一种快速的利用基因重组酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法

专利名称：一种快速的利用基因重组酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法，特别涉及到 的是一种快速的利用基因重组酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法。
背景技术：
朊病毒是一类能在动物和人中引起可传染性脑病(包括疯牛病、羊搔 痒症、库鲁病、克雅氏病等)的病原体，其高度传染性和致死性对整个社 会造成了极大的危害。关于朊病毒的分子致病机理和治疗药物筛选、开发 的研究是国际上生物学、医学领域研究的前沿和热点。全世界的研究者们 正致力于寻求抗朊病毒药物筛选的细胞模型的研究，从而尽快研发出预防 和治疗朊病毒引发疾病的药物。而目前在美国和欧洲有关抗朊病毒药物的 研发领域中，主要利用动物细胞模型药物抗朊病毒的药物。但是这个筛选 系统的技术上的复杂性，只能局限在少数化合物中进行；更重要的是，由 于这个筛选系统的实验成本过于昂贵，又具有哺乳类动物内朊病毒交叉传 染的危险性，需要P3级以上的无菌实验室和大量的高级技术人员的工作才 能保证药物筛选的进行，使得大规模的在已知化合物的范畴内筛选抗朊病 毒药物缺乏实用的可能性。目前，有研究表明建立在酵母细胞上的抗朊病 毒药物筛选模型完全可以取代动物细胞模型，而且在操作的安全性上有强 大的保障。但是以野生型酵母细胞为模型，为大规模筛选抗哺乳动物朊病 毒的药物提供候选药物存在着缺陷和不足由于利用野生型酵母的颜色表 现型来判断药物的抗朊病毒效果，酵母细胞的颜色变化需要在药物处理后涂在1/2YPD的固体培养基上，置于24。C恒温培养箱中培养3天，再转入4°C 冰箱中培养7天后才能明显确定，这使得药物筛选的时间过长，不利于快 速、大量的药物筛选，并且颜色判断存在人为差异，误差较大。

发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于通过基因重组野生型酵母细胞朊病毒，固体菌落颜色为 白色。
本发明采用的技术方案是 一种快速的利用基因重组酵母细胞筛选抗 朊病毒药物的方法，步骤如下
1) [Gi^门酵母细胞的制备
在野生型酿酒酵母(&cc/z"TOw;^ey cerev/W"e)内的朊病毒[i^门的编 码基因SC/户35上，将荧光标签G^P基因插在N和M结构域中间，使基因编码 的Sup35p由NMC转变为NGMC，得到荧光标记[P5T]朊病毒的[G/^/]酵母 细胞，其菌落颜色显浅粉色；即利用分子生物学上的基因操作技术，在酵母细胞的Sf/尸35基因的编码区的123位密码子和124位密码子中插入编码 绿色荧光蛋白(GFP)的基因，得到含有荧光标签(Sup35-GFP)的酵母细 胞。
2)筛选抗朊病毒药物酵母细胞悬液 OD600-0.5;
筛选待测药物取无菌冻存管，分别加入待测药物、1/2YPD培养液以 及调试好的[GPS广]酵母细胞悬液，在24'C的条件下，振荡培养，每天定时 取前一天冻存管中的51X47-:T57酵母细胞放入新的装有1/2YPD培养液和待测 药物的无菌冻存管中，振荡培养1 5天；
检测用荧光显微镜，定量观察[Gi^/]酵母细胞。
朊病毒被治愈的细胞中荧光呈可溶状态，并分布于整个细胞，未被治 愈的细胞中荧光聚集在一起形成焦点。通过细胞中的荧光焦点，可以直观 快速的检测出待测药物对朊病毒聚集体的作用效果。
本发明的重组[Gi^/]酵母细胞和野生型酿酒酵母细胞[户57l的基本生 理特征进行定量化的评估测定相同培养条件下的[Gi^/]与野生型酵母细 胞[i^/]的对数生长期代时及菌落颜色的指标。结果见表l。
5表1 [G尸57l与[7^/]的对数生长期代时及菌落颜色
代时(generation time) *菌落颜色
24 °C30°C
220 min116 min浅粉色
216 min114 min白色
W咅养条件为1/2YPD,三次测定结果的平均值。
