专利名称：牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测方法
技术领域：
本发明属于水产动物病原的检测与诊断技术，特别是牙鲆弹状病 毒的检测方法。
背景技术：
牙解弹状病毒(Hirame rhabdovirus，简称HRV)病毒粒子呈枪 弹形，大小为80nmX160-180nm， 1986年日本首次报道。我国黄海 、渤海近岸等地养殖的牙鲆已被发现有此病症。发病季节为冬季和早 春，鱼体发病时，水温一般都在15。C以下。本病主要危害牙鲆，人 工感染对真鲷、黑鲷有强烈的致病性，从香鱼和无备平触中也分离到 此病毒，对虹鳟也有致病作用。幼苗期和仔鱼期的鱼体易患此病。感 染牙鲆弹状病毒的病鱼体表和鳍充血或出血，腹部膨胀，内有腹水。
解剖鱼体，肌肉、肠黏膜的固有层出血，生殖腺的结缔组织充血或出 血。
中国国家质量监督检验检疫总局与韩国海洋水产部于2005年发 布的《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》中规定，我国出口到韩 国的鲈鱼、真鲷、大菱鲆、牙鲆等鱼类必须进行牙鲆弹状病毒的检验 检疫。因此，迫切需要建立快速、灵敏、准确的牙鲆弹状病毒的检测 方法，打破国外技术壁垒，为国家贸易服务。目前鱼类病毒的检测方 法主要包括细胞学诊断技术、免疫学诊断技术、分子生物学诊断技术 三大类细胞学诊断技术主要包括采用细胞培养分离病毒、组织病理 切片及电镜观察，其操作繁琐，检测周期长，且灵敏度低；免疫学诊 断技术主要包括免疫荧光检测、免疫点杂交，其方法具有特异性强、 敏感性高的优点，但方法相当繁琐，不适宜对大量样品进行检测；分 子生物学诊断技术主要包括聚合酶链式反应(PCR)，比较快速、灵敏， 目前被广泛应用于检测鱼类病毒，如传染性造血器官坏死病毒、锦鲤疱疹病毒、传染性胰脏坏死病毒、真鲷虹彩病毒等，据检索，目前尚
未见采用RT-PCR技术检测牙鲆弹状病毒的报道。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种牙鲆弹状病毒的逆
转录-聚合酶链式反应快速检测方法，利用RT-PCR快速检测牙鲆弹状 病毒，该方法灵敏度高，特异性好，准确度高，可以应用于水产养殖 业和国际鱼类贸易中对牙鲆弹状病毒进行快速检测。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是牙鲆弹状病毒的逆 转录-聚合酶链式反应快速检测方法，首先设计特异性引物，然后提 取待测样品的RNA，再进行逆转录-聚合酶链式反应，最后通过琼脂 糖凝胶电泳进行结果判定。
所述特异性引物对GF/GR，扩增的目的核酸带大小为515bp，其
序列如下
GF: 5' - GTGCCAATGGTACACGGACAA -3'
GR: 5, _ TGATCTCCGCATGTGCCTCTA -3'。
所述提取待测样品的RNA:解剖待检测的鱼类样品，取脑、肾、 脾等组织进行匀浆，釆用传统的TRIZ0L法或者商业化的RNA提取试 剂盒提取RNA，之后用核酸分析仪进行0D26。/0D，检测纯度，调整RNA 浓度为100ng /uL。
所述逆转录-聚合酶链式反应
(1)逆转录合成cDNA:取待测样品的RNA模板10uL,加入PCR 反应管中，再加入引物GF 1 pL、 GR 1 uL，水3 uL;充分混匀后 70。C温浴10min，迅速冰浴5min;再加入5 XAMV buffer (缓冲剂) 5uL， dNTPs (各10mM) 2 u L， RNase Inhibitor (核糖核酸酶抑制 齐U，浓度20 U/ ix U 1 u L, 7jC 1 ti L， AMV Reverse Transcriptase (反 转录酶，浓度5U/uL)1 uL，使反应总体积为25 pL，轻弹管壁混 匀，稍离心后42。C保温30-60min，得到cDNA产物；(2) PCR扩增取10 XPCR buffer (10mM)5yL， dNTPs (10 mM) luL， 25 mM 的MgCh3 u L，引物GF 1—2 w L、 GR 1—2 u L， cDNA 产物2 nL， Taq DNA Polymerase (聚合酶，浓度5 U/u L) 1 u L， 水34-36 yL，使反应总体积为50uL，轻弹管壁混匀，稍离心后， 进行PCR反应，反应程序为94°C，预变性5min; 94"C变性1 min、 52-58°C退火l min、 72。C延伸2 min，共35个循环，最后72°。延 伸10 min。
