专利名称：沙冬青抗寒基因AmEBP1的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种我国西北荒漠地区的源于远古第三纪的国家二级濒危保护植 物，也是至今在亚洲中部荒漠地带唯一保留下来的常绿阔叶木本植物沙冬青的抗寒基因 AmEBPI的分子克隆和遗传转化。通过低温诱导和差异表达分析，获得了低温诱导上调表达 的沙冬青抗冻基因的EST片段，然后通过RACE扩增获得了沙冬青抗寒基因AmEBPI的全长 cDNA序列，在基因库中进行了注册，注册为DQ519359。AmEBPI含有完整的0RF区域，0RF全 长1188个核苷酸，编码395个氨基酸和一个终止密码子(TGA)。随后构建了沙冬青抗寒基 因AmEBPI的真核表达载体pCAMBIA2300-AmEBPl，用于转化拟南芥和林木，获得的转基因植 株抗寒性有所提高。AmEBPI是国际上克隆并完成遗传转化验证的第一个木本植物抗寒基 因，我们拥有完全独立自主的知识产权。它的克隆和成功转化对于木本植物抗寒基因研究 和遗传育种具有重要意义。
背景技术：
低温是限制植物的生长，发育和分布的重要因素，2007-2008年在我国南方大面积 发生的那场冻害，我们还记忆犹新，其中对木本植物造成的危害最重，而且其影响将持续在 其后十几年。木本植物抗寒基因的研究落后于草本植物，更落后于原核生物及鱼类和昆虫。 但从另一个角度来看，由于木本植物具有相同的多年生的特性，具有木质化构造，冬季能够 发展出较强的抗寒性，所以从木本植物中应该更容易分离到有较强抗寒效果的基因。把这 样的基因转化到需要的木本植物中可能会比转化来自于其它生物的抗寒基因更为有效。所 以从木本植物中克隆抗寒基因并研究它们的表达和功能，具有重要的理论意义和应用价 值。植物抗寒基因工程与其它抗性基因工程相比起步晚，发展慢，直到八十年代末，才 报道了抗寒基因工程方面的研究成果。至今，植物抗寒基因工程主要通过以下五个途径进 行①鱼类及昆虫抗冻基因途径；②脂肪酸去饱和代谢关键酶基因途径；③超氧物岐化酶 (SOD)基因途径；④糖类基因途径；⑤本草植物抗冻基因途径。其中用的最早的是鱼类抗冻 基因途径，鱼类抗冻蛋白(AFPS)吸附于冻晶上，使极地鱼类有抗冰晶化作用，保护极地鱼。 1989年，Cutler用极地鱼黄鲽抗冻蛋白处理植物组织，明显改善了马铃薯、草菁和拟南芥 属叶子的抗寒性能。George把人工合成的黄盖鲽AFP基因，通过电激法成功导入玉米原生 质体，得到表达。Sallis以农杆菌介导，把合成的PHA-AFP (植物凝集素PHF)转入到马铃薯 中，马铃薯的抗冻与耐冻能力提高了。近年来植物抗冻基因的研究有了较好的进展，美国和 中国的科学家分别克隆了拟南芥的抗冻基因并导入番茄，得到良好的表达，获得了抗寒性 提高的转基因植株。美国DNA植物技术公司把抗冻基因导入到蕃茄中，培育出耐寒蕃茄，并 且认为抗冻蛋白有可能应用于所有蔬菜品种的改良。但木本植物抗寒基因的克隆和转化 方面迄今尚未见成功报道。本研究结果正是希望在这个领域打开突破口而开展起来的。
发明内容
