专利名称：：一种酿酒酵母及其筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，具体地说是一种酿酒酵母及其筛选方法和应用。
背景技术：
：酿酒酵母属于真菌属，酵母菌科，是兼性厌氧微生物，有氧时，酵母菌则进行有氧呼吸，新陈代谢旺盛，繁殖快；缺氧时进行无氧呼吸，产生酒精和二氧化碳。菌体呈圆形、卵形或椭圆形，内有细胞核、液泡和颗粒体物质。通常以出芽繁殖；有的能进行二等分分裂；有的种类能产生子囊孢子。广泛分布于自然界，尤其在葡萄及其他各种果品和蔬菜上更多，是重要的发酵素，能分解碳水化合物产生酒精和二氧化碳等。生产上常用的有面包酵母、饲料酵母、酒精酵母和葡萄酒酵母等。现用的酿酒酵母有啤酒酵母、葡萄汁酵母等。这些酵母在啤酒、葡萄酒等各自领域内能较好完成发酵任务，似用于酿造樱桃酒时，得不到很好的发酵效果。分析原因主要有两个一是酵母自身存在一定限制，如对酸、酒精耐受力较低、发酵温度范围较窄，另一个原因是樱桃果肉硬度大、组织致密、酸度糖度较高，现用酵母适应不了发酵条件，致使生长繁殖速度慢、原料利用率低，影响最终发酵效果，达不到要求。
发明内容本发明的目的是提供一株适用于樱桃酒、冰樱桃酒、樱桃露酒、櫻桃果酒等系列樱桃酒酿造的菌株。该菌株也可用于葡萄酒及其他果酒的酿造。本发明所提供的一种适宜于系列樱桃酒酿造的酿酒酵母菌株，酉良酒酵母SC203(Sacc/araOT_yc"ce"w^at"SC70)，己由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)进行保藏，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏日期为2008年12月5号，保藏编号为CGMCCN0.2786。本发明酿酒酵母SC203的基本生理特征细胞圆形、卵圆形或洋梨形；在显微镜下观察，该菌丛呈圆形，乳白色，边缘整齐，凸起；在幼年菌落中，细胞为4-14x3-7微米，长和宽的比率是l:1-1:2;在麦汁屮沉淀；子囊孢子圆形，平滑。本发明酿酒酵母SC203菌株是通过筛选，选育出的乙醇脱氢酶基因缺失或不表达的变异菌株，具有能耐受高浓度酒精、酸、二氧化硫的优点。本发明酿酒酵母SC203菌株同现在所使用的其他酿酒酵母菌菌株及原出发菌株相比，能耐受较高浓度的酒精和酸；其发酵周期比现有酵母縮短20%;S02耐受能力达到260mg/L;降糖能力范围在30%-40%之间；发酵糖度在12%40%之间；低温发酵能力较强，在5-15'C时，还能进行较活跃的发酵活动，且在此条件下具有良好发酵生产能力。本发明还提供了一种筛选和培养酿酒酵母SC203的方法。本发明所述的筛选和培养酿酒酵母SC203的具体操作方法如下(1)筛选从莱州大红樱桃园内土壤中筛选分离纯化酿酒酵母A、取大红樱桃园内表层以下5-10cm的土壤0.5g，倒入带玻璃珠的无菌水瓶中振荡5-10min，此为10—2的土壤悬液，用无菌移液管吸10—s的土壤悬液0.5ml，放入4.5ml无菌水中，制成10^稀释液，如此重复，依次制成10久10;的稀释液；B、在超净工作台上，取融化后降温至约5(TC的葡萄糖酵母膏(YPD)固体培养基约20ml倒入平板，在培养基中加入0.1-100mg/L浓度的抑制细菌的抗生素(如青霉素)，待培养基凝固后，取A歩骤制取的稀释液0.05-0.1ml分别加入四个平板上，用三角刮铲将菌液均匀涂布于平板表面；C、将制备好的平板置于23-28°〇培养箱'!-'培养2-3d;D、用接种环挑取经纯化的各种典型酵母齒齒落至另一新葡萄糖酵母膏固体培养基平板划线，将平板置于23-28t:培养箱中培养2-3d;E、持续D步骤操作，直至菌落完全纯化，得到40株纯的酿酒酵母菌株。(2)培养用樱桃汁筛选富集优良酿酒酵母菌株A、将新鲜的大红樱桃榨汁(原浆浓度12%)，在12rc下灭菌30min;作为筛选富集酿酒酵母培养基。B、樱桃汁培养基冷却后分别接入纯化后的40株酵母菌，置于23-28'C培养箱中，培养3-7d。C、由菌落的颜色判定酵母产酒精的能力，挑选红色的菌落作为初筛入选菌。