购自上海申能博彩公司；底物邻硝基苯酚-P-D半乳糖苷(0NPG)购自Pierce公司；5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)购自TaKaRa;dNTP购自天根生化科技(北京)有限公司；酵母提取物、蛋白胨购自Oxford公司；二曱基曱酰胺(DMF)购自上海生物工程有P艮^^司；其他试剂为国产分析纯。1.1.3培养基及有关溶液的配置(1)细菌富集培养基:乳糖1.0%，酵母膏1.0°/o,MgS040.02%,115°C15min;(2)细菌分离培养基乳糖2.0%,酵母膏0.5%,蛋白胨1.0%，NaCl0.5%，(固体培养基含2.0%琼脂)115。C灭菌15min;(3)真菌富集培养基乳糖2.0%,蛋白胨O.1%,酵母膏O.1%,115。C灭菌15min;(4)真菌分离培养基乳糖2.0%，蛋白胨O.1%,(NH4)2S040.14%,KH2P040.2%，CaCl20.03%,MgS040.03%，Toween800.2%，FeS045.Omg/ml,MnS041.6mg/ml,ZnS041.4mg/ml,CoCl22.0mg/ml,(固体培养基含2.0%琼脂)115。C灭菌15min;(5)LB培养基0.5°/。酵母提取物，1.0%蛋白胨，1.0%NaCl,用NaOH调至pH7.0，(固体培养基含1.5°/。琼脂)121°C灭菌15min。1.2菌体分离将12种土样，各取O.5g，放入25ml无菌生理盐水，制成悬浮液，在37。C恒温摇床中培养lh。然后再进行富集培养两个100ml三角瓶，分别放入20ml细菌富集和真菌富集培养基，灭菌后接入1%的土壤悬浮液，培养至菌体混浊，用ONPG为底物进行酶活测定。将检测有酶活的土样通过平板稀释法进行菌林分离培养。在进行平板稀释法稀释到10一时平板可见单菌落，用X-gal作为指示物，在平板上检测有p-半乳糖苷酶活性的菌体，将变蓝的菌落用牙签挑到分离培养基中继续培养，用平板划线法进行分离纯化，反复驯化，直至在显微镜下观察菌体为单菌。在富含乳糖的细菌分离培养基中进行复筛，结果分离到有半乳糖苷酶活性的菌林Dm。1.3菌林的分子鉴定1.3.1菌抹Dm基因组DNA的提取将在乳糖分离培养基中30。C培养了10d左右的菌液离心，超纯水洗涤后收集菌体。将湿菌体在液氮中研磨成粉末，加入到冰预冷的0.4ml提取液中(5Ommol/LTris-HClpH8.0，150mmol/LNaCl,100mmol/LEDTApH8.0),振荡混匀，加入50|a110%SDS,37。CM呆温lh,再加入75ja115mol/LNaCl,轻轻混匀，然后加入65jalCTAB/NaCl(10°/。CTAB,0.7mol/LNaCl)混合液，65。C下保温1020min,依次用等体积的酚氯仿(1:1)、氯仿抽提，上清液用终浓度75%的异丙醇沉淀，沉淀用70%乙醇洗涤2次后，真空干燥，溶于TE中备用。1.3.216srDNA序列分析(1)才艮据细菌的16srDNA的保守区设计引物F5，一GGCCTAACACATGCAAGT—3，R5，一CTACGGTTACCTTGTTACGA—3，(2)PCR扩增以菌林Dm的基因组DNA为模板扩增16SrDM序列。将获得的PCR产物(图1)连接pGEM-TEasy载体(购自promega公司)构建pGEM-T-16SrDNA,￡coRI酶切鉴定获得正确的克隆，测序获得16SrDNA序列。13序列测定表明，分离抹Dm的16SrDM序列与GENBANK中的放线菌门中的微球菌亚目下的纤维单胞菌属(Ceiiulo/no力assp.)的16Sr腿有9簡相似性。将分离株归为纤维单胞菌属(Ce!iuioMxnassp.),命名为Ce!!u2,薦sp.Dm。实施例2p-半乳糖苷酶基因的分离、克隆2.1材料2.1.1菌种和质粒纤维单胞菌Dm(Ce2k]o/Honassp.)为实施例1所筛选得到；pEASY-Tl克隆载体购自北京全式金生物公司；Top10大肠杆菌感受态细胞购自北京全式金生物^^司。2.1.2工具酶和试剂LATAqDNA聚合酶购自Takara/>司；Phusion超保真PCR试剂盒购自NEB公司；其他化学试剂均为国产分析纯。2.1.3培养基和相关溶液配制乳糖分离培养基乳糖2.0%，酵母膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCI0.5%,115。C灭菌15min;TAE(50x):242gTris石威，57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0),用无菌水定容至1L。提取大肠杆菌质粒的溶液溶液I:50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HC1,10mmol/LEDTA;溶液II:(新鲜配制)0.2mol/LNaOH,1%SDS;溶液III:3mol/LKAc,5mol/LHAc。