专利名称：：酶法水解乳清蛋白的方法及水解产物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种酶法水解乳清蛋白的方法及水解产物。
背景技术：
：牛乳中含有3%3.5%蛋白质，其中约20%为乳清蛋白。乳清蛋白主要包括P-乳球蛋白(P-LG)、ci-乳白蛋白(a-LA)、血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白(Ig)、乳铁蛋白，还有多种酶、多种维生素、微量元素及各种生长因子和激素。其中a-乳白蛋白和P-乳球蛋白是乳清蛋白中的主要成分。P-LG是牛乳乳清蛋白的主要蛋白质，不存在于母乳中。研究表明e-LG是引起牛乳过敏的主要过敏原，大约有2X6X的婴幼儿对乳蛋白质有一定的过敏。对以牛乳为主要食物的婴幼儿来说，牛乳过敏影响乳蛋白质的正常消化吸收，严重影响婴幼儿的健康成长。为了消除或降低牛乳过敏性，通过对牛乳蛋白过敏原进行改性生产低过敏或无过敏牛乳技术已取得了较大进展。蛋白酶解法是一种目前常用的牛乳清蛋白改性方法，主要是利用蛋白酶水解乳清蛋白制备得到水解产物，水解产物的抗原性可降低，进一步应用于配制低过敏性或无过敏性食品例如婴幼儿食品等。另外，酶法水解乳清蛋白往往会产生苦味肽，从而影响制品的口感和风味。当前的对酶法水解乳清蛋白的方法的研究中，大多集中在对酶具体种类的筛选以及酶解过程中工艺条件的优化，以期得到所希望的具有特定性能或特定组分的水解产物。例如，CN101260421A公开了一种利用特定组成的复合蛋白酶酶解乳清蛋白的方法，以提高水解度、乳清蛋白利用率及产品收率等；CN101297674A公开了一种利用由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶按一定比例组成的复合蛋白酶水解乳清蛋白生产低敏性水解物的方法；包怡红等人研究了碱性蛋白酶对乳清蛋白的水解作用，并优化了工艺条件，乳清蛋白水解后，产物溶解性和热稳定性得到提高("乳清蛋白的酶解及其性质研究"，《食品科学》，2003，Vol.24，No.9);王国荣等人通过对多种蛋白酶酶解乳清蛋白的研究比较，筛选出蛋白酶A具有优先降解P-乳球蛋白的能力，并优化了蛋白酶A优先降解P-乳球蛋白的工艺("优先酶解乳清蛋白浓縮物中P-乳球蛋白工艺的研究"，《中国乳品工业》，2007年第35巻第IO期)；......。在酶法水解乳清蛋白的研究中，可以通过选择合适的蛋白酶、控制酶解工艺条件等措施来降低水解产物的抗原性和/或水解产物的苦味，使水解产物具有所期望的性能及组成。
发明内容本发明的一个目的在于提供一种酶法水解乳清蛋白的方法，以制备具有低抗原性的水解产物。本发明的另一目的在于提供一种酶法水解乳清蛋白的方法，以降低水解产物的苦味。本发明的另一目的在于提供一种酶法水解乳清蛋白的方法，以制备易于消化吸收的水解产物。本发明的另一目的在于提供一种乳清蛋白水解产物，其具有低抗原性、低苦味，并易于消化吸收。—方面，本发明提供了一种酶法水解乳清蛋白的方法，该方法包括步骤将欲进行水解的乳清蛋白水溶液的pH值调节到适合蛋白酶水解的值，然后对该乳清蛋白水溶液进行热处理，使蛋白变性，再添加蛋白酶进行水解。在所属领域中，在向欲进行酶解的乳清蛋白水溶液中添加蛋白酶进行水解前，需要将乳清蛋白水溶液的pH值调节到适合蛋白酶水解的值，是已知的；通常，在传统的优选方法中，在调节乳清蛋白水溶液pH值、添加酶水解的步骤前，还需要预先对乳清蛋白水溶液进行热处理(例如可参见前述CN101260421A、CN101297674A公开的内容，以及包怡红等人的研究、王国荣等人的研究中的记载)，热处理的主要目的是使蛋白变性，使蛋白的一些结构伸展开，暴露出更多的酶切位置，利于酶解的进行。