一株温控共表达外源基因的重组大肠杆菌及其应用的制作方法

专利名称：一株温控共表达外源基因的重组大肠杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株基因重组大肠杆菌及其应用，尤其涉及一株温控共表达外源基因的
重组大肠杆菌及其在制备N-乙酰神经氨酸中的应用。
背景技术：
唾液酸(Sialic acid)是神经氨酸及其衍生物的总称，是一类含有羧棊的九碳氨 基糖类物质，其生物功能与重要的生理和病理现象密切相关，具有广泛的应用前景 [Traveling, 1998: Schauer, 2000。而N-乙酰神经氨酸(N-acetyl-D-neuraminic acid, Neu5Ac)是分布最广的一类唾液酸，其本身及其类似物有重要的药用前景。其中 N-乙酰神经氨酸的结构类似物，扎纳米韦(Zanamivir)已于1995年被批准用于商业化 的抗流感病毒药物Dreitlein et al. , 2001。
唾液酸生产方法包括提取、化学合成、发酵法和酶催化法。从禽蛋中的蛋黄膜和脐 带中或牛乳乳清和酪蛋白提取唾液酸，由于含量较低，成分多样，分离和提纯过程比较 复杂，收率较低，因此难以实施工业化；化学合成唾液酸至少要经过十几步反应，形成 大量的中间产物，这给唾液酸的后分离过程造成很大困难李连生等2002；某些大肠 杆菌菌株在生长过程中能自身合成唾液酸的同聚合体——多聚唾液酸，经酸或酶水解后 即可得到唾液酸单体MamoruK., 1993，但产量较低；酶催化由于其高效性和选择性， 更适用于工业化合成精细化合物。 .
以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸为底物，N-乙酰神经氨酸醛縮酶(EC 4.1.3.3)的逆 反应被应用于酶催化合成N-乙酰神经氨酸，但此过程中酶纯化过程相对复杂，N-乙酰 甘露糖胺价格较贵。碱法异构化和N-乙酰葡萄糖胺异构酶方法实现了相对便宜的N-乙 酰葡萄糖胺到N-乙酰甘露糖胺的转化，进一步降低了生产成本Maru, 1998。但碱法 异构化的处理过程复杂，环境污染和底物分解等方面的问题Blayer， 1999；而使用 N-乙酰葡萄糖胺异构酶催化，需要ATP辅因子的参与，使得反应成本过高，也限制了酶 催化的工业化发展。
由于完整休止细胞具有高能磷酸化合物的合成能力，使全细胞催化成为该领域研究 的热点。首次报道的使用全细胞进行N-乙酰神经氨酸合成，是利用异源表达来源于集 胞藻(5y"ec/ oc7"issp. ) PCC6803的sZrl975基因(该基因表达的酶具有GlcNAc异 构酶功能)和来源于￡sc/ eric/u'3 co/i K-l的N-乙酰神经氨酸合成酶基因的重组大肠 杆菌细胞为催化剂，利用谷氨酸棒杆菌合成辅因子和底物磷酸烯醇式丙酮醆，在葡萄糖 和N-乙酰葡萄糖胺存在的条件下，使用三种完整细胞转化生产N-乙酰神经氨酸，但转 化率仅达到5%Tabata， 2002。
2007年Lee等利用来源于大肠杆菌(^sc力ehc力h coh') K12的唾液酸醛縮酶和来 源于^7s力朋/ s sp. CH1的N-乙酰葡萄糖胺异构酶分别利用商品化的pET载体系统在大 肠杆菌中分别进行表达，以两种混合细胞为催化剂，以N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸为底 物，催化合成N-乙酰神经氨酸。由于该催化过程中使用的异构酶与前面报道的酶学性 质相比，ATP需求量低，酶活性高，才使得最高产率达到10. 2 g/l*h，接近之前报道 的酶催化效率Lee et al， 2007。
3中国发明专利(ZL2004100242223)报道了利用施氏假单胞菌SDM完整细胞与表达 有N-乙酰神经氨酸醛缩酶的重组大肠杆菌￡ coh' BL21 (DE3) /pET15b-nanA为催化剂， 以乳酸钠和化学异构得到的N-乙酰甘露糖胺为底物，合成N-乙酰神经氨酸的生产工艺， 但是该方法需要用碱法异构化及两种细胞的参与。
综上所述，全细胞催化合成N-乙酰神经氨酸是工业化合成N-乙酰神经氨酸的发展 方向。但是目前全细胞催化合成N-乙酰神经氨酸存在缺陷(1)由于细胞膜这层天然屏 障对底物的阻碍作用，与酶催化相比，底物转化率相对比较低，Chen， 2007。(2)完 整细胞虽然处于休止状态，但仍有某些酶促反应，从而造成了催化过程中副产物的产生Ishigeetal， 2005。(3)常用诱导剂IPTG的毒性和较贵的价格，不适用于医药化 合物的规模化生产Hannig and Makrides， 1998。经检索，使用温度诱导共表达N-乙酰神经氨酸醛縮酶和N-乙酰葡萄糖胺异构酶的全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸的方 法及相关催化过程尚未见报道。
参考文献
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发明内容
针对上述现有催化合成N-乙酰神经氨酸方法中，重组型催化剂不宜规模化制备， 并且制备过程中会引入有毒物质的缺陷，以及全细胞转化率低，成本高，后处理麻烦， 难以大规模生产的不足，本发明要解决的问题是提供一株重组大肠杆菌，即一株温控共 表达外源基因的重组大肠杆菌及其在制备N-乙酰神经氨酸中的应用。本发明所述的菌 株含有以安全无毒、操作方便的温度诱导的强启动子，通过温度控制即可同时表达两步 催化所用的两个酶N-乙酰神经氨酸醛縮酶和N-乙酰葡萄糖胺异构酶，从而方便地得 到细胞作为催化剂。使用该催化剂能够实现在不额外加入ATP的条件下，使用相对较便 宜的底物N-乙酰葡萄糖胺推动反应进行，高效合成N-乙酰神经氨酸的同时保证了较简单的后处理过程。
本发明公开了一种基因重组大肠杆菌及其应用(如图l所示)。所述菌株包括构建 的基因突变菌株和携带有两种酶基因(基因A和基因B)的温控型载体；其中所述基 因突变株为敲除了 N-乙酰葡萄糖胺磷酸转运系统的菌株，该菌株具有弱化的伴随磷酸 化过程的N-乙酰葡萄糖胺摄入胞内能力；所述基因A为具有N-乙酰神经氨酸醛縮酶活 性的基因；所述基因B为具有N-乙酰葡萄糖胺异构酶活性的基因。