本发明的有益效果是利用酵母朊病毒与动物存在着严格种间屏障的
优点，采用分子生物学基因重组技术改造酵母细胞，构建了插入荧光标签 的基因重组酵母细胞。本发明能够在酵母活体细胞内实时定量观察药物对 于朊病毒的治疗作用。利用野生型酵母细胞进行药物筛选的方法，是通过
菌落颜色变化来判断药物对朊病毒的作用，需要5天的连续培养，以及10天 的颜色积累过程，时间长，误差大。而本发明由于在朊病毒[i^/]的编码基 因Sf/i^5上，插入了荧光绿色标签GFP基因，在待测药物作用过程中，利用 荧光显微镜，观察酵母活体内药物对于朊病毒的治疗作用，时间短，整个 过程仅需5 7天。本发明因具有快速以及能够在活体中实时定量的观察药物 对于朊病毒的治疗作用的优点，为在更大范围内的寻找抗朊病毒的药物奠 定了基础。


图1是实施例1中，荧光显微镜下检测盐酸胍对于朊病毒作用的照片;
图2是实施例2中，荧光显微镜下检测在增效剂盐酸胍存在时，菲啶 对于朊病毒作用的照片。
具体实施例方式
实施例l1) [GPS/]酵母细胞的制备
(1) 基因突变取野生型酿酒酵母细胞(5^cc/2aramyc"cwevW^)， 来自于美国标准菌种库(American Type Culture Collection, ATCC)，保藏编 号为208719。利用分子生物学上的基因操作技术，使用聚合酶链式反应
(PCR)，扩增酵母细胞的Sf/尸35基因，并将其连接到pJ501 (//ZS3)质粒 载体上。利用聚合酶链式反应(PCR)，扩增质粒pFA6a-GFP(S65T)-TRPl 中的GFP基因，并将其插入到质粒pJ501 (if/S3)上St/尸35基因的编码区的 123位密码子和124位密码子中间，将其基因编码的基因由A^『转 变为WGMC，即得到含有荧光标签(Sup35-GFP)的质粒pJ509。使用 Apal-Notl内切酶切割质粒pJ509中的7VGMC片断，将其连接到pJ510 质粒载体上。
(2) 基因重组因为SC/P35基因为生长必须基因，首先，将带有SC/P35 基因的pJ501(7/ZS3)质粒导入酵母细胞；其次，利用同源重组技术在染色体 上敲除Sf/尸35基因；然后，将带有NGMC基因的pJ510(i^t/2)质粒导入[/^/] 酵母细胞；最后，利用质粒上带有的不同标签基因，在选择培养基上筛选 出丢失pJ501(77/W)质粒的酵母细胞，得到重组的[GPS门酵母细胞。
(3) 重组[( 7^门酵母细胞鉴定采用①在基因水平的DNA测序、mRNA 逆转录测序，以及蛋白质水平的westem blot鉴定，酵母细胞的四分体表现 型分析的手段进行鉴定。②荧光显微镜下检测荧光标签GFP是否插入通过 荧光显微镜下镜检照片，观察到[Gi^/]重组酵母细胞在镜下呈绿色荧光， 此绿色荧光定位于酵母细胞的细胞质中，证明荧光标签GFP己经插入到 Sup35p上。(4)保藏[G/^门酵母细胞:使用酵母菌的常规保藏方法，保藏得到[G尸S/] 酵母细胞。
2)模拟筛选抗朊病毒药物盐酸胍
酵母细胞单菌落放入装有1/2YPD液体培养基的三角瓶中，30。C振荡过夜培 养。酵母细胞初始OD值的调试取培养的[G尸S/]酵母细胞悬液放 入比色杯中，使用紫外分光光度计，用1/2YPD液体培养基调零，UV设置 在600nm，测量酵母细胞悬液的OD值，加入酵母细胞悬液或1/2YPD液体 培养基来调节OD值至0.5。
筛选待测药物取3支无菌冻存管，分别加入1/2YPD培养液900^1、 897|il、 895pl;上述调试好的[Gi^/]酵母细胞悬液各100pl以及lmM的盐 酸胍Opl、 3)^1、 5^1，使其终浓度分别为OmM、 3mM、 5mM。在24'C的条 件下，振荡培养5天。每天定时稀释酵母细胞培养液，即取前一天冻存管 中的[GPS/]酵母细胞100^1l放入新的装有和上述同样含量的1/2YPD培养液 和盐酸胍的无菌冻存管中。
检测-
