专利名称：实时荧光pcr检测鸡源性成分的引物、探针及方法
技术领域：
本发明涉及一种实时荧光PCR检测用引物、探针以及利用该引物、探针对
鸡源性成分进行鉴别检测的方法。
背景技术：
目前，国内外应用于检测食品和饲料中所含动物成分的技术主要有三种 饲料显微镜学方法、ELISA方法及PCR特异扩增法，在实际检测中应用最多 的是PCR特异扩增法，PCR特异扩增法又有普通定性PCR、实时荧光PCR、 巢式PCR等。实时荧光PCR技术是基于普通PCR技术基础上发展而来的，在 扩增反应体系中添加一个特异性的荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，即检测耙核苷酸序列扩增状态，以进行结果判定。它的主要优点是: (1)在闭管状态下进行扩增产物检测，无需PCR产物的后处理，避免了扩增 产物污染而致的假阳性，保证了结果的可靠性；(2)探针杂交特异性更强、灵 敏度更高，在普通PCR扩增的基础上又多了一条可以与模板互补配对的荧光探 针，提高了特异性，荧光信号由仪器自动收集，进一步提高了灵敏度；(3)无 需酶切位点存在，无需进行酶切、电泳，节省了时间，PCR后无需后续处理， 操作更简单快速；(4)安全无污染，DNA测序表明该方法准确性很高。
随着市场经济的发展，肉制品的生产与消费一直保持持续发展的势态，但 是某些肉制品中却添加有鸡源性成分(食品标签中并未注明)。由于没有相应的 引物、探针，迄今为止还没有对食品中鸡源性成分的定性检测方法，以至于不 能及时发现食品中鸡源性成分的存在，严重损害了消费者的利益。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种用于检测鸡 源性成分的实时荧光PCR引物、探针及方法。 本发明的技术解决方案是
一种实时荧光PCR检测鸡源性成分的引物和探针，其特征在于所述引物 是由序列为CAAACAACCCTGCAAACAAAATTA的上游引物Pl和序列为GGGCTTGAGAATTGGTCGAA的下游引物P2组成的引物对；探针序列为 CCCCTGAACCTGACCATGAACCTAAGCTT,该探针的5'端用报告荧光染料 FAM标记，3'端用淬灭荧光染料TAMRA标记。
本发明同时涉及一种用上述的引物和探针进行实时荧光PCR检测鸡源性 成分的方法，其特征在于
a. 提取待检样品基因组DNA;
b. 以所提取的DNA作为模板，加入上述引物对和荧光染料标记的探针以 及酶反应液进行实时荧光PCR反应；
c. 设置扩增反应条件95'C20s， l个循环；95。C5s、 6(TC31s， 40个循环， 记录样品反应的Ct值；
d. 在样品检测的同时，设置空白对照、阴性对照、阳性对照，所述确定质
量控制指标是
空白对照以ddH20为模板，按照b和c所述条件，进行实时荧光PCR反
应，检测Ct值大于或等于40;
阴性对照以非鸡源性物种基因组DNA为模板，按照b和c所述条件， 进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40;
阳性对照以鸡基因组DNA为模板，按照b和c所述条件，进行实时荧 光PCR反应，检测Ct值小于或等于34;
e. 样品判定结果是
待测样品鸡源性基因检测Ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空 白对照结果正常者，判定该样品未检出鸡源性基因；
待测样品鸡源性基因检测Ct值小于或等于36，阴性对照、阳性对照和空 白对照结果正常者，判定该样品检出鸡源性基因；
待测样品鸡源性基因检测Ct值在36~40之间，重做实时荧光PCR扩增， 再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判 定该样品未检出鸡源性基因；再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照、阳 性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出鸡源性基因。
本发明设计了实时荧光PCR检测鸡源性成分的引物、探针及具体检测方 法，具有良好的灵敏性和特异性。采用实时荧光PCR特异扩增法可以定性分析 食品中是否含有鸡源性成分，发挥了实时荧光PCR检测技术的优点，进一步完善了食品检测体系，加大对消费者利益的保护力度。
图1是本发明实施例检测鸡源性成分阳性样品的荧光PCR扩增图。
具体实施方式
-
1. 所用引物和探针-
选择鸡mtDNA作为对象，设计并合成实时荧光PCR特异性扩增引物和探针。
实时荧光PCR引物和探针序列包括-
上游弓I物P1: CAAACAACCCTGCAAACAAAATTA;
下游引物P2: GGGCTTGAGAATTGGTCGAA;
探针CCCCTGAACCTGACCATGAACCTAAGCTT,该探针的5，端用报 告荧光染料FAM标记，3'端用淬灭荧光染料TAMRA标记。
2. 样品DNA的提取与纯化按以下步骤进行
a. 将含鸡源性成分的肉样品置于液氮中，用组织匀浆器将样品打成匀浆， 取100mg加入400ul TE混匀，加入裂解液(Tris.HCl 10mmol/L (PH8.0), EDTA0.1mol/L， SDS 1% (W/V))混匀，再加入浓度为25mg/ml的蛋白酶K， 55"C振荡保温lhr;
b. 加与上清液等体积的酚/氯仿/异戊醇25: 24: l混匀，静置5min;
c. 8000 rpm离心5min，取离心上清液，加等体积的氯仿/异戊醇24: l混 匀，静置5 min;
