猪瘟间接血凝检测试剂盒及制备方法

专利名称：：猪瘟间接血凝检测试剂盒及制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种猪瘟抗原重组蛋白制备方法及用这种猪瘟抗原重组蛋白制备间接血凝检测试剂盒的方法及试剂盒。
背景技术：
：猪瘟是严重威胁养猪业，造成重大经济损失的病毒性疾病，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类16种法定传染病之一。1999年2月12日我国农业部发布的第96号公告也将猪瘟列为一类动物疫病。到目前为止，猪瘟己经存在了近2个世纪，虽然世界各国对该病的防制都做了巨大努力，而且在北美、欧洲和北欧的一些地区还成功地消灭了猪瘟，但猪瘟在世界许多地区仍广泛传播，并且其流行和发病的特点己发生了很大变化，许多病例属于温和型和隐性感染、持续感染，症状不典型，这给准确诊断带来了难度，不能及时将这些病猪隔离。它们作为传染源在猪群中存在，又导致更多的猪发病，从而使防制工作更加困难。对于猪瘟的防制，目前除了欧盟成员国禁止使用疫苗之外，其它世界各国仍以弱毒疫苗免疫为主。经过多年实践应用，公认安全有效、没有残余致病力的弱毒疫苗株有三种(1)中国"54—III系"，又称C株兔化弱毒疫苗；(2)日本GPE—细胞弱毒疫苗；(3)法国培育的"Thiveosal"冷变异弱毒株。猪瘟弱毒疫苗在全世界的广泛应用对控制和消灭猪瘟起到了及其重要的作用，但这也给有效检测猪瘟野毒感染增加了难度，因为疫苗免疫过的猪群普遍具有高滴度的CSFV抗体。为了消灭猪瘟，需要快速而准确的诊断技术，世界各国对猪瘟的实验诊断都进行了大量研究，分为检测病毒抗原和检测病毒抗体两个方向。检测病毒抗原的方法主要有动物接种试验、琼脂扩散试验、免疫荧光试验、血清中和试验、新城疫病毒强化及RT-PCR法等。检测病毒血清的方法主要有血清中和试验、酶联免疫吸附试验、正向间接血凝试验、间接免疫荧光试验等，参见《动物病毒学》，殷震，刘景华主编，1997年第二版，科学出版社出版。但常规血清学方法不能区分疫苗株和野毒感染产生的血清抗体。另外，由于CSFV与牛病毒性腹泻一粘膜病病毒(BVDV)具有共同的可溶性抗原，在血清学上与BVDV有交叉反应。在自然状态下，BVDV可以感染猪，因此这些感染猪中存在抗BVDV的血清抗体。目前，除川分别针对CS.FV和BVDV的单克隆抗体区分它们外，用猪瘟全病毒抗原检测血清抗体的常规免疫学方法均不能区分BVDV感染。
发明内容本发明提供一种制备猪瘟抗原重组蛋白的方法，和这种猪瘟抗原重组蛋白，这种猪瘟抗原蛋白可克服现有技术的不足，仅与CSFV抗休发生反应但不与BVDV抗体发生交叉反应；本发明同时提供用这种重组蛋白制备检测试剂盒的方法，以及用前述的方法制备的试剂盒。本发明的猪瘟抗原重组蛋白的制备方法是从猪瘟病毒(CSFV)基因的保守区中选取一段与牛病毒性腹泻一粘膜病病毒(BVDV)基因同源性低于35%的60个核苷酸的序列S1，其对应的氨基酸序列为Al，所选的序列A1中至少包括1个能刺激动物机体产生中和抗体的抗原位点，同时要求所选择的核苷酸序列中的密码子应尽可能地不存在稀有密码子或亚稀有密码子，再将其中的第4个氨基酸改变为亲水性氨基酸，得到氨基酸A2，然后在不改变氨基酸序列的惜况下对A2对应的核苷酸序列S2进行改变，分别得到另外3段与S2的密码子不同并尽可能地避免了稀有密码子或亚稀有密码子出现的，而且为大肠杆菌所偏爱的新的核苷酸序列S3、S4、和S5;选用其编码的氨基酸自身内以及与氨基酸A2的单个氨基酸间均不形成共价键的联接核苷酸S6，以避免后续表达的抗原蛋白形成二级结构而影响抗原的反应原性，然后在保证其编码的氨基酸序列不改变，尽可能地避免稀有密码子出现以及核苷酸序列尽量不重复的原则下进行人为改变得到联接核苷酸S7和S8。