D、复筛是在加有杜氏小管的大试管液体培养基中，接入分离的斜面菌种，25。C恒温培养箱中培养，每隔6h记录菌体生长及发酵情况。将有典型酒香生成、气泡较多的酵母菌作为复筛入选菌。E、将效果较好的20株酵母菌选出，分别进行耐S02能力、发酵糖能力和耐糖能力等性能方面的研究；F、耐S02能力实验分别接种筛选出的酵母，在S02浓度为80、120、140、200、300mg/L时，发酵一周的过程中，观察发酵液可溶性固形物含量随时间的变化情况。实验表明，当SO2浓度较低(〈230mg/L)时，浓度高低对酵母死亡率影响不显著，而当SO2浓度达到300mg/L时，影响显著。20株酵母中，S02耐受能力较高的菌株，达到280mg/L260mg/L;G、降糖能力实验可溶性固形物(原浆)浓度15%、30%、40%、50%时，观察酵母的降糖速度和生长滞后期时间。实验表明，原浆浓皮在15%时，各个酵母菌株都能较快地利用糖，开始迅速降糖，发酵液屮酒精含量也相应地迅速增加。当nJ溶性固形物含量卨于40。/。时，大部分酵母的生fc在发酵的初期受到了一定的影响。表现为酵母的生长滞后期变长(由2d变到4d)。在高糖浓度50%时，各酵母发酵性能均受到很大程度的抑制。从整体上来看，降糖能力最强的酵母菌株，适宜范围在30%-40%之间H、耐糖能力实验随着发酵液的可溶性固形物含量从30%升高到50%，酵母菌总数下降(从7.6降到6.46.8)，死亡率升高。这一现象说明高糖浓度对酵母的生长有很大影响。表现出较高的耐糖性的酵母在各种浓度下的生长能力均比其他酵母强，适合发酵糖度在]2%40%之间。I、低温发酵能力实验发酵温度分别设置5'C、15°C、25°C、35°C、45。C时，观察酵母的繁殖速度。实验表明，原浆浓度在25-35。C时，各个酵母菌株都能较快繁殖。当温度低于15'C和高于35"C时，大部分酵母的生长受到了较大的影响。当温度在5"C时,各酵母发酵性能受到很大程度的抑制。从整体上来看，低温发酵能力较强，的酵母菌株在5-15t:时，还能进行较活跃的发酵活动。综合上述各项酵母发酵能力的实验结果，选出综合效果较好的酵母菌种进行复筛。J、将复筛入选菌种，按5%的接种量接种发酵培养基，于25。C生化培养箱中发酵7d，从发酵性能和发酵产物感官评定等方面综合评价，选取综合性能最佳，发酵后酒体果香浓郁，口味纯正，风格独特，酒精度在10度以上的菌种作为入选菌种，并将其命名为酿酒酵母SC203(S"cc/z"ra附yce5"w由/"e经过大量实验，故将其与四种商业酵母进行发酵性能比较。K、酿酒酵母SC203与商品酵母发酵能力比对选择四种商业酵母，R2、DVIO、D254、RC212，分别进行耐S02能力、发酵糖能力和耐糖能力、发酵温度四方面的比较。比较结果见下表1。表1酿酒酵母SC203与四中商业酿洒fil./:j.发酵能力对比《<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通过比对试验，酿酒酵母SC203综合性能明显优于这四种商业酵母，适用于系列櫻桃酒的酿造，也可用于其它类型酒类酿造。(4)种子培养酿酒酵母SC203要经过四级液体种子培养。A、菌种斜面培养菌种接种在YPD斜面上，置于23-28'C于生化培养箱培养12-48小时；B、大试管培养将上述YPD斜面上的菌种接入装有5-10ml无菌麦汁液体培养基大试管，置于22-30。C摇床振荡培养12-48小时；C、三角瓶一级扩大培养上述试管培养物转接于装有50-150ml麦芽汁的250ml三角瓶中，置于22-3(TC摇床振荡培养12-48小时；D、酵母罐扩大培养上述试管菌体密度约为1(f-l()S个/ml的培养物50mL转接于装有1500-2500ml麦芽汁的5000ml酵母罐中，，置于22-30。C培养12-48小时；此时培养的酵母菌SC203可用于发酵生产，齒体密度为10、10"个/ml发酵液。上述酿酒酵母SC203在培养基中培养时，起始pH值为pH5.8，发酵过程中控制pH值在5.0-6.5之间。本发明的酿酒酵母SC203，具有生长快、起发早、发酵周期短、对低温、酸、酒精、二氧化硫耐受力强等特点。