上述基因重组大肠杆菌构建过程包括温控型重组载体构建和菌株改造两部分。重 组载体以pBV220 (病毒学报，第6巻，第2期，111-116页)为出发载体，在P^启动 子下游顺序插入了 N-乙酰神经氨酸醛縮酶(Neu5Ac aldolase)基因和加有SD序列的 N-乙酰葡萄糖胺异构酶(GlcNAc2-印imerase)基因，得到温控型双顺反子载体。插入 基因来源于已报道相关功能基因或数据库注释具有相应功能的基因，其中所述的N-乙 酰神经氨酸醛縮酶基因优选来源于猪、鼠或大肠杆菌的N-乙酰神经氨酸醛縮酶基因， 所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因优选来源于蓝细菌的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因。 上述载体的宿主为N-乙酰葡萄糖胺特异性的磷酸转运系统(GlcNAc-specificPTS)基 因朋^E缺失的大肠杆菌K12ATCC 25404。通过两次同源重组，得到具有稳定遗传特性 的该突变株大肠杆菌(^sc力en'c/w'3coh') DT26,而且不会引入额外的抗性基因。将上 述构建载体转化进入上述构建的N-乙酰葡萄糖胺磷酸转运系统缺失的大肠杆菌，即得 温控共表达外源基因的重组大肠杆菌，其中所述构建的代表菌株为大肠杆菌
(^sc力aric力/a c。力')DT26 (pBVNsS)。
本发明所述温控共表达外源基因的重组大肠杆菌，其特征在于该菌株命名为大肠 杆菌(^sc力en'c力/a co7" DT26 (pBVNsS);所述菌株已于2009年1月12日保藏于"中 国典型培养物保藏中心"(武汉大学，中国武汉)，保藏号为CCTCC NO: M 209018。
上述温控共表达外源基因的重组大肠杆菌菌株的基因型为Zi朋^: :FRT;其含有温 控共表达载体即构建质粒pBVNsS。
上述质粒pBVNsS是以载体pBV220为出发载体，在PA启动子下游顺序插入了 N-乙酰神经氨酸醛縮酶(Neu5Ac aldolase)基因朋M和加有SD序列的N-乙酰葡萄糖胺 异构酶(GlcNAc 2-印imerase)基因Wrl975，具有双顺反子片段/ aM-SD-sZrl975。
上述大肠杆菌(^sc/ eiu'c力j'a co乃')DT26 (pBVNsS), CCTCC NO: M 209018构建过 程包括温控型重组载体构建pBVNsS和抅建菌株大肠杆菌(&c力eri'c/^'acoh') DT26两 部分。重组载体构建以pBV220为出发载体，在PA启动子下游顺序插入了N-乙酰神经 氨酸醛縮酶(Neu5Ac aldolase)基因和加有SD序列的N-乙酰葡萄糖胺异构酶
(GlcNAc 2-印imerase)基因slrl975，得到温控型双顺反子载体(如图2所示);其 中所述N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因y^M优选来源于大肠杆菌K12 ATCC 25404的N-乙 酰神经氨酸醛縮酶基因，所述N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因Wrl975优选来源于集胞藻
(5)77ec力oc;^y" sp. ) PCC6803的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因。上述载体的大肠杆菌 宿主为N-乙酰葡萄糖胺特异性的磷酸转运系统(GlcNAc-specific PTS)基因"a^E缺 失的大肠杆菌K12。通过进行一次"a^E侧翼同源重组和一次FRT同源重组得到具有稳 定遗传特性的该突变株大肠杆菌(fsc力en'c/u'acWi) DT26,而且不会引入额外的抗性 基因(如图3所示)。其中，第一次同源重组前制备带有重组酶的电转化感受态菌体的 诱导过程为大肠杆菌K12在37'C培养诱导1 3小时，加入L-阿拉伯糖浓度为0. 2 10 g/L，诱导2 7小时，收集菌体制作电转感受态。将构建载体转化进入上述构建的 N-乙酰葡萄糖胺磷酸转运系统缺失的大肠杆菌，即得到本发明所述的菌株——温控共表 达外源基因的重组大肠杆菌。该菌株培养温度为16 45'C,可在含有氨节青霉素的LB 或LB无机盐培养基中生长。 '
其中，制备带有重组酶的电转化感受态时，诱导前菌株培养时间优选1.5 2小时， 加入L-阿拉伯糖浓度优选1 5 g/L,诱导时间优选4. 5 5. 5小时。
其中，上述的LB培养基配方为每升中加入5g酵母粉，10 g蛋白胨，10gNaCl， 调节pH值为7.5, 12rC湿热灭菌20分钟。LB加无机盐培养基配方为每升中加入5 g 酵母粉，10 g蛋白胨，0.5 g NaCl， 12.8 g Na風，3 g KH2P04， 1 g NH4C1， 0.24 g MgS。4和0, Oil g CaCl2，调节pH至7.0， 115。C湿热灭菌20分钟。
进一步的，本发明所述温控共表达外源基因的重组大肠杆菌的培养温度优选30 42。C。
本发明所述大肠杆菌(￡^c/ en'c/w'3 DT26 (pBVNsS) CCTCC No. M 209018
具有如下生物学特性好氧或兼性好氧，有周生鞭毛，不形成孢子，革兰氏阴性。在营 养琼脂上的菌落呈光滑、低凹、潮湿和灰白，表面有光泽、边缘较整齐。化能有机营养， 具有呼吸和发酵代谢。发酵D-葡萄糖、其他糖类化合物和多元醇，产气。能利用乙酸 为唯一碳源，不能利用柠檬酸盐。
本发明所述温控共表达外源基因的重组大肠杆菌即大肠杆菌(fsc/zeric力j'a co力') DT26 (pBVNsS) CCTCC No. M 209018作为催化剂在全细胞催化制备N-乙酰神经氨酸
中的应用。
其中所述温控共表达外源基因的重组大肠杆菌用于制备全细胞催化剂的条件为
诱导前培养温度20 35"，诱导前培养时间0.5 5小时；诱导温度37 45'C,诱导时 间4 30小时，摇床转速150 250转/分钟，发酵罐氧溶解度15 45%;使用上述全细 胞催化剂制备N-乙酰神经氨酸的反应体系及反应条件是反应体系中全细胞催化剂N-乙酰神经氨酸醛縮酶酶活性为20 40 U，相应的N-乙酰葡萄糖胺异构酶酶活性为4 8 U， N-乙酰葡萄糖胺浓度为200 1000mM,丙酮酸浓度为200~1500 mM,磷酸缓冲液浓 度40 80mM， Mg"浓度10 30 mM，反应体系中添加0. l 10 g/L Triton X-'l00、 0. l 10 g/L SDS、 0.1 10 g/L CTAB或0. 1 10 g/L CHAPs表面活性剂，反应pH值为7 7.8，反应温度为25 37°C，反应时间为12 72小时，反应过程使用往复式摇床或控 制发酵罐转速使氧溶解度为30 70%。
进一步的，本发明所述大肠杆菌(foc/ eWc/ j'acoh') DT26 (pBVNsS) CCTCC No. M 209018作为催化剂在制备N-乙酰神经氨酸中的应用的具体方法和步骤是