而本案发明人在研究中发现，在对乳清蛋白水溶液进行热处理前即将其pH值调节到适合蛋白酶水解的值，然后进行热处理使蛋白变性，再添加蛋白酶进行水解，与传统的先热处理然后调pH值加酶水解的方法相比，将能带来预料不到的技术效果。发明人的相关实验证明利用本发明的先调pH值然后热处理再加酶水解的方法，所得水解产物将具有更低的抗原性；而且，利用本发明的方法所得水解产物将具有较低的苦味；此外，本发明的方法还利于控制水解率，制备寡肽含量高、易于消化吸收的水解产物。根据本发明的具体实施方案，本发明中所述欲进行酶解的乳清蛋白水溶液是通过将乳清蛋白溶于水得到的。所述乳清蛋白可以是通过本领域已知的方法得到的，如干酪乳清、乳清浓縮蛋白、乳清分离蛋白等。典型的乳清蛋白制品是含有P-乳球蛋白和/或a-乳白蛋白，市售的多为乳清蛋白浓縮物(WPC)或乳清蛋白分离物(WPI)。在本发明优选的实施方案中，是对通过将乳清蛋白浓縮物或乳清蛋白分离物溶于水得到的乳清蛋白水溶液进行酶解。本发明中，所述欲进行酶解的乳清蛋白水溶液的浓度为2%12%(w/w，按总固形物的含量计算，除特别标注和说明外，本发明中所述含量和比例为重量含量和比例)，优选为5%10%。根据本发明的具体实施方案，本发明是采用微生物蛋白酶对乳清蛋白进行水解，更具体地，所述蛋白酶包括蛋白酶U、蛋白酶A、蛋白酶P3、蛋白酶N、蛋白酶S和蛋白酶SEB中的至少一种。这些蛋白酶均可商购获得。在确定所用蛋白酶之后，适合蛋白酶水解的pH值范围即可获知。本发明中即可将欲进行水解的乳清蛋白水溶液的pH值调节到适合所用蛋白酶水解的值，然后在该pH值下对该乳清蛋白水溶液进行热处理，使蛋白变性。根据本发明的优选实施方案，应控制欲进行热处理的乳清蛋白水溶液的pH值为58，更优选为67，调节pH值的调节剂可以采用所属领域中常用的调节剂，如NaOH溶液、HCl溶液等。热处理的条件如温度和时间等，可以参照所属领域中已知的方法进行，也可以考虑乳清蛋白水溶液的性状而确定。根据本发明的优选实施方案，所述热处理温度为80°C98t:，更优选85t:95t:，处理时间为3min15min，更优选5min10min。在将乳清蛋白水溶液进行热处理后，将其冷却至适合酶水解的温度，即可加入蛋白酶进行水解。在选定所用的蛋白酶后，适合酶水解的温度是可以得知的，向乳清蛋白水溶液中加入的蛋白酶的量可以根据本领域已知的方法来确定，也可以根据所用的酶的活性和乳清蛋白水溶液的性状来确定。本发明中，蛋白酶的活性以U(Unit)表示。一个U表示在最佳条件下，单位时间内(每分钟)水解酪蛋白释放出lg酪氨酸所需要的酶量。酶水解酪蛋白从而每分钟释放一定量的三氯乙酸(TCA)可溶物。根据本发明的具体实施方案，蛋白酶的添加量为每lOOmL乳清蛋白溶液中添加酶活单位为500021000U，优选的实施方案中，添加的酶活单位为1900020000U/100mL乳清蛋白溶液。根据本发明的优选具体实施方案，向乳清蛋白溶液中加入蛋白酶后应控制在45°C7(TC进行水解，优选45°C65°C，更优选50°C60°C。水解时间控制在30分钟到4小时，优选为2小时到3小时。随着水解的进行，乳清蛋白被水解为乳清蛋白水解物。根据本发明的具体实施方案，本发明的方法还包括热灭活蛋白酶以终止水解的步骤。本发明在水解过程中，可随时取样，检测水解物中抗原含量。根据本发明的优选实施方案，是当乳清蛋白水解物中的过敏原含量降低到1875mg/kg(本发明中抗原含量是以乳清蛋白水解物的干物质量而非水解溶液的量为基准)以下后，热灭活蛋白酶，终止水解的进行。