2.1.4所用引物序列(1)简并引物序列Primerl:ggcggggactacaaccccga(g/a)ca(g/a)tggccPrimer2:gacgtgccagagcgc(a/t/c/g)a(g/a)(a/t/c/g)gc(a/t/c/g)gg(a/g)tgPrimer3:cacccggcgctg(g/c/a)(c/t/g)(a/g/c/t)(a/c/t)t(a/g/c/t)tggcacgtPrimer4:gcccgcgtgcgggac(a/g/c/t)"a/g/t)(a/t/c/g)gc(a/t/c/g)(c/g)(a/t)(a/g)tg(2)TAIL-PCR引物序列第一轮TAIL-PCR引物上SP1:GAGGATCTCGGGGTGCTTGC上SP2:CTCGTCGAGCCAGCCCCACTC上SP3:CGTCCTCGAGGCGGACCTCC下SP1:GGCCTCGAGCCACACCAAGGGC下SP2:CGCCGGAGGCCACCCGTGGATC下SP3:GATGTTCTTCCAGTGGCGGACG第二轮TAIL-PCR引物TAIL2-SP1:GCTGTGGCGCCTCGGCGTGACCTAIL2-SP2:CGACGGTCGCCGTGACGTACTTCTAIL2-SP3:GTACCCGGGCGCCTTCCGCGACTAIL-PCR简并引物AD3:GSWGTTTSSGTTTTAD4:WSCGCWGCWATTTTAD8:STTGNTASTNCTNTGC(3)反向PCR的引物序列9.21反向下内(APAI)CTGCCCACGACGTACCAGATCACC9.21反向下外(APAI)TCCGCACGCAGGAGTTCTTCCC9.21反向上内(APAI)GTGGCAGCCGATCTCGTTGTCG9.21反向上外(APAI)TCGTCGCATGGTGACGGGTCTG(4)全长扩增引物序列全长F:GAATTCATGCGACGACGCACCTCAT(￡coRI)全长R:TATCAAATGCGGCCGCTCAGACGAC(JVotI)2.2P-半乳糖苷酶基因ga7c的扩增及重组质粒的构建因目前还没有来源于纤维单胞菌的P-半乳糖苷酶基因的报道，所以P_半乳糖苷酶基因gak通过设计简并引物获得中间序列，TAIL-PCR扩增侧翼序列，反向PCR获得末端序列三步完成。2.2.1中间序列的获得根据纤维单胞菌所属的亚目即微球菌亚目中所报道的P-半乳糖苷酶序列来设计简并引物，以纤维单胞菌Dm的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物组合(fi:Primerl,n:Primer2);(f2:Primer3,r2:Primer4)反应体系10xPCRbuffer(含MgCl》2m1dNTPmix(10mmol/L)0.5ju1TaqPlus(3u/ju1)1ju1Primerf(lOfimol/L)3ju1Primerr(10pmol/L)3jal模板腿0.5ja1ddH2010ju1总体系扩增条件194°C3min294°C35S372°C2min472°C5min20|al230循环将Primerl与Primer2,Primer3与Primer4两个组合获得的PCR产物回收，分别克隆到pEasy-Tl载体，测序获得P-半乳糖苷酶基因的部分序列。2.2.2TAIL-PCR扩增侧翼序列根据获得的部分序列设计上下游特异引物分别与根据细菌同源序列设计的一组简并引物组合，进行TAIL-PCR。回收PCR产物，克隆到pEasy-Tl载体，测序获得P-半乳糖苷酶基因部分序列。TAIL-PCR引物第一轮TAIL-PCR引物上SP1，上SP2，上SP3，第二轮TAIL-PCR引物TAIL2—SPl,TAIL2-SP2，简并引物AD3,AD4，AD8。反应体系2xPCRbuffer(高GC)dNTPmix(10mmol/L)LATaq(5u/jli1)SP(10jimol/L)AD(10,1/L)模板醒ddH20下SPl，下SP2,下SP3<TAIL2—SP3'总体系扩增条件TAIL--PCR1194°Clmin225°C2min59s372°C2min30s494°Clmin566°C30s672°C2min30s794°Clmin866°C30s972°Clmin30s1094°Clmin1144°Clmin1272°C2min30s1372°ClOmin12.5ju11|u10.5|a14|u11ju15,6|a125ja1-0.2s14循环17TAIL--PCR2194°Clmin294°Clmin366°C30s472°Clmin594°Clmin666°C30s772°Clmin894°Clmin942°C30S1072°Clmin1172°ClOminTAIL--PCR3194°Clmin294°C30s366°C30s472°Clmin94°C30s666°C30s772°Clmin894。