(1) 在无菌条件下将大肠杆菌(^sc力en'c力ia co i) DT26 (pBVNsS) CCTCC No. M 209018接种到含有0.5 1.5 g/L氨苄青霉素的LB中，置20 35。C下，振荡培 养8 30小时，得到种子细胞。
(2) 用(1)中的种子细胞，无菌条件下以体积比0.5M 2X的接种量接种于LB或LB 无机盐培养基，于20 35。C培养0.5 5小时。
(3) 升温至37 45°C，以摇床转速150 250转/分钟，发酵罐氧溶解度15 45%的条
件进行诱导4 30小时。 '(4) 将上述培养物以8000转/分钟离心5分钟，并用PBS缓冲液清洗两遍，即得到所 述温控共表达外源基因的重组大肠杆菌的全细胞催化剂，于4'C保藏备用。
(5) 将上述全细胞催化剂溶解于破碎缓冲液中，调节ODe2。至30，超声波破碎菌体后 进行N-乙酰神经氨酸醛縮酶和N-乙酰葡萄糖胺异构酶酶活测定。
(6) 使用上述全细胞催化剂制备N-乙酰神经氨酸的反应体系及反应条件是反应体 系中全细胞催化剂N-乙酰神经氨酸醛縮酶酶活性为20~40 U，相应的N-乙酰葡 萄糖胺异构酶酶活性为4 8U， N-乙酰葡萄糖胺浓度为200 1000raM，丙酮酸浓 度为200 1500 mM，磷酸缓冲液浓度40 80 mM， Mg"浓度10 30 mM，反应体 系中添加0.1 10 g/L Triton X-100、 0.1 10 g/L SDS、 0.1 10 g/L CTAB 或0.1 10 g/L CHAPs表面活性剂，反应pH值为7 7. 8，反应温度为25 37°C， 反应时间为12 72小时，反应过程使用往复式摇床或控制发酵罐转速使氧溶解 度为30 70%。
(7) 反应产物提取使用离子交换树脂从反应液中提取，经过浓縮至100 200 g/L 后，用2 10倍体积冰乙酸于4'C沉淀得到产品结晶即为N-乙酰神经氨酸。
其中，步骤(1)中所述的种子细胞培养和制备催化剂细胞的优选温度是27 32'C; 氨苄青霉素的浓度优选为0.8 1.3 g/L，种子细胞培养时间优选是15 25小时。
其中，步骤(2)中所述的制备催化剂细胞中，优选种子细胞接种量为0.8% 1.2%， 培养温度27 32°C，培养时间优选1. 5~2. 5小时。
其中，步骤(3)中所述的诱导过程中，诱导温度优选为42 45。C,诱导时间优选 为4. 5 5. 5小时。
其中，步骤(1)和(2)中使用的LB培养基配方为每升中加入5g酵母粉，10 g蛋白胨，10 g NaCl，调节pH值为7.5， 12rC湿热灭菌20分钟。 .
其中，步骤(2)中使用的LB无机盐培养基配方为每升中加入5g酵母粉，10 g 蛋白胨，0. 5 g NaCl, 12.8 g Na2HP04, 3 g KH2P04， 1 g NH4C1， 0.24 g MgS(X和0.011 g CaCl"调节pH至7.0， 115。C湿热灭菌20分钟。
其中，步骤(5)中所用破碎缓冲液为60 mM磷酸缓冲液(pH 7.4)和100g/L甘油。
其中，步骤(5)中所述N-乙酰神经氨酸醛縮酶酶活测量反应体系为20mM磷酸 钾缓冲液(pH 7.4) 350 ii 1， 100 ul N-乙酰神经氨酸(5 mg/ml), 50 ul酶液。酶 活测量反应条件为37。C反应10 min，加0. 5 ml 2， 4 二硝基苯肼(DNP)， 20 min后加 5 ml NaOH (0.4 M)显色。于520 nm比色。丙酮酸标准曲线配制10 raM的丙酮酸钠 溶液25ml，分别稀释为O. 1、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 l.OmM六种不同浓度。将测酶活 反应体系中的50 ul酶液换成50 "1不同浓度的丙酮酸钠溶液。反应条件与测酶活 条件相同。比色法测定丙酮酸标准曲线如图4所示。酶活定义为每分钟分解N-乙酰神 经氨酸生成l Pmol丙酮酸所需酶量为一个酶活单位。
其中，步骤(5)中N-乙酰葡萄糖胺异构酶酶活测量反应体系及条件为0.1 M Tris-HC1 (pH 7.5)， 10 raM MgCl" 50 mM ManNAc， 5 mM ATP和20 ul酶液。3(TC反 应30分钟后，沸水浴5分钟终止反应，12，000转/分钟离心，取上清用高效液相色谱 (HPLC)分析N-乙酰葡萄糖胺浓度，N-乙酰葡萄糖胺标准曲线如图5所示。酶活定义 每分钟转化N-乙酰甘露糖胺生成l umol N-乙酰葡萄糖胺所需酶量定义为一个酶活单位(U)。
其中，步骤(6)所述反应体系中，丙酮酸浓度优选为600 800 mM， N-乙酰葡萄 糖胺浓度优选为800 1000 mM，磷酸盐浓度优选为60 80 mM, Mg"浓度优选为15 30 mM，反应pH值优选为7.2 7.4，反应温度优选为30 35°C,发酵罐氧溶解度优选控制 在40% 70%，表面活性剂优选浓度为0. 2 0. 6 g/L的CTAB。
其中，步骤(6)和(7)中涉及的采用HPLC分析的方法及条件为样品沸水浴IO 分钟后，12，000转/每分钟，离心20分钟，取离心液上清，用流动相稀释至合适倍数， 用0. 22 u m滤膜过滤，滤过液进行HPLC检测。釆用BioRad Aminex HPX-87H (300X 7. 8 mm)色谱柱对样品进行分析方法及条件为柱温为55。C，以10 mM硫酸水溶液为流动 相，流速为0. 4 ml/min，在Agilent 1100高效液相色谱仪上运行，进样量5 lU,检 测器为示差折光检测器(RID)。
用HPLC分析得到的丙酮酸、N-乙酰神经氨酸、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰甘露糖胺 的标准曲线如图5所示。HPLC分析转化液图谱如图6所示。
应用本发明所述温控共表达外源基因的重组大肠杆菌即大肠杆菌(^&c力e/v'"^ co7/) DT26 (pBVNsS) CCTCC No. M 209018在规模化催化生产N-乙酰神经氮酸过程 中具有催化剂制备安全方便，催化过程操作简单，价格便宜，效率较高，易于提取等特 点，具体为
(1) 本发明首次构建了可同时表达N-乙酰神经氦酸醛缩酶和N-乙酰葡萄糖胺2-异 构酶的重组质粒pBVNsS。使用该质粒仅通过温度控制就实现在一个菌体细胞内 进行两种酶的高表达。与同类常用IPTG等化学药物诱导表达的催化剂相比，诱 导不需要外加其它物质，更安全，操作更方便。并且仅培养诱导一次就可以得 到两步催化中的酶，