本发明中具体的热灭活温度可控制为75°C98t:，优选为80°C98t:，更优选为85°C95°C;热灭活时间5min15min，优选为5min10min。灭活后迅速冷却到室温，即得到本发明的乳清蛋白水解产物(灭活并冷却至室温的水解产物仍是存在于水解液中，经冷冻干燥后即可得以固体形式存在的水解产物)。本发明中，可不需要对该水解产物进行脱盐处理，即可应用于配制食品等。在本发明的一具体的实施方案中，所述的酶法水解乳清蛋白的方法包括步骤配制质量浓度2%12%，优选5%10%的乳清蛋白水溶液；将乳清蛋白水溶液的pH值调节到适合蛋白酶水解的值，且该pH值范围在58;将调好pH值的乳清蛋白水溶液在80°C98"热处理315min;冷却到适合于酶水解的温度，添加蛋白酶500021000U/100mL乳清蛋白水溶液，4565。C水解30分钟4小时；当乳清蛋白水解物中过敏原含量降低到1875mg/kg以下后，热灭活蛋白酶；灭活温度7598°C，时间5min15min。灭活后迅速冷却(例如置于冰水混合水浴中冷却)到室温。另一方面，本发明还提供了一种乳清蛋白水解产物，其是按照本发明所述的酶法水解乳清蛋白的方法得到的水解产物。本发明中，还采用酶联免疫方法对水解产物的抗原性进行了测定，按照本发明的方法所制备得到的水解产物，与按照传统方法得到的水解产物相比，其抗原性将显著降低。本发明中，每千克乳清蛋白水解产物(以干物质量为基准)中，过敏原含量在1875mg以下，可进一步应用于配制低过敏性或无过敏性食品例如婴幼儿食品等。本发明中，还对水解产物的苦味进行了评价(直接评价水解原液的苦味)。具体的苦味评价方法为采用硫酸奎宁标准溶液，称取O.lg硫酸奎宁溶于50mL5%的乙醇溶液中，作为标准液。苦味程度采用5级评价，标准液浓度为C(C=3X10—6mol/L)时刚好无苦味(_)，2C为有轻微苦味(+)，4C为中等苦味(++)，8C为强苦味(+++)，10C为很强的苦味(++++)，12C为很强的苦味(+++++)，15C为很强的苦味(++++++)。按照本发明的方法所制备得到的水解产物，与按照传统方法得到的水解产物相比，其苦味将显著降低。将本发明的水解产物用于配制食品，可减少苦味5肽对制品的口感和风味的影响。本发明中，还采用高效液相色谱法对水解产物的分子量分布进行了测定。本发明的乳清蛋白水解产物，其中分子量1801000Dal的寡肽含量^50%，特别是分子量180500Dal的二肽和三肽在水解产物中含量高，本发明的水解产物易于消化吸收。综上所述，本发明采用微生物蛋白酶对乳清蛋白进行水解，通过控制恰当的方法步骤，进一步选择合适的蛋白酶，有利于水解的进行，所得水解产物的抗原性显著降低；本发明的乳清蛋白水解产物在未经脱盐及其它工艺处理的前提下，苦味较低，且无其他不良风味，改善了水解产物的口感；本发明所得水解产物中寡肽的含量较高，易于消化吸收；并且，本发明的乳清蛋白水解产物安全性高、无副作用。图1显示本发明实施例1和对比例1中利用蛋白酶U和蛋白酶A对乳清蛋白进行水解过程中抗原性变化。图2显示本发明实施例2和对比例2中利用蛋白酶N和蛋白酶S对乳清蛋白进行水解过程中抗原性变化。图3显示本发明实施例3中水解3小时水解产物的分子量分布。图4显示本发明实施例4中水解2小时水解产物的分子量分布。图5显示本发明实施例5中水解3小时水解产物的分子量分布。图6显示本发明实施例6中利用蛋白酶A水解乳清蛋白所得水解产物与市售同类产品相比的抗原性对比。图7显示本发明实施例6所得最终水解产物的分子量分布。