表现型检测方法从第一天起，隔天提取前一天的冻存管中的[G尸S/"] 酵母细胞悬液适量，稀释后，取10(Hil稀释液在l/2YPD固体培养基的培养 皿上涂布；将涂好[GPS/]酵母细胞悬液的培养皿置于24"恒温培养箱中培 养3天，再转入4"C冰箱中培养7天，观察[Gi^/]酵母细胞的颜色。菌落 为红色表示该待测药物具有抗朊病毒的作用，菌落仍为粉色表示该待测药物对于朊病毒无作用。计算该待测药物对朊病毒[i^广]的治愈率愈率=变 红的菌落数/总的菌落数xl00%。结果见表2。
荧光显微镜镜检法从待测药物液体培养的第一天起，在待测药物作 用过程中利用荧光显微镜在[G^S/]酵母细胞活体内实时定量观察药物对于 朊病毒的治疗作用。具体方法是在无菌操作条件下，取上步无菌冻存管
中培养的[G^S/]酵母细胞悬液，稀释后，取100(il稀释液在YPAD固体培 养基的培养皿上涂布；将涂好[G7^/]酵母细胞悬液的培养皿置于3(TC恒温 培养箱中培养2天。两天后在无菌载玻片上滴一滴无菌水，用接种环取 YPAD固体培养基上的酵母细胞，溶于无菌水中，并使之均匀分散。然后盖 以盖玻片，封片。在荧光显微镜下观察，并照相。如图1所示。
比较实验直接用野生型酵母细胞做加入不同浓度的盐酸胍对朊病毒 作用效果的实验，酵母细胞的活化和酵母细胞初始OD值的调试及筛选待测 药物液体的配制与上述使用突变型[G尸S/]酵母细胞的方法相同。检测方法 为表现型检测方法，结果见表2。
表2.不同浓度盐酸胍对[GPS/]和[PS/]朊病毒的治愈率申
治愈率生长ld3d5d条件
0mM GuHCl0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%
3mM GuHCl1.70%1.97%17.21%16.90%49.23%47.20%
5mM GuHCl3.38%3.80%65.05%64.67%97.53%96.83%
*数值均为三次测定结果的平均值。
根据表2结果可以看出，采用菌落颜色变化的判断方法，重组型酵母 细胞[G/^广]和野生型酵母细胞[户S/]，在抗朊病毒药物筛选工作中的准确性 和灵敏度基本一致。根据图1所示可以看出，通过3天的药物作用，[G尸S/]酵母细胞内的 荧光焦点已经出现解聚的效果，当药物作用第5天时，在荧光显微镜下观 察到细胞内的朊病毒基本被治愈。图中所看到的Sup35p-GFP状态与表2中 所得的实验数据结果基本相吻合。使用荧光显微镜镜检法，在每批连续培 养后2天就可以观察到聚集的荧光焦点解聚的效果，而利用野生型酵母细 胞[i^/]进行药物筛选的方法，每一批培养的酵母细胞则需要10天的颜色 积累过程，这样消耗掉大量的药物筛选时间。利用重组型酵母细胞[GP5"/] 解决了野生型酵母细胞[i^/]在药物筛选系统中筛选速度慢，无法在活体细 胞内实时定量观察药物对于朊病毒的治疗作用的缺陷。 实施例2
1) 取实施例1制得的[G/^/]酵母细胞。
2) 模拟筛选抗朊病毒药物菲啶(phenanthridine， phe):酵母细胞的活化同实施例l。 [Gi^/]酵母细胞初始OD值的调试同实施例l
筛选待测药物在该体系中，使用0.5mM盐酸胍作为药物筛选的增效剂。
取7支无菌冻存管，4支分别加入含有0.5mM盐酸胍的l/2YPD培养液 900fxl、 898.75^1、 897.5jil、895)il;上述调试好的[G尸5"/]酵母细胞悬液各100(il; 以及40mM菲啶0)J、 1.25^1、 2.5^1、 5ji1，使每只冻存管中的药物浓度分别 为0.5mM盐酸胍+0mM菲啶、0.5mM盐酸胍+0.05mM菲啶、0.5mM盐酸胍 +0.11^菲啶以及0.5111]^盐酸胍+0.2111]^菲啶。l支加入l/2YPD培养液895nl、 上述调试好的[Gi^/]酵母细胞悬液10(^1、 40mM菲啶5(il使得冻存管中药物浓度为0.2mM菲啶+OmM盐酸胍。2支分别加入l/2YPD培养液900fxl、 895|al; 上述调试好的[G尸S/]酵母细胞悬液各100^il;以及lmM的盐酸胍Opl、 5pl， 使其终浓度分别为OmM (用作阴性对照)、5mM (用作阳性对照)。在24"C 的条件下，振荡培养5天。每天定时稀释酵母细胞培养液，即取前一天冻存 管中的[Gi^/]酵母细胞100)il放入新的装有和上述同样含量的盐酸胍的 1/2YPD培养液、菲啶的无菌冻存管中。