(2) 首次使用pKD46系统对大肠杆菌的N-乙酰葡萄糖胺磷酸转运系统的基因/7a^E 进行敲除，得到菌株大肠杆菌(^ c力eric/ " co乃')DT26，并应用于以过量N-乙酰葡萄糖胺为底物的催化。从菌株基因水平上对全细胞催化剂进行改造，使 该菌株具有更稳定的催化特性。
(3) 首次构建了含有共表达N-乙酰神经氨酸醛縮酶和N-乙酰葡萄糖胺2-异构酶载 体的"a5E基因敲除的大肠杆菌菌株，并直接使用诱导后的该菌株作为全细胞催 化剂。酶以全细胞的形式行使功能，有细胞膜保护，催化过程中比纯酶更稳定， 适用于重复使用。而且全细胞可以通过简单的离心方法和过滤方法进行分离， 易于后处理。
(4) 生产全细胞催化剂菌株的培养基简单、成本低，均为常规有机碳氮源和无机盐。
(5) 本发明的生物催化剂能以丙酮酸和N-乙酰葡萄糖胺为底物。与酶催化相比，可 以在没有额外添加ATP的条件下合成N-乙酰神经氨酸，节约了催化成本。
(6) 本发明首次使用表面活性剂用于提高全细胞生物催化剂的细胞膜通透性，与其 它全细胞催化合成N-乙酰神经氨酸过程相比提高了产物的合成速度和终浓度。
(7) 本发明首次把过量的N-乙酰葡萄糖胺推动反应的方法用于以全细胞为催化剂的 N-乙酰神经氨酸合成，得到较高浓度的N-乙酰神经氨酸和较低的残留丙酮酸浓 度，易于后续离子交换分离。


图1构建重组大肠杆菌的催化过程示意图
a为N-乙酰葡萄糖胺异构酶；b为N-乙酰神经氨酸醛缩酶；C为N-乙酰葡萄糖胺磷
酸转运系统。
图2重组共表达载体构建过程
A为pBV220载体，具体构建方法参见文献张智清等1990年于病毒学报发表的《含 PA启动子的原核高效表达载体的组建及其应用》(第6巻，第2期，111-116页)；B为 用重组PCR方法构建的中间插有SD序列的两个基因；C为构建好的温控共表达载体 (pBVNsS)。
图3基因敲除菌株构建过程
A: PCR得到的nagE基因连接到pMD18-T载体；B: Axr57HI酶切pMD18-T_4639得 到带有nagE基因两头序列的pMD18-T，片段；C: Smal酶切pL0I2065得到FRT-tet-FRT 片段；D:连接pMD18-T，和FRT-tet-FRT片段，得到载体；E:以pMD18-T-4047为模板 PCR得到FnagEl-FRT-tet-FRT-FnagE2; F: FnagEl-FRT-tet-FRT-FnagE2电转进入表达 重组酶的大肠杆菌K12得到重组子;G:重组子表达Flp重组酶消除抗性基因tet;FnagE: nagE基因的部分片段
图4比色法测定丙酮酸标准曲线
图5 HPLC分析丙酮酸、N-乙酰神经氨酸、N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰甘露糖胺标准 品图谱及标准曲线。
a: N-乙酰神经氨酸标准曲线；b:丙酮酸标准曲线；C: N-乙酰甘露糖胺标准曲线； d: N-乙酰葡萄糖胺标准曲线。
图6 HPLC分析转化体系图谱。
具体实施例方式
实施例1:重组基因工程菌株大肠杆菌(￡sc/ arr'c/ j'acoh') DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018构建
1、 N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因(/73M)克隆
采用常规的方法制备菌株大肠杆菌K12 ATCC 25404的基因组DNA，该过程可参考 科学出版社出版的《精编分子生物学指南》中细菌基因组的小量制备的方法；使用合成 的引物从大肠杆菌K12的基因组DNA中PCR扩增得到N-乙酰神经氨酸酶基因"3/7A片 段用￡coRI和尸stl双酶切后回收，连接至相同酶处理过并回收的质粒pBV220 (见病毒 学报，第6巻，第2期，111-116页)。
其中，上述大肠杆菌K12 ATCC 25404作为朋/^基因的来源菌，根据已测序的该菌 的基因组序列，设计引物上游引物5， -AGGAATTCATGGCAACGAATTTAC-3'，携带一个 化oRI位点；下游引物5' -TCCTGCAGTCACCCGCGCTCTT-3，，携带一个位点。
2、 N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因(s7rl975)克隆
用BG11培养基培养集胞藻(5)77ec力oc;^^ sp. ) PCC6803; 5,000转/分钟，离心 10分钟，每1克湿菌体悬浮于20 ml缓冲液A (含1 M NaCl和30 P 1 10% Sarkosyl (十二烷基肌氨酸钠)实验中用SDS替代)4'C放置2小时以上；离心收集(8000转每 分钟，离心10分钟)。用缓冲液A (含1 mM NaCl)洗涤，重悬于25 ml缓冲液A (含 25%蔗糖)，室温放置l小时(混匀)；加溶菌酶至10-20 mg/ml 37°C保温15分钟；加
975 ml 10 raM Tris HC1 (含50 mM EDTA， pH 8. 5)，即稀释4倍，继续保温1小时；加 SDS至W，加蛋白酶K至100 lig/ml，.于37。C处理2小时；(TC放置过夜后，6， 000 g 离心20分钟；上清加入NaCl至lM再加入2倍体积冷乙醇，离心12， 000转/分钟，10 分钟，去上清，溶于l ml TE缓冲液；加RNase A;酚/氯仿/异戊醇抽提蛋白一次，再 用氯仿/异戊醇抽提一次；加2倍体积无水乙醇，0'C放置2小时以上，沉淀DNA,离心 去上清，沉淀溶于TE缓冲液。使用合成的引物从集胞藻(5y/ ec力oc/w'ssp. ) PCC6803 的基因组DNA中PCR扩增得到N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因(sZrl975);' 其中，BG11培养基配方如表1所示
表l BG11培养基成分
成份 贮液浓度(g/100ml) 1L培养基加量(ml)
NaN031510
K2HP04.3H200.410
MgS04-7H200.7510
CaCl2'2H20.0.3610
柠檬酸0.0610
柠檬酸铁铵0.0610
EDTA 二钠0.0110
Na2C030.210
A5*-1 -
蒸馏水-919
*A5溶液组成H3B03 61.0 mg/L， MnS04 H20 1 69. 0 mg/L， ZnS04 7H20 2 87.0 mg/L, GuS04 5H20 2. 5 mg/L， (NH4)6Mo7024 4H20 12. 5 mg/L