具体实施例方式以下通过具体实施例详细说明本发明的技术及特点，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的技术实质和所能产生的有益效果，不能理解为对本发明实施范围的限定。实施例1配制8%WPC80水溶液2份，用1N氢氧化钠将溶液调到用酶的最适pH值7.0，然后8(TC水浴热处理10min，降温至55°C，1份加入蛋白酶U，1份加入蛋白酶A，酶的用量在20000U/100mL乳清蛋白水溶液，分别在55。C下水解210min;观察水解过程中pH值变化，在水解过程中的不同时间取样，取样后立即热灭活所取样中的蛋白酶，灭活温度95t:，时间10min，灭活后迅速冷却至室温，对其中的水解产物的pH值、苦味和过敏原指标(抗原含量)进行测定。水解过程中pH值逐渐下降，水解到210minpH值下降到6.35-6.4之间，苦味评价实验结果请参见表l，抗原含量测定结果请参见图1。对比例1参照实施例1进行对比实验，对比实验中，是先将所配制的8%WPC80水溶液在8(TC水浴热处理10min并冷却至55t:后，再用1N氢氧化钠将溶液调到用酶的最适pH值，分别用蛋白酶U和蛋白酶A在55t:下水解，其他工艺条件与实施例l相同。该对比例l水解过程中pH值仍然逐步下降，水解到210minpH值也维持在6.356.4之间，与实施例1相比变化不显著。该对比例l水解过程中水解产物的抗原含量测定结果和苦味评价请参见图61和表1。实施例1与对比例1水解过程中水解产物的抗原性分析结果请参见图1所示。从图1中可看出在酶法水解乳清蛋白的过程中，随着水解时间的延长，水解产物中抗原含量逐渐下降；采用本发明实施例1的方法，与对比例1的方法相比，在相同水解条件下，抗原含量将显著降低。实施例1和对比例1利用蛋白酶U和蛋白酶A水解乳清蛋白过程中水解产物苦味变化对比情况请参见下表1:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注"_"表示无苦味，"+"表示较弱苦味，随着"+"的增多，苦味也增强。从表1可看出在酶法水解乳清蛋白的过程中，随着水解时间的延长，水解产物苦味逐渐增加；采用本发明实施例1的方法，与对比例1的方法相比，水解产物的苦味将显著降低。实施例2配制10%WPC80水溶液2份，用1N氢氧化钠将溶液调到适合酶解的pH值7.0，然后85t:水浴热处理10min，降温至6(TC，保温，1份加入蛋白酶N，1份加入蛋白酶S，酶的用量为21000U/100mL乳清蛋白水溶液，分别在6(TC下水解240min;观察水解过程中pH值变化，在水解过程中的不同时间取样，取样后沸水浴10min灭活所取样中的蛋白酶，灭活后迅速冷却至室温，对其中的水解产物的pH值、苦味和过敏原指标(抗原含量)进行测定。水解过程中pH值逐渐下降，水解到240minpH值下降到6.356.4之间。苦味评价实验结果请参见表2，抗原含量测定结果请参见图2。对比例2参照实施例2进行对比实验，对比实验中，是先将所配制的10%WPC80水溶液在85t:水浴热处理10min并冷却至6(TC后，再用1N氢氧化钠将溶液调到用酶的最适pH值7.O，分别用蛋白酶N和蛋白酶S在6(TC下水解，其他工艺条件与实施例2相同。该对比例2水解过程中pH值仍然逐步下降，水解到240minpH值维持在6.46.5之间，与实施例2相比变化不显著。该对比例2水解过程中水解产物的抗原含量测定结果和苦味评价请参见图2和表2。实施例2与对比例2水解过程中水解产物的抗原性分析结果请参见图2所示。从图2中可看出在酶法水解乳清蛋白的过程中，随着水解时间的延长，水解产物中抗原含量逐渐下降；采用本发明实施例2的方法，与对比例2的方法相比，在相同水解条件下，抗原含量显著降低。