以S2、S6、S3、S7、S4、S8和S5的顺序依次进行串联，得到序列S9，其对应的氨基酸序列为A3，在序列S9前面添加限制性内切酶位点S謹HI及保护性碱基,在后面添加限制性内切酶位点屈ol及保护性碱基，所得核苷酸序列SIO，将序列S10进行人工合成，然后将其用BflmHI和屈oI进行双酶切，得到的目的基因片段与同样用B謹HI禾n屈oI进行双酶切后得到的载体pGEX-4T—l序列进行连接，然后将重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行诱导表达，从表达产物中分离纯化得到重组蛋白。本发明优选的猪瘟抗原重组蛋白其制备过程中各氨基酸及核苷酸序列如下Al的氨基酸序列为ASEQl，A2的氨基酸序列为ASEQ2，A3的氨基酸序列为ASEQ3，Sl的序列为SEQ1，S2的序列为SEQ2，S3的序列为SEQ3，S4的序列为SEQ4，S5的序列为SEQ5，S6的序列为SEQ6，S7的序列为SEQ7，S8的序列为SEQ8，S9的序列为SEQ9，与S9对应的氨基酸序列为A3,S10的序列为SEQIO。采用本发明的猪瘟抗原重组蛋白可制备出间接血凝检测抗原。本发明优选采用核苷酸序列为SEQ9，氨基酸序列为ASEQ3的重组蛋白制备间接血凝检测抗原。利用前述重组猪瘟抗原重组蛋白可制备出间接血凝检测试剂盒。本发明的优越性包括以下方面本发明试剂盒中的抗原为重组抗原，与抗BVDV抗体没有交叉反应，具有很强的特异性，能真实准确地反应猪群中的猪瘟抗体水平。所用的表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，适合大规模培养，成本低廉，且表达性能稳定，容易获得大量重组蛋白抗原。纯化的重组蛋白用偶连剂碳二亚胺(EDAC)以偶连法致敏醛化绵羊红细胞，抗原不易从红细胞上脱落，稳定性好。另外通过该方法与红细胞连接的蛋白抗原有定向性，可减少空间构型对抗原抗体反应的阻碍。本发明中的试剂盒可局限性的诊断猪瘟野毒感染。出生后超过50日龄，未免疫过猪瘟弱毒疫苗，用本发明中的试剂盒检测出猪瘟抗体阳性可诊断为猪瘟野毒感染。本发明中所设计的基因序列为人工合成，不动用活毒，避免了散毒的危险，安全性高。由于本发明的重组抗原制备中，将选定的序列中第4个氨基酸改变为亲水性氨基酸，可以使所得产物有充分的水溶性，大大方便其实际的应用。本发明的试剂盒具有操作简便、省时实用及成本低廉等特点，可在实际生产中广泛推广应用。具体实施例方式首先，用DNAstar软件比对Genbank数据库上登载的CSFV和BVDV序列选择CSFV中最保守的60个核苷酸序列。选择核苷酸的原则是所选择的核苷酸序列必须是CSFV中最保守的；必须包括至少1个能刺激动物机体产生中和抗体的抗原位点，以保证后续表达的重组蛋白能与抗CSFV血清发生反应；所选择核苷酸的序列编码的氨基酸与对应区的BVDV核苷酸序列所编码的氨基酸的同源性在35%以下，以保证后续表达的重组蛋白与抗BVDV血清没有交叉反应；所选择的核苷酸序列中的密码子要尽可能地避免稀有密码子或亚稀有密码子的出现，以保证重组蛋白的顺利表达。本发明实施例中选定的60个核苷酸S1的序列如SEQ1，其对应的氨基酸序列如ASEQ1所示。为了更利于目的基因的可溶性表达，将选定的ASEQ1的第4个氨基酸C人为改变成D，改变后的氨基酸序列如ASEQ2，其对应的核苷酸序列如SEQ2所示。将C改变为D的目的是D是带负电荷的亲水性氨基酸，且其对应的密码子GAC是大肠杆菌的偏爱密码子，有利于基因的后续表达;C对应的密码子TGC是稀有密码子，不利于基因的后续表达，且C含有二硫键，影响后续表达蛋白的结构，从而影响蛋白抗原的反应性。