其中，缓冲液A成份为，50 mM Tris HC1和50raM EDTA， pH 8. 5。
以集胞藻(加ec力。cj^s sp. ) PCC6803的DNA为模板，以引物sir-f和sir-r进 行PCR得到sZrl975基因。连接至PMD18-T载体，得到pMD18-T-^Zrl975。
其中，根据已测序的集胞藻(^Sy"ec力ocj^ '"sp. ) PCC6803的基因组序列及报道的 该基因的序列，设计克隆s7rl975基因所用引物如下
上游引物slr-f: 5， ATAGAATTCATGATTGCCCATCGCCGTC 3，，携带一个^boRI位点； 下游引物slr-r: 5， ATTGGATCCTTAACTAACCGGAAGTTGGA 3，,携带一个y 湖HI位点。 3、重组PCR方法构建pBVNsS共表达载体
第一轮PCR条件及过程如下。分别以质粒pBV220-/7朋A和pMD18-T-sZr1^75为模板， 分别以引物A、 B和引物C、 D进行PCR。经过94'C变性2分钟后开始循环，94'C变性， 50-6(TC退火，72i:延伸l分钟或2分钟(因片段长度而变)，30个循环后，72'C再延伸 IO分钟。再进行第二轮PCR:以第一次PCR得到的两条带为模板，以重组PCR引物A和 D为引物进行连接PCR。先进性5次延伸循环，以利于重组片段的形成。然后加入引物 94。C变性2分钟后开始循环，94。C变性，50-6(TC退火，72。C延伸5分钟，30个循环后， 72t:再延伸10分钟。重组PCR得到的2. 1 kb片段切胶回收后连接到T载体，然后转化 进入大肠杆菌DH5a 。挑取转化子，酶切验证，得到质粒pMD-18T-/ 朋A-slrl975。用fcoRI 和双酶切得到的2. 1 kb片段和fcoRI和5"a71处理过的pBV220连接，转化大肠杆菌DH5a。酶切验证，诱导后进行蛋白电泳和酶活性验证。 其中，重组PCR构建所用引物为，
引物A: 5， -GGCGAATTCATGGCAACGMTTTACGTGGC-3，,携带一个fcoRI位点；引物 B: 5， -TTATCTCCCTCGAGTATTCACCCGCGCTCTTgCA-3，，携带一个SD序列和一个位 点；
引物C: 5， -ATACTCGAGGGAGATAAATGATTGCCCATCGCCGT-3，携带一个J力ol位点；引 物D: 5， -GGCGTCGACTTAACTAACCGGAAGTTGGAGA-3，携带一个5^I位点。
4、 大肠杆菌K12基因组上/7agE基因敲除
(1) 分析pMD18-T的酶切位点及待敲除基因的酶切位点。
(2) PCR扩增T7a^基因(以nagE-u和nagE-d为引物；以大肠杆菌K12 ATCC 25404 基因组为模板)，连接pMD18-T，得到pMD18-T4639。
(3) 用A r5iHI酶切pMD18-T4639，并回收大小约为2.7 kb的片段；用5"aM 双酶切pL012065，回收大小为1630 bp的片段
(4) 回收的大段和小片段连接得到pMD18-T4740
(5) PCR得到片段nagE::FRT-tet-FRT (以nagE-u和nagE-d为引物；以 pMD18-T4740为模板)，电转化进入大肠杆菌K12 (pKD46)的电转感受态(含有L-阿拉 伯糖诱导后表达的red重组酶)，涂布含有四环素的固体LB平板，37'C培养。
(6) 挑取重组子，用tet-u和tet-d引物进行PCR验证。
(7) 在3(TC条件下，用LB培养上述重组子至0D6。。^值为0. 6。培养物转至42°C 培养，消除菌株中的pKD46。转接至含100 ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37'C培 养，验证pKD46质粒彻底消除的菌株。
(8) 把上述消除pKD46的菌株做感受态，把质粒pFT-A转化进入感受态细胞， 涂布含有100 ug/ml氨苄青霉素的LB培养基，3(TC培养，筛选转化子。
(9) 挑取转化子于LB培养基中，30'C培养，加入10 u g/ml金霉素诱导FLP重 组酶表达，培养6小时后，转为42。C培养消除质粒pFT-A。
(10) 培养液稀释至适当浓度(约1(T)，涂布LB平板，于37。C培养，挑取多个 单菌落分别转接到含100 U g/ml氨节青霉素和10 Ug/ml四环素的摇管，选择既消除 四环素抗性又消除pFT-A质粒的菌株。
其中，扩增"^E基因所用引物如下 上游引物nagE-u: 5， -ATGAATATTTTAGGTTTTTTCC-3 ，， 下游引物nagE-d: 5， -TTACTTTTTGATTTCATACAGC-3 ，。 其中，上述敲除过程中抗性基因PCR检测用引物如下 上游引物tet-u: 5' -GGGTACCGAGCTCGAATT-3'， 下游引物tet-d: 5， -GGGGAGCTTGTCGACAAT-3，。
5、 构建重组基因工程菌株大肠杆菌(&c力er/cy^'a DT26 (pBVNsS)
以常规方法将构建质粒pBVNsS转化进入大肠杆菌(^s"c力eric力/acoJ7) DT26得到 大肠杆菌(foc力en'c/w'a DT26 (pBVNsS)并经过SDS-PAGE和酶活性维测具有N-
乙酰神经氨酸醛缩酶活性和N-乙酰葡萄糖胺异构酶活性。
上述大肠杆菌(foc力eWc力j'a coh') DT26 (pBVNsS)菌株已于2009年1月12日保 藏于"中国典型培养物保藏中心"(武汉大学，中国武汉)，保藏号为CCTCCN0:M209018。上述重组大肠杆菌(￡sc/ erj'c/w'a coh') DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018，为 革兰氏阴性菌，可以用于催化N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸生产N-乙酰神经氨酸。
上述重组大肠杆菌(￡sc/ er/c/ /a co7/) DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018具 有以下生理生化特征较佳培养温度为37±rC，可以在含有IOO Hg/ml氨苄青霉素 的LB培养基或LB无机盐培养基上生长。好氧或兼性好氧，有周生鞭毛，不形成孢子， 革兰氏阴性。在营养琼脂上的菌落呈光滑、低凹、潮湿和灰白，表面有光泽、边缘较整 齐。化能有机营养，具有呼吸和发酵代谢。发酵D-葡萄糖、其他糖类化合物和多元醇， 产气。能利用乙酸为唯一碳源，不能利用柠檬酸盐。