C30s942°C30S1072°Clmin1172°ClOmin24循环224循环2.2.3反向PCR获得末端序列根据TAIL-PCR的测序结果设计反向PCR引物，以纤维单胞菌Dm的基因组DNA为模板，进行反向PCR，获得末端序列。反向PCR的引物9.21反向下内(APA1)，9.21反向下外(APAI),9.21反向上内(APAI),9.21反向上外(APA1)。反应体系182xPCRbuffer(高GC)dNTPmix(10mmol/L)TaqPlus(3u/ja1)Primerf(10,1/L)Primerr(10一01/1)模板醒ddH2010ja14ja11|a11|i11|U11Hi12|al总体系20|il扩增条件(touch-downPCR):1234567894°C94°C72°C72°C94°C62°C72°C72°C3min45S30S90S45S30S90S5min-0.5s220循环30循环2.2.4基因全长的扩增根据测序结果拼接所得序列设计基因两端特异引物(在引物两端加入5coWI，WotI酶切位点)，以Dm基因组DNA为模板，用Phuzion超保真DM聚合酶扩增全长。PCR全长引物全长F,全长R。反应体系ddH2029,5n1HFbuffer10|alDMSO1.5(a1dNTPmix(2.5mmol/L)4p1全长F(10pmol/L)2|il全长R(10^imol/L)2jil模板DM0.5|a1Phuzion0.5ja1总体积50u1扩增条件198°Clmin298°C30s365°C10s-ls472°C2min210循环598°C30s655°C10s772°C2min525循环872°C10min反应结束后，加入普通Taq酶，72。C延伸30min。回收PCR产物，克隆到pEasy-Tl载体，构建pTl-ga!c重组质粒(图2),测序获得基因全长。2.3(3-半乳糖苷酶基因ga2c的序列分析及相似性比较将经鉴定无误的连有纤维单胞菌Dm的p-半乳糖苷酶基因片段的重组质粒pTl-ga]c进行测序，序列结果分析所示，该p-半乳糖苷酶基因全长2076bp(SEQIDNO:l)，(G+C)%含量72.9%,推导编码692个氨基酸(SEQIDNO:2)。无信号肽序列。蛋白理论分子量约76kD，等电点为pH5.3。经生物信息学分析推测该酶属于糖基水解酶第42家族，具有该家族的保守结构域。将基因ga2c表达的|3-半乳糖苷酶命名为GALC，ga]c衍生的氨基酸序列在NCBI的GENBANK中搜索比较相似性。氨基酸序列经过比对后发现，其与来源于节杆菌属Ur"roba"ersp.FB24)的P-半乳糖苷酶相似性最高,达到59°/。。图3显示，纤维单胞菌属与节杆菌属均属于4鼓球菌亚目。实施例3p-半乳糖苷酶基因的表达3.1材料3.1.1菌4朱和质粒大肠杆菌TOPIO、大肠杆菌BL21(DE3)购自北京全式金生物公司;pET-30a(+)载体购自Novagen/>司。3.1.2工具酶和试剂IPTG购自Promega/>司；蛋白分子量标准DMIOI,DR101购自北京全式金生物/>司；丙烯酰胺、N,N'-亚曱叉丙烯酰胺、琼脂糖购自Sigma/>司；亲和层析树脂Ni-NTAAgarose购自Qiagen/^司；其他均为国产分析纯试剂。3.1.3培养基及有关溶液的配置蛋白上样緩冲液(2x):100隱ol/LTris-HCl(pH6.8)、200mmol/L二碌u苏糖醇(DTT)、4%SDS、0.2%溴酚蓝、10%甘油。30%丙烯酰胺溶液29g丙烯酰胺，lgN,N口-亚甲叉丙烯酰胺，溶于100ml水。考马斯亮蓝染液0.24g考马斯亮蓝R250溶于90ml曱醇水(1:1,v/v)和10ml冰乙酸中。脱色液90ml曱醇水(1:1,v/v)和10ml冰乙酸中。亲和层析用NTA-O緩冲液20mmol/LTris-Cl緩冲液(pH8.Q)+10%甘油+0.5mol/L氯化钠。亲和层析用NTA-20緩冲液20mmol/LTris-Cl緩冲液(pH8.0)+10%甘油+0.5mol/L氯化钠+20mmol/L咪唑。亲和层析用NTA-40緩冲液20mmol/LTris-Cl緩冲液(pH8.0)+10%甘油+0.5mol/L氯化钠+40mmol/L咪哇。亲和层析用NTA-6G緩冲液20mmol/LTris-Cl緩冲液(pH8.0)+10%甘油+0.5mol/L氯化钠+60mmol/L咪唑。亲和层析用NTA-80緩冲液20mmol/LTris-Cl緩冲液(pH8.0)+10%甘油+0.511101/1>氯化钠+80mmol/L咪哇。亲和层析用NTA-100緩沖液20mmol/LTris-Cl緩冲液(pH8.0)+10%甘油+0.5mol/L氯化钠+100mmol/L咪唑。亲和层析用NTA-200緩冲液20mmol/LTris-Cl緩沖液(pH8.0)+10%甘油+0.5mol/L!U匕钠+200mmol/L。米哇。0.lmol/L硫酸镍称取2.6285gNiS046H20溶于水,定容到100ml，过滤，4XM呆存。