本发明所制得的酿酒酵母SC203，特别适合应用于原衆樱桃酒、冰樱桃酒、樱桃露酒、樱桃果酒等的酿造，也可应用于葡萄酒、其他果酒以及啤酒的酿造。本发明所述的酿酒酵母SC203可以单独使用，也可以与生香酵母和/或其它酿酒酵母一起作为合酵酿酒酵母在酿酒发酵生产过程中使用。具体实施例方式下述实施例将有助于理解本发明，但并不能限制本发明的内容。实施例1选择含糖量高、充分成熟的樱桃鲜果500kg，除掉劣果；洗净表皮的污物，用3%的双氧水浸泡，清洗后沥干水分。榨汁，制成原浆浓度为15%的樱桃汁，按原浆量0.3。/。。的比例加入150gVc，按料液量1.5。/。接入酿酒酵母SC203，控制SO2浓度150mg/L，进行控温共同发酵，发酵温度为24r，发酵时间为10d，主发酵结束，立即分离皮渣。控制后发酵温度为16r，经30d后发酵醪残糖^4g/L，后发酵停止。陈酿结束后，硅藻土过滤，杀菌，得原浆樱桃酒。实施例2选择含糖量高、充分成熟的樱桃鲜果500kg，除掉劣果；洗净表皮的污物，用3%的双氧水浸泡，清洗后沥干水分。榨汁，制成原浆浓度为30%的樱桃汁，按原浆量0.396。的比例加入150gVc，按料液量1.6。/。接入酿酒酵母SC203和生香酵母(酿酒酵母SC203与生香酵母的比例为2:1)，控制SO2浓度150mg/L，进行控温共同发酵，发酵温度为24。C，发酵吋间为10d，卞发酵结束，立即分离皮渣。控制后发酵温度为16。C，经30d后发酵醪残糖^4g/L，后发酵停止。陈酿结束后，硅藻土过滤，杀菌，得度原浆樱桃酒。实施例3选择含糖量高、充分成熟的樱桃鲜果500kg，除掉劣果；洗净表皮的污物，用3%的双氧水浸泡，清洗后沥干水分。榨汁，制成原浆浓度为30%的樱桃汁，按原浆量0.3%。的比例加入150gVc，按料液量1.6%接入葡萄酒酵母1450，控制S02浓度150mg/L，进行控温共同发酵，发酵温度为24。C，发酵时间为10d，主发酵结束，立即分离皮渣。控制后发酵温度为16°C，经30d后发酵醪残糖^4g/L，后发酵停止。陈酿结束后，硅藻土过滤，杀菌，得原浆樱桃酒。表2实方包例13发酵结果比较表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>接种不同酵母，发酵樱桃原浆生产樱桃酒，发酵结果如表2所示。从樱桃酒的理化指标和感官指标综合评定可以得出结论酿酒酵母SC203的发酵性能要.W著优于葡萄酒酵母1450，而酵母酿洒酵母SC203与生香酵母合酵的发酵性能要优于酏酒酵母SC203单独发酵。实例4选择含糖量高、充分成熟的葡萄500kg，除掉劣果；洗净表皮的污物，用3%的双氧水浸泡，清洗后沥干水分。搾汁，按葡萄汁原浆量0.3。/。。的比例加入150gVc，按料液量1.2。/。接入酿酒酵母SC203，控制SO2浓度120mg/L，进行控温共同发酵，发酵温度为25"，发酵时间为10d，主发酵结束，立即分离皮渣。控制后发酵温度为15。C，经40d后发酵醪残糖S4g/L，后发酵停止。陈酿结束后，硅藻土过滤，杀菌，最终得到16度葡萄酒。表3两种酵母发酵葡萄酒结果比较项目总糖挥发酸总一.氧化干浸出物酒度Cg/L)g/L碳，m|/L9/L%(vol)酿酒酵母0.60.5132.128.112.5SC203葡萄酒酵母0.90.8185,819.611.31450国家标准24.0化0S200218.027.0由表可知，酿酒酵母SC203、葡萄酒酵母1450发酵生产的葡萄酒理化指标都符合国家标准。酿酒酵母SC203的发酵结果较葡萄酒酵母1450的发酵结果好。权利要求1.一种酿酒酵母菌株酿洒酵母SC203(SaccharomycescerevisiaeSC203)，由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCCNO.2786。2.如权利要求1所述的酿酒酵母SC203，其特征是(1)基本生理特征细胞圆形、卵圆形或洋梨形，在显微镜下观察，该菌丛呈圆形，乳白色，边缘整齐，凸起。