专利名称：在动物血液中生产人的血清白蛋白的制作方法
技术领域：
本申请书申请的专利内容属于生物工程的范畴，涉及重组DNA技术，制作转基因 动物和蛋白质纯化技术。概括的讲，专利的技术过程包括以下主要步骤从人体组织分离信 使RNA(mRNA)，通过RT/PCR技术获得人血清白蛋白基因；把人血清白蛋白基因组装到血液 组织特异性表达载体上，构建成表达结构；提取和纯化表达结构的DNA，并把它转移到动物 的受精卵(单细胞胚胎)中，使其发育成转基因动物；把转基因动物繁殖成群体，并从它们 的血液中纯化出人的血清白蛋白。
背景技术：
血清白蛋白是一种重要的医用蛋白质，用量很大，长期处于供不应求的状态。据文 献报导，全世界每年需要人血清白蛋白四百多吨，我国每年的需求量也在一百吨以上。因 此，人的血清白蛋白是一种市场非常稳定的大商品，我国人源性血清白蛋白的年产值高达 数百亿元。目前，血清白蛋白必须从人血中提取，尚无其它替代原料可以生产同类产品。从 人血中提取血清白蛋白存在很多问题，主要是血源紧缺和产品容易被污染。随着经济的发 展和人民收入的提高，那些依靠有偿献血来增加收入的人越来越少，血液来源受限制的情 况会越来越严重，血清白蛋白的供应将会越来越紧张，价格也会节节升高，急需开辟替代来 源。此外，从数量很大的人群中取得血液原料，从中提取血清白蛋白，时时存在着产品被病 原体污染的严重隐患。人群中带有危险传染病原体(如肝炎和艾滋病病毒)的个体不在 少数，一旦有一个人未被检查出来，大批产品就可能被污染，污染的产品可能在未察觉的情 形下注射给患者，造成更大的污染。我国曾经有过血库被污染的例子，人血液产品被污染的 危险始终存在。基因是遗传信息的载体，在自然界，遗传信息是统一的，无论一个基因来自何种生 物，它所载有的遗传信息都可以被其它生物识别，只有极少的例外。遗传信息的统一性是生 物工程的基础，使得人类可以把基因在不同物种间转移，用植物或动物来生产人的蛋白质。 本专利技术的科学依据就是，在猪的血红蛋白BETA亚基基因调控元件的控制下，编码人血 清白蛋白的基因序列可以忠实地指导猪的细胞合成人的血清白蛋白，合成的产品与从人血 液中提取的产品无异。转基因动物是一种非常有用的技术，它在四个方面有重要应用前景。首先，它是研 究基因结构与功能的重要手段，对分子生物学和基因工程技术的发展起着决定性作用。由 于世界各国都在推进基因组计划，主要动植物和微生物的基因组序列将在不久的将来被破 译。但是，知道基因组的结构只是万里长征的第一步，因为要确定每个基因在体内的功能和 基因之间的互作将更加困难，全部搞清需要很长时间。转基因动物是研究人类基因功能的 最好手段之一，借助在动物体增加或删除基因，人类基因的功能就可以逐步被搞清楚。转基 因动物的第二个用途，是可以作为研究疾病或筛选新型药物的模型，通过在动物上模拟人 类的某些疾病，既可以用来探查疾病的起因，也可以筛选治疗此种疾病的有效药物。第三， 转基因动物可以用来生产医用或其它高价值蛋白质。动物体合成蛋白质的能力十分强大，因为动物的细胞是组合在一起形成组织和器官的，从生物工程的角度来衡量，动物器官的 工作能力超乎想象。动物血液系统也是一个高水平合成蛋白质的场所，就其总体生产能力而言，仅次 于动物乳腺组织。但是，血液生物反应器有几个突出的优点，对于生产某些产品而言，它比 乳腺生物反应器更有优势。它的突出优点是第一，外源蛋白质产量高。