检测表现型检测方法从第一天起，隔天提取前一天的冻存管中的 [GP5"门酵母细胞悬液适量，稀释后，取100pl稀释液在1/2YPD固体培养基 的培养皿上涂布；将涂好[C^57l酵母细胞悬液的培养皿置于24'C恒温培养 箱中培养3天，再转入4"C冰箱中培养7天，观察[G7^广]酵母细胞的颜色。 菌落为红色表示该待测药物具有抗朊病毒的作用，菌落仍为粉色表示该待 测药物对于朊病毒无作用。计算该待测药物对朊病毒[i^广]的治愈率愈率 =变红的菌落数/总的菌落数xl00%。结果见表3。
荧光显微镜镜检法从待测药物液体培养的第一天起，在待测药物作 用过程中利用荧光显微镜在[G/^/]酵母细胞活体内实时定量观察药物对于
朊病毒的治疗作用。具体方法是在无菌操作条件下，取上步无菌冻存管
中培养的[G/^/]酵母细胞悬液，稀释后，取lOO)il稀释液在YPAD固体培 养基的培养皿上涂布；将涂好[G尸5T]酵母细胞悬液的培养皿置于3(TC恒温 培养箱中培养2天。两天后在无菌载玻片上滴一滴无菌水，用接种环取 YPAD固体培养基上的酵母细胞，溶于无菌水中，并使之均匀分散。然后盖 以盖玻片，封片。在荧光显微镜下观察，并照相。检测结果如图2所示。 比较实验直接用野生型酵母细胞做加入不同浓度的盐酸胍对朊病毒作用效果的实验，酵母细胞的活化和酵母细胞初始OD值的调试及筛选待测 药物液体的配制与上述使用突变型[Gi^/]酵母细胞的方法相同。检测方法 为表现型检测方法，结果见表3。
表3不同浓度菲啶对重组酵母细胞[6尸5/1朊病毒的治愈率*
生长条件治愈率ld3d5d
OmMGuHCl0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%
0.2mMphe+0mMGuHCl0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%
0mMphe+0.5mMGuHCl0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%0.00%
0.05mMphe+0.5mMGuHCl0.56%0.00%19.07%17.78%62.87%59.49%
0.1mMphe+0,5mMGuHCl0.96%0.80%34.95%32,54%98.65%96.13%
0.2mMphe+0.5mMGuHCl0.80%0.67%36.19%35,61%98.32%97.20%
5mMGuHCl4.80%3.90%67.10%65.07%97.60%96.71%
*数据均为三次测定结果的平均值。
根据表3结果可以看出，采用菌落颜色变化的判断方法，重组型酵母 细胞[GPS/]和野生型酵母细胞[i^/]，在抗朊病毒药物筛选工作中的准确性 和灵敏度基本一致。
根据图2所示可以看出，通过3天的药物作用，[G尸5T]酵母细胞内的荧 光焦点已经出现解聚的效果，当药物作用第5天时，在荧光显微镜下观察到 细胞内的朊病毒基本被治愈。图中所看到的Sup35p-GFP状态与表2中所得的 实验数据结果基本相吻合。 实施例3
1) 取实施例1制得的[GPS/]酵母细胞。
2) 筛选待测药物[Gi^/]酵母细胞的活化同实施例l。 [Gi^门酵母细胞初始OD值的调试同实施例l
筛选待测药物取若干支无菌冻存管，按照实施例l的模式，在总体积 为lml的混合体系中分别加入一定浓度的待测药物、l/2YPD培养液以及占总 体积10%的上述调试好的[67^/]酵母细胞悬液；另取2支无菌冻存管按照实 施例2分别加入1/2YPD培养液、上述调试好的[Gi^/]酵母细胞悬液以及盐 酸胍0mM (用作阴性对照)、5mM (用作阳性对照)。在24。C的条件下，振 荡培养5天。每天定时稀释酵母细胞培养液，即取前一天冻存管中的[G尸S/] 酵母细胞100^il放入新的装有和上述同样含量的l/2YPD培养液、待测药品的 无菌冻存管中。
检测荧光显微镜镜检法从液体培养的第一天起，在待测药物作用 过程中利用荧光显微镜在[Gi^/]酵母细胞活体内实时定量观察药物对于朊