实施例2和对比例2利用蛋白酶N和蛋白酶S水解乳清蛋白过程中水解产物苦味变化对比情况请参见下表2:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注"-"表示无苦味，"+"表示较弱苦味，随看"+"的增多，苦味也增强；"*"表示酸、咸味。从表2可看出采用本发明实施例2的方法，与对比例2的方法相比，水解产物的苦味将显著降低。实施例3配制8XWPC80水溶液，用1N氢氧化钠将溶液调到适合酶解的pH值7.0，然后8(TC水浴热处理10min，降温至5(TC，保温，加入蛋白酶U，酶的用量在19000U/100mL乳清蛋白水溶液，混匀，开始水解，水解3h，立即沸水浴10min灭活所取样中的蛋白酶，灭活后迅速冷却至室温，对其中的水解产物的抗原含量进行测定，结果为383.Omg/kg。本实施例中还采用高效液相法测定了水解3小时的乳清蛋白水解产物中的分子量分布，结果请参见得图3。经分析可得知该水解产物中，分子量小于500Dal的二肽和三肽在水解产物中占的比例大约为60%，因此可知该物质具有较好的消化吸收性。实施例4配制8XWPC80水溶液，用1N氢氧化钠将溶液调到适合酶解的pH值7.0，然后8(TC水浴热处理10min，降温至55t:，保温，加入蛋白酶P3，酶的用量在19000U/100mL乳清蛋白水溶液，混匀，开始水解，水解2h立即沸水浴10min灭活所取样中的蛋白酶，灭活后迅速冷却至室温，对其中的水解产物的抗原含量进行测定，结果为1507.5mg/kg。本实施例中，还采用高效液相法测定了水解2小时的乳清蛋白水解产物中的分子量分布，结果请参见得图4。经分析可得知该水解产物中，分子量小于1000Dal的肽在水解产物中占的比例约为63.9%，其中分子量小于500Dal的二肽和三肽约占42%;因此可知该物质具有较好的消化吸收性。实施例5配制8%WPC80水溶液，用1N氢氧化钠将溶液调到适合酶解的pH值7.0，然后8(TC水浴热处理10min，降温至60°C，保温，加入蛋白酶SEB(SEB-NeutralPL)，酶的用量在19000U/100mL乳清蛋白水溶液，混匀，开始水解，水解3h立即沸水浴10min灭活所取样中的蛋白酶，灭活后迅速冷却至室温，对其中的水解产物的抗原含量进行测定，结果为525.Omg/kg。本实施例中，还采用高效液相法测定了水解3小时的乳清蛋白水解产物中的分子量分布，结果请参见图5。经分析可得知该水解产物中，分子量小于1000Dal的十肽以下水解产物所占比例约为70.2%，其中小于500Dal的二肽和三肽在水解产物中占的比例大约为38%，因此可知该物质具有较好的消化吸收性。实施例6配制8XWPC80水溶液，用1N氢氧化钠将溶液调到适合酶解的pH值6.857.15，然后8(TC水浴热处理10min，降温至57.5°C62.5°C，保温，加入蛋白酶A，酶的用量在19500U/100mL乳清蛋白水溶液，混匀，水解2小时，之后沸水浴10min灭酶，迅速冷却至室温，得水解产物。将该水解产物与市售某乳清蛋白水解产物相比，本发明实施例6的水解产物的苦味较弱，介于无苦和微苦之间，而市售乳清蛋白水解物苦味评价结果为弱苦。对本实施例所得水解产物的抗原含量与市售乳清蛋白水解物中抗原含量测定对比结果请参见图6，可以看出本发明实施例6中的抗原性显著低。本实施例中，还采用高效液相法测定了实施例6所得水解产物的分子量分布，结果请参见得图7。经分析可得知该水解产物中，分子量小于500Dal的二肽和三肽在水解产物中占的比例大约为58%，因此可知该物质具有较好的消化吸收性。