血液本身的蛋白质 含量很高，每公斤血液约含血红蛋白120-160克，含血清白蛋白和其它血浆蛋白70-90克， 总蛋白含量高达200-250克/公斤。相比之下，牛乳汁中总蛋白的含量约35克/公斤。因 此，如果通过转基因技术使动物血液蛋白的10% 外源蛋白取代(假设10%的取代不影响 动物正常生理机能)，血液中可期望生产的目标产品是每公斤20-25克，而乳汁中可期望的 产量只有3.5克。第二，血液表达体系最为成熟。由于目前技术水平的限制，制作转基因动 物的成功率只有1_2%。也就是说，经过转基因处理的胚胎发育成的动物后代，每100只中 只有一两只是真正的转基因动物，其它都不能利用。造成这种后果的原因很多，其中最影响 最终结果的是外源基因的插入方式和插入位点。半个世纪的数据统计显示，经过转基因处 理的胚胎发育成的后代，约有50%不整合外源基因，即使在含有外源基因序列的个体中，大 部分不表达外源基因或者表达量很低，没有任何使用价值。因此，表达系统是否成熟，决定 转基因动物项目的成败和所付出的代价。血液表达系统是研究得最清楚的动物转基因技术 体系，含有血液组织特异性基因表达元件的外源基因，插入到动物基因组织后都能表达，而 且都能高效率地表达，不受整合位点的影响。这使得制作血液生物反应器成功的机率比其 它类型的动物生物反应器(如，乳腺生物反应器)高出很多倍，可以大大节约制作转基因动 物的费用，无形中节约了很多成本，降低了项目的风险。第三，从血液中纯化产品的成本低。 红血球中蛋白质含量很高，种类单纯，主要是血红蛋白，其它混杂的蛋白质种类和含量都很 少，为目标产品的纯化提供了很有利的条件。如果把目标产品表达在红血球中，纯化时只需 通过离心机把血球与血清分离，用低渗透压的溶液使红血球破裂，通过加热处理和高速离 心分离，就能去除血红蛋白，收获高浓度的目标产品。假若目标产品是疫苗或用于动物的功 能蛋白质，则产品不需要进一步提纯，可以直接配置商品；如果产品是医用蛋白质，对纯度 要求很高，可以通过多种层析技术使产品的纯度达到99. 9%，满足给人注射的要求。相反， 如果用动物乳腺或其它系统表达目标产品，就需要购置很复杂的纯化设备，纯化工序所花 费的成本将占到总成本的80%。由于动物血液反应器有上述许多优点，对于用量只有几百 公斤的产品，用它来生产更加合算。在动物转基因的历史上，猪是首先被用来进行转基因试验的家畜，也是取得成功 次数最多的大家畜。猪的繁殖力强，每次发情排出的卵子20-30个，每一胎生产的仔畜8-12 头，是容易制作转基因个体的畜种，可以采用多种方式来制作转基因猪。但是，究竟采用哪 一种方法制作转基因猪更为便捷，完全取决于具体条件，特别是技术条件。就研制动物血液 生物反应器而言，因为我们掌握血液组织特异性基因表达载体，所生产的转基因后代大部 分能高效表达外源基因，用下述两种方法都可以达到预期目的。第一种方法是采用传统的 直接注射DNA的方法。具体操作办法是注射激素诱导小母猪大量生产卵子，自然受精后把 受精卵冲出来注射基因，然后再把经过DNA注射而存活下来的受精卵移植回去。使用这种 方法，20只小母猪可以冲出400-500枚受精卵，注射和移植之后能生出40-60只小猪，除发 育过程中损失外，能够保留下30-50只转基因猪，足够用于培育转基因猪品系。第二种方法是通过体外受精生产转基因猪。具体过程是从屠宰场收集卵巢，吸取未成熟的卵子，在实验 室培养成熟之后进行体外受精，生产试管胚胎。在培养体外受精胚胎的过程中，注射外源基 因并筛选转基因胚胎，进行冷冻保存。然后，选择自然发情的母猪，进行胚胎移植，生产转基 因猪。因为胚胎是经过事先筛选的，凡是能发育到出生的小猪，都应当是转基因猪。因此， 使用10头受体母猪就可以生产足够的转基因猪。应用这种方法，可以把部分现场的工作转 移到实验室慢慢做，需要的人力资源少，但对技术水平要求较高。