实施例2:全细胞催化剂在N-乙酰神经氨酸合成中的应用
(1) 平板培养将上述大肠杆菌(^sc力e77'c力j'a DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018菌株划线到含有质量体积比为1. 5%琼脂并含100 ^ g/ml的氨苄青霉素LB平 板上，37'C培养12小时。
(2) —级种子在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌 落，然后接种到5 ml的含100 Pg/ml氨苄青霉素的液体培养基中，3(TC摇床振荡培养 12小时。
(3) 摇瓶培养在无菌条件下，取步骤(2)所培养的培养液以体积比为1%的接
种量，接种到30 ml含有100 y g/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中，3(TC旋转式摇 床200转/分钟培养2小时。
(4) 诱导把摇瓶移至45'C摇床，180转/分钟诱导4小时。
其中上述步骤(1) (3)中所述的LB培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉
5 g/L; NaCl 10 g/L， pH 7.0; 115。C灭菌15分钟。
上述步骤(4)中所述LB无机盐液体培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L; Na2HP04 7H20 12. 8 g/L; KH2P04 3 g/L; NaCl 0. 5 g/L; NH4C1 1 g/L; CaCl2 0. 011 g/L; 葡萄糖4 g/L; 115。C灭菌15分钟。
(5) 收集菌体将步骤(4)培养得到的培养物8，000转/分钟离心15分钟；并用 pH 7. 4、 1/15 M的PBS缓冲液洗涤菌体两遍。测得N-乙酰神经氨酸醛縮酶比酶活性5.321 U/mg菌体蛋白，N-乙酰葡萄糖胺异构酶比酶活为0.486U/mg菌体蛋白。将离心的菌体 置于4'C的冰箱中冷藏，即得到生物催化剂，待用。
上述细胞催化剂酶活性测量方法为取浓縮10倍菌液，悬浮于破碎缓冲液，超声 波破碎后，取上清测定酶活性。其中破碎缓冲液成份为60 mM磷酸缓冲液(pH 7.4) 和100g/L甘油。
上述N-乙酰神经氨酸醛缩酶活性测定方法为如下。酶活测量反应体系20mM磷酸 钾缓冲液(pH 7.4) 350 ul， 100 "1 N-乙酰神经氨酸(5 mg/ml)， 50 ul酶液。酶 活测量反应条件为37'C反应10分钟，加0. 5 ml DNP溶液显色20分钟后，加NaOH (0.4 M) 5 ml显色。于520 nm比色。
上述N-乙酰葡萄糖胺异构酶活性测定方法如下。反应体系及反应条件0.1 M Tris-HC1 (pH 7. 5)力I] 10 mM MgCl2加50 mM ManNAc力B 5 mM ATP最后加20 u 1酶液 启动反应。3(TC反应10分钟后，沸水浴5分钟终止反应，12，000转/分钟，离心，取 上清用高效液相色谱(HPLC)进行分析。(6) 利用上述生物催化剂生产N-乙酰神经氨酸将歩骤(5)所得的生物催化剂即 重组大肠杆菌(foc/ ar2'c/u'a coh') DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018的细胞醛縮酶 总活性调节约至40U，相应的异构酶总活性约为8 U，在3(TC， pH7.4条袢下，丙酮酸 浓度为600 mM， N-乙酰葡萄糖胺浓度为1000 mM,并加入CTAB终浓度为0. 3 g/L，在往 复式摇床振荡反应42小时，得到含N-乙酰神经氨酸转化液。
(7) 将转化液以8,000转/分离心10分钟，去除所加入的生物催化剂，测定上清 液中N-乙酰神经氨酸和丙酮酸的含量分别为191 mM和253 mM。
(8) 用HZ201X8树脂将转化液中的N-乙酰神经氨酸分离。收集的流出液，在真空 度0.095MPa， 5(TC的条件下浓縮。浓縮液进行冰乙酸沉淀，4"C下静置得到结晶。纯度 约为98.0%,回收率约为90.2%。
上述HPLC检测反应体系方法为样品处理方法如下。样品沸水浴10分钟后，12, 000 转/分钟，离心20分钟。取离心液上清，用流动相稀释至合适倍数，用0.22 wni滤膜 过滤，滤过液进行HPLC检测。使用BioRad Aminex HPX-87H (300X7.8咖)色谱柱对 样品进行分析。柱温为55°C，以10 mM硫酸水溶液为流动相，流速为0.4 ml/分钟， 在Agilent 1100高效液相色谱仪上运行，进样量5 u l，检测器为示差折光检k(器(RID)。
实施例3:全细胞催化剂在N-乙酰神经氨酸合成过程中的应用
(1) 平板培养将大肠杆菌(fsc/ er化/w'a coh') DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018 菌株划线到含有质量体积比为1. 5%琼脂并含100 P g/mL的氨苄青霉素LB平板上，37'C 培养12小时。
(2) —级种子在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌 落，然后接种到5ml的含100iig/ml氨苄青霉素的液体培养基中，37'C摇床振荡培养 12小时。
(3) 二级种子在无菌条件下，取步骤(2)所培养的培养液以体积比为1%的接 种量，接种到500 ml含有100 Ug/ml的氨苄青霉素的LB无机盐液体培养基中，30'C 摇床振荡培养12小时。
(4) 发酵罐培养在无菌条件下，取步骤(3)所得的培养液以体积比'为10%的接 种量接种5 L的上述LB无机盐液体培养基，42'C诱导6小时。
其中上述步骤(1) (3)中所述的LB培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉
5 g/L; NaCl 10 g/L， pH 7.0; U5。C，灭菌15分钟。
上述步骤(4)中所述LB无机盐液体培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L; Na2HP04 7H20 12. 8 g/L; KH2P04 3 g/L; NaCl 0. 5 g/L; NHXl 1 g/L; CaCl2 0. Oil g/L; 葡萄糖4 g/L; 115'C，灭菌15分钟。