10xYNB(13.4%的无氨基酸酵母氮源)134gYNB固体溶于1L去离子水,过滤灭菌，4。C保存；500xB(0.02%生物素)生物素20mg/100ml水，过滤灭菌，4。C保存；10xD(20%葡萄糖)200gD-葡萄糖溶于1000ml水，过滤灭菌，4°C保存；lOxGY(10%的甘油)100ml甘油溶于900ml水，过滤灭菌，4。C保存；lOOxAA(含每种氨基酸O.5%):称取L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸各500g溶于100ml水，过滤灭菌，4。C保存；1mol/L的山梨醇将182.lgD-山梨醇溶于1L的水中，过滤灭菌，4匸保存。培养基YPD培养基1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；RDB固体培养基lmol/L山梨醇，1%葡萄糖，1.34%YNB,0.00004%Biotin,0.005°/谷氨酸，0.005°/。曱硫氨酸，0.005%赖氨酸，0.005°/。亮氨酸，0.005%异亮氨酸，1.5%琼脂；醒固体培养基1.34%YNB，0.00004%Biotin，0.5°/。甲醇，1.5°/。琼脂；MD固体培养基1.34%YNB,0.00004%Biotin,2%葡萄糖，1.5°/。琼脂；BMGY培养基1%酵母提取物，2%蛋白胨，100,ol/L磷酸緩冲液(pH6.0)，1.34%YNB,0.00004%Biotin,1%甘油(V/V);B應Y培养基除以0.5%曱醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同；发酵培养基10xBasalSalts:磷酸26.7ml/L,石危酸4丐0.93g/L,石危酸钾18.2g/L,七水合硫酸镁14.9g/L,氢氧化钾4.13g/L，葡萄糖50g/L。发酵中所用的微量盐溶液PTM:硫酸铜6.0g/L、硪化钠0,08g/L、硫酸锰3.0g/L、钼酸钠0.2g/L、硼酸0.02g/L、氯化钴0.5g/L、氯化锌20g/L、硫酸亚铁65g/L、生物素0.25g/L、硫酸5ml/L。3.2原核重组表达质粒的构建重组质粒pTl-ga2c用￡coRI，iVotl双酶切，回收约2.Okb的片l爻(gak基因)，以EcoRI、双酶切原核表达载体pET-30a(+)并回收。16。C连接，热击转化大肠杆菌TOP10感受态细胞。用《卯I酶切鉴定筛选原核重组表达质粒，命名为pET-galc。3.3ga2c基因在大肠杆菌中的诱导表达22将重组表达质粒pET-gale及空载体pET-30a(+)分别转化大肠杆菌BL21,涂于含卡那霉素的LB(简称LB-kan)平板，37。C培养至长出单菌落。挑单菌落培养，提质粒酶切鉴定正确后，接种于10mlLB-kan液体培养基，37。C摇床培养过夜。按1°/。体积转接于100mlLB-kan液体培养基，摇床培养至d。为0.6~0.8。加入IPTG(终浓度0.4mmol/L)在28。C诱导培养。取IPTG处理前和IPTG诱导4h后的菌液各1ml用于煮沸裂解细胞进行SDS-PAGE4全测，其余诱导后菌液离心收集菌体，按菌液Tris-HC1緩冲液(20Mm,pH8.0)=20:1的比例重悬菌体，用于超声波破碎细胞，破碎后离心收集上清用于蛋白纯化。3.4原核表达P-半乳糖苷酶的纯化(1)取亲和层析树脂Ni-NTAAgarose1.5-2ml，加入已放好垫片的塑料管中，待树脂全部沉积到一起时，放入上层垫片，压紧，这样就灌好一个亲和层析柱，备用。(2)将柱子垂直摆放在4。C冰箱中，加入水15-20ml。(3)流尽后加入23ml0.lmol/L硫酸镍(第一次使用时可以不加)。(4)流尽后加入15~20mlNTA-O緩冲液平衡柱子。(5)流尽后即可加入破壁后菌体上清液，此时带有组氨酸标签的蛋白可以与树脂上的镍结合。(6)上清液全部流尽后，仍用NTA-0緩沖液20ml清洗柱子。(7)分别取5mlNTA-20,NTA-40，NTA-60,NTA-80，NTA-100,NTA-200緩冲液依次冲洗柱子，洗脱液分别回收。此步骤在第一次做蛋白纯化时用来摸索洗脱緩冲液时做，根据不同浓度洗脱液中目标蛋白的浓度和纯度来确定最适的緩冲液。(8)如果洗脱緩冲液已经确定则直接用最适緩冲液10ml洗脱，洗脱液回收，进行SDS-PAGE电泳才企测。(9)加入0.5mol/LNaOH清洗柱子30min。加入30%乙醇20ml清洗柱子，最后将柱子保存在30%乙醇内。取以不同的咪唑浓度的NTA洗脱的收集液各20in1,加入等体积2x上样緩冲液煮沸5min，各取10ja1上样进行SDS-PAGE检测(蛋白胶浓度12%)(如图4)。结果表明，p-半乳糖苷酶基因ga2c在大肠杆菌BL21中表达，经过柱纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳后，为单一条带，有p-半乳糖苷酶活性。