本研究用我国西北荒漠地区一种常绿阔叶的豆科灌木沙冬青为材料，进行了木本 植物冷诱导基因的克隆和功能分析研究。通过低温诱导处理和差异表达分析，获得了低温 诱导上调表达的沙冬青抗冻基因的EST序列十三个(包括八个全长基因和五个cDNAs的部 分序列)。其中的一个(基因库注册号DQ519359)包含沙冬青抗寒基因ErbB3结合蛋白基 因(the geneencoding ErbB3 binding protein of Ammopiptanthus mongolicus)的全长 cDNA序列，命名为AmEBPl，其ORF区域长1188个核苷酸，编码395个氨基酸和一个终止密 码子(TGA)，与马铃薯的StEBPl蛋白有89%的一致性。同时AmEBPl与拟南芥的AtG2蛋白 及人的EBP1蛋白具有78%和46%的一致性。可见它们属于在真核界保守性较高的蛋白。 AmEBPl的核苷酸序列和推导出的氨基酸序列见附图1。随后克隆了 AmEBPl基因的核DNA 序列，结构分析表明，AmEBPl基因核DNA序列含有9个外显子和8个内含子，与水稻、拟南 芥同源基因的结构一致。构建目的基因所用的载体是目前国内外植物遗传工程研究中广泛应用、并已商品 化的双元载体pCAMBIA2300(购自公司澳大利亚Cambia公司)，其结构见附图2，该载体 无致病性。它本身带有一套完整的遗传操作系统和克隆位点(T-DNA区域，以左、右两个 边界表示出来)，进行目的基因克隆时，选择合适的克隆位点，将目的基因插入。启动子是 CaMV35S，终止子是0CS，来源于Ti质粒。在构建目的基因AmEBPl的表达载体时，将分子克 隆得到的AmEBPl基因片段在Xba I和Sal I双酶切位点插入到载体pCAMBIA2300中，建成 的表达载体被命名为pCAMBIA2300-AmEBPl，如附图3所示。所用的标记基因是广泛应用的 新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)，它编码的产物对氨基葡糖苷类抗生素如卡那霉素等具有 抗性。在构建本表达载体时考虑到融合基因太大会影响表达，因此没包含报告基因GUS.该基因转化到植物体内后可以抑制冰晶生长及新冰晶的形成，从而保护细胞免受 损伤，提高植物的耐寒性。由于AmEBPl基因来源于木本植物，转化后在木本植物宿主体内 更容易表达，转化的植物对环境没有任何影响。
四
图1. AmEBPl基因的编码序列及推导的氨基酸序列
图2广泛应用、并已商品化的双元载体PCAMBLA2300的结构示3AmEBPl基因构建图
五具体实施例方式(一 )以木本植物的离体再生体系作为转化材料，利用农杆菌浸染、花粉管通道、 基因枪等方法进行遗传转化。( 二)转化操作步骤
1.农杆菌转化法(1)通过三亲株杂交法将AmEBPl基因表达载体转化到根癌农杆菌LBA4404中，用 做农杆菌浸染转化植物。(2)菌液制备1)用接种环刮拭含有重组质粒的农杆菌菌株冻结的培养物表面，划线于含有相应 抗生素的上述YEP平板上，置于28°C恒温培养箱培养2天，待平板上有菌落长出来的时候， 即可用于液体培养。长出菌落的平板置于4°C冰箱保存。一个月后转接到新的YEP平板上， 以保持菌的活性。2)从平板上挑取单菌落，接种于含IOml附加相应抗生素的YEP液体培养基 (pH7. 0)中，在恒温摇床上，于28°C，180-200rpm振荡培养过夜。3)次日早晨，当菌液OD6tltl = 0.4-0. 8时，可用于转化。(经验上一般为头天下午5 点左右进行振荡培养，次日早晨8点左右菌液浓度可达到标准)备注培养基中加入抗生素的时候，一定要等到培养基冷却但未凝固时(即人手 所能忍耐的温度)加入，否则抗生素在高温下会失效。(3)农杆菌转化1)预培养将无菌离体再生组织横向切割2-3个切口，后接种在分化培养基上进 行预培养1-2天。2)共培养用无菌水将农杆菌菌液稀释5-20倍，将经过预培养的离体再生组织浸 泡在稀释液中10-20分钟，取出茎段，用无菌滤纸吸干后，转入分化培养基上暗培养2-4天， 对照处理是将剪伤的离体再生组织在无菌水中浸10-20分钟，其它处理与实验材料一样。