(5) 收集菌体将步骤(4)培养得到的培养物8，000转/分钟离心15分钟；并用 pH 7.4、 1/15 M的PBS缓冲液洗涤菌体两遍。测得N-乙酰神经氨酸醛縮酶比酶活为 1. 765。， N-乙酰葡萄糖胺异构酶比酶活为0.142。将离心的菌体置于4'C的冰箱中冷藏， 即得到生物催化剂，待用。
上述细胞催化剂酶活性测量方法为取浓縮10倍菌液，悬浮于破碎缓冲液，超声 波破碎后，取上清测定酶活性。其中破碎缓冲液成份为60 mM磷酸缓冲液'(pH 7.4) 和100 g/L甘油。
13上述N-乙酰神经氨酸醛縮酶活性测定方法为如下。酶活测量反应体系20mM磷酸 钾缓冲液(pH 7.4) 350 ul, 100 ixl N-乙酰神经氨酸(5 mg/ml)， 50 "1酶液。酶 活测量反应条件为37。C反应10分钟，加0. 5 ml 2， 4 二硝基苯肼(DNP)溶液显色20 分钟后，加NaOH (0.4 M) 5 ml显色。于520 nm比色。
上述N-乙酰葡萄糖胺异构酶活性测定方法如下。反应体系及反应条件0.1 M Tris-HC1 (pH 7. 5)力卩10 mM MgCl2加50 mM ManNAc加5 mM ATP最后加20 u 1酶液 启动反应。30'C反应10分钟后，沸水浴5分钟终止反应，12，000转/分钟，离心15分 钟，取上清用高效液相色谱(HPLC)进行分析。
(6) 利用上述生物催化剂生产N-乙酰神经氨酸将步骤(5)所得的生物催化剂即 重组大肠杆菌(￡sc/ en'c/;j'a coh') DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018的细胞N-乙 酰神经氨酸醛缩酶活性约为4011，相应N-乙酰葡萄糖胺异构酶活性约为8 U,在3(TC, pH7.4条件下，丙酮酸浓度为400 mM， N-乙酰葡萄糖胺浓度为600 mM，并加入CTAB终 浓度为0.2g/L,往复式摇床振荡反应36小时，得到含N-乙酰神经氨酸转化液。
(7) 将转化液以8,000转/分离心IO分钟，去除所加入的生物催化剂，测定上清 液中N-乙酰神经氨酸和丙酮酸的含量为75±2 mM和252士2 mM。
(8) 用HZ201X8树脂将转化液中的N-乙酰神经氨酸分离。收集的流出液，在真空 度0.095MPa， 50'C的条件下浓縮。浓縮液进行冰乙酸沉淀，4'C下静置得到结晶。纯度 约为98. 1%,回收率约为90.03%。
上述HPLC检测反应体系方法为:样品处理方法如下。样品沸水浴10分钟后，12, 000 转/分钟离心20分钟。取离心液上清，用流动相稀释至合适倍数，用0.22 !xm滤膜过 滤，滤过液进行HPLC检测。使用BioRad Aminex HPX-87H (300X7.8 mm)色谱柱对样 品进行分析。柱温为55°C，以10 mM硫酸水溶液为流动相，流速为0.4 ml/分钟，在 Agilent 1100高效液相色谱仪上运行，进样量5 P 1，检测器为示差折光检测器(RID)。
实施例4:全细胞催化剂在N-乙酰神经氨酸合成中的应用
(1) 平板培养将重组大肠杆菌(^sc力en'c/ ia co i) DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018菌株划线到含有质量体积比为1. 5%琼脂并含100 u g/mL的氨苄青霉素LB平 板上，37'C培养12小时。
(2) —级种子在无菌的条件下，用无菌的牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌 落，然后接种到5ml的含100 U g/ml氨苄青霉素的液体培养基中，30。C摇床振荡培养 12小时。
(3) 二级种子在无菌条件下，取步骤(2)所培养的培养液以体积比为1%的接 种量，接种到IOO ml含有100 ug/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中，37'C摇床振 荡培养10小时。 '
(4) 发酵罐培养在无菌条件下，取步骤(3)所得的培养液以体积比为1%的接 种量接种10 L的限制碳源的LB无机盐液体培养基，42'C诱导，流加葡萄糖控制比生长 速率，培养6小时
其中上述步骤(1) (3)中所述的LB培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉
5 g/L; NaCl 10 g/L， pH 7.0; 115。C，灭菌15分钟。
上述步骤(4)中所述LB无机盐液体培养基配方是蛋白胨10g/L;酵母粉5g/L;Na2HP04 7H20 12. 8 g/L; KH2P04 3 g/L; NaCl 0. 5 g/L; NH4C1 1 g/L; CaCl2 0. Oil g/L; 葡萄糖4 g/L; 115°C，灭菌15分钟。
上述细胞催化剂酶活性测量方法为取浓縮10倍菌液，悬浮于破碎缓冲液，超声
波破碎后，取上清测定酶活性。其中破碎缓冲液成份为60 mM磷酸缓冲液.(pH 7.4) 和100 g/L甘油。
上述N-乙酰神经氨酸醛縮酶活性测定方法为如下。酶活测量反应体系20mM磷酸 钾缓冲液(pH 7.4) 350 ul, 100 ul N-乙酰神经氨酸(5 mg/ml), 50 ul酶液。酶 活测量反应条件为37。C反应10分钟，加0.5 ml 2, 4 二硝基苯肼(DNP)溶液显色20 分钟后，加NaOH (0.4 M) 5 ml显色。于520nra比色。
上述N-乙酰葡萄糖胺异构酶活性测定方法如下。反应体系及反应条件0.1 M Tris-HCl (pH 7, 5)加10 mM MgCljB 50 mM ManNAc力B 5 mM ATP最后加20 u 1酶液 启动反应。3(TC反应10分钟后，沸水洛5分钟终止反应，12,000转/分钟，离心15分 钟，取上清用高效液相色谱(HPLC)进行分析。
(5) 收集菌体将步骤(4)培养得到的培养物8，000转/分钟离心15分钟；并用 pH 7.4 1/15 M的PBS缓冲液洗涤菌体两遍后，测得N-乙酰神经氨酸醛縮酶比酶活为 5.023。， N-乙酰葡萄糖胺异构酶酶活性比酶活为0.523。将离心的菌体置于4'C的冰箱 中冷藏，即得到生物催化剂，待用。
(6) 利用上述生物催化剂生产N-乙酰神经氨酸将步骤(5)所得的生物催化剂 即重组大肠杆菌(&c力ar化力j'a c。h.) DT26 (pBVNsS) CCTCC NO: M 209018的细胞N-乙酰神经氨酸醛縮酶酶活性约为30U，相应N-乙酰葡萄糖胺异构酶酶活性约为4U，在 30°C， pH7.4条件下，丙酮酸浓度为1000 mM， N-乙酰葡萄糖胺浓度为800 mM，加入CTAB 终浓度为0.2 g/L往复式摇床振荡反应36小时，得到含N-乙酰神经氨酸转化液。