实施例7配制5XWPC80水溶液，用1N氢氧化钠将溶液调到适合酶解的pH值7.0，然后85t:水浴热处理10min，降温至60°C，保温，加入蛋白酶N，酶的用量在21000U/100mL乳清蛋白水溶液，混匀，开始水解，在水解过程中的不同时间取样，取样后立即沸水浴10min灭活所取样中的蛋白酶，灭活后迅速冷却至室温，对其中的水解产物的抗原含量及苦味进行测定。该实施例7中利用蛋白酶N水解乳清蛋白过程中，水解到4h时，水解产物中过敏原就降到1780mg/kg。水解过程中水解产物苦味变化情况请参见下表3，本实施例的水解产物具有较弱的苦味。表39<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注"_"表示无苦味，"+"表示较弱苦味，随着"+"的增多，苦味也增强。权利要求一种酶法水解乳清蛋白的方法，该方法包括步骤将欲进行水解的乳清蛋白水溶液的pH值调节到适合蛋白酶水解的值，然后对该乳清蛋白水溶液进行热处理，使蛋白变性，再添加蛋白酶进行水解。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蛋白酶选自蛋白酶U、蛋白酶A、蛋白酶P3、蛋白酶N、蛋白酶S和蛋白酶SEB中的至少一种。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述乳清蛋白水溶液的浓度为2%12%。4.根据权利要求1所述的方法，其中，在进行热处理前是将所述乳清蛋白水溶液的pH值调节到58。5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述热处理的条件为80°C98°C、315min。6.根据权利要求1所述的方法，其中，控制水解过程中酶的用量为500021000U/100mL;水解温度45°C70。C，水解时间30分钟4小时。7.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括热灭活蛋白酶以终止水解的步骤；所述灭活温度75°C98°C，时间5min15min。8.根据权利要求l所述的方法，该方法包括步骤配制质量浓度5%10%的乳清蛋白水溶液；将乳清蛋白水溶液的PH值调节到适合蛋白酶水解的值，范围为58;将调好pH值的乳清蛋白水溶液在80°C98"热处理315min;冷却到适合于酶水解的温度，添加500021000U的蛋白酶/100mL乳清蛋白水溶液，4565。C水解30分钟4小时；当乳清蛋白水解物中过敏原含量降低到1875mg/kg以下后，热灭活蛋白酶；灭活温度7598°C，时间5min15min。9.一种乳清蛋白水解产物，其是按照权利要求18任意一项所述酶法水解乳清蛋白的方法得到的水解产物。10.根据权利要求9所述的乳清蛋白水解产物，该水解产物中分子量1801000Dal的寡肽含量^50%。全文摘要本发明提供了一种酶法水解乳清蛋白的方法及水解产物，所述的方法包括步骤将欲进行水解的乳清蛋白水溶液的pH值调节到适合蛋白酶水解的值，然后对该乳清蛋白水溶液进行热处理，使蛋白变性，再添加蛋白酶进行水解。按照本发明的方法所得乳清蛋白水解产物，抗原性低，苦味低，且水解产物中分子量180～1000Dal的寡肽含量≥50％，吸收性高。文档编号A23J3/08GK101785521SQ200910003940公开日2010年7月28日申请日期2009年1月23日优先权日2009年1月23日发明者云战友,安颖,张俊英,王彩云申请人:内蒙古伊利实业集团股份有限公司