蛋白分子量约76KD,与理论分子量一致。经梯度洗脱后我们发现，在NTA-80(含80mM咪唑)时洗脱效果最好。在后续的酶液收集中，直接以此浓度进行洗脱。3.5|3-半乳糖苦酶酶活性的测定标准曲线的绘制称取28mgONP(邻竭基芬)，先溶于lml曱醇中，再用0.lmol/LpH6.4的磷酸氢二钠-柠檬酸緩冲液定容至100ml,配成2mmol/LONP母液。分别加入不同量的ONP和0.lmol/LpH6.4的磷酸氢二钠-柠檬酸緩冲液，总体积lml,然后依次加入lml的IO订CA，2ml的lmol/LNaC03显色液，测定朋42。的光吸收值，绘制酶活标准曲线(如图5)。表l标准曲线的绘制编号12345672mmol/LONP母液0501001502002503000.1mol/LpH6.42000195019001850180017501700Buffer(p1)10订CA终止液(ml)1111111lmol/LNaC。3显色2222222液(ml)体系中ONP含量0100200300400500600(nmo1)00.110.2170.3350.4460.5480.656卯"。00.1140.2190.3490.4560.5570.65800.1150.2230.3350.450.5630.669平均卯00.1130.2200.3400.4500.5560.661才艮据p-半乳糖苦酶标准曲线的结果，如图5，半乳糖苷酶酶活性计算公式5XNX(902.94x-1.8383)酶活性(U/ml"x:420nm处光吸收值；N:酶液的稀释倍凄t;15:反应15min;5:将200li1稀释酶液中的酶活折算为lml的酶活性。酶活测定24纯化后酶液通过P-半乳糖苷酶活性检测，得到酶活力为98.309U/ml。实施例4原核表达p-半乳糖苷酶酶学性质的分析4.1材料在大肠杆菌BL21中表达的p-半乳糖苷酶，经纯化后的获得单一条带的p-半乳糖苷酶蛋白。4.2(3-半乳糖苦酶比活的测定考马斯亮蓝法测定蛋白含量标准曲线的绘制表2蛋白含量标准曲线的绘制编号123456BSA浓度(ng/ml)1002004006008001000BSA体积(p1)100100100100100100BSA含量(ng)1020406080100考马斯亮蓝G-250溶液55555(ml)0.1570.3250.5430.7150.8891.0860.1670.3340.5660.7270.9021.085收950.170.330.550.7560.8941.065平均鹏950.1650.3300.5530.7330.8951.079根据标准曲线绘制结果(图6)得出的蛋白含量公式为蛋白浓度(mg/ml)=(卯595x100.65-11.3)xNx10(2)OA":595nm处光吸收值；N:稀释倍数；10:将0.lml的蛋白稀释液中的蛋白折算成lml中的蛋白含量。比活的计算通过考马斯亮蓝法测定酶液中的蛋白含量为522.101jig/ml,再通过p-半乳糖苷酶活性测定，得到酶活力为98.309U/ml,故酶蛋白样品比活为188.30u/mg。4.3p-半乳糖苦酶的最适pH在37。C条件下，测定不同pH条件的p-半乳糖苷酶活性，作酶的最适pH曲线(图7)。可知pH6.4时酶活性最高，并且在pH5.8~7.6之间，该P-半乳糖苷酶均保持约76%以上的活性。4.4P-半乳糖苦酶的pH稳定性如图8所示，酶在较宽的pH范围内较稳定，Ph5.8~9范围内其相对酶活达到60°/。以上，尤其在pH6.4~9范围内其相对酶活更在90%以上。在pH8和pH9时，其相对酶活在95%以上。4.5P-半乳糖苷酶的最适温度从图9可知，47。C时酶的水解活力最高，在40°C50。C之间相对酶活性均在65°/。以上，但5(TC以上酶活性急剧下降。4.6e-半乳糖苷酶的热稳定性由图10可知，该酶在经过热处理后，酶活有所下降。47。C处理两分钟，酶活没有多大变化，而在处理4min后，相对酶活接近于70%,在处理20min后，相对酶活只有2%。而在55。C处理lmin后，相对酶活仅存留1.78%。^f旦在37。C处理70min后，相对酶活仍存留40%以上。4.7金属离子和相关化学试剂对P-半乳糖苷酶活性的影响在酶反应体系中加入金属离子和相关化学试剂(终浓度lmmol/L),发现金属离子和相关化学试剂对P-半乳糖苷酶活性的影响有较大差异，其活性对比见图13。由图ll可知，K+、Pb2+、Fe2+、Cu2+、EDTA对p-半乳糖苷酶有明显的激活作用，其中以Pb"为最；Mn2+、Mg2+、Zn2+、SDS对酶有抑制作用，SDS的影响最大，对酶活抑制作用接近20%;其他的离子影响不大；EDTA对酶的影响不大，说明该酶对金属离子的依赖性不强。4.8p-半乳糖苷酶的Km和Vmax值用0.lmol/LpH6.4磷酸氬二钠-柠檬酸緩冲液配制不同浓度的0NPG溶液，按酶活测定程序测定稀释酶液在47。C下的0仏2。值，并计算[S]及其对应的v，求出二者的倒数，作1〃对1/[S]的直线，结果见图12。