3)选择培养离体再生组织与农杆菌共培养后，即可看到离体再生组织边缘有乳 白色的农杆菌菌落出现，用无菌水冲洗茎段，然后用无菌滤纸吸干。将离体再生组织转移到 加有选择压的脱菌分化培养基上，在光照4000-1200()lX，25°C条件下进行选择培养。4)继代选择培养选择培养3-4周后，离体再生组织的转化细胞将分化出抗性不 定芽，将这些抗性材料转入相应的加大选择压的脱菌选择培养基中进行培养。5)生根培养待不定芽长到2厘米以上时，切下并插入含有选择压的脱菌生根培 养基上进行生根培养，两周左右长出不定根，获得转化植株。2、花粉管通道、基因枪等转化法(1)将AmEBPl基因表达载体转化到大肠杆菌中，配制不同浓度，在植物开花初期 利用授粉时期，使目的基因嵌入植物内，收集果实，培育再生苗木，获得转化植株。(2)将AmEBPl基因表达载体转化到大肠杆菌中，配制不同浓度，利用基因枪等转 化设备，将菌液与弹丸混合后，利用外界力量射入植物体内，培育再生苗木，获得转化植株。(三)PCR分子检测1、植物总DNA的提取(采用CTAB法)(1)称取2克左右植物试管苗新鲜叶片，置研钵中，加入1/10植物材料体积的 PVPP,倒入液氮将植物材料研磨成细末。(2)将此粉末放入大离心管中，加入65°C预热过的与植物材料等体积的2XCTAB 提取液，再加入1 %的β _巯基乙醇，反复颠倒混勻，65°C保温15-20min.(3)取出，冷却到室温，加入等体积的氯仿，轻轻的反复颠倒约lOmin，室温12000rpm离心15分钟。(4)将上清液置于另一离心管中，重复上一步骤1-2次。(5)加入2倍体积无水乙醇，充分混勻，用玻璃钩挠出絮状沉淀，置于预先放满 70%乙醇的Eppendorf管中，洗涤DNA，12000rpm离心，倒掉乙醇。(6)加入2倍体积70 %乙醇，洗涤DNA 2次。(7)吹干，溶于ΤΕ(ρΗ8· 0)缓冲液中，加入RNase (终浓度10mg/ml)，_20°C保存。2、聚合酶链式反应(PCR)检测(1)反应体系以质粒DNA作为阳性对照，以未经转化的组培苗作为阴性对照，对转化再生苗进 行PCR扩增检测。根据所提供的AmEBPl基因的序列资料，设计一对特异性引物。引物 1:5' -ATGTCGGATGATGAAAGGGAGGAGAAGGA-3'，引物 2 5 ‘ -TAGGGAAGGGAGGTCAATCTTGAGGTGT-3 ‘，引物1设计在5'端载体序列上，引物2设计在目的基因的3'端，用这对特异性 引物扩增出的PCR产物为1. 2Kb，包含是目的基因的全序列，这样可以保证PCR扩增产物只 能来自导入的AmEBPl基因序列，而不可能来自内源基因序列，提高了检测的特异性和准确 性。PCR-Southern杂交所用的探针是目的基因中的部分序列，即PCR扩增出的1. 2Kb的片 段，经32P-dCTP标记后用作PCR-Southern杂交的探针，PCR和PCR-Southern杂交检测双重 阳性的则被认为是转基因植株。1)反应液
ddH2017μ 1
Buffer2. 5μ 1
dNTP2μ 1
Primerl1 μ 1
Primer21 μ 1
Template DNA1 μ 1
TaqE0. 5μ 1
Total25 μ 1
2)反应程序
预变性:94°C,5min
在以下条件下扩增35个循环变性，94°C 60sec ；复性，55°C 40sec ；延伸，72°C，
Imin ；最后延伸:72°C,5min