所述电泳检测取5 u L逆转录-聚合酶链式反应的PCR产物， 与2 u L浓度0. 25%溴酚蓝上样缓冲液混合，在含有溴化乙锭浓度 为0. 5 u g/ml的1. 0%琼脂糖凝胶中进行电泳和染色，在透射紫外灯 下观察，如果有515bp的核酸条带，说明样品中有牙鲆弹状病毒，反 之如果没有515bp的核酸条带，说明样品中没有牙鲆弹状病毒。
本发明采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, 简禾尔RT-PCR)技术检 测鱼类牙鲆弹状病毒的方法，适用于对牙鲆弹状病毒进行快速检测， 可广泛应用于鱼类特别是牙鲆、鲈鱼、大菱鲆、真鲷等养殖场的疫病 监控及进出口贸易中牙鲆弹状病毒的检测。与现有技术相比，本发明 的有益效果包括(1)检测快速、效率高从核酸提取、逆转录(RT) 和聚合酶链反应(PCR)到结果判定仅需要6小时； 一次可以进行多 个样品的检测，具有高效性。(2)检测准确特异性引物只与牙鱼平弹 状病毒特异性地结合，与其他鱼类病毒都没有交叉反应。(3)灵敏度 高。
图1是牙鲆弹状病毒的电泳检测图。
图中l:分子量标准2:牙鲆弹状病毒515bp的扩增片段。
具体实施例方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步阐述。 实施例l:以牙鲆样品为例对牙鲆弹状病毒进行检测。牙解样品采自黄海岸某养殖场，具有感染疫病的临床症状，体表 和鳍充血或出血，腹部膨胀，内有腹水。解剖鱼体，肌肉、肠黏膜的 固有层出血，生殖腺的结缔组织充血或出血。
具体检测步骤如下
1. 设计特异性引物-
在http:〃ww. ncbi. nlm. nih. gov/Genbank/中搜索牙鱼平弹状病 毒的序列，利用已有的DNA LASERGENE 7. 1软件分析比较各个基因序 列的保守性，结果表明牙鲆弹状病毒的糖蛋白基因序列比较保守；因 此，以糖蛋白基因为目标基因，利用Primer Express2. 0软件设计特 异性引物序列；设计的引物其退火温度(melting temperature,简 称Tm)值在57"C-63"C之间，不具有二级结构，两条引物的Tm值相 差2'C以内，且不形成引物二聚体。引物序列如下-GF: 5' - GTGCCAATGGTACACGGACAA -3' GR: 5, _ TGATCTCCGCATGTGCCTCTA -3'。 扩增片断长度为515 bp。
设计好特异性引物序列和荧光探针序列后，通过TAKARA商业公 司，采用e-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行
特异性引物的合成。
2. 提取待测样品的RNA:
解剖待检测的鱼类样品，取脑、肾、脾等组织进行匀浆，采用商 业化的试剂盒PureLinkViral RNA/DNA Mini Kit (invitrogen) 提取RNA，之后用核酸分析仪进行OD26。/OD，检测，调整RNA浓度为 100ng /比
3. 逆转录-聚合酶链式反应
(1)逆转录合成cDNA:取待测样品的RNA模板10uL，加入PCR 反应管中，再加入引物GF 1 u U GR 1 pL，水3 uL;充分混匀后 70°C温浴10min，迅速冰浴5min;再加入5XAMV buffer 5 p L， dNTPs (各10 mM) 2 u L RNase Inhibitor (20 U/ u L) 1 u L，水1 y L， AMVReverse Transcriptase (5U/u U 1 "，使反应总体积为25 u L
轻弹管壁混匀，稍离心后42。C保温30-60min，得到cDNA产物。
(2) PCR扩增:取10 X PCR buffer 5 "， dNTPs (各10 mM) 1 ti L， 25 mM MgCl23 u L，引物GFluL、GRl u L， cDNA产物2 u L， Taq DNA Polymerase (5 U/uL) 1 u L，水34-36 u L，使反应总体 积为50uL。轻弹管壁混匀，稍离心后，进行PCR反应，反应程序为 94°C，预变性5 min; 94。C变性1 min、 52°C退火1 min、 72。C延伸 2 min，共35个循环，最后72。C延伸10 min。