然后在不改变氨基酸序列A2的情况下，再对其对应的核苷酸序列S2进行人为改变，这种改变是保证其对应的氨基酸序列A2不变，但其编码氨基酸的密码子尽可能不同，而且改变后的密码子尽可能地避免稀有密码子或亚稀有密码子的出现，而且为大肠杆菌所偏爱，以利于基因的后续表达。本发明的实施例中是将氨基酸序列ASEQ2对应的核苷酸序列SEQ2改变为新的核苷酸序列SEQ3、SEQ4、SEQ5。选用其编码的氨基酸自身内以及与氨基酸A2的单个氨基酸间均不形成共价键的联接核苷酸S6，以避免后续表达的抗原蛋白形成二级结构而影响抗原的反应原性，然后在保证其编码的氨基酸序列不改变，尽可能地避免稀有密码子出现以及核苷酸序列尽量不重复的原则下进行人为改变得到联接核昔酸S7和S8。在完成前述工作后将核苷酸以S2、S6、S3、S7、S4、S8和S5的顺序依次进行串联，得到序列S9，其对应的氨基酸序列为A3，在序列S9前面添加限制性内切酶位点AmnHl及保护性碱基,在后面添加限制性内切酶位点屈ol及保护性碱基，所得核苷酸序列SIO，将序列S10进行人工合成，然后将其用^画HI和屈oI进行双酶切，得到的目的基因片段与同样用S画HI和IoI进行双酶切后得到的载体pGEX-4T—l序列进行连接，然后重组载体导入大肠杆菌进行诱导表达，从表达产物分离纯化得到重组蛋白。在本发明的实施例中，核苷酸序列SEQ2、SEQ3、SEQ4、SEQ5依次分别用SEQ6、SEQ7和SEQ8进行串联，串联后得到核苷酸S9的序列为SEQ9，其对应的氨基酸序列为ASEQ3。SEQ9在大肠杆菌中表达，表达后得到的目的蛋白的氨基酸序列为ASEQ3。为了与表达载体pGEX-4T-1连接，在序列SEQ9前面添加限制性内切酶位点SamHl及保护性碱基,在后面添加限制性内切酶位点屈ol及保护性碱基，所得序列为SEQIO。将SEQ10送生物公司进行人工合成后，与克隆载体pMD18-T连接，转化进大肠杆菌JM109;挑取阳性单克隆菌株，提取质粒；用内切酶5awHI和屈oI对该质粒和表达载体pGEX-4T-l分别进行双酶切；然后分别进行琼脂糖凝胶纯化、回收酶切后的SEQ10和载体pGEX-4T-l序列。将回收的SEQ10和载体pGEX-4T-lDNA序列用T4连接酶进行连接，然后转化进表达菌株BL21(DE3)pLysS，挑取阳性单克隆菌株，以终浓度0.3mmol/L的IPTG进行诱导表达。诱导后的菌液离心，将沉淀用pH7.4PBS重悬，超声波破碎，上清中的可溶性目的蛋白过琼脂糖凝胶GST4FF柱进行纯化。纯化好的重组蛋白以偶连法致敏鞣化绵羊红细胞，所用化学交联剂为碳二亚胺(EDAC)。制备的间接血凝检测抗原，再与配套试剂组装成检测CSFV血清抗体的试剂盒。其具体的做法是1、将人工合成的SEQ10与克隆载体pMD18-T连接，转化进大肠杆菌JM109，培养阳性单克隆菌株，提取质粒，对质粒进行双酶切，琼脂糖凝胶纯化、回收酶切好的SEQ10序列。2、采用琼脂糖凝胶纯化、回收酶切好的pGEX-4T-l载体序列。3、将SEQ10与pGEX-4T-l载体序列用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化进表达菌株BL21(DE3)pLysS，筛选阳性单克隆菌株。4、将前述所得阳性单克隆菌株在LB培养基中培养至OD600值至0.6-1.0，以终浓度0.3mmol/L的IPTG进行诱导5、将诱导菌液离心，沉淀以PBS悬浮，超声波破碎完全，再离心取上清。6、所得菌液上清过琼脂糖凝胶GST4FF柱纯化重组H的蛋白。