发明内容
1.血液组织特异性基因表达载体结构血液组织特异性基因表达载体由三个功能性元件组成，如图1所示，在一 个大肠杆菌载体上，从5’端开始，依次插入人血红蛋白beta亚基基因的基因座控制序列 (LCR)，人血红蛋白BETA亚基基因的近端启动子(promoter)，多克隆位点(MCS)和人血红蛋 白BETA亚基基因3’端非翻译序列(3’UTR)。这一组生物原件形成一个控制基因编码序列 表达的单元，保证插入多克隆位点的外源基因在动物造血系统充分表达。功能LCR是真核生物特有的基因调控元件，它的主要功能是开放某一段染色体， 使处于该段染色体上的基因座活化，以致各种转录因子能接近要表达的基因，启动基因的 转录；近端启动子含有TATA盒和核糖体结合位点(kozak序列)，前者是RNA多聚酶转录基 因的起始部位，后者是多核糖体结合位点，是核糖体依照信使RNA所携带的遗传信息合成 蛋白质必须的；多克隆位点含有多个可以被不同DNA内切酶切割的序列，为把不同基因插 入到启动子下游提供了方便；3’段UTR有增强子功的功能，它不但保证插入的外源基因高 效表达，而且保证表达事件只在造血系统发生，不会在其它组织和器官中发生。2.转基因胚胎筛选技术制作转基因动物是费力和费钱的工作，造成这种结果的原因之一，是经过注射DNA 的受精卵中，只有50%能整合外源基因，其余胚胎不能整合外源基因。为解决这个问题，本 专利申请一种载体，其结构特点是在血液组织特异性表达人血清白蛋白的载体上，增加了 一个标记基因表达盒。这个表达盒可以在胚胎阶段表达绿色荧光蛋白基因，使胚胎呈现绿 色。使用这种载体制作转基因动物时，阳性胚胎因表达标记基因而呈现颜色，很便利我们直 观地去区分转基因胚胎与非转基因胚胎。因为标记基因表达盒的两端含有一对loxP序列， 有自我重组的特性，在完成转基因胚胎的筛选工作之后，只要在培养基中加入Cre酶，继续 培养胚胎，在酶的作用下，两个loxP序列将会高频率地发生重组，只留下一个loxP序列，从 而将处在它们之间的标记基因序列全部删除。因此，利用这种载体可以示踪目标基因整合 和表达，当通过体外受精技术或克隆动物的技术生产转基因动物时，可以事先筛选转基因 胚胎，避免给受体动物移植那些并未整合目标基因的非转基因胚胎，做到有效缩减试验规 模，节省经费和人力。标记基因的结构和工作模式见附图2所示，图中显示，在培养基中增 加Cre酶可以使90%以上标记基因被删除。蛋白质标签人血清白蛋白的注射剂量很大，对纯度有很高的要求，提纯人血清白蛋白需要很 昂贵的设备。目前，人血清白蛋白主要是从人血中提取，纯度要求不特别高，对纯化没有过 高的要求，人们对提纯方面的困难尚无深切的感觉。为提高纯化效率，特别在人血清白蛋白