4.电泳检测
取5 PL PCR产物，与2 uLO.25%溴酚蓝上样缓冲液混合，在 含有溴化乙锭浓度为0. 5 u g/ml的1. 0%琼脂糖凝胶中进行电泳和染 色，在透射紫外灯下观察，有515bp的核酸条带，说明牙鲆样品中感 染牙鲆弹状病毒。
实施例2:分析外观健康的真鲷是否感染牙鲆弹状病毒。
真鲷样品采自黄海南边岸某养殖场，外观正常，检测体内是否携 带牙鲆弹状病毒。
1. 设计特异性引物同实施例l。
2. 提取待测样品的RNA:
采用传统的TRIZOL法进行RNA的提取。解剖真鲷，取脑、肾、 脾等组织进行匀浆，加入600叱裂解液，颠倒混匀，再加入200化 氯仿，混匀器上震荡混匀5sec。于4。C 12000 rpm离心15min。吸取 上清液500叱，加入400叱异丙醇，-20。C放置30分钟。12000 rpm 离心15min，倒去上清；然后加入600叱75%乙醇，洗涤沉淀，于12000 rpm离心5min，轻轻倒去上清。将RNA沉淀室温干燥3min后，加入 20叱水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA。 2000rpm离心5sec，在冰上 保存备用。之后用核酸分析仪进行检测，结果表明样品核酸的 0D26。/0D28。在1. 8-2. 0之间，调整RNA浓度为100ng / n L。
3. 逆转录-聚合酶链式反应(1) 逆转录合成cDNA:取待测样品的RNA模板lOuL，加入PCR 反应管中，再加入引物GF 1 pL、 GR 1 "L，水3 iiL;充分混匀后 70°C温浴10min，迅速冰浴5min;再加入5XAMV buffer 5 u L， dNTPs (各10 mM) 2 p L， RNase Inhibitor (20 U/ u U 1 u L,水1 u L， AMV Reverse Transcriptase (5U/u U 1 "，使反应总体积为25 u L。 轻弹管壁混匀，稍离心后42。C保温30-60min，得到cDNA产物。
(2) PCR扩增取10 X PCR buffer 5 y L， dNTPs (各10 mM) 1 u L， 25 mM MgCl23 p L，引物GF 2 u L、 GR 2 u L， cDNA产物2 u L， Taq DNA Polymerase (5 U/u L) 1 u L，水34 u L，使反应总体积为 50 UL。轻弹管壁混匀，稍离心后，进行PCR反应，反应程序为94°C， 预变性5 min; 94。C变性1 min、 58°C退火1 min、 72。C延伸2 min， 共35个循环，最后72'C延伸10 min。
4.电泳检测
取5 uL PCR产物，与2 uLO.25%溴酚蓝上样缓冲液混合，在 含有溴化乙锭浓度为0. 5 y g/ml的1. 0%琼脂糖凝胶中进行电泳和染 色，在透射紫外灯下观察，没有515bp的核酸条带，说明真鲷样品中 没有感染牙鲆弹状病毒。SEQUENCE LISTING
<110>孙颖杰、岳志开、刘荭、吴斌、李叶
<120>牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测方法
<160> 2
< 170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> prim—bind <222> (1)...(21)
<223>根据PCR反应要求设计，用于检测牙鲆弹状病毒的正向引物 <400> 1
gtgccaatgg tacacggacaa 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence<220>
<221> prim—bind <222> (1)...(21)
<223>根据PCR反应要求设计，用于检测牙鲆弹状病毒的反向引物 <400> 2
tgatctccgc atgtgcctct a 2权利要求