d. 8000 rpm离心5min，取离心上清液，加入40 ix 1 3mol/L醋酸钠混匀，加 入混匀后液体2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20^冰箱沉淀30分钟；
e. 12000 rpm 4。C离心5min，弃上清，加入预冷75%乙醇溶液lml洗涤沉淀， 1000rpm5min，弃上清，吹干。加纯净水溶解白色沉淀，37。C保温lhr;
3. 建立实时荧光PCR扩增反应体系
试剂名称 最终浓度 DNA聚合酶反应液 1 X
上游引物 500nM 下游引物 500nM探针 250nM DNA模板 10-lOOng
余量为ddH20 总体积为50 yL
4. 按照仪器操作要求选择相应的荧光通道，设置扩增反应条件95'C20s， 1 个循环；95°C5s、 60°C31s， 40个循环，记录样品反应的Ct值。
5. 所述确定质量控制指标是
空白对照以ddH20为模板，按照3和4所述条件，进行实时荧光PCR 反应，检测Ct值大于或等于40;
阴性对照以非鸡源性物种基因组DNA为模板，按照3和4所述条件， 进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40;
阳性对照以鸡基因组DNA为模板，按照3和4所述条件，进行实时荧 光PCR反应，检测Ct值小于或等于34;
6. 结果判定
待测样品鸡源性基因检测Ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空 白对照结果正常者，判定该样品未检出鸡源性基因；
待测样品鸡源性基因检测Ct值小于或等于36，阴性对照、阳性对照和空 白对照结果正常者，判定该样品检出鸡源性基因；
待测样品鸡源性基因检测Ct值在36 40之间，重做实时荧光PCR扩增， 再次扩增后结果Ct值大于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常， 判定该样品未检出鸡源性基因；再次扩增后结果Ct值仍小于40，且阴性对照、 阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出鸡源性基因。每个试样必须有 2个平行实验。
7. 检测结果
本发明实施例1将待检鸡肉和鸡肉加工品样品提取DNA后，进行实时荧 光PCR检测。经检测，含有鸡源性成分的鸡肉和鸡肉加工品显示如图l所示的 阳性扩增曲线；不含有鸡源性成分的样品中则无扩增信号。实施例表明本发明 的引物和探针具有良好的灵敏性和特异性。
权利要求
1.一种实时荧光PCR检测鸡源性成分的引物和探针，其特征在于所述引物是由序列为CAAACAACCCTGCAAACAAAATTA的上游引物P1和序列为GGGCTTGAGAATTGGTCGAA的下游引物P2组成的引物对；探针序列为CCCCTGAACCTGACCATGAACCTAAGCTT，该探针的5’端用报告荧光染料FAM标记，3’端用淬灭荧光染料TAMRA标记。
2. —种用权利要求1所述的引物和探针进行实时荧光PCR检测鸡源性成 分的方法，其特征在于a. 提取待检样品基因组DNA;b. 以所提取的DNA作为模板，加入权利要求1所述引物对和荧光染料标 记的探针以及酶反应液进行实时荧光PCR反应；c. 设置扩增反应条件95-C20s， l个循环；95°C5s、 60°C31s， 40个循环，记录样品反应的Ct值；d. 在样品检测的同时，设置空白对照、阴性对照、阳性对照，所述确定质量控制指标是空白对照以ddH20为模板，按照b和c所述条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40;阴性对照以非鸡源性物种基因组DNA为模板，按照b和c所述条件， 进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40;阳性对照以鸡基因组DNA为模板，按照b和c所述条件，进行实时荧 光PCR反应，检测Ct值小于或等于34;e. 样品判定结果是待测样品鸡源性基因检测Ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空 白对照结果正常者，判定该样品未检出鸡源性基因；待测样品鸡源性基因检测Ct值小于或等于36，阴性对照、阳性对照和空 白对照结果正常者，判定该样品检出鸡源性基因；待测样品鸡源性基因检测Ct值在36~40之间，重做实时荧光PCR扩增， 再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该样品未检出鸡源性基因；再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照、阳 性对照和空白对照结果正常，判定该样品检出鸡源性基因。
全文摘要
本发明公开一种实时荧光PCR检测鸡源性成分的引物和探针及方法。所述引物序列为上游引物P1CAAACAACCCTGCAAACAAAATTA，下游引物P2GGGCTTGAGAATTGGTCGAA；所述探针序列为CCCCTGAACCTGACCATGAACCTAAGCTT，该探针的5’端用报告荧光染料FAM标记，3’端用淬灭荧光染料TAMRA标记。本发明有益效果主要体现在具有良好的灵敏性和特异性，操作简单快速，检测结果准确可靠，为鸡源性成分的鉴别检测提供了一种简便、有效、准确的检测方法，进一步完善了食品检测体系，加大了对消费者利益的保护力度。
文档编号C12Q1/68GK101633953SQ20091001236
公开日2010年1月27日 申请日期2009年7月6日 优先权日2009年7月6日
发明者刘岑杰, 刘彦泓, 张建宁, 滴 杨, 王立娜, 穆红英 申请人:大连标准检测技术研究中心;大连市产品质量监督检验所