5基因编码序列的尾端增加了专门用于提纯的标记(tag)。与这种纯化标记相适应，市场上现有与这种标记高度亲和的纯化介质，可以通过亲和层析的方法提高纯化效率和增加产出。 在纯化工艺完成后，蛋白质标记可以切除，恢复和保留血清白蛋白的天然结构。纯化标签的 结构和工作模式见附图3所示。创新性(1)开发出能消除基因整合“位置效应”和红细胞组织特异性表达载体，克服了转 基因动物制作中的重大技术瓶颈。猪属于真核生物，真核生物的基因包裹在染色体内，DNA 被蛋白质屏蔽，不像细菌那样，只要将基因转入，它就可以整合和实现表达。要想使转入真 核生物体内的外源基因整合并实现表达，首先要让它处在一个活动的基因座上。在活动的 基因座上，染色体是开放的，各种表达因子可以接近基因并驱动它表达；不活动的基因座是 封闭的，表达因子接触不到DNA，基因是不会表达的。由于这个缘故，随机插入染色体的外源 基因，有的表达，有的不表达，主要取决于它的插入位置，这就是所谓的“位置效应”。本专利 的创新之一，就是找到了一个可以作为LCR使用的基因片段，只要有它的存在，染色体就是 开放的。因此，本专利的载体消除了转基因动物基因插入的“位置效应”问题，使用这个载 体制作转基因动物时，无论外源基因插入哪个位置，所处的位置都可以被活化，外源基因都 可以表达。(2)真核生物的基因表达呈现组织特异性，一种组织只表达一组基因，不表达其它 基因。本专利的创新之二，是找到了一段能控制外源基因只在红血球中表达的DNA，并将它 应用在商业载体上。使用本专利描述的载体，任何基因都只能在红血球中表达，不在任何其 它组织和器官中表达。这项创新不仅避免了外源基因无控制的表达危害动物健康，而且为 产品纯化提供了便利。在载体中增加可以去除的标记基因，可以做到只移植转基因胚胎，不 一移植那些虽然经过转基因处理但未能整合外源基因的胚胎，可以有效地减少受体母畜的 数目，大幅度节约运行成本。这是本专利的创新之三。人血清白蛋白的尾部增加可去除的 标记，能提高蛋白质纯化的效率，保证获得的产品具备很高的纯度。若没有此项技术，为了 能够满足市场对血清白蛋白纯度的要求，将不得不大幅度增加纯化人血清白蛋白的设备投 资。
图1是血液组织特异性表达人血清白蛋白基因载体结构图。图2是利用标记基因筛选转基因胚胎示意图。图3是人血清白蛋白cDNA基因序列。
具体实施例方式本专利是一项利用转基因动物生产高价值蛋白质的生物工程工艺技术，
发明内容
既包括生物元件，也包括使用这些生物元件生产出合格的重组人血清白蛋白的技术，还可 以使用相似的程序把血清白蛋白基因换成其它基因序列，生产相应的其它蛋白质产品。因 此，成功实施这项专利技术首先需要取得构成本专利技术的生物元件；其次，要求能熟练掌 握实施本专利所需要的各类技术的人员；第三，要求具备相应的实验设备和条件。事实上， 能够实施本专利的人很缺乏，集中一个团队来实施本专利并非很容易的事。最可靠的实施方式是由专利发明人组织专利的实施。
具体实施方式
概述如下
1.载体DNA的制备载体DNA的制备可以参考萨姆布鲁克等人所著《分子克隆试验指南》中所载方法 进行。其概要包括将含有本专利载体的菌种接种在一升含氨卞青霉素的LB培养基中，在 摄氏370C下培养至对数生长晚期。离心收集细菌体，用SDS碱裂解法大量制备质粒DNA。 通过琼脂糖电泳或分光光度计测定粗制DNA的量，于每一克质粒DNA溶液中加入固体氯化 絶(CsCl) 1. 01克，每5克DNA溶液中加入100微升10mg/ml的溴化乙锭溶液，混合均勻。