1、一种牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测方法，其特征是牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测方法，首先设计特异性引物，然后提取待测样品的RNA，再进行逆转录-聚合酶链式反应，最后通过琼脂糖凝胶电泳进行结果判定。
2、 根据权利要求1所述的一种牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链 式反应检测方法，其特征是特异性引物对GF/GR，扩增的目的核酸带大小为515 bp，其序列如下GF: 5' - GTGCCAATGGTACACGGACAA -3' GR: 5' - TGATCTCCGCATGTGCCTCTA -3'。
3、 根据权利要求1所述的一种牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链 式反应检测方法，其特征是提取待测样品的RNA:解剖待检测的鱼 类样品，取脑、肾、脾等组织进行匀浆，采用传统的TRIZ0L法或者 商业化的RNA提取试剂盒提取RNA，之后用核酸分析仪进行0D26Q/0D280 检测纯度，调整RNA浓度为100ng L。
4、 根据权利要求1所述的一种牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链 式反应检测方法，其特征是逆转录-聚合酶链式反应(1) 逆转录合成cDNA:取待测样品的RNA模板10uL，加入PCR反应管中，再加入引物GF 1 uL、 GR 1 uL，水3 uL;充分混匀后 70°C温浴10min，迅速冰浴5min;再加入5 XAMV buffer (缓冲剂) 5uL， dNTPs (各10mM) 2 u L， RNase Inhibitor (核糖核酸酶抑制 剂，浓度20U/u L) 1 p L， 7jCluL， AMV Reverse Transcriptase (反 转录酶，浓度5U/uL)1 pL,使反应总体积为25 uL，轻弹管壁混匀，稍离心后42。C保温30-60min，得到cDNA产物；(2) PCR扩增:取10 XPCR buffer (10mM)5uL， dNTPs (10 mM) luL, 25 mM 的MgClz3 u L，引物GF 1—2 w L、 GR 1—2 u L， cDNA产物2 uL， Taq DNA Polymerase (聚合酶，浓度5 U/u L) 1 u L， 水34-36 uL，使反应总体积为50uL，轻弹管壁混匀，稍离心后， 进行PCR反应，反应程序为94°C，预变性5min; 94"C变性1 min、 52-58°C退火l min、 72。C延伸2 min，共35个循环，最后72"C延 伸10 min。
5、根据权利要求1所述的一种牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链 式反应检测方法，其特征是电泳检测取5 uL逆转录-聚合酶链 式反应的PCR产物，与2 iiL浓度0.25。/。溴酚蓝上样缓冲液混合， 在含有溴化乙锭浓度为0. 5 " g/ml的1. 0%琼脂糖凝胶中进行电泳和 染色，在透射紫外灯下观察，如果有515bp的核酸条带，说明样品中 有牙鲆弹状病毒，反之如果没有515bp的核酸条带，说明样品中没有 牙鲆弹状病毒。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域。一种牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应检测方法，牙鲆弹状病毒的逆转录-聚合酶链式反应快速检测方法，首先设计特异性引物，然后提取待测样品的RNA，再进行逆转录-聚合酶链式反应，最后通过琼脂糖凝胶电泳进行结果判定。本发明具有快速，准确、特异性好、灵敏度高的优点，适合对牙鲆弹状病毒的快速检验检疫，可以应用于水产养殖场以及检验检疫部门，应用前景广泛。
文档编号C12Q1/70GK101624633SQ20091001317
公开日2010年1月13日 申请日期2009年8月13日 优先权日2009年8月13日
发明者荭 刘, 斌 吴, 孙颖杰, 岳志芹, 叶 李 申请人:孙颖杰;岳志芹;刘 荭;吴 斌;李 叶