在幼年菌落中，细胞为4_l4x3_7微米，长和宽的比率是l:1-1:2;在麦汁中沉淀；子囊孢子圆形，平滑；(2)酿酒酵母SC203菌株是通过筛选，选育出的乙醇脱^酶基因缺失或不表达的变异菌株，具有能耐受卨浓度酒精、酸、二氧化硫的优点；3.如权利要求1所述的酿酒酵母SC203的筛选培养方法，其特征在于(1)筛选从莱州大红樱桃园内土壤中筛选分离纯化酿酒酵母菌A、取大红樱桃园内表层以下5-10cm的土壤0.5g，倒入带玻璃珠的无菌水瓶(无菌水95ml)中振荡5-10min，制成10—2的土壤悬液，用无菌移液管吸10_2的土壤悬液0.5ml，放入4.5ml无菌水中，制成10—3稀释液，如此重复，依次制成10—3-10-7的稀释液；B、在超净工作台上，取融化后降温至约5(TC的葡萄糖酵母膏(YPD)固体培养基倒平板，在平板中注入约20ml的培养基，在培养基中加入0.1-100mg/L浓度的抑制细菌的抗生素，待培养基凝固后，取上述稀释液0.05-0.1ml分别加入四个平板上，用三角刮铲将菌液均匀涂布于平板表面；C、将制备好的平板置于23-28'C培养箱中培养2-3d;D、用接种环挑取经纯化的各种典型酵母菌菌落至另一新葡萄糖酵母膏固体培养基平板划线，将平板置于23-28。C培养箱中培养2-3d;E、持续D步骤操作，直至菌落完全纯化，得到40株纯的酵母菌株。(2)用樱桃汁富集筛选优良酿酒酵母菌株，其具体方法为A、樱桃汁(原浆浓皮12%),12rC灭齒30min;B、分別接入纯化后的酵母菌，置于23-28。C培养箱「1-'培养2-3d;C、将效果较好的20株酵母菌进行发酵能力实验，从中挑选出综合指标最好的酿酒酵母菌株；D、将选出的综合性能优越的菌株与四株商品酿酒酵母进行性能比对；F、筛选出的酿酒酵母要经过四级种子培养。(如权利要求3所述的培养方法，其特征是所述酿酒酵母SC203经过四级液体种子培养，其具体方法为-A、菌种斜面培养菌种接种在YPD斜面上，置于23-28"C于生化培养箱培养12-48小时；B、大试管培养将i:述YPD斜面上的菌种接入装有5-10ml无菌麦汁液体培养基大试管，置于22-3(TC摇床振荡培养12-48小时；C、三角瓶一级扩大培养上述试管培养物转接于装有50-150ml麦芽汁的250ml三角瓶中，置于22-3(TC摇床振荡培养12-48小时；D、酵母罐扩大培养上述试管菌体密度约为107-108个/1111的培养物50mL转接于装有1500-2500ml麦芽汁的5000ml酵母罐中，，置于22-3(TC培养12-48小时；此时培养的酵母菌SC203可用于发酵生产，菌体密度为10、10"个/ml发酵液。4.<image>imageseeoriginaldocumentpage3</image>5如权利要求3所述的培养方法，其特征是所述酿酒酵母SC203在培养基中培养时，起始pH值为pH5.8，发酵过程中控制pH值在5.0-6.5之间。6.如权利要求1所述的酿酒酵母SC203菌株的应用，其特征是用于樱桃酒、冰樱桃酒、樱桃露酒、樱桃果酒的酿造。7.如权利要求1所述的酿酒酵母SC203的应用，其特征是可以用于葡萄酒和其它果酒的酿造，也可以用于啤酒的酿造。8.如权利要求7所述的l'狼酒酵母SC203的应j目，其特征是n了以单独使川，也可以与生香酵母和/或其它酵母合川。全文摘要本发明涉及一种适宜于系列樱桃酒酿造的酿酒酵母的筛选及应用，属于生物工程
技术领域：
。本发明的酿酒酵母SC203菌株，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，登记编号为CGMCCNo.2786。本发明菌株具有生长快、起发早、发酵周期短、对低温、酸、酒精、二氧化硫耐受力强等特点，是一株适用于樱桃酒、冰樱桃酒、樱桃露酒、樱桃果酒等系列樱桃酒酿造的菌株。此外，本发明菌株也可用于葡萄酒及其他普通果酒和冰酒的酿造。文档编号C12R1/865GK101550400SQ20091001368公开日2009年10月7日申请日期2009年1月22日优先权日2009年1月22日发明者于磊娟,林曹,李敬龙,王超萍申请人:李敬龙;曹林