病毒的治疗作用。具体方法是在无菌操作条件下，取培养的酵母细胞悬
液，稀释后，取lOOpl稀释液在YPAD固体培养基的培养皿上涂布；将涂好 [G尸S/]酵母细胞悬液的培养皿置于3(TC恒温培养箱中培养2天。两天后在无 菌载玻片上滴一滴无菌水，用接种环取YPAD固体培养基上的酵母细胞，溶 于无菌水中，并使之均匀分散。然后盖以盖玻片，封片。在荧光显微镜下 观察，并照相。 实施例4
1) 取实施例1制得的[Gi^/]酵母细胞。
2) 筛选待测药物酵母细胞的活化同实施例l。[G/^/]酵母细胞初始OD值的调试同实施例l
筛选待测药物在该体系中，使用0.5mM盐酸胍作为药物筛选的增效剂。
取若干支无菌冻存管，按照实施例2的模式，在总体积为lml的混合体 系中加入一定浓度的待测药物、含有0.5mM盐酸胍的l/2YPD培养液以及占 总体积10。/。的上述调试好的[G7^/]酵母细胞悬液；另取2支无菌冻存管按照 实施例2分别加入1/2YPD培养液、上述调试好的[G7^/]酵母细胞悬液以及 盐酸胍0mM (用作阴性对照)、5mM (用作阳性对照)。在24"C的条件下， 振荡培养5天。每天定时稀释酵母细胞培养液，即取前一天冻存管中的[Gi^/] 酵母细胞100iil放入新的装有和上述同样含量的含盐酸胍的l/2YPD培养液、 待测药物的无菌冻存管中。
检测荧光显微镜镜检法从液体培养的第一天起，在待测药物作用 过程中利用荧光显微镜在[G尸S/]酵母细胞活体内实时定量观察药物对于朊 病毒的治疗作用。具体方法是在无菌操作条件下，取培养的酵母细胞悬 液，稀释后，取10(Hil稀释液在YPAD固体培养基的培养皿上涂布；将涂 好[G/^/]酵母细胞悬液的培养皿置于3(TC恒温培养箱中培养2天。两天后 在无菌载玻片上滴一滴无菌水，用接种环取YPAD固体培养基上的酵母细 胞，溶于无菌水中，并使之均匀分散。然后盖以盖玻片，封片。在荧光显 微镜下观察，并照相。
1权利要求
1、一种快速的利用基因重组酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法，其特征在于步骤如下1)[GPS1+]酵母细胞的制备在野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)内的朊病毒[PS1+]的编码基因SUP35上，将荧光标签GFP基因插在N和M结构域中间，使基因编码的Sup35p由NMC转变为NGMC，得到荧光标记[PS1+]朊病毒的[GPS1+]酵母细胞，其菌落颜色为浅粉色；2)筛选抗朊病毒药物[GPS1+]酵母细胞的活化取[GPS1+]酵母细胞接入1/2YPD培养液中，30℃振荡过夜培养；[GPS1+]酵母细胞初始OD值的调试调制[GPS1+]酵母细胞悬液OD600＝0.5；筛选待测药物取无菌冻存管，分别加入待测药物、1/2YPD培养液以及调试好的[GPS1+]酵母细胞悬液，在24℃的条件下，振荡培养，每天定时取前一天冻存管中的[GPS1+]酵母细胞放入新的装有1/2YPD培养液和待测药物的无菌冻存管中，振荡培养1～5天；检测用荧光显微镜，观察药物作用的[GPS1+]酵母细胞中朊病毒的状态。
全文摘要
本发明公开了一种快速的利用基因突变酵母细胞筛选抗朊病毒药物的方法。采用的技术方案是在野生型酿酒酵母的朊病毒PSI⁺的编码基因SUP35上，插入荧光标签GFP基因，得到荧光标记[PSI⁺]朊病毒的[GPSI⁺]酵母细胞；然后经[GPSI⁺]酵母细胞的活化、[GPSI⁺]酵母细胞初始OD值的调试、筛选待测药物后，用荧光显微镜实时观察待测药物对[GPSI⁺]酵母细胞中朊病毒的作用效果。本发明具有快速以及能够在活体中实时定量的观察药物对于朊病毒的治疗作用的优点，为在更大范围内的寻找抗朊病毒的药物奠定了基础。
文档编号C12Q1/18GK101481728SQ200910010218
公开日2009年7月15日 申请日期2009年1月21日 优先权日2009年1月21日
发明者尧 宋, 宋有涛, 辉 李 申请人:辽宁大学