由图12所得函数式，计算出iL=19.33mmol/L;Cx=46.67nmol/min。KLPI090013—3.txt序列表<110>中国农业科学院生物技术研究所<120>编码f-半乳糖苷酶的基因及其表达和应用〈130>klpi080887<160〉2<170>Patentlnversion3.1<210>1〈211>2079<212〉腿<213>Cellulomonassp.<400〉1atgcgacgacgcacctcatccgagtccttcgacccttccgccgtccggccctggaacgcc60ggcatccgcggcctcggcttcggcggcgactac貼ccccgagcagtggccccaggaggtc120cgcctcgaggacgtcgagctcatgcgagaggccggcgtcaacctgctcagcgtcgcgatc180ttctcctgggccacgatcgagccgcgcgagggcgagctcgagtggggctggctcgacgag240acgatggaccgcctgcacgacgccggcatccaggtcgcgctcgccacggccacggcgtca300cccccgccgtggctcacgcgcaagc3ccccgagatcctcccccgcaccgccgacggcacc360gtcctgcaccagggcgggcgccagtcgtacgcggtcacgcacccggtgcaccgcgagtac420gcgctgcgcatggccgagcgcatggccgagcgctaccgcgaccatccggcgctcgcgctg480tggcacgtcgacaacgagatcggctgccacgtgccgcgcgactactcggeicgccgccgcc540gcggcgttccgtgagtggctccgcgcccgctacgccacgatcgagg￡tcctcaaccaggcg600tggggC3CCgcgttctggtcgcagcgctacgggitcgttcgacgacgtcctgccgccgctc660gtcgcacccacgttcgccaacccgacgcagcagctcgacttcgaccgcttctcctccgac720gcgctgctcgactactaccgcgacctgcgcgacacgctgcgccagatcacgccccacgtg780cccacgacgaccaacctcatggcctcgagccacaccaagggcatggactacttctcctgg840gcgcccgagctcgacgtcgtcgcgaacgaccactacaccgtcgccgcgtcgcccgagcgg900cacgtcgagctcgccttctccgccgacctctcgcggggcatcgccggaggccacccgtgg960atcctcatggagcactcgacgtcggcggtcaactggcaggagcgcaaccgctccaagctt1020ccggg卿gctgctgcgc犯ctcgctgcagcacgtggcgcgcggcgcggactcggtgatg1080ttcttccagtggcgggcgtcgcgcgcgggcgccgagaagtaccactccgcgatggtcccg1140cacgccggcacggacaccgacctgtggcgcgacgtcgtcggcctgggcgatgcgctgcgc1200gcgctcggcgctcgcgcgtgcgctcgcgggccgcgatggtCgtCg3Ctgg1260ccgtcctggtggggctccgagctcgactcgcaccccacccaggcgctccgctacatggac1320caggtccaggccgagcgcgggacaccgacgtacttctccgttxcgcgaccgtccgggtcgacgcacgtggaggccagcgacgcctcgaccggtccggacgacgacgtcgtgaggcgcccggtccccgccgKLPI090013—3.txtcctggtacgccgcgctgtggcgcctcggcgtgaccgtcgacatgg"tgccg1380acctcgccggttacgacctcgtcgtcctgcccacgacgtacctgatcacc1440ccgccaacgtggccgtcgcggcgtcacgcggcgcgacggtcgccgtgacg1500gcatcgtcgacgagaacgaccacgtgcggctcggcgggtacccgggcgcc1560tgctcggcgtccgcacgcaggagttcttcccgctccaggagggcgagacc1620agggcgaggcgctggacggcggggccacggccgacctgtggaccgagaag1680tcgacgggaccgacgtcgtcgcgacgtacgccgacggcgcgctgcgcggc1740tcacccggcgcccggccggcacgcgtggcgccgcgtggtacgtcgcgacg1800ccgcgggactcgacgcgctcgccacgcgcctggtccgggagtccggcgtc1860"tggccgccccggccggggtcgaggtcgtgcggcgctggtccgacgacggc1920ggctgttcgcgatcaaccacaccgagaccgaggcgacgctgggcaccgca1980tgcgcggcgtcgagctgctcacaggUccgacgtcggcgggcggctcgcc2040gggcggtacgtgtggtgcgggtcgtctga2079<210〉2〈211〉692<212>PRT<213>Cellulomonassp.<400〉2MetArgArgArgThrSerSerGluSer15PheAspProSerAlaValArg1015ProTrpAsnAlaGlylieArgGlyLeuGlyPheGlyGlyAspTyrAsn202530ProGluGinTrpProGinGluValArgLeuGluAspValGluUuMet354045ArgGluAlaGlyValAsnLeuLeuSerValAlaliePheSerTrpAla505560ThrlieGluProArgGluGlyGluLeuGluTrpGlyTrpLeuAspGlu65707580ThrMetAspArgLeuHisAspAlaGlylieGinValAlaLeuAlaThr859095AlaThrAlaSerProProProTrpLeuThrArgLysHisProGlulie100105110LeuProArgThrAlaAspGlyThrValLeuHisGinGlyGlyArgGin115120125SerTyrAlaValThrHisProValHisArgGluTyrAlaLeuArgMet130135140KLPI090013—3.txtAlaGluArgMetAlaGluArgTyrArgAspHisProAlaLeuAlaLeu145150155160TrpHisValAspAsnGlulieGlyCysHisValProArgAspTyrSer165170175AspAlaAlaAlaAlaAlaPheArgGluTrpLeuArgAlaArgTyrAla180185190ThrlieGluAspLeuAsnGinAlaTrpGlyThrAlaPheTrpSerGin195200205ArgTyrGlySerPheAspAspValLeuProProLeuValAlaProThr210215220PheAlaAsnProThrGinGinLeuAspPheAspArgPheSerSerAsp225230235240AlaLeuLeuAspTyrTyrArgAspLeuArgAspThrLeuArgGinlie245250255ThrProHisValProThrThrThrAsnLeuMetAlaSerSerHisThr260265270LysGlyMetAspTyrPheSerTrpAlaProGluLeuAspValValAla275280285AsnAspHisTyrThrValAlaAlaSerProGluArgHisValGluLeu290295300AlaPheSerAlaAspLeuSerArgGlylieAlaGlyGlyHisProTrp305310315320lieLeuMetGluHisSerThrSerAlaValAsnTrpGinGluArgAsn325330335ArgSerLysLeuProGlyGluLeuLeuArgAsnSerLeuGinHisVal340345350AlaArgGlyAlaAspSerValMetPhePheGinTrpArgAlaSerArg355360365AlaGlyAlaGluLysTyrHisSerAlaMetValProHisAlaGlyThr370375380AspThrAspLeuTrpArgAspValValGlyLeuGlyAspAlaLeuArg385390395400AlaLeuGlyGluValArgGlySerArgValArgSerArgAlaAlaMet405410415ValValAspTrpProSerTrpTrpGlySerGluLeuAspSerHisPro420425430ThrGinAlaLeuArgTyrMetAspGinValGinAlaTrpTyrAlaAla43544044530KLPI090013—3.txtLeuTrpArgLeuGlyValThrValAspMetValProProSerAlaAsp450455460LeuAlaGlyTyrAspLeuValValLeuProThrThrTyrLeulieThr465470475480AspThrAspAlaAlaAsnValAlaValAlaAlaSerArgGlyAlaThr485490495ValAlaValThrTyrPheSerGlylieValAspGluAsnAspHisVal500505510ArgLeuGlyGlyTyrProGlyAlaPheArgAspLeuLeuGlyValArg515520525ThrGinGluPhePheProLeuGinGluGlyGluThrValArgValGlu530535540GlyGluAlaLeuAspGlyGlyAlaThrAlaAspLeuTrpThrGluLys545550555560ThrHisValValAspGlyThrAspValValAlaThrTyrAlaAspGly565570575AlaLeuArgGlyArgProAlalieThrArgArgProAlaGlyThrArg580585590GlyAlaAlaTrpTyrValAlaThrArgLeuAspProAlaGlyLeuAsp595600605AlaLeuAlaThrArgLeuValArgGluSerGlyValGlyProAspVal610615620AlaAlaProAlaGlyValGluValValArgArgTrpSerAspAspGly625630635640ThrThrSerTrpLeuPheAlalieAsnHisThrGluThrGluAlaThr645650655LeuGlyThrAlaGluAlaProValArgGlyValGluLeuLeuThrGly660665670SerAspValGlyGlyArgUuAlaValProAlaGlyAlaValArgVal675ValArgValVal69068068权利要求1、一种编码β-半乳糖苷酶的基因，该基因选自(a)、(b)、(c)或(d)所示的核苷酸序列(a)SEQIDNO1所示的核苷酸序列；或(b)在严谨条件下能与(a)所示的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，且该核苷酸序列编码具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白；或(c)编码SEQIDNO2所示氨基酸序列的核苷酸序列；或(d)编码具有β-半乳糖苷酶功能的蛋白衍生物的核苷酸序列，该蛋白衍生物通过将SEQIDNO2所示的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基替换、缺失或插入而获得。2、按照权利要求1所述的基因，其特征在于该基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。3、一种(3-半乳糖苷酶，其特征在于选自以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或(b)将SEQIDNO:2所示的氨基酸序列通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或插入而获得的仍具有P-半乳糖苷酶活性的蛋白书亍生物。4.根据权利要求3的半乳糖香酶，其特征在于其是SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。5.含有权利要求1或2所述基因的重组表达质粒。6.按照权利要求5的重组表达质粒，其特征是所述的重组表达质粒是pET-galc。7.含有权利要求5或6所述重组表达质粒的重组菌林。8、一种制备权利要求3所述p-半乳糖苦酶的方法，包括以下步骤构建含有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的重组表达质粒；用该重组表达质粒转化宿主细胞，得重组菌抹；培养该重组菌林，诱导重组P-半乳糖香酶的表达，回收并纯化所表达的P-半乳糖苷酶。9.按照权利要求8的方法，其特征是所述的重组表达质粒是pET-galc;所述的宿主细胞是大肠杆菌(￡sci3eric/n'acoii)BL21。全文摘要本发明公开了编码β-半乳糖苷酶的基因及其表达和应用。本发明从采自新疆的土壤中筛选克隆了一个来源于纤维单胞菌属(Cellulomonassp.)的β-半乳糖苷酶新基因(SEQIDNO1)。该β-半乳糖苷酶基因组DNA全长2076bp，(G+C)％含量72.9％，推导其编码692个氨基酸。该基因所编码的β-半乳糖苷酶与来源于节杆菌属的β-半乳糖苷酶相似性最高，为59％。酶学性质测定表明，本发明β-半乳糖苷酶为中性常温酶。文献报道的其他节杆菌属(Arthrobactersp.)的β-半乳糖苷酶大多属低温适冷酶，在酶学性质上与本发明的β-半乳糖苷酶存在着显著差异。文档编号C12N1/19GK101597614SQ200910001928公开日2009年12月9日申请日期2009年1月14日优先权日2008年11月24日发明者伍宁丰,斌姚,伟张,张宇宏,范云六,军郭申请人:中国农业科学院生物技术研究所