(7) 将转化液以8，000转/分离心l0分钟，去除所加入的生物催化剂，测定上清 液中N-乙酰神经氨酸和丙酮酸的含量分别约为382 mM和400士50 mM;
(8) 用HZ201X8树脂将转化液中的N-乙酰神经氨酸分离。收集的流出液，在真 空度0.095 MPa, 50。C的条件下浓缩。浓縮液进行冰乙酸沉淀，4。C下静置得到结晶。 纯度约为97. 9% ，回收率约为83. 03% 。
上述HPLC检测反应体系方法为样品处理方法如下。样品沸水浴10分钟后，12, 000 转/分钟，离心20分钟。取离心液上清，用流动相稀释至合适倍数，用0.22 txm滤膜 过滤，滤过液进行HPLC检测。使用BioRad Aminex HPX-87H (300X7.8 mm)色谱柱对 样品进行分析。柱温为55°C，以10 mM硫酸水溶液为流动相，流速为0.4 ml/分钟， 在Agilent 高效液相色谱仪上运行，进样量5 iil，检测器为示差折光检测器(RID)。序列表
〈110〉山东大学
〈120〉 一株温控共表达外源基因的重组大肠杆菌及其应用 〈141〉 2009-7-3
〈160〉 1
〈210〉 1
〈211〉 5743
〈212〉 DNA
〈213〉大肠杆菌(^sr力eric力/a co力')
〈221〉 pBVNsS
〈222〉 (1)…(5743)
〈400〉 1
aattcatggc犯cgaatttacgtggcgt犯tggctgcactcctgactccttttgaccaac60
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1.一株温控共表达外源基因的重组大肠杆菌，其特征在于该菌株命名为大肠杆菌(Escherichia coli)DT26(pBVNsS)；所述菌株已于2009年1月12日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为CCTCC NOM 209018。
2. 根据权利要求1所述的温控共表达外源基因的重组大肠杆菌，其特征在于所 述菌株的基因型为4"^E: :FRT;其含有温控共表达载体即构建质粒pBVNsS。
3. 根据权利要求2所述的温控共表达外源基因的重组大肠杆菌，其特征在于所 述质粒pBVNsS是以载体pBV220为出发载体，在&&启动子下游顺序插入了 N-乙酰神 经氨酸醛縮酶(Neu5Ac aldolase)基因朋M和加有SD序列的N-乙酰葡萄糖胺异构酶(GlcNAc 2-印imerase)基因Wrl975，具有双顺反子片段"朋A-SD-W/i975。
4. 根据权利要求3所述的温控共表达外源基因的重组大肠杆菌，其特征在于所 述N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因朋M来源于大肠杆菌K12 ATCC 25404。
5. 根据权利要求3所述的温控共表达外源基因的重组大肠杆菌，其特征在于所 述N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因slrl975来源于集胞藻(S印ec力oc/s"s sp. ) PCC6803。
6. 权利要求1所述温控共表达外源基因的重组大肠杆菌作为催化剂在全细胞催化 的制备N-乙酰神经氨酸中的应用。
7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述温控共表达外源基因的重组大 肠杆菌用于制备全细胞催化剂的条件为诱导前培养温度20 35°C，诱导前培养时间 0.5 5小时；诱导温度37 45。C，诱导时间4 30小时，摇床转速150 250转/分钟， 发酵罐氧溶解度15 45%;使用上述全细胞催化剂制备N-乙酰神经氨酸的反应体系及反 应条件是反应体系中全细胞催化剂N-乙酰神经氨酸醛縮酶酶活性为20 40 U，相应 的N-乙酰葡萄糖胺异构酶酶活性为4 8U, N-乙酰葡萄糖胺浓度为200 1000 mM，丙 酮酸浓度为200 1500 mM，磷酸缓冲液浓度40 80 mM， Mg"浓度10 30 mM，反应体 系中添加0.1 10 g/L Triton X_100、 0. 1 10 g/L SDS、 0.1~10 g/L CTAB或0. l 10g/LCHAPs，反应pH值为7 7.8，反应温度为25 37°C，反应时间为12 72小时， 反应过程使用往复式摇床或控制发酵罐转速使氧溶解度为30~70%。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述温控共表达外源基因的重组大 肠杆菌用于制备全细胞催化剂的条件为诱导前培养温度27 32°C，诱导前培养时间 1.5 2.5小时;诱导温度42 45"C，诱导时间4. 5 5. 5小时。
9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述使用上述全细胞催化剂制备N-乙酰神经氨酸的反应体系及反应条件是反应体系中全细胞催化剂N-乙酰神经氨酸醛 縮酶酶活性为27 35 U，相应的N-乙酰葡萄糖胺异构酶酶活性为5 7U， N-乙酰葡萄 糖胺浓度为800 1000 mM，丙酮酸浓度为600 800 raM，磷酸缓冲液浓度60 80 mM， Mg"浓度15 30 raM，反应体系中添加浓度为0. 2 0. 6 g/L的CTAB，反应pH.值为7. 2~ 7.4，反应温度为32 35°C，反应时间为32 60小时，反应过程控制发酵罐氧溶解度 为40 70%。
全文摘要
本发明公开了一株温控共表达外源基因的重组大肠杆菌，名为大肠杆菌(Escherichia coli)DT26(pBVNsS)CCTCC NOM 209018，其基因型为ΔnagE::FRT；含有温控共表达载体pBVNsS。同时本发明还公开了所述重组大肠杆菌作为催化剂在全细胞催化制备N-乙酰神经氨酸中的应用。本发明的温控共表达外源基因的重组大肠杆菌在规模化催化生产N-乙酰神经氨酸过程中具有催化剂制备安全方便，催化过程操作简单，价格便宜，效率较高，易于提取等特点。
文档编号C12N1/21GK101603023SQ200910016499
公开日2009年12月16日 申请日期2009年7月10日 优先权日2009年7月10日
发明者张奕南, 平 许, 马翠卿 申请人:山东大学