在 一个适当离心管中进行低速离心(3000-5000转、分)，清楚杂质，然后，把上清液转移到适 当的离心管中，在高速离心机上进行密度梯度离心(转速45000-60000/分)。离心结束后， 在紫外光下用注射器和针头把显示质粒DNA位置的条带吸出来，用异戊醇抽提两次去掉溴 化乙锭，在冷酒精内将DNA沉淀，再溶解在TE缓冲液中。取适量经纯化的载体DNA，用核酸 内切酶Hindlll和Notl将DNA切断，电泳分离较大的片段，稀释为适当浓度的DNA溶液，就 完成了用于显微注射或其它转移方法永的DNA样品的制备。2.用显微注射DNA的方法生产转基因猪(1)供体母猪的准备选取6月龄的后备小母猪30-40头，在其发情周期的第15 天，按体重一次性肌肉注射PMSG 20单位/公斤，72小时后，每头再肌肉注射hCG 500单位。 当母猪有发情表现时，用公猪进行自然配种，并于注射hCG 72小时后用手术的方法冲卵。(2)受精卵采集耳静脉注射水合氯醛或巴比妥钠，进行全身麻醉，仰卧保定。在 腹中线上倒数第二个乳头处切开一个8-10厘米的切口，将一侧卵巢和输卵管拉出，清点排 卵窝，从输卵管伞部插入一根冲卵管，深2厘米，用手固定。用注射器在子宫角与输卵管的 结合部注射20毫升PBS+20% BSA溶液，将受精卵冲入平皿，在显微镜下清点受精卵数，将单
细胞受精卵移到培养皿中。然后，用同样的方法将另一側输卵管中的受精卵冲出，移入培养 皿。(3)显微注射DNA 用PBS+20 % BSA溶液在培养皿内做成培养胚胎的小滴(体积 25微升)，小滴上覆盖石腊油。将检出的单细胞受精卵每组10个移入小离心管，在12000转 /分下离心5分中，然后，移入培养小滴，立即进行显微注射。注射时先在400倍的视野下， 通过一侧的显微操作手用固定管一个受精卵固定，再用另一侧的显微操作手持注射针刺入 雄原核，扭动螺旋注射器将DNA溶液注入雄原核，直到细胞核稍微膨胀为止。照此方法，一 组一组地完成全部受精卵的注射，并在PBS+20% BSA溶液中进行短期培养(1-2小时)。(4)胚胎移植接受胚胎移植的受体母猪，以经产的自然发情母猪最佳。如果使用 经产母猪作受体，需在大群繁殖母猪中挑选与供体母猪发情周期相近的个体，这种母猪不 需要任何处理，可以直接用作受体。如果找不到足够的经产母猪，可以诱导适龄的后备母 猪同期发情，然后当作受体使用。诱导后备母猪同期发情的处理方法，与诱导排卵的方法相 同。胚胎移植的程序与采卵基本相同，需先将母猪麻醉，在腹部中线作一个切口，分别拉出 两侧的输卵管，用移卵管从伞部插入输卵管，或用注射针从中间部位刺入输卵管，然后在每 侧输卵管中注入15个经过DNA注射的受精卵。最后，将输卵管复位，缝合腹腔。3.用体外受精的方法生产转基因猪(1)卵子的采集从屠宰场收集废弃的卵巢，放在盛有生理盐水的保温瓶中，在2 小时内运到实验室。用18号针头刺入突出在卵巢表面的滤泡，抽取卵子/颗粒细胞复合体，集中在含PBS+10%羔羊血清的溶液中。在体视显微镜下，选择卵子质地正常和外面包裹多 层颗粒细胞的卵子/颗粒细胞复合体，移入培养小液滴，在二氧化碳培养箱中培养过夜。(2)体外受精用微量移液枪反复吹打过夜培养的卵子，除去颗粒细胞，将透明带 完整的卵子50个一组移入含有受精液的培养小滴。将经过离心洗涤和悬浮上游的精子溶 液分别注入受精小滴，放在二氧化碳培养箱中培养过夜。