其实际操作步骤按产品生产商的说明书进行。7、纯化好的重组蛋白致敏鞣化绵羊红细胞，操作步骤包括(1)配制所需的溶液，共4种。溶液hpH5.4醋酸盐缓冲液。溶液2:含2XEDAC的pH5.4醋酸盐缓冲液。溶液3:pH7.4PBS缓冲液。溶液4:含1%甘油，lX兔血清的pH7.4PBS缓冲液。(2)鞣化好的绵羊红细胞用溶液1洗涤3遍。(3)再将红细胞用溶液2悬浮至5%，在摇床内，200r/min，37。C孵育lh。(4)再将红细胞用溶液1洗涤3遍，重悬至5%。(5)红细胞与最适比例的重组蛋白抗原混合，在摇床内，200r/min，37°。孵育lh。本发明的抗原的最佳致敏终浓度为0.05-0.1mg/ml。(6)将前步骤所得红细胞以溶液3洗涤2遍，以溶液4洗涤1遍，以溶液4重悬至终浓度1%。(7)所得(6)中的红细胞即为间接血凝检测用抗原，与配套试剂组装成试剂盒。试剂盒中包括抗原1瓶，5ml/瓶；标准阳性血清1瓶，0.5ml/瓶；标准阴性血清1瓶，0.5ml/瓶；稀释液3瓶，10ml/瓶。8、试剂盒的使用方法示例(1)在血凝板1-7排的1-12孑L，第8排的1-6孔各加稀释液25pl。(2)在血凝板1-12列的第1孔各加1份待检血清25pl，用排枪依次往下作倍比稀释，直至第6排。待检血清的稀释倍数依次为1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64。(3)在血凝板的第7排第1孔加25)il标准阳性血清，依次作倍比稀释，直至第12孔。(4)在血凝板的第8排第1孔加25pl标准阴性血清，作倍比稀释至第3孑L，第4-6孔为空白对照。(6)血凝板置于微量振荡器上振荡1-2分钟，充分混匀，室温或37"静置1.5-2小时。(7)结果判定红细胞全部凝集(++++);75%红细胞凝集(+++);50%红细胞凝集(++);25%红细胞凝集(+);无凝集(一)。阳性血清对照1-8孔应呈现++++++凝集；阴性血清和空白对照应呈现一。在对照孔合格的前提下，观察待检血清各孔。以呈现++凝集的最大稀释倍数作为该份血清的抗体效价。血清稀释倍数1:4出现+以下者判为阴性；血清稀释倍数1:4出现++以上者判为阳性；血清稀释倍数1:16出现++以上者判为保护效价。9、交叉反应试验用本发明中的试剂盒检测BVDV、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2型)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)的阳性血清，结果均无交叉反应，试剂盒具有极高的特异性。10、检测田间血清样品对采自规模化猪场的460份猪血清，用本发明的试剂盒、全CSFV制备的间接血凝检测试剂盒CSFV-IHA以及间接ELISA检测试剂盒CSFV-E2-正LISA分别进行检测。结果本发明中的CSFV-4A1A2-IHA试剂盒与CSFV-IHA检测试剂盒的符合率为95.4%，与CSFV-E2-正LISA检测试剂盒的符合率为97.8°%，经交叉试验，证实该试剂盒与同属于瘟病毒属的BVDV阳性血清，以及导致猪产生类属症状的PRRSV、PCV-2、PRV、PPV、JEV的阳性血清均无交叉反应，具有极高的特异性。经检测田间猪血清样品，证实本发明的试剂盒能灵敏的检测出猪血清中CSFV的抗体效价，检测结果与全病毒抗原IHA试剂盒(CSFV-IHA)的符合率为95.4%(439/460，参见表1)，与CSFV-E2-正LISA试剂盒的符合率为97.8%(450/460，参见表2)。上述试验说明本发明中的试剂盒符合率良好，可在实际生产中应用。