4 °C，保存备用。
权利要求
本发明从我国西北荒漠地区的源于远古第三纪的国家二级濒危保护植物，也是至今在亚洲中部荒漠地带唯一保留下来的常绿阔叶木本植物沙冬青中克隆了其抗寒基因AmEBP1的抗寒基因AmEBP1。AmEBP1含有完整的ORF区域，ORF全长1188个核苷酸，编码395个氨基酸和一个终止密码子(TGA)。随后构建了沙冬青抗寒基因AmEBP1的真核表达载体，用于转化拟南芥和林木，获得的转基因植物抗寒性有所提高。AmEBP1是国际上克隆并完成遗传转化验证的第一个木本植物抗寒基因，我们拥有完全独立自主的知识产权。AmEBP1来源于木本植物，因此转化后在木本植物体内更容易表达，转基因植株对环境没有不良影响。它的克隆和成功转化对于木本植物抗寒研究和遗传育种具有重要意义。
2.克隆的沙冬青抗寒基因AmEBPl的编码序列全长1188个核苷酸，它编码395个氨基 酸和一个终止密码子(TGA)，见图1。在构建本表达载体时，CaMV35S启动子、目的基因、终 止子0CS和标记基因NPTII整合在一起构建成嵌合基因，有利于转化和表达。
3.所用的标记基因是广泛应用的来源于细菌的新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)，它编 码的产物对氨基葡糖苷类抗生素如卡那霉素等具有抗性，本表达载体不含报告基因GUS。
4.设计了检测导入的AmEBPl基因的两个特异PCR引物，它们的序列如下 引物 1 5 ‘ -ATGTCGGATGATGAAAGGGAGGAGAAGGA-3 ‘，引物 2 5 ‘ -TAGGGAAGGGAGGTCAATCTTGAGGTGT-3 ‘，这两个PCR引物的扩增产物为1.2Kb，包含了导入的AmEBPl基因的序列，其中一个引 物设计在5'端的载体序列上，而另一个引物则设计在导入的AmEBPl基因的3'末端序列 上，这样可以保证PCR扩增产物只能来自导入的AmEBPl基因序列，而不可能来自内源基因 序列，提高了检测的特异性和准确性。
5.聚合酶链式反应(PCR)检测1)反应液 ddH20 Buffer dNTP Primerl Primer2 Template DNA TaqE Total2)反应程序 预变性94°C，5min在以下条件下扩增35个循环变性，94°C 60sec ；复性，55°C 40sec ；延伸，72°C，lmin ； 最后延伸72°C，5min 4°C，保存备用。17u 1 2. 5u 1 2u 1 1 u 1 1 u 1 1 u 1 0. 5u 1 25 u 全文摘要
沙冬青抗寒基因AmEBP1涉及一种我国西北荒漠地区的源于远古第三纪的国家二级濒危保护的常绿阔叶木本植物。该基因的分子克隆，通过低温诱导和差异表达分析获得了低温诱导上调表达的沙冬青抗冻基因的EST片段，然后通过RACE扩增获得了该基因全长cDNA序列，并在基因库中进行了注册，注册号为DQ519359。AmEBP1含有完整的ORF区域，ORF全长1188个核苷酸，编码395个氨基酸和一个终止密码子(TGA)；以真核表达载体pCAMBIA2300-AmEBP1转化拟南芥，获得的转基因植株抗寒性有所提高；沙冬青抗寒基因AmEBP1是国际上克隆并完成遗传转化验证的第一个木本植物抗寒基因。
文档编号C12N15/11GK101892242SQ20091001518
公开日2010年11月24日 申请日期2009年5月20日 优先权日2009年5月20日
发明者冯殿齐, 刘静, 曹鹏秀, 王斌, 翁曼丽 申请人:泰安市泰山林业科学研究院;王斌