(3) DNA注射在一架带 有微分干涉镜头的倒置显微镜下，将能够观察到两个原核 的受精卵检出，用于显微注射DNA。注射方法与注射从体内冲出的单细胞胚胎基本相同。注 射完成之后，将胚胎培养1-2小时，将没有裂解的胚胎继续培养。(4)胚胎培养将经过显微注射而没有裂解的胚胎，分成每组20个，移入 mKRB+10%羔羊血清的培养液小滴，在二氧化碳培养箱中培养过夜。(5)转基因胚胎的筛选如果使用的载体带有筛选标记，可在过夜培养的第二天， 当胚胎分裂到2-4细胞时，进行肉眼检测。根据胚胎是否发出荧光进行转基因胚胎的筛选。(6)胚胎移植体外受精的胚胎可以在发育到4-8细胞时，即完成阳性胚胎检测之 后，立即进行移植；也可以继续体外培养，直到形成囊胚时再进行移植。应当注意的是，4-8 细胞的胚胎应移植到输卵管，而囊胚必须移植到子宫角。4.转基因猪的分子检测(1)转基因猪基因整合的检测胚胎移植所生的小猪出生两周后，就可以进行外 源基因整合和表达检测。进行基因整合检测时，需从小猪尾部或耳部剪取一小块组织，提取 DNA做模板。这种DNA模板可用来进行特异的PCR扩增，斑点杂交和Southern杂交，借以确 定基因是否已经整合到染色体上。(2)转基因猪的表达检测血液生物反应器的最大优点是可以早期进行基因表达 的检测，因为外源基因在红血球中表达，只要产生血液就能确定基因是否表达。进行表达检 测时，需抽取少量血液样品，通过蛋白质PAGE技术找到人血清白蛋白，同时确定它与血红 蛋白的相对比例，测定每升血液中人血清白蛋白的表达量。5.转基因猪的繁殖转基因猪通过转基因操作获得的新遗传性状，即可以在红血球中提取人的血清白 蛋白，是可以遗传给其后代的的稳定生产性状。因此，可以采取以下两种策略繁殖转基因 猪第一种方法是用转基因猪与非转基因猪进行交配，从后代中挑选转基因个体，用于商业 生产；第二种方法是使用半同胞交配的方法固定转基因，培育成专门的转基因品系。两种方 法各有优点和缺点，对于生产重要产品的转基因猪理论上应当培育成品系，但有时出于对 猪只健康的考虑，保持杂合状态也许更好。6.从猪血液中人血清白蛋白由于人血清白蛋白基因是经过重组的基因序列，它的尾巴上多了六个氨基酸，这 些个氨基酸残基是专门用于蛋白质纯化的标签。使用市场上可买到的专用分离介质进行亲 和层析，只需一步就可以把产品提纯到99%。再辅以其它蛋白质分离技术，例如，凝胶过滤， 离子交换和膜分离，组合成一套完整的纯化工艺，可以使产品达到商业使用的要求。
权利要求
血液组织特异性基因表达载体。
2.转基因胚胎筛选技术。
全文摘要
本申请的发明内容属于生物工程的范畴，涉及重组DNA技术，制作转基因动物和蛋白质纯化技术。概括的讲，发明的技术过程包括以下主要步骤从人体组织分离信使RNA(mRNA)，通过RT/PCR技术获得人血清白蛋白基因；把人血清白蛋白基因组装到血液组织特异性表达载体上，构建成表达结构；提取和纯化表达结构的DNA，并把它转移到动物的受精卵(单细胞胚胎)中，使其发育成转基因动物；把转基因动物繁殖成群体，并从它们的血液中纯化出人的血清白蛋白。
文档编号C12N5/10GK101857876SQ20091001106
公开日2010年10月13日 申请日期2009年4月8日 优先权日2009年4月8日
发明者姜峰, 戴雁峰, 秦树江, 陈永福 申请人:秦树江;姜峰;陈永福;戴雁峰