表l本发明的试剂盒与CSFV-IHA的检测结果项<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表2本发明的抗原与CSFV-E2-iELISA的检测结果本发明的试剂盒阳性血清阴性血清总样品数阳性血清3707377CSFV-E2-iF丄ISA阴性血清38083总样品数37387460附录核苷酸和氨基酸序列表SEQ1:gttatagagtgcacagcagtgagcccaacaactctgagaacagaagtggtaaagaccttc60SEQ2:gttatcgaggacaccgcagtgagcccgacgactctgcgtacggaagtggtaaagaccttc60SEQ3:gtcattgaagatactgccgtttctccgaccacgcttcgtaccgaggtcgttaaaacgttt60SEQ4:gtaatcgaagacactgcggtgtccccgactaccttgcgtactgaggtagttaagacgttt60SEQ5:gtcatcgaagacacggcggtaagcccgactacgttgcgtactgaggtagtcaagacgttc60SEQ6:agcccaggttcc12SEQ7:tctcctggaagt12SEQ8:tcacctggctccL2SEQ9:gttatcgaggacaccgcagtgagcccgacgactctgcgtacggaagtggtaaagaccttc60agcccaggttGGgtcattgaagatactgccgtttctccgaccacgcttcgtaccgaggtc120gttaaaacgttttctcctggaagtgtaatcgaagacactgcggtgtccccgactaccttg180cgtactgaggtagttaagacgttttcacctggctccgtcatcgaagacacggcggtaagc240ccgactacgttgcgtactgaggtagtcaagacgttc276SEQ10:cgggatccgttatcgaggacaccgcagtgagcccgacgactctgcgtacggaagtggtaa60agaccttcagcccaggttccgtcattgaagatactgccgtttctccgaccacgcttcgta120ccgaggtcgttaaaacgttttctcctggaagtgtaatcgaagacactgcggtgtccccga180ctaccttgcgtactgaggtagttaagacgttttcacctggctccgtcatcgaagacacgg240cggt3agcccgactacgttgcgtactgaggtagtcaagacgttcgaattccgASEQ1:VallieGluCysThrAlaValSerProThrThrLeuArgThrGluVal151015ValLysThrPhe19ASEQ2:VallieGluAspThrAlaValSerProThrThrLeuArgThrGluVal151015ValLysThrPhe19ASEQ3:VallieGluAspThrAlaValSerProThrThrLeuArgThrGluVal12292151015ValLysThrPheSerProGlySerValI丄eGluAspTh:rA丄aValSer202530ProThrThrLeuArgThrGluValValLysThrPheSerProGlySer354045VallieGluAspThrAlaValSerPi-oThrThrLeuArgThrGluVal505560ValLysThrPheSerProGlySerVallieGluAspThrAlaValSer657075ProThrThrLeuArgThrGluValValLysThrPhe808590权利要求1、一种猪瘟抗原重组蛋白的制备方法，其特征是从猪瘟病毒(CSFV)基因的保守区中选取一段与牛病毒性腹泻—粘膜病病毒(BVDV)基因同源性低于35％、其中至少包括1个能刺激动物机体产生中和抗体的抗原位点的60个核苷酸的序列S1，其对应的氨基酸序列为A1，且所选择的核苷酸序列S1中的密码子应尽可能地不存在稀有密码子或亚稀有密码子，再将其中的第4个氨基酸改变为亲水性氨基酸，得到氨基酸A2，然后在不改变氨基酸序列的情况下对其对应的核苷酸序列S2进行改变分别得到另外3段与编码氨基酸A2的密码子不同，并尽可能地避免了稀有密码子或亚稀有密码子出现的，而且为大肠杆菌所偏爱的新的核苷酸序列S3、S4、和S5，选用其编码的氨基酸自身内以及与氨基酸A2的单个氨基酸间均不形成共价键的联接核苷酸S6，尽可能地避免稀有密码子出现以及核苷酸序列尽量不重复的原则下进行人为改变得到联接核苷酸S7和S8，将S2、S6、S3、S7、S4、S8、S5依次串联，得到序列S9，其对应的氨基酸序列为A3，在序列S9前面添加限制性内切酶位点BamHI及保护性碱基，在后面添加限制性内切酶位点XhoI及保护性碱基，所得核苷酸序列S10，将序列S10进行人工合成，然后将其用BamHI和XhoI进行双酶切，得到的目的基因片段与同样用BamHI和XhoI进行双酶切后得到的载体pGEX-4T—1序列进行连接，然后将重组载体导入大肠杆菌进行诱导表达，从表达产物分离纯化得到重组蛋白。2、根据权利要求l所述的制备方法制备的猪瘟抗原重组蛋白，其特征是A1的氨基酸序列为ASEQ1，A2的氨基酸序列为ASEQ2，A3的氨基酸序列为ASEQ3，S1的序列为SEQ1，S2的序列为SEQ2，S3的序列为SEQ3，S4的序列为SEQ4，S5的序列为SEQ5，S6的序列为SEQ6，S7的序列为SEQ7，S8的序列为SE08，S9的序列为SEQ9，S10的序列为SEQIO。3、用权利要求1所述的方法制备的猪瘟抗原重组蛋白制备间接血凝检测抗原。4、用权利要求2所述的猪瘟抗原重组蛋白制备间接血凝检测抗原。5、一种猪瘟间接血凝检测试剂盒，其特征是检测试剂盒中有(1)权利要求3所述间接血凝检测抗原；(2)标准阳性血清；(3)标准阴性血清；(4)稀释液。6、一种猪瘟间接血凝检测试剂盒，其特征是检测试剂盒中有(1)权利要求4所述间接血凝检测抗原；(2)标准阳性血清；(3)标准阴性血清；(4)稀释液。全文摘要本发明涉及一种重组蛋白制备方法及用这种蛋白制备猪瘟间接血凝检测试剂盒及方法。其蛋白制备方法是从猪瘟病毒(CSFV)基因的保守区中选取一段与牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)基因同源性低于35％对应氨基酸为A1的核苷酸序列S1，再将其中的第4个氨基酸改变为亲水性氨基酸，得到氨基酸A2，再对A2对应的核苷酸序列S2进行改变，分别得到另外3段新的核苷酸序列，用联接核苷酸顺序串联，得到序列S9，其对应的氨基酸序列为A3，经相应处理后得到核苷酸序列S10，将S10人工合成、酶切、与载体pGEX-4T-1连接，重组载体导入大肠杆菌诱导表达，从表达产物中分离纯化得到重组蛋白。文档编号C12N15/70GK101487017SQ200910004789公开日2009年7月22日申请日期2009年2月25日优先权日2009年2月25日发明者周继章,宫晓炜,